Summary
ここでは、水からの抗生物質耐性菌の分離と同定、およびそれらの抗生物質耐性遺伝子(ARG)の分子特性評価のための詳細なプロトコルを紹介します。培養ベースおよび非培養ベース(メタゲノム解析)技術の使用は、インドのムンバイからの淡水に存在する細菌の多様性全体とさまざまなARGの総プールに関する完全な情報を提供します。
Abstract
淡水域に関連する微生物叢を介した抗生物質耐性(AR)の発生と拡散は、世界的な健康上の大きな懸念事項です。本研究では、淡水サンプルを収集し、従来の培養ベースの技術とハイスループット培養に依存しないメタゲノムアプローチの両方を使用して、細菌の多様性とAR遺伝子(ARG)全体に関して分析しました。この論文は、淡水サンプルから総および抗生物質耐性の培養可能な細菌を列挙し、培養可能な分離株の表現型および遺伝子型耐性を決定するための体系的なプロトコルを提示します。さらに、淡水サンプルから抽出された全メタゲノムDNAの全メタゲノム解析を使用して、非培養細菌を含む全体的な細菌の多様性を特定し、水域内のさまざまなARG(レジストーム)の総プールを同定したことを報告します。これらの詳細なプロトコルに従って、9.6 × 10 5-1.2 × 109 CFU / mLの範囲で高い抗生物質耐性菌負荷が観察されました。ほとんどの分離株は、セフォタキシム、アンピシリン、レボフロキサシン、クロラムフェニコール、セフトリアキソン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、トリメトプリム、シプロフロキサシンなどの複数の試験済み抗生物質に耐性があり、複数の抗生物質耐性(MAR)指数は≥0.2であり、分離株の耐性が高いことを示しています。16S rRNAシーケンシングにより、肺炎桿菌などの潜在的なヒト病原体、およびコマモナス属、ミクロコッカス属、アルスロバクター属、アエロモナス属などの日和見細菌が特定されました。 分離株の分子特性評価は、blaTEM、blaCTX-M(β-ラクタム)、aadA、aac(6')-Ib(アミノグリコシド)、およびdfr1(トリメトプリム)などのさまざまなARGの存在を示し、これもメタゲノムDNA分析全体で確認されました。抗生物質排出ポンプをコードする他のARGの高い有病率-mtrA、macB、mdtA、acrD、β-ラクタマーゼ-SMB-1、VIM-20、ccrA、ampC、blaZ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子catB10、およびリファンピシン耐性遺伝子rphB-もメタゲノムDNAで検出されました。この研究で議論されたプロトコルの助けを借りて、多様なAR表現型および遺伝子型形質を有する水系MAR細菌の存在を確認しました。したがって、全メタゲノムDNA分析は、水域の全体的なAR状態を決定するための従来の培養ベースの技術を補完する技術として使用できます。
Introduction
薬剤耐性(AMR)は、最も差し迫った地球規模の問題の1つとして認識されています。AMRの急速な進化とその世界的な普及は、それに関連する医療費の観点から、人間の健康と世界経済にとって最大の脅威の1つです1。抗生物質の過剰使用と誤用は、ARの増加につながっています。これはCOVID-19のパンデミックによって強調されており、その間、多くの場合、影響を受けた患者のAMRにより、関連する二次感染症の治療が大幅に損なわれました2。人間による抗生物質の直接使用/誤用に加えて、農業および畜産における抗生物質の過剰使用および誤用、および水域を含む環境への不適切な排出が大きな懸念事項です3。細菌における新しい耐性形質と多剤耐性の台頭は、ARの開発とその普及につながる要因のより良い理解の必要性を緊急に浮き彫りにしています。プラスミドなどの移動性遺伝要素に複数のAR遺伝子(ARG)を運ぶことが多い複数の抗生物質耐性菌は、これらの耐性遺伝子を潜在的なヒト病原体を含む非耐性微生物に移す可能性があるため、最後の手段の抗生物質でさえ治療できないスーパーバグの出現につながります4。これらの複数の抗生物質耐性菌は、水生態系に存在する場合、魚、カニ、軟体動物などの汚染された水ベースの食品を消費することにより、人間の腸に直接侵入する可能性があります。以前の研究では、天然に存在する水系におけるAR細菌の拡散は、飲料水を含む他の水供給にも到達する可能性があり、したがって、人間の食物連鎖に入る可能性があることが示されています5,6,7。
本研究の目的は、培養ベースと非培養ベースの組み合わせを使用した包括的なプロトコルを提供することです(全メタゲノム分析)技術 完全な情報を取得する インドのムンバイの水域に存在する細菌の多様性とさまざまなARGの総プール。従来、培養ベースの技術は、水域における細菌の多様性を研究するために使用されてきた。培養可能な微生物は、どのニッチでも微生物叢全体のごく一部しか構成していないため、細菌の多様性の全体的な状態と、あらゆるサンプルに蔓延しているさまざまな耐性形質をよりよく理解するには、さまざまな培養ベースおよび培養に依存しない技術を並行して使用する必要があります。そのような堅牢で信頼性の高い培養に依存しない技術の1つは、全メタゲノムDNA分析です。このハイスループットメソッドは、細菌の多様性やさまざまなARGの機能アノテーションに関するさまざまな研究で成功裏に利用されています8,9。この手法は、メタゲノム(サンプル中の総遺伝物質)をさまざまな分析の出発材料として使用するため、培養に依存しません。本研究のプロトコルは、全メタゲノムDNA分析に使用して、水サンプル中の細菌全体の多様性とさまざまなARG(レジストーム)に関する情報を取得できます。
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Protocol
1.サンプルの収集と処理
- サンプル収集
- 適切な量の水サンプルを滅菌サンプル容器に収集し、容器の3/4以下が満たされていることを確認します。
- 採取後できるだけ早く無菌条件下でサンプルを実験室に輸送し、直ちに処理します。
- サンプル処理
- 滅菌モスリン布で水サンプルを無菌ろ過し、粒子状物質を除去します。
- さらなる分析のために、ろ過水の適切な段階希釈を実行します。
2. 総細菌量と抗生物質耐性菌数の推定
- 総細菌量の決定
- 18.12 gのR2A寒天、改質粉末を1,000 mLの二重蒸留水に懸濁し、加熱して溶解します。溶解した混合物を121°C、15psiで20分間オートクレーブします。 R2A寒天培地を調製し、 適量のオートクレーブ処理された混合物を滅菌ペトリプレートに注ぐことにより、プレートを変更します(たとえば、約20 mLのオートクレーブ滅菌培地を90 mmの滅菌ペトリプレートに加えます)。
- ろ過水サンプルの適切な希釈液100 μLをR2A寒天培地上に均一に広げ、培地が固まったら修正プレート。実験を二重に実行します。
- 上記のすべてのプレートを35〜37°Cで48時間インキュベートします(分離に使用する培地に応じて温度とインキュベーション時間を変えます)。
- 式 (1) を使用して、ミリリットルあたりのコロニー形成単位 (CFU/mL) で総細菌負荷を表します。
(1)
- AR細菌数の決定
- 手順 2.1.1-2.1.4 に従います。ただし、R2A寒天培地の代わりに、R2A寒天培地を使用し、セフォタキシム(3μg/mL)、シプロフロキサシン(0.5μg/mL)、エリスロマイシン(20μg/mL)、カナマイシン(15μg/mL)、およびバンコマイシン(3μg/mL)の5つの異なる抗生物質を個別に補充した改変プレートを使用する。
- 手順2.2.1で述べたように、最終的な抗生物質濃度を達成するために、20 mLの滅菌溶融R2A寒天培地(溶融R2A寒天培地の温度、≤40°Cで修正)を含むチューブに抗生物質を別々に追加します。
- 均一に混合するために渦巻き、寒天が固まる前に滅菌ペトリプレートに注ぎます。実験を二重に実行します。
- 上記のすべてのプレートを35〜37°Cで48時間インキュベートします(異なる培地を使用する場合、温度とインキュベーション時間は異なる場合があります)。
- 抗生物質の品質管理と有効性の確認のために、大腸菌ATCC 25922および黄色ブドウ球菌ATCC 29213株の細菌懸濁液100 μLをそれぞれの抗生物質含有R2A寒天培地、修飾プレートに広げます(接種に使用される新鮮な培養物の密度が600 nmでOD = 0.5であることを確認してください)。
- ステップ2.1.4で説明されているように、CFU / mLの観点から抗生物質耐性菌数を決定します。
- 分離株のグリセロールストック
- 形態学的に異なるARコロニーを選択します。
- 単一の単離されたコロニーを、それぞれの抗生物質を含有する滅菌ルリア・ベルタニブロス2mLに懸濁する(例えば、コロニーがセフォタキシムを含有するプレートから選択される場合、ステップ2.3.1のコロニーを、それぞれの濃度のセフォタキシムを含有する滅菌ルリア・ベルタニブロスに接種する)。
- 接種したチューブを37°C、80rpmでOD600 が0.5に達するまでインキュベートします。
- ステップ2.3.3の培養懸濁液750 μLを無菌条件下で滅菌100%グリセロール250 μLに混合することにより、分離株のグリセロールストックを調製します。
- グリセロールストックは、さらに分析されるまで-80°Cで保存してください。
注:グリセロールストックから培養物を復活させるには、グリセロールストックを4°Cで解凍します。 このストックを、それぞれの抗生物質を含む2 mLの滅菌ルリアベルターニブロスにループで接種し、増殖させます。.
(1)3. 16S rRNA遺伝子シーケンシングによる培養可能菌の同定
- PCR用の分離株からのDNAテンプレートの調製
注:細菌からの粗DNAの単離のためのPCR用のDNAテンプレートの調製について記載されているプロトコルは、Carlsonらによって与えられています10。- 滅菌つまようじを使用して、ペトリプレート上で成長している分離物の単一の分離された純粋なコロニーを取ります。細菌コロニーを滅菌マイクロ遠心チューブ内の滅菌二重蒸留水100 μLに懸濁し、10分間煮沸します。
- 懸濁液を10,000 × g で2分間遠心分離して破片をペレット化し、上清を新しい滅菌マイクロ遠心チューブに移して粗DNAテンプレートとして使用します。
- 16S rRNA遺伝子のV3領域の標的PCR増幅とシーケンシング
- 表1に記載されているように、PCR増幅用のPCRチューブで40 μLの反応混合物を調製します。
注:DNA調製は、汚染の可能性を最小限に抑えながら、氷のブロックで実行する必要があります(試薬を取り扱うときは手袋を着用し、70%エタノールで作業面を完全に洗浄してください)。 - チューブをサーマルブロックに入れ、PCRサーマルサイクラーで適切なプログラムを実行します。標準化されたPCRサイクリング条件および16S rRNA遺伝子のV3領域の増幅のためのプライマー情報については 、表2 を参照されたい。
- アンプリコンの分解と可視化のために、アガロースゲル電気泳動(AGE)を実施してください。増幅PCR産物10 μLと6xゲルローディングバッファー2 μLを混合し(表3)、この混合物を10 mg/mLのエチジウムブロマイド(EtBr)を含む1.5 μLの1.5%アガロースゲル(100 mLの1x TAEバッファーに1.5 gのアガロース粉末を溶解[表3])のウェルにロードします。
注意: EtBrは強力な発がん性物質です。EtBrおよびEtBrを含むジェルを取り扱うときは、常に手袋を着用する必要があります。 - アンプリコンのサイズを推定するためのDNAラダーを追加します。
- 80〜100 VのTAEタンクバッファー中でゲルの電気泳動を実行します。
- トラッキング色素がゲルの3/4を走ったら、電気泳動を停止し、UVトランスイルミネーターの下でアンプリコンバンドを可視化します。
- 16S rRNA遺伝子シーケンシング用のPCR産物(アンプリコン)を使用して、分離株を特定します。
- アンプリコンを式(2)を用いた分光光度分析に供して定量する。
(2) - DNAの純度を確認するには、A260 / A280の比率を計算します。
注: 理想的には、この数値は 1.5 より大きく、できれば 1.8 から 2.0 の間である必要があります。 - 分離株を特定するには、適切なアライメント検索ツールを使用して、取得した配列を配列データベースと比較します。
- 表1に記載されているように、PCR増幅用のPCRチューブで40 μLの反応混合物を調製します。
(2)4.抗生物質感受性試験を用いた分離株中の抗生物質耐性の検出
注:このプロトコルは、椎間板拡散による抗生物質感受性試験(AST)の方法を説明しています。以下の抗生物質ディスクを使用した:セフォタキシム(5μg)、アンピシリン(10μg)、レボフロキサシン(5μg)、クロラムフェニコール(30μg)、チゲサイクリン(15μg)、セフトリアキソン(30μg)、イミペネム(10μg)、ゲンタマイシン(10μg)、ネオマイシン(10μg)、トリメトプリム(5μg)、およびシプロフロキサシン(5μg)。
- ASTのための接種材料の調製
- Luria-Bertaniブロス(抗生物質なし)などの滅菌非選択培地2 mL中の滅菌ループを使用して、単一の単離精製ARコロニーを無菌的に接種し、37°Cで80rpmで一晩インキュベートします。
- 100〜150 μLの一晩培養培養物(約OD600 = 1.8-2.0)を2 mLの新鮮な非選択的Luria-Bertaniブロス培地に取り、2〜4時間インキュベートします(OD600 が0.4〜0.5に達するまで)。
- 培養液の密度が0.5マクファーランド標準(約OD600 = 0.1)に等しくなるように、滅菌0.85%生理食塩水を使用してこの新たに成長した培養懸濁液を希釈し、これはおよそ1〜2 ×10 8 細胞/ mLに相当します。
- 均一な細胞分布のために細菌懸濁液を穏やかに混合する。
- 上記の懸濁液は、希釈から15分以内に使用してください。.
- 寒天プレートの接種
- 1,000 mLの二重蒸留水にMHA38 gを混合してASTを行うためのミューラーヒントン寒天培地(MHA)プレートを準備し、加熱して溶解します。溶解した混合物を121°C、15psiで15分間オートクレーブします。
- プレート内のMHAの深さが4 mm(プレートあたり25 mLの培地)であることを確認します。
- 同時に、抗生物質ディスクを冷凍庫から取り出し、室温まで温めます。
注意: 抗生物質ディスクは、最初に4°Cでディスクを解凍し、その後室温で解凍して徐々に解凍し、ディスク上の結露の潜在的な危険性を減らす必要があります。 - 無菌条件下で、滅菌綿棒をステップ4.1で調製した接種材料に浸し、プレートの過剰接種を避けるために余分な懸濁液を取り除きます。
- MHAプレートの上部から始めて、端から端まで前後に培養液をプレートに均等に広げます。拭き取りながらプレートを60°回転させます。
- 抗生物質ディスクの応用
- 火炎滅菌された鉗子の助けを借りて、抗生物質ディスクを接種されたMHAプレートに無菌的に移し、ディスクを軽く押して寒天との完全な水平接触を確保します。
注:この手順は、プレート上の培養物の接種から15分以内に行わなければなりません。 - 阻害ゾーンの重なりを避けるために、生物、使用する抗生物質、およびプレートのサイズを考慮して、適切な数の抗生物質ディスクを寒天プレートに配置します。
注意: 90mmの円形プレートに4〜5枚のディスクを収容できます。
- 火炎滅菌された鉗子の助けを借りて、抗生物質ディスクを接種されたMHAプレートに無菌的に移し、ディスクを軽く押して寒天との完全な水平接触を確保します。
- プレートのインキュベーション
- 抗生物質ディスクの適用から15分以内に、プレートを反転させ、37°Cで一晩インキュベートします。
- 結果の解釈
- ZOI の直径をミリメートル (mm) 単位で測定し、EUCAST11 で指定されたブレークポイント値に従って解釈します。以下の2つの例を参照してください。
- エンテロバクテラレスのシプロフロキサシン系抗生物質ディスク(5μg)のゾーン直径ブレークポイント(mm)はS ≥ 25およびR < 22であり、これはZOIが25mm≥場合は感度(S)であると見なされ、ZOIが22mmの場合は耐性(R)である<であることを意味します。ZOI直径が22〜25の場合、分離物は中間(I)と見なされます。
- ブドウ球菌属のクロラムフェニコール系抗生物質ディスク(30μg)のゾーン直径ブレークポイント(mm)はS ≥ 18およびR < 18であり、ZOIが18 mmであれば感度がある≥、ZOIが18 mm<場合は耐性があると考えられます。
- 分離株が曝露される抗生物質の総数に対する分離株が耐性である抗生物質の数の比率を見つけることにより、複数の抗生物質耐性(MAR)指数を決定します。
注:品質管理のために、 大腸菌 ATCC 25922および S。 黄色ブドウ球菌 ATCC 29213は、ステップ4のようなプロトコルに従って参照株として使用されます。
- ZOI の直径をミリメートル (mm) 単位で測定し、EUCAST11 で指定されたブレークポイント値に従って解釈します。以下の2つの例を参照してください。
5. PCRによる分離株中の抗生物質耐性遺伝子の検出
- 分離株中のARGの同定には、標準的なPCRプロトコルを使用してください。ステップ3.1で与えられたプロトコルを使用してDNAテンプレートを準備します。
注:この研究で使用されたPCRサイクル条件は、94°Cで10分間、続いて94°Cで30秒間の35サイクル、適切な温度で30秒間のアニーリング(各プライマーセットで標準化)、72°Cで40秒間の伸長、および72°Cで5分間の最終延長でした。反応混合物を 表4に記載する。ARG、プライマー、およびアニーリング温度のリストを 表5に示します。 - アンプリコンの純度を分解、視覚化、および確認するには、手順3.2.3〜3.2.10に従います。
6.細菌全体の多様性の同定とメタゲノム中のARGの検出のための全メタゲノムDNA分析
- 水サンプルからの全DNA(メタゲノム)の抽出
- ろ過された水サンプルからメタゲノムDNAを抽出します。
注:現在の研究では、メタゲノムDNA(総DNA)は、製造元のプロトコルに従って参照されたDNA分離キットを使用して、ろ過された水サンプルから抽出されました( 材料の表を参照)。 - 抽出したメタゲノムDNA3 μLを0.8%アガロースゲルにロードしてDNAの品質を確認し、ゲルを80-110 Vで約30分間実行します。
- 単一の無傷のバンドの存在を確認します。
- 蛍光光度計を使用してDNA濃度を確認します。
- ろ過された水サンプルからメタゲノムDNAを抽出します。
- 全メタゲノムDNAシーケンシングを用いた細菌多様性の決定とARGの検出
- ライブラリ調製とPCR増幅:
- 参照されているDNAライブラリ調製キットを使用して、ペアエンドシーケンシングライブラリを調製します(材料表を参照)。
- 200 ngのDNAを採取し、それを機械的に小さな断片にせん断した後、3'末端に「A」を追加するエンドリペアの連続ステップを行うことにより、アダプターライゲーション用のDNAを準備します。
- シーケンシングに使用するプラットフォームに応じて、DNA断片の両端に特定のアダプターをライゲーションします。
注:シーケンスのためにデュアルバーコードライブラリをフローセルにバインドするために重要なシーケンスは、これらのアダプターに存在します。これにより、アダプターライゲーションフラグメントのPCR増幅と標準シーケンシングプライマーの結合が可能になります。 - 品質と量を確認するには、製造元の指示に従って、高感度DNAチップを使用して増幅ライブラリを分析します。
- クラスターの生成と順序付け:
- 増幅されたライブラリを適切なシーケンシングプラットフォームにロードして、クラスター生成とその後のシーケンシングを行います。
注:ライブラリ分子は、ペアエンドフローセル上の相補的なアダプターオリゴに結合します。シーケンシング中、順鎖は、逆鎖の再合成後に選択的に切断される。次いで、このコピーされた逆鎖は、フラグメントの反対側の端部から配列決定される。
- 増幅されたライブラリを適切なシーケンシングプラットフォームにロードして、クラスター生成とその後のシーケンシングを行います。
- バイオインフォマティクス解析:
- 適切なプラットフォームを使用して、高品質のデータからスキャフォールドを生成します。
- これらの足場を、分類学的分類とARGの同定のためのバイオインフォマティクス分析にかけます。
注:細菌全体の多様性の同定とメタゲノム中のARGの検出のためのメタゲノムDNA分析全体のワークフローを 図1に示します。原稿に記載されている完全な方法論のフローシートを 図2に示します。
- ライブラリ調製とPCR増幅:
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Representative Results
総細菌量と抗生物質耐性(AR)細菌数
総細菌負荷の列挙は、水サンプルの10−4〜10−6倍希釈をR2A寒天培地上に広げることによって行った。AR細菌数の列挙のために、抗生物質を含む培地プレート上に10−3〜10−6倍希釈を広げました(図3)。総菌数とAR菌数をCFU/mLとして計算し、すべてのめっき実験を重複して実施した。上記のプロトコルに従って、本研究では、総細菌数が3.0 ×10 9 CFU / mLであることが示されました。AR細菌負荷は、9.6 × 10 5-1.2 ×10 9 CFU / mLの範囲で高いことがわかりました(表6)。
16S rRNA遺伝子シーケンシングによる培養可能細菌の同定
各単離物からの粗DNAを鋳型として使用し、16S rRNA遺伝子特異的PCRを行った。配列決定された合計15のAR分離株のうち、10は腸内細菌科に属し、ほとんどが大腸菌と肺炎桿菌でした。 コマモナス科に属するコマモナス属、ミクロコッカス属、アルスロバクター属などのまれな日和見細菌。 ミクロコッカス科に属する、およびアエロモナス科に属するアエロモナス属も水試料から同定された(表7)。
抗生物質感受性試験を用いた培養細菌の抗生物質耐性の検出
上記同定された分離株の抗生物質耐性プロファイルは、ディスク拡散法を用いてASTを行うことによって生成された(図4)。テストされた15の分離株のうち、8つは≥0.2のMARインデックスを持ち、高度の耐性を示しています。さらに、分離株の多くは共耐性プロファイル(同じ抗生物質セットに対する耐性)を示しました。しかし、 コマモナス 属や アルスロバクター 属などの分離株は、試験した抗生物質のいずれに対しても耐性を示さなかった(表8)。
培養細菌における抗生物質耐性遺伝子の検出と同定
合計10個のAR分離株をPCRを用いてARGの存在についてスクリーニングした。培養可能な分離株で最も一般的なARGは、β-ラクタマーゼをコードする blaTEMであり、次にアミノグリコシド耐性遺伝子 aadAが続きました。他の増幅されたARGは blaCTX-M、 dfr1、および aac(6')-Ib であり、それぞれβ-ラクタム、トリメトプリム、およびアミノグリコシドに対する耐性を付与しました。ARGの増幅の代表的な結果を 図5に示す。同定された分離株のほとんどについて、表現型耐性(AST)は、PCRベースの遺伝子型ARプロファイリング を介して 分子レベルで確認されました。
メタゲノムDNAにおける細菌全体の多様性の同定
すべての可能な細菌(培養可能および非培養可能の両方)の存在を確認し、それらの相対的な存在量を特定するために、細菌全体の多様性についてメタゲノムDNA分析を実施しました。ハイスループット次世代シーケンシング(HT-NGS)アプローチを使用すると、全シーケンスリードの~96.94%が得られ、高いカバレッジが得られました。分類学的アノテーションは、リードを門から属レベルまでの異なる分類群に分類するために実施された(図6および図7)。メタゲノムには合計50門が同定され、水サンプル中の細菌の多様性が高いことを示しています。プロテオバクテリアは、アルファプロテオバクテリア、ベータプロテオバクテリア、およびガンマプロテオバクテリアのクラスからなる最も支配的な門でした。注文レベルでは、バークホルデリアレスが最も一般的な注文であり、ベータプロテオバクテリアクラスに属していました。 シュードモナス、アシネトバクター、ペドバクター、プロステコバクター、リムノハビタンス、フラボバクテリウム、およびコマモナスは、水サンプルに見られる豊富な属の一部でした。
メタゲノムDNAからのARGの検出
水サンプルのメタゲノム中のARGの総プールを理解するために、メタゲノムシーケンス全体を実行し、続いて適切なバイオインフォマティクスツールを使用してARGを同定しました。メタゲノムアプローチにより、サンプル中の培養可能な微生物と培養不可能な微生物の両方に存在するARGが検出されます。βラクタムに対する耐性を付与する様々な遺伝子(SMB-1、ampC1、VIM-20、ccrA、nmcR、ARL-1、blaZ)。アミノギルコシド(AAC(6')-34);キノロン類 (qnrS6, qnrVC5);抗生物質排出ポンプ-抵抗性-結節性-細胞分裂(RND)(evgA、mtrA、mdtA、acrD)、ATP結合カセット(ABC)(oleC、macB、patA、bcrA)、および主要なファシリテータースーパーファミリー(MFS)(abaQ); トリメトプリム耐性ジヒドロ葉酸レダクターゼ(dfrD、dfrA20);リファンピンホスホトランスフェラーゼ(rphB);クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)(catB10)がメタゲノムで検出されました。培養可能な分離株(blaTEM、blaCTX-M、aadA、aac(6')-Ib、dfr1)でPCRを介して検出されたARGは、全メタゲノムシーケンシングによっても検出され、水サンプル中の存在が確認されました。全メタゲノムDNA解析を用いてメタゲノム中で同定されたARGの代表的な結果を表9に示す。
図1:メタゲノムDNA全体の解析ワークフロー。 細菌全体の多様性を同定し、メタゲノムからARGを検出するための段階的なワークフローが提示されます。全体的なステップには、メタゲノムDNAの準備、増幅、および同定が含まれます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:完全な方法論のフローシート。 本研究で用いた方法論の段階的ワークフロー。培養ベースと非培養ベースの両方の技術を組み合わせて、細菌の多様性と水サンプルに存在するARGの同一性に関する完全な情報を取得します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:抗生物質含有R2A寒天培地、改変プレート上の単離されたコロニーの代表的な画像。 セフォタキシム(3 μg/mL)含有R2A寒天培地、修正プレートにプレーティングした水サンプル。サンプルを連続希釈し、重複A1、A2:10−4でメッキしました。B1, B2: 10−5;C1, C2: 10−6.適切なインキュベーション期間の後、単離されたコロニーはB1、B2、C1、およびC2プレート上に見えました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:椎間板拡散法による抗生物質感受性試験。大腸菌分離株のディスク拡散法によるASTの代表的な画像。ASTは重複A1、A2で実行されました:CTX、IPM、C、CIP;B1、B2:LE、TGC、AMP、GEN;C1, C2: TR, N, K, CTR.ZOIの直径はミリメートル(mm)で測定されました。分離株が使用された抗生物質に耐性があるか感受性であるかを解釈するために、ZOIを最新のEUCAST表と比較した。略語:AST =抗生物質感受性試験;CTX =セフォタキシム;IPM = イミペネム;C =クロラムフェニコール;CIP =シプロフロキサシン;LE =レボフロキサシン;TGC =チゲサイクリン;AMP =アンピシリン;GEN =ゲンタマイシン;TR =トリメトプリム;N =ネオマイシン;K =カナマイシン;CTR =セフトリアキソン;ZOI =阻害ゾーン;EUCAST = 抗生物質感受性試験に関する欧州委員会。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:培養細菌由来の抗生物質耐性遺伝子のPCR増幅。 PCR後のアガロースゲル電気泳動は、増幅されたバンドの可視化のために実施され、分離株中のARGの存在を確認しました。PCRアンプリコンの分離されたバンドがゲル上に見られます。個々のPCRアンプリコンのサイズを適切なDNAマーカーと比較します。レーンL1:100 bp DNAラダー;レーン 1-5: 1: dfr1 (425 bp);レーン2: ブラテム (310 bp);レーン 3: blaCTX-M (500 bp);レーン 4: aac(6')-Ib ( 395 bp);レーン5: aadA (624 bp)。略称:ARGs = 抗生物質耐性遺伝子。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:門レベルとクラスレベルの分類学的分類 。 (A)水試料中の細菌メタゲノムの門レベルの分類学的存在量分布を示す棒グラフ。メタゲノム解析により合計50の細菌門が同定された。細菌の最初の12の優勢な門が示されています。(B)水サンプル中の細菌メタゲノムのクラスレベルの分類学的存在量分布を示す棒グラフ。メタゲノム解析により、合計50の細菌クラスが同定されました。細菌の最初の15の優勢なクラスが示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:順序と属レベルの分類学的分類 。 (A)水試料中の細菌メタゲノムの分類学的存在量分布を次数で示す棒グラフ。メタゲノム解析により合計50の細菌オーダーが同定された。細菌の最初の14の優勢な順序が図に示されています。(B)水試料中の細菌メタゲノムの属レベルの分類学的存在量分布を示す棒グラフ。メタゲノム解析により合計50の細菌属が同定された。細菌の最初の15優勢な属が図に示されている。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| PCR試薬 | 容量(μL) |
| 2x Taq Master Mix | 20 |
| フォワードプライマー(10ピコモル) | 1.5 |
| リバースプライマー(10ピコモル) | 1.5 |
| 粗 DNA テンプレート | 1.5 |
| 滅菌分子生物学用水 | 15.5 |
| 総量 | 40 |
表1:PCRマスターミックス成分。 各種PCR試薬の反応混合物組成。
| 方向 | プライマー配列 5' – 3' | PCR条件 | サイクル数 |
| フォワード | ガグキャグキャグガット | 94°Cで10分間 | 1 |
| 94°Cで30秒間の変性 | 35 | ||
| 50°Cで30秒間アニーリング | |||
| 72°Cで40秒間延長 | |||
| 逆 | CTACCGGGGTATCTAATCC | 72°Cで5分間の最終延長 | 1 |
表2:16S rRNA遺伝子の増幅のためのPCRサイクル条件。 16S rRNA遺伝子増幅に必要なPCRサイクル条件を示す。ステップには、最初の変性ステップ、それに続く35サイクルの変性、アニーリング、伸長、および最後の伸長ステップが含まれます。
| 6xローディングジェル | |
| 内容 | 量 |
| ブロモフェノールブルー | 25ミリグラム |
| 85%グリセロール | 7.06 ミリリットル |
| ミリQ水 | 2.94ミリリットル |
| 総量 | 10ミリリットル |
| 50x トリスアセテート-EDTA(TAE)ストックバッファー組成物 | |
| 内容 | 量 |
| トリスベース | 242 g、700 mLの二重蒸留水 |
| 氷酢酸(GAA) | 57.1 ミリリットル |
| 0.5 M (EDTA) pH 8.0 | 100ミリリットル |
| pHを8.5に調整し、二重蒸留水で容量を1000mLに補います | |
| 1x TAE の場合: 20 mL の 50x TAE バッファー + 980 mL の二重蒸留水 | |
表3:6xゲルローディングバッファーおよび50xトリスアセテート-EDTAストックバッファーの組成。 6xゲルローディングバッファーをサンプルと混合し、アガロースゲル電気泳動で実行します。追跡色素としてブロモフェノールブルーが含まれています。グリセロールは、ウェルへの適切なローディングのためにロードされるサンプルの密度を増加させます。50xTAEストックバッファーの調製に必要な各種試薬の組成も示されています。TAEバッファーはAGEに使用される最も一般的なバッファーの1つであり、pHを8.5に維持し、AGE中に増幅されたDNAの移行を可能にします。略語:TAE =トリスアセテート-EDTA;AGE = アガロースゲル電気泳動。
| PCR試薬 | 容量(μL) |
| 2x Taq Master Mix | 5 |
| フォワードプライマー(10ピコモル) | 0.5 |
| リバースプライマー(10ピコモル) | 0.5 |
| 粗 DNA テンプレート | 1.5 |
| 滅菌分子生物学グレードの水 | 2.5 |
| 総量 | 10 |
表4:ARGの同定のためのPCRマスターミックス組成物。 PCR実験を行うために必要な各種PCR試薬の反応混合物組成物。
| シニア番号 | 標的遺伝子 | への抵抗 | 入門 | プライマー配列(5'-3') | アンプリコンサイズ(bp) | 焼鈍温度(°C) | 参照 | ||||
| 1 | ティッカーある | トリメトプリム | フォワード | TGGTAGCTATATC ガガートガット |
425 | 59 | ラセヴィチら, 19 | ||||
| 逆 | TATGTTAGAGGCG AAGTCTTGGGTA |
||||||||||
| 2 | ブラテム | β – ラクタム | フォワード | GCACGAGTGGG タカッガ |
310 | 60 | ゲブレイエス、タクール20 | ||||
| 逆 | GGTCCTCCGAT CGTTGTCAG |
||||||||||
| 3 | blaCTX-M | β – ラクタム | フォワード | CGATGGGACG ATGTCACTG |
500 | 52 | 李ら 21 | ||||
| 逆 | CGGCTTTCTG CCTTAGGTT |
||||||||||
| 4 | aac(6')-Ib | アミノグリコシド | フォワード | タトガググ TAAATCGAT |
395 | 50 | エイカーズら 22 | ||||
| 逆 | CCCGCTTTCT グタグカ |
||||||||||
| 5 | アードある | アミノグリコシド | フォワード | ACCGTAAGGC TTGATGAAACA |
624 | 58 | チェシエルチュク 23 | ||||
| 逆 | GCCGACTACC TTGGTGATCTC |
||||||||||
表5:培養細菌におけるARGのPCR用プライマー。 本研究で使用されたさまざまなARGを、それぞれのプライマー配列とともに示します。アンプリコンの予想されるサイズは塩基対で与えられる。各プライマーセットのアニーリング温度も記載される。
| 抗生物質 | 抗生物質の濃度 (μg/mL) | CFU/mL |
| - | - | 3.0×109 |
| ティッカー | 3 | 4.5×107 |
| ティッカー | 0.5 | 3.2×108 |
| K | 15 | 9.6×105 |
| E | 20 | 1.6×108 |
| バージニア州 | 3 | 1.2×109 |
表6:総菌数と抗生物質耐性菌数。 5つの抗生物質を、水サンプルからの抗生物質耐性菌の初期分離に使用しました。総細菌数(抗生物質なし)およびAR細菌数は、ミリリットルあたりのコロニー形成単位(CFU / mL)で表されます。略語:AR =抗生物質耐性;CFU =コロニー形成単位;CTX =セフォタキシム;CIP =シプロフロキサシン;K =カナマイシン;E =エリスロマイシン;VA =バンコマイシン。
| コードの分離 | 微生物 | 家族 |
| 1 | 大腸菌 | 腸内細菌科 |
| 2 | 大腸菌 | 腸内細菌科 |
| 3 | 大腸菌 | 腸内細菌科 |
| 4 | 大腸菌 | 腸内細菌科 |
| 5 | 大腸菌 | 腸内細菌科 |
| 6 | 大腸菌 | 腸内細菌科 |
| 7 | 肺炎桿菌 | 腸内細菌科 |
| 8 | 肺炎桿菌 | 腸内細菌科 |
| 9 | 肺炎桿菌 | 腸内細菌科 |
| 10 | 肺炎桿菌 | 腸内細菌科 |
| 11 | コマモナス属 | コマモナス科 |
| 12 | コマモナス属 | コマモナス科 |
| 13 | ミクロコッカス属。 | ミクロコッカス科 |
| 14 | アルスロバクター属。 | ミクロコッカス科 |
| 15 | アエロモナス属 | アエロモナス科 |
表7:16S rRNA遺伝子シーケンシングによる抗生物質耐性分離株の同定。 コロニーPCRは、16S rRNA遺伝子特異的プライマーを用いて各単離物について行った。次に、得られたアンプリコンを配列決定し、適切なバイオインフォマティクスツールを使用して同定した。
| 分離番号 | 隔離する | ティッカー | アンプ | ル | C | ティッカー | クリック率 | ティッカー | 世代 | N | ティッカー | ティッカー | 台無しにする | 3月インデックス | ||
| 1 | 大腸菌 | 13R | 0R | 0R | 28秒 | 23秒 | 11R | 39秒 | 20代 | 18秒 | 0R | 0R | 6 | 0.5 | ||
| 2 | 大腸菌 | 31秒 | 0R | 12R | 29秒 | 23秒 | 32秒 | 37秒 | 19秒 | 16秒 | 0R | 14R | 4 | 0.4 | ||
| 3 | 大腸菌 | 14R | 0R | 14R | 14R | 21秒 | 10R | 34秒 | 17秒 | 11R | 24秒 | 16R | 7 | 0.6 | ||
| 4 | 大腸菌 | 28秒 | 13R | 18R | 26秒 | 21秒 | 28秒 | 32秒 | 16R | 11R | 24秒 | 19R | 5 | 0.4 | ||
| 5 | 大腸菌 | 11R | 0R | 12R | 26秒 | 21秒 | 10R | 31秒 | 17秒 | 16秒 | 22秒 | 11R | 5 | 0.4 | ||
| 6 | 大腸菌 | 27秒 | 0R | 12R | 12R | 22秒 | 30代 | 32秒 | 19秒 | 11R | 0R | 14R | 6 | 0.5 | ||
| 7 | 肺炎桿菌 | 28秒 | 0R | 17R | 27秒 | 22秒 | 30代 | 32秒 | 18秒 | 22秒 | 0R | 16R | 4 | 0.4 | ||
| 8 | 肺炎桿菌 | 29秒 | 11R | 26秒 | 24秒 | 22秒 | 30代 | 28秒 | 17秒 | 16秒 | 24秒 | 23秒 | 1 | 0.1 | ||
| 9 | 肺炎桿菌 | 29秒 | 13R | 25秒 | 24秒 | 22秒 | 28秒 | 29秒 | 18秒 | 17秒 | 24秒 | 25秒 | 1 | 0.1 | ||
| 10 | 肺炎桿菌 | 33秒 | 14秒 | 26秒 | 28秒 | 22秒 | 31秒 | 32秒 | 19秒 | 20代 | 24秒 | 29秒 | 0 | 0 | ||
| 11 | コマモナス属 | - | - | - | 23秒 | - | - | 37秒 | - | - | - | - | 0 | 0 | ||
| 12 | コマモナス属 | - | - | - | 27秒 | - | - | 42秒 | - | - | - | - | 0 | 0 | ||
| 13 | ミクロコッカス属。 | 25秒 | 17R | 24秒 | 32秒 | 22秒 | 34秒 | 28秒 | 20代 | - | 21秒 | 26秒 | 1 | 0.1 | ||
| 14 | アルスロバクター属。 | 45秒 | 57秒 | 28秒 | 26秒 | 34秒 | 27秒 | 39秒 | 26秒 | - | 28秒 | 28秒 | 0 | 0 | ||
| 15 | アエロモナス属 | - | - | 20R | - | - | - | - | - | - | - | 20R | 2 | 1 | ||
表8:ASTによって分析された細菌分離株の抗生物質耐性表現型。 単離株中の表現型耐性は、ディスク拡散法を用いて分析した。数字はZOIをミリメートル(mm)で示しています。MARインデックスの場合、数字は分離株が耐性のある抗生物質の総数を示します。略語:AST =抗生物質感受性試験;CTX =セフォタキシム;AMP =アンピシリン;LE =レボフロキサシン;C =クロラムフェニコール;TGC =チゲサイクリン;CTR =セフトリアキソン;IPM = イミペネム;GEN =ゲンタマイシン;N =ネオマイシン;TR =トリメトプリム;CIP =シプロフロキサシン;R =耐性;S =敏感です。MAR =複数の抗生物質耐性;ZOI =阻害ゾーン。
| AMR遺伝子ファミリー | 遺伝子 |
| SMBベータラクタマーゼ | SMB-1 |
| ampC型β-ラクタマーゼ | アンプC1 |
| VIMベータラクタマーゼ | VIM-20 |
| CcrAベータラクタマーゼ | ティッカー |
| NmcAβ-ラクタマーゼ | nmcR |
| ARLベータラクタマーゼ | アルル-1 |
| blaZβ-ラクタマーゼ | ブラズ |
| blaTEMベータラクタマーゼ | ブラテム* |
| blaCTXベータラクタマーゼ | ブラCTX |
| AAC(6') | aac(6')-Ib, aac(6')-34 |
| アリ(3インチ) | アーダ |
| キノロン耐性タンパク質(QNR) | qnrS6, qnrVC5 |
| 抵抗性結節細胞分裂(RND)抗生物質排出ポンプ | evgA, mtrA, mdtA, acrD |
| ATP結合カセット(ABC)抗生物質排出ポンプ | oleC, macB, patA, bcrA |
| 主要なファシリテータースーパーファミリー(MFS)抗生物質排出ポンプ | アバク |
| トリメトプリム耐性ジヒドロ葉酸レダクターゼDFR | dfr1, dfrD, dfrA20 |
| リファンピンホスホトランスフェラーゼ | ティッカー |
| ウンデカプレニルピロリン酸関連タンパク質 | ティッカー |
| メチシリン耐性PBP2 | メックD |
| バンJ膜タンパク質 | バンJ |
| テトラサイクリン耐性リボソーム保護タンパク質 | tetT |
| クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT) | カテゴリB10 |
| Erm 23SリボソームRNAメチルトランスフェラーゼ | えーと(37) |
| 糖ペプチド耐性遺伝子クラスター | vanRB, vanRE, vanRD |
| MCRホスホエタノールアミントランスフェラーゼ | MCR-9 |
| スルホンアミド耐性スル | スル3 |
| *下線は培養可能な微生物からも遺伝子が検出されました | |
表9:全メタゲノムDNA分析を使用して同定されたARG。 水サンプルの全メタゲノムを全メタゲノムシーケンシングに使用し、得られた配列を適切なARGデータベースを使用してアノテーションしました。メタゲノムDNAで同定された重要なARGのいくつかの代表的な結果が示されています。下線の遺伝子は、培養可能な微生物でも検出されました。略称:ARG =抗生物質耐性遺伝子。
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Discussion
サンプルの収集と処理は重要な役割を果たし、研究の結果と解釈に影響を与える可能性があります。したがって、サンプルの変動性を排除するには、調査対象の淡水域の複数の場所でサンプリングを実行することが重要です。このようなサンプルを取り扱う際に適切な無菌環境条件を維持することで、汚染を防ぐことができます。さらに、抽出された核酸の質と量に影響を与える可能性のある細菌組成の変化を防ぐために、通過条件は4°Cに維持され、サンプル収集の時点からその後の処理までの時間経過を最小限に抑える必要があります。いくつかの研究は、サンプルの収集と処理の間のこの中間期間が、慎重に行われない場合、分析の後の段階でさまざまな結果をもたらす可能性があることを強調しています12,13。
めっきにさまざまな希釈液を使用することで、コロニーが凝集したり、コロニーが少なすぎて数えられないことが保証されます。ピペッティング/ハンドリングエラーによって発生する可能性のあるCFU/mLの変動を考慮するには、実験を重複して実行する必要があります。さらに、使用される抗生物質が効果的に機能し、偽陽性の結果が排除されるように、すべての実験でコントロールプレートが維持されます。したがって、コントロールプレートには目に見えるコロニーの成長があってはなりません。これは、使用される抗生物質の有効性を示しています。
AST中、接種材料培養密度と寒天プレートの厚さは、ZOIの直径、ひいては結果の解釈に影響を与える可能性があります。したがって、AST実験を行う際には、これら2つの要素を均一に保つように注意する必要があります。最も重要な側面は、接種材料に存在する細菌細胞の数です。一般に、1 × 108-2 ×10 8 CFU / mLの細胞が接種材料として使用され、これは0.5マクファーランド標準14に相当します。接種材料のこの濃度は、結果の変動を避けるために一定に保つ必要があります。必要濃度より高いまたは低い濃度は、滅菌生理食塩水の助けを借りて希釈し、15分以内に直ちに接種に使用する必要があります。寒天プレートに接種材料を広げる間、過剰な量の接種材料を避けるように注意する必要があります。MHAプレートに接種する前に、細菌懸濁液チューブの側面にある綿棒を押すことで、余分な接種材料を取り除くことができます。標準的なAST手順からの逸脱は、そのようなプロトコル11、15から得られるデータに大きな影響を与える可能性があります。以前の研究では、MARインデックス値≥0.2は、分離株16の耐性が高いことを示していることが示されました。ASTの結果の解釈はZOIに基づいているため、培養物の接種不足または過剰接種は避ける必要があります。
PCRでは、マスターミックスをアイスブロック上で調製して、成分の分解と酵素の活性の損失の可能性を最小限に抑える必要があります。反応を設定する際に手袋を着用すると、外部汚染の可能性が最小限に抑えられます17。AGE中の電圧は、加熱効果や負荷されたサンプルの劣化につながる可能性があるため、高すぎてはいけません。AGEを最適な電圧で実行すると、バンドが十分に分離され、ドラッグや汚れの影響なしにシャープになります。
過去数十年間に実施された研究では、さまざまな微生物の同定に16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンシングを使用することが実証されています。16S rRNA遺伝子シーケンシングの場合、鋳型DNAの抽出方法の選択はバイアスを引き起こす可能性があり、それがダウンストリーム分析に影響を与える可能性があります。グラム陽性菌はペプチドグリカン細胞壁が厚いため、核酸の抽出が困難になる可能性があります。したがって、抽出方法の選択は、それがすべての種類の微生物DNAを効果的に捕捉するようなものでなければなりません。粗い鋳型DNAを抽出する従来の煮沸法は、細胞の内容物を抽出するためのそのような効率的な方法の1つであり、したがって結果の偏りを減らす。
水域の完全な細菌群集を理解するために、この研究ではハイスループット次世代シーケンシング(HT-NGS)技術が使用されました。全メタゲノムDNA分析により、特定のサンプルのメタゲノム全体を研究できます。培養ベースの技術は、主に細菌負荷の好気性カウントを与え、サンプルの微生物学的品質を示します。しかし、培養可能な微生物は全微生物の1%しか占めていません。嫌気性菌を含む多様な種を含む残りの微生物叢は、特徴が不十分であり、しばしば無視されます。これらの微生物はAR形質を持っている可能性があります。さらに、共生微生物は、様々な遺伝子交換事象を介して病原体に伝達され得るAR遺伝子の貯蔵庫である18。これらの共生の多くは非培養可能であり、HT-NGSを含むメタゲノムアプローチによって研究することができ、あらゆるサンプル中の多様な微生物叢の同定のためのより大きなカバレッジを提供します。メタゲノム解析を使用して、細菌分類群の詳細なプロファイルが得られ、培養可能なデータを補完しました。さらに、このような補完的なアプローチは、調査中の水域の全体的なAR状態のアイデアを提供することができます。
本研究では、従来の培養ベースと非培養ベースのメタゲノム技術の両方を組み合わせて、細菌の多様性全体、さまざまな抗生物質耐性菌、および水媒介ARGの総プールを特定することができました。この研究で説明されている方法論は、他の水源(沿岸水、天然水、人工飲料水)中のAR病原体の同定のために複製およびカスタマイズできます。また、水系院内病原体の感染を追跡したり、流し台、トイレ、浴槽、加湿器などの水源を介して病院や診療所での病院関連感染を監視したりするためにも使用できます。これは、AMRの監視と水ベースのAMRホットスポットの特定に役立ちます。
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Disclosures
著者は、開示する相反する利益を持っていません。
Acknowledgments
この作業は、ムンバイ大学の科学技術省-大学研究および科学的卓越性促進(DST-PURSE)スキームからの財政的助成金によって部分的に支援されました。Devika Ghadigaonkarは、このスキームの下でプロジェクトフェローとして働いていました。科学技術省科学技術研究委員会(DST-SERB)プロジェクト番号:CRG/2018/003624の上級研究員であるHarshali Shindeによる技術的支援が認められています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | Himedia | MBT049-50LN | For estimation of size of the amplicons |
| 2x PCR Taq mastermix | HiMedia | MBT061-50R | For making PCR reaction mixture |
| 37 °C Incubator | GS-192, Gayatri Scientific | NA | For incubation of bacteria |
| 6x Gel Loading Buffer | HiMedia | ML015-1ML | Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis |
| Agarose powder | Himedia | MB229-50G | For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Ampicillin antibiotic disc | HiMedia | SD002 | For performing AST |
| Autoclave | Equitron | NA | Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | NA | To check the quality and quantity of the amplified library |
| Bisafety B2 Cabinet | IMSET | IMSET BSC-Class II Type B2 | Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc. |
| Cefotaxime antibiotic disc | HiMedia | SD295E-5VL | For performing AST |
| Cefotaxime antibiotic powder | HiMedia | TC352-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Ceftriaxone antibiotic disc | HiMedia | SD065 | For performing AST |
| Centrifuge Minispin | Eppendorf | Minispin Plus-5453 | Used to pellet the debris during crude DNA preparation |
| Chloramphenicol antibiotic disc | HiMedia | SD006-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD060-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic powder | HiMedia | TC447-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Colorimeter | Quest | NA | For checking the OD of culture suspensions |
| Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database | functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/ | ||
| Cooling Shaker Incubator | BTL41 Allied Scientific | NA | For incubation of media plates for culturing bacteria |
| Deep Freezer (-40 °C) | Haier | DW40L, Haier Biomedicals | For storage of glycerol stocks |
| DNA Library Prep Kit | NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NA | Paired-end sequencing library preparation |
| EDTA | HiMedia | GRM1195-100G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Electrophoresis Apparatus | TechResource | 15 cm gel casting tray | For making the agarose gel and carrying out electrophoresis |
| Electrophoresis Power pack with electrodes | Genei | NA | For running the AGE |
| Erythromycin antibiotic disc | HiMedia | SD222-5VL | For performing AST |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | CMS528-1G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | TC024-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Escherichia coli ATCC 25922 | HiMedia | 0335X-1 | Used as a control while performing AST |
| Ethidium Bromide | HiMedia | MB071-1G | Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System |
| Fluorometer | Qubit 2.0 | NA | For determining concentration of extracted metagenomic DNA |
| Gel Documentation System | BioRad | Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis | |
| Gentamicin antibiotic disc | HiMedia | SD170-5x50DS | For performing AST |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS119-500ML | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Glycerol | HiMedia | GRM1027-500ML | For making glycerol stocks |
| Imipenem antibiotic disc | HiMedia | SD073 | For performing AST |
| Kaiju Database | NA | NA | For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/ |
| Kanamycin antibiotic disc | HiMedia | SD017-5x50DS | For performing AST |
| Kanamycin antibiotic powder | HiMedia | MB105-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Levofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD216-5VL | For performing AST |
| Luria Bertani broth | Himedia | M1245-500G | For enrichment of cultures |
| McFarland Standards | Himedia | R092-1No | To compare density of culture suspension |
| Molecular Biology water | HiMedia | TCL018-500ML | For making PCR reaction mixture |
| Mueller-Hinton Agar (MHA) | HiMedia | M173-500G | For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST) |
| Neomycin antibiotic disc | HiMedia | SD731-5x50DS | For performing AST |
| PCR Gradient Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz | Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes |
| Primers | Xcelris | NA | For PCR amplication |
| R2A Agar, Modified | HiMedia | M1743 | For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load |
| Scaffold generation | CLC Genomics Workbench 6.0 | NA | For generation of scaffolds |
| Sequencer | Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) | NA | Sequencing of amplified library |
| Sodium Chloride | HiMedia | TC046-500G | For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample |
| Soil DNA isolation Kit | Xcelgen | NA | For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 | HiMedia | 0365P | Used as a control while performing AST |
| Taxonomical Classification | Kaiju ioinformatics tool | NA | For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level |
| The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) | NA | NA | For functional annotation of ARGs |
| Tigecycline antibiotic disc | HiMedia | SD278 | For performing AST |
| Trimethoprim antibiotic disc | HiMedia | SD039-5x50DS | For performing AST |
| Tris base | HiMedia | TC072-500G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Vancomycin antibiotic powder | HiMedia | CMS217 | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Weighing Balance | Mettler Toledo | ME204 Mettler Toledo | Used for weighing media powders, reagent powders etc. |
| NA - Not Applicable |
References
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