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Bioengineering

मल्टी-स्ट्रीम छिड़काव बायोरिएक्टर गतिशील सेल संस्कृति के लिए आउटलेट विभाजन के साथ एकीकृत

Published: July 20, 2022 doi: 10.3791/63935
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2,3
1Department of Chemical and Biochemical Engineering, Rutgers University, 2Department of Biomedical Engineering, Rutgers University, 3Department of Medicine, Rutgers Biomedical Health Sciences

Summary

यह पेपर सेलुलर प्रक्रियाओं में विलेय के स्राव और अवशोषण दरों की गतिशीलता को मापने के लिए कम लागत वाली, मल्टीचैनल छिड़काव सेल संस्कृति प्रणाली के निर्माण और संचालन के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। सिस्टम गतिशील उत्तेजना प्रोफाइल के लिए कोशिकाओं को भी उजागर कर सकता है।

Abstract

कुछ सेल और ऊतक कार्य मिनटों से घंटों के गतिशील समय पैमाने के भीतर काम करते हैं जो पारंपरिक संस्कृति प्रणालियों द्वारा खराब रूप से हल किए जाते हैं। इस काम ने एक कम लागत वाली छिड़काव बायोरिएक्टर प्रणाली विकसित की है जो संस्कृति माध्यम को लगातार एक सेल संस्कृति मॉड्यूल में सुगंधित करने की अनुमति देती है और इस पैमाने पर गतिशीलता को मापने के लिए डाउनस्ट्रीम मॉड्यूल में विभाजित होती है। प्रणाली का निर्माण लगभग पूरी तरह से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध भागों से किया गया है और इसे एक साथ पारंपरिक बहु-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों में स्वतंत्र प्रयोगों का संचालन करने के लिए समानांतर किया जा सकता है। यह वीडियो आलेख प्रदर्शित करता है कि बेस सेटअप को कैसे इकट्ठा किया जाए, जिसके लिए समानांतर में छह संस्कृतियों को सुगंधित करने के लिए केवल एक एकल मल्टीचैनल सिरिंज पंप और एक संशोधित अंश कलेक्टर की आवश्यकता होती है। मॉड्यूलर डिज़ाइन पर उपयोगी वेरिएंट भी प्रस्तुत किए जाते हैं जो नियंत्रित उत्तेजना गतिशीलता की अनुमति देते हैं, जैसे कि विलेय दालें या फार्माकोकाइनेटिक जैसी प्रोफाइल। महत्वपूर्ण बात यह है कि विलेय संकेत प्रणाली के माध्यम से यात्रा करते हैं, वे विलेय फैलाव के कारण विकृत हो जाते हैं। इसके अलावा, MATLAB का उपयोग करके एक अनुरेखक के साथ छिड़काव सेटअप के घटकों के निवास समय वितरण (आरटीडी) को मापने के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। आरटीडी यह गणना करने के लिए उपयोगी हैं कि बहु-डिब्बे प्रणाली में प्रवाह से विलेय संकेत कैसे विकृत होते हैं। यह प्रणाली अत्यधिक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, इसलिए बुनियादी शोधकर्ता विशेष निर्माण सुविधाओं की आवश्यकता के बिना इसे आसानी से अपना सकते हैं।

Introduction

कई महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाएं सेल और ऊतक संस्कृतियों में मिनटों के टाइमस्केल पर 1,2,3 तक होती हैं। जबकि इनमें से कुछ घटनाओं को समय-चूक माइक्रोस्कोपी4, बायोल्यूमिनेसेंस1, या अन्य तरीकों का उपयोग करके स्वचालित फैशन में देखा और दर्ज किया जा सकता है, रासायनिक विश्लेषण के लिए संस्कृति सतह पर तैरनेवाला नमूनों के संग्रह से जुड़े प्रयोग अक्सर स्थिर सेल संस्कृतियों में मैन्युअल रूप से किए जाते हैं। मैनुअल नमूनाकरण लगातार या घंटों के बाद नमूना टाइमपॉइंट की असुविधा के कारण कुछ अध्ययनों की व्यवहार्यता को सीमित करता है। स्थैतिक संस्कृति विधियों की आगे की कमियों में रासायनिक उत्तेजनाओं के लिए नियंत्रित, क्षणिक जोखिम से जुड़े प्रयोग शामिल हैं। स्थैतिक संस्कृतियों में, उत्तेजनाओं को मैन्युअल रूप से जोड़ा और हटाया जाना चाहिए, और उत्तेजना प्रोफाइल समय के साथ चरण परिवर्तनों तक सीमित हैं, जबकि मध्यम परिवर्तन अन्य मध्यम घटकों को भी जोड़ते हैं और हटाते हैं, जो कोशिकाओं को अनियंत्रित तरीके से प्रभावित कर सकते हैं5. फ्लूइडिक सिस्टम इन चुनौतियों को दूर कर सकते हैं, लेकिन मौजूदा उपकरण अन्य चुनौतियां पेश करते हैं। माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस उत्पादन और उपयोग करने के लिए विशेष उपकरणों और प्रशिक्षण की निषेधात्मक लागतों के साथ आते हैं, नमूनों को संसाधित करने के लिए माइक्रोएनालिटिकल तरीकों की आवश्यकता होती है, और छिड़काव 6 के बाद कोशिकाओं को उपकरणों से पुनर्प्राप्त करना मुश्किलहोता है। यहां वर्णित प्रयोगों के प्रकार 7,8,9,10 के लिए कुछ मैक्रोफ्लुइडिक सिस्टम बनाए गए हैं, और वे घर में बने कई कस्टम भागों से बने हैं और कई पंप या अंश कलेक्टरों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, लेखकों को निलंबन संस्कृति के लिए उत्तेजित टैंक बायोरिएक्टरों के अलावा किसी भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मैक्रोफ्लुइडिक छिड़काव सेल संस्कृति प्रणालियों के बारे में पता नहीं है, जो बायोमैन्युफैक्चरिंग के लिए उपयोगी हैं, हालांकि मॉडलिंग और शरीर विज्ञान का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन नहीं किए गए हैं।

लेखकों ने पहले व्यावसायिक रूप से उपलब्ध भागों11 से लगभग पूरी तरह से बना कम लागत वाले छिड़काव बायोरिएक्टर सिस्टम के डिजाइन पर रिपोर्ट की थी। सिस्टम का आधार संस्करण एक अच्छी तरह से प्लेट में कई संस्कृतियों को सीओ2 इनक्यूबेटर में रखने में सक्षम बनाता है और लगातार एक सिरिंज पंप से माध्यम के साथ सुगंधित होता है, जबकि संस्कृतियों से प्रवाह मध्यम धाराओं को कस्टम संशोधन के साथ एक अंश कलेक्टर का उपयोग करके समय के साथ नमूनों में स्वचालित रूप से विभाजित किया जाता है। इस प्रकार, यह प्रणाली समय के साथ संस्कृतियों के लिए संस्कृति मध्यम सतह पर तैरनेवाला और निरंतर विलेय इनपुट के स्वचालित नमूने को सक्षम बनाती है। सिस्टम मैक्रोफ्लुइडिक और मॉड्यूलर है और उपन्यास प्रयोग डिजाइनों की जरूरतों को पूरा करने के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है।

यहां प्रस्तुत विधि का समग्र लक्ष्य एक छिड़काव सेल संस्कृति प्रणाली का निर्माण, लक्षण वर्णन और उपयोग करना है जो प्रयोगों को सक्षम बनाता है जिसमें समय के साथ कोशिकाओं द्वारा पदार्थों के स्राव या अवशोषण दर को मापा जाता है, और / यह वीडियो लेख बताता है कि बेस सेटअप को कैसे इकट्ठा किया जाए, जो एक एकल सिरिंज पंप और संशोधित अंश कलेक्टर का उपयोग करके एक साथ छह सेल संस्कृतियों को सुगंधित करने में सक्षम है। आधार प्रणाली पर दो उपयोगी वेरिएंट जो प्रयोगों की अनुमति देने के लिए अतिरिक्त पंपों और भागों का उपयोग करते हैं जो कोशिकाओं को क्षणिक विलेय एकाग्रता संकेतों को उजागर करते हैं, जिसमें संक्षिप्त दालों और फार्माकोकाइनेटिक जैसी प्रोफाइल12 शामिल हैं, भी प्रस्तुत किए जाते हैं, चित्रा 1 में दिखाया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: छिड़काव प्रणाली डिजाइन पर तीन विविधताएं( शीर्ष) बुनियादी छिड़काव प्रणाली। (मध्य) कई मध्यम स्रोतों के लिए एक स्टॉपकॉक के साथ छिड़काव प्रणाली। (नीचे) वितरण की एक अच्छी तरह से मिश्रित मात्रा की नकल करने के लिए एक उत्तेजित टैंक के साथ छिड़काव प्रणाली। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रवाह के भीतर फैलाव और प्रसार के कारण, विलेय संकेत विकृत या "धुंधला" हो जाते हैं क्योंकि वे प्रवाह प्रणाली के माध्यम से यात्रा करते हैं। इस विरूपण को निवास समय वितरण (आरटीडी) 13 के उपयोग के माध्यम से निर्धारित किया जा सकता है। यह आलेख बताता है कि छिड़काव प्रणाली (चित्रा 2) के घटकों पर अनुरेखक प्रयोग कैसे करें, और मापा डेटा से आरटीडी उत्पन्न करने के लिए MATLAB स्क्रिप्ट प्रदान करता है। इस विश्लेषण का एक विस्तृत विवरण लेखकों के पिछले पेपर11 में पाया जा सकता है। अतिरिक्त मैटलैब स्क्रिप्ट आरटीडी के लिए उपयुक्त कार्यों को फिट करती हैं और भौतिक मापदंडों को निकालती हैं, और आरटीडी का उपयोग करके सिग्नल कन्वोल्यूशन करती हैं ताकि यह अनुमान लगाया जा सके कि उपयोगकर्ता द्वारा विलेय सिग्नल इनपुट छिड़काव प्रणाली14 के माध्यम से कैसे प्रचारित और विकृत होगा।

Figure 2
चित्रा 2: निवास समय वितरण। प्रवाह प्रणाली घटकों के आरटीडी, जैसे कि ट्यूबिंग की इस लंबाई को सिस्टम में ट्रेसर की एक नाड़ी इनपुट करके मापा जाता है और यह मापता है कि यह एकत्र किए गए अंशों में बाहर निकलने तक "स्मीयर" कैसे होता है। इस आंकड़े को एरिक्सन एट अल 11 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Protocol

1. अच्छी तरह से प्लेट छिड़काव के लिए भागों तैयार करें

  1. ट्यूबिंग तैयार करें
    1. प्रत्येक सेल संस्कृति को सुगंधित करने के लिए सिलिकॉन ट्यूबिंग (1.6 मिमी आंतरिक व्यास) की दो लंबाई काटें। सुनिश्चित करें कि अपस्ट्रीम ट्यूबिंग के रूप में उपयोग किया जाने वाला टुकड़ा सिरिंज पंप से इनक्यूबेटर के अंदर सेल संस्कृति तक पहुंचने के लिए काफी लंबा है, और डाउनस्ट्रीम टुकड़ा सेल संस्कृति से अंश कलेक्टर की सबसे दूर विस्तारित स्थिति तक पहुंच सकता है।
    2. ट्यूबिंग के प्रत्येक टुकड़े को लेबल टेप के साथ अपने दोनों सिरों पर एक अद्वितीय लेबल दें।
  2. अच्छी तरह से प्लेट के लिए डाट तैयार करें
    1. अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं के लिए एक सिलिकॉन डाट प्राप्त करें, एक एयरटाइट सील के साथ कुओं में फिट होने के लिए एक उपयुक्त व्यास के साथ।
    2. स्टॉपर की बोतलों से अतिरिक्त सामग्री को काट लें ताकि वे इच्छित तरल स्तर से ऊपर हवा के लिए जगह छोड़ते हुए कुओं में फिट हो जाएं।
    3. कुएं के माध्यम से प्रवाह के लिए इनलेट और आउटलेट के रूप में सेवा करने के लिए प्रत्येक डाट के माध्यम से दो कुंद 18 जी सुइयों को ऊपर और बाहर धक्का दें, कुएं के भीतर उनकी युक्तियों के बीच की दूरी को अधिकतम करने के लिए एक दूसरे के विपरीत।
    4. प्लग किए गए कुएं के भीतर सुइयों की ऊंचाइयों को समायोजित करें, क्योंकि आउटलेट सुई की ऊंचाई छिड़काव के दौरान कुएं में तरल स्तर की स्थिर ऊंचाई निर्धारित करेगी।
      नोट: यदि छिड़काव तरल स्तर से ऊपर आउटलेट सुई के साथ शुरू किया जाता है, तो तरल कुएं में जमा हो जाएगा जब तक कि स्तर सुई तक नहीं पहुंच जाता। यदि छिड़काव तरल स्तर के नीचे आउटलेट सुई के साथ शुरू किया जाता है, तो तरल स्तर स्थिर रहेगा जब तक कि हवा के बुलबुले कुएं में प्रवाहित नहीं होते हैं, जिससे तरल ऊंचाई कम हो जाएगी जब तक कि यह आउटलेट सुई के समान ऊंचाई न हो।
  3. अतिरिक्त भागों को इकट्ठा करें
    1. प्रत्येक सेल संस्कृति के लिए एक बाँझ सिरिंज प्राप्त करें जो पूरे छिड़काव के लिए पर्याप्त माध्यम रखने के लिए पर्याप्त बड़ा है, साथ ही शुरू में ट्यूबिंग को भरने के लिए माध्यम की एक अतिरिक्त मात्रा है।
    2. प्रत्येक संस्कृति को सुगंधित करने के लिए, एक मादा-टू-बार्ब और दो नर-टू-बार्ब लुअर कनेक्टर्स, साथ ही दो मादा और दो पुरुष लुएर कैप प्राप्त करें।
  4. भागों को साफ और निष्फल करें
    1. यदि भागों का उपयोग पहले किया गया है, तो उन्हें 0.1 एन एनएओएच के साथ सुगंधित करके साफ करें, इसके बाद विआयनीकृत पानी के साथ कुल्ला करें।
    2. आटोक्लेविंग या अन्यथा, ऊपर सूचीबद्ध सभी भागों की बाँझपन सुनिश्चित करें।

2. लेजर-कट मल्टी-हेड डिस्पेंसर और इसे एक अंश कलेक्टर से संलग्न करें

  1. कंप्यूटर एडेड डिज़ाइन प्रोग्राम में चित्रा 3 से मल्टी-हेड डिस्पेंसर मॉडल को फिर से बनाएं या प्रदान किए गए मॉडल डीएक्सएफ फ़ाइल (पूरक फ़ाइल 1) डाउनलोड करें।
  2. ऐक्रेलिक शीट में 1/8 से डिजाइन को काटने के लिए लेजर कटर का उपयोग करें।
  3. अंश कलेक्टर के चलती आधार पर वितरण सिर संलग्न तीन शिकंजा निकालें।
  4. चलती आधार में पेंच छेद के साथ मल्टी-हेड डिस्पेंसर में तीन सबसे छोटे छेद संरेखित करें, और संलग्न करने के लिए छेद के माध्यम से शिकंजा को वापस पेंच करें।
  5. मल्टी-हेड डिस्पेंसर को ऊपर और नीचे कोण करने के लिए तीन शिकंजा की जकड़न को समायोजित करें जब तक कि वितरण छेद की पंक्ति इसके नीचे संग्रह ट्यूबों के साथ संरेखित न हो जाए।
  6. ध्यान से वितरण युक्तियों के रूप में सेवा करने के लिए वांछित छेद के माध्यम से 300 μL विंदुक युक्तियाँ रखें।
    नोट: अंश कलेक्टर का उपयोग मल्टी-हेड डिस्पेंसर के बिना एक एकल सेल संस्कृति को सुगंधित करने के लिए किया जा सकता है।

3. घटक आरटीडी को मापें और सिग्नल कंवोल्यूशन करें

  1. ट्रेसर पल्स के लिए पंप और सिरिंज सेट करें जैसा कि चित्रा 2 में दिखाया गया है।
    1. दो एकल चैनल या मल्टीचैनल सिरिंज पंप प्राप्त करें।
    2. सेल संस्कृति प्रयोगों के दौरान प्रवाह प्रणाली में उपयोग किए जाने वाले माध्यम का प्रतिनिधित्व करने के लिए एक पृष्ठभूमि समाधान चुनें। सुनिश्चित करें कि पृष्ठभूमि समाधान में माध्यम के समान द्रव्यमान हस्तांतरण गुण हैं। कई मामलों में, विआयनीकृत पानी एक उपयुक्त विकल्प है।
    3. सेल संस्कृति प्रयोगों के दौरान ब्याज की होगी कि विलेय का प्रतिनिधित्व करने के लिए एक अनुरेखक पदार्थ चुनें। सुनिश्चित करें कि अनुरेखक में ब्याज के विलेय के समान द्रव्यमान हस्तांतरण गुण हैं, और इसकी एकाग्रता को मापा जाना चाहिए। कई मामलों में, खाद्य डाई एक उपयुक्त विकल्प है।
    4. अनुरेखक समाधान बनाने के लिए पृष्ठभूमि समाधान में अनुरेखक पदार्थ को भंग करें।
    5. एक पृष्ठभूमि समाधान के साथ एक सिरिंज भरें और इसे एक सिरिंज पंप में लोड करें। ट्रेसर समाधान के साथ एक और सिरिंज भरें और इसे दूसरे सिरिंज पंप में लोड करें।
    6. दोनों सिरिंज को लुअर कनेक्टर का उपयोग करके चार-तरफ़ा स्टॉपकॉक के तीन बंदरगाहों में से दो से कनेक्ट करें।
    7. स्टॉपकॉक को पृष्ठभूमि समाधान में बंद करें और ट्रेसर समाधान को स्टॉपकॉक में तब तक पंप करें जब तक कि यह खुले बंदरगाह को ड्रिप करना शुरू न कर दे। पंप बंद करो और सिरिंज को आगे समायोजित न करें।
      नोट: यह महत्वपूर्ण है कि सिरिंज पंप की चलती पट्टी प्रयोग शुरू होने से पहले सिरिंज सवार के खिलाफ धक्का दिया जाता है। यह पंप शुरू होने पर प्रवाह को तुरंत शुरू करने की अनुमति देगा। अन्यथा, पंप शुरू किया जा सकता है, लेकिन प्रवाह वास्तव में तब तक शुरू नहीं होगा जब तक कि चलती पट्टी सवार स्थिति तक नहीं पहुंच जाती।
    8. स्टॉपकॉक को ट्रेसर समाधान में बंद करें और स्टॉपकॉक में पृष्ठभूमि समाधान को पंप करें जब तक कि सभी अवशिष्ट अनुरेखक समाधान खुले बंदरगाह से बाहर नहीं निकल जाते। पंप बंद करो और सिरिंज को आगे समायोजित न करें।
  2. ब्याज के प्रवाह प्रणाली घटक और अंश कलेक्टर सेट करें
    1. आरटीडी विश्लेषण के लिए वांछित प्रवाह प्रणाली घटक सेट करें। ऑपरेशन के दौरान अंश कलेक्टर तक पहुंचने के लिए उपयुक्त लंबाई और लचीलेपन के डाउनस्ट्रीम ट्यूबिंग के एक टुकड़े के साथ मापा जाने वाला घटक सुनिश्चित करें।
    2. मल्टी-हेड डिस्पेंसर में एक पिपेट टिप डिस्पेंसर में डाउनस्ट्रीम ट्यूबिंग के अंत को डालें जैसे कि यह स्नगली जुड़ा हुआ है।
    3. मापने के लिए घटक के इनलेट में चार-तरफ़ा स्टॉपकॉक के खुले बंदरगाह को संलग्न करें। घटक के माध्यम से पृष्ठभूमि समाधान पंप करें जब तक कि यह पूरी तरह से भर न जाए क्योंकि यह सेल संस्कृति प्रयोग के दौरान होगा, और यह अंश कलेक्टर डिस्पेंसिंग टिप से बाहर निकलना शुरू कर देता है। पंप बंद करो।
  3. अनुरेखक पल्स इंजेक्ट करें, अंश एकत्र करें, और ट्रेसर को मापें
    1. वांछित प्रवाह दर के लिए अनुरेखक समाधान के लिए पंप सेट करें। स्टॉपकॉक को पृष्ठभूमि समाधान में बंद करें और ट्रेसर समाधान का प्रवाह प्रारंभ करें। उसी समय, अंश कलेक्टर शुरू करें।
    2. ट्रेसर के आवेग इनपुट का अनुमान लगाने के लिए थोड़े समय के लिए ट्रेसर समाधान के प्रवाह को जारी रखें। घंटा की प्रवाह दर पर आरटीडी के लिए 10 मिनट की पल्स अवधि अच्छी तरह से काम करने के लिए पाई गई थी।
      नोट: यदि अनुरेखक पल्स बहुत संक्षिप्त है, तो पर्याप्त अनुरेखक औसत दर्जे का होने के लिए प्रवाह में प्रवेश नहीं करेगा। यदि नाड़ी बहुत लंबी है, तो यह अब एक आवेग का अनुमान नहीं लगाएगी और आरटीडी के आकार को बदल देगी।
    3. अनुरेखक समाधान पल्स अवधि के अंत में, अनुरेखक समाधान पंप बंद करो। ट्रेसर समाधान के लिए स्टॉपकॉक को जल्दी से बंद करें और एक ही प्रवाह दर पर पृष्ठभूमि समाधान का प्रवाह शुरू करें।
    4. पृष्ठभूमि समाधान को प्रवाहित करने और अंशों को एकत्र करने की अनुमति दें जब तक कि सभी अनुरेखक सिस्टम के माध्यम से और एकत्र किए गए अंशों में पारित न हो जाएं।
    5. सिस्टम को रोकें और अंशों में ट्रेसर एकाग्रता को मापें। केवल उन अंशों को शामिल करें जो पूरी तरह से वितरित किए गए थे। यदि संग्रह को अंश के संग्रह के माध्यम से आंशिक रूप से रोक दिया जाता है, तो उस अंश को शामिल न करें।
  4. मैटलैब में मापा डेटा से निवास समय वितरण (आरटीडी) की गणना करें
    नोट: इस MATLAB स्क्रिप्ट द्वारा किए गए विश्लेषण का एक लिखित विवरण लेखकों के पिछले प्रकाशन11 में पाया जा सकता है, और सिद्धांत की चर्चा साहित्य13 में व्यापक रूप से उपलब्ध है।
    1. पूरक फ़ाइल 2 में प्रदान की गई example_tracer_data.xlsx स्प्रेडशीट के प्रारूप में एकाग्रता डेटा युक्त एक .xlsx फ़ाइल का उत्पादन करें। पंक्ति 2 में बाएं से दाएं कालानुक्रमिक क्रम में अंशों (किसी भी इकाई) में अनुरेखक के एकाग्रता मान दर्ज करें। पल्स की शुरुआत से सेल ए 5 में अंतिम अंश के अंत तक बीत चुके समय को दर्ज करें, और सेल ए 8 में मिनटों में ट्रेसर पल्स की लंबाई दर्ज करें।
    2. MATLAB निर्देशिका में .xlsx फ़ाइल सहेजें।
    3. MATLAB संपादक में अनुपूरक फ़ाइल 3 से RTD_From_Data.m स्क्रिप्ट खोलें।
    4. स्क्रिप्ट फ़ाइल में लिखे गए निर्देशों का पालन करते हुए, स्क्रिप्ट के डेटा लोड करें अनुभाग की पहली पंक्ति में कोष्ठक में .xlsx फ़ाइल का नाम नई .xlsx डेटा फ़ाइल के नाम से बदलें। स्क्रिप्ट चलाएँ।
    5. सुनिश्चित करें कि स्क्रिप्ट सफलतापूर्वक आरटीडी विश्लेषण13 करती है, आरटीडी की साजिश का उत्पादन करती है और आरटीडी पर संख्यात्मक अभिन्न के मूल्य को 1 के बराबर लौटाती है। मैटलैब निर्देशिका में स्क्रिप्ट द्वारा सहेजे गए समय वेक्टर (टी) और संबंधित आरटीडी मान वेक्टर (ईटी) का पता लगाएं।
  5. मैटलैब में आरटीडी के लिए एक मॉडल फ़ंक्शन फ़िट करें
    1. अनुपूरक फ़ाइल 4 से MATLAB संपादक में Fit_RTD_Function.m स्क्रिप्ट खोलें।
    2. आरटीडी में फिट होने के लिए तीन टिप्पणी-आउट मॉडल कार्यों में से एक चुनें: अक्षीय फैलाव मॉडल13, जो बेलनाकार ट्यूबों में लामिना के प्रवाह के लिए आरटीडी फिट बैठता है; सीएसटीआर मॉडल13, जो अच्छी तरह से उत्तेजित टैंक फिट बैठता है; और एन-सीएसटीआर मॉडल15, जो लगभग बड़ी अच्छी तरह से प्लेटों को फिट करता है। यहां शामिल नहीं किए गए किसी अन्य मॉडल को फिट करने के लिए, इसे उसी प्रारूप में स्क्रिप्ट में जोड़ें।
    3. फिटिंग के लिए चुने गए मॉडल वाले स्क्रिप्ट के अनुभाग में टिप्पणियों को निकालें।
    4. आरटीडी के लिए उपयुक्त लोगों के लिए पैरामीटर के लिए प्रारंभिक अनुमानों के मूल्यों को बदलें।
    5. RTD डेटा पर मढ़ा फिट फ़ंक्शन का एक प्लॉट बनाने के लिए और फ़ंक्शन के लिए फ़िट पैरामीटर मान मुद्रित करने के लिए स्क्रिप्ट चलाएँ। यदि फ़िट बहुत खराब है या त्रुटियाँ उत्पन्न होती हैं, तो पैरामीटर प्रारंभिक अनुमान बदलें और स्क्रिप्ट को फिर से चलाएँ।
  6. मैटलैब में सिग्नल कन्वोल्यूशन करें
    1. या तो एक सिग्नल और एक आरटीडी या दो आरटीडी को संयोजित करने के लिए चुनें।
    2. MATLAB संपादक में पूरक फ़ाइल 5 से Signal_Convolution.m स्क्रिप्ट खोलें।
    3. दो संकेतों में से प्रत्येक के लिए (यानी, एक सिग्नल और एक आरटीडी, या दो आरटीडी), वांछित इकाइयों में समान रूप से दूरी वाले समय बिंदुओं के एक वेक्टर और उस समय सिग्नल मूल्यों के संबंधित वेक्टर को परिभाषित करें।
      नोट: दो संकेतों के वैक्टर तत्वों की एक ही संख्या और एक ही आकार समय चरणों होना चाहिए। यही कारण है कि आरटीडी को एक निरंतर फ़ंक्शन के रूप में रखना उपयोगी है जिसे किसी भी समय अंतराल पर बिंदुओं की मनमानी संख्या के लिए नमूना दिया जा सकता है।
    4. मैटलैब में दो सिग्नल दर्ज करें और आउटपुट सिग्नल के समय और सिग्नल वैक्टर प्राप्त करने के लिए स्क्रिप्ट चलाएं।

4. एक अच्छी तरह से प्लेट में कोशिकाओं के साथ बुनियादी छिड़काव प्रणाली स्थापित करें

  1. अच्छी तरह से प्लेट तैयार करें
    1. अच्छी तरह से प्लेट संस्कृति छिड़काव प्रयोग के लिए उपयुक्त मध्यम गहराई सुनिश्चित करें। छिड़काव शुरू करने से पहले वांछित किसी भी अंतिम माध्यम परिवर्तन, उत्तेजना, या अन्य चरणों को निष्पादित करें। यदि निलंबन कोशिकाओं को सुगंधित किया जा रहा है, तो यह सुनिश्चित करने के लिए प्लेट को अपकेंद्रित्र करें कि वे तल पर हैं।
    2. बाँझ परिस्थितियों में, सुइयों के साथ डाट को अच्छी तरह से प्लेट संस्कृतियों में सुइयों के साथ खींचें। स्टॉपर जगह में होने के बाद, छिड़काव के लिए वांछित ऊंचाई तक सुइयों को कम करें, क्योंकि आउटलेट सुई की ऊंचाई स्थिर तरल स्तर निर्धारित करती है।
    3. पुरुष लुअर कैप्स के साथ सुइयों को कैप करें और उपयोग होने तक पूरी अच्छी तरह से प्लेट को इनक्यूबेटर में रखें।
  2. सिरिंज और अपस्ट्रीम ट्यूबिंग तैयार करें
    1. बाँझ परिस्थितियों में, छिड़काव की वांछित अवधि के लिए पर्याप्त माध्यम के साथ सुगंधित होने के लिए प्रत्येक संस्कृति के लिए एक सिरिंज भरें, साथ ही अपस्ट्रीम ट्यूबिंग को भरने के लिए पर्याप्त अतिरिक्त माध्यम।
    2. एक महिला-से-बार्ब लुअर कनेक्टर का उपयोग करके सिरिंज के लिए अपस्ट्रीम ट्यूबिंग संलग्न करें। ट्यूब के दूसरे छोर पर, एक पुरुष-से-बार्ब लुअर कनेक्टर डालें।
    3. सिरिंज से माध्यम को वितरित करें जब तक कि अपस्ट्रीम ट्यूब पूरी तरह से माध्यम से भर न जाए।
    4. एक महिला लुअर टोपी के साथ ट्यूब के खुले छोर को कैप करें।
      नोट:: सभी प्रतिकृति सिरिंज इस बिंदु पर बिल्कुल एक ही मात्रा होनी चाहिए। यदि उनकी मात्रा बराबर नहीं है, तो उनके प्लंजर अलग-अलग स्थितियों में होंगे, और वे सभी एक ही मल्टीचैनल सिरिंज पंप में अच्छी तरह से फिट नहीं होंगे।
  3. बाँझ परिस्थितियों में, डाउनस्ट्रीम ट्यूबिंग के एक छोर में एक नर-टू-बार्ब लुअर कनेक्टर डालें, और इसे एक महिला लुएर टोपी के साथ कैप करें।
  4. ध्यान से सभी तैयार टयूबिंग, सिरिंज, और अच्छी तरह से प्लेट इनक्यूबेटर है कि छिड़काव के लिए इस्तेमाल किया जाएगा लाने के लिए।
  5. इनक्यूबेटर के पास वांछित स्थानों में सिरिंज पंप और अंश कलेक्टर रखें। सिरिंज पंप को इनक्यूबेटर के ऊपर या पास रखें, और बंदरगाह के पास इनक्यूबेटर के बगल में अंश कलेक्टर रखें।
  6. सभी अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम ट्यूबों के कैप्ड सिरों को एक साथ बंडल करें और उन्हें इनक्यूबेटर के बाहर से बंदरगाह के माध्यम से अंदर तक धक्का दें।
  7. सिरिंज पंप में सिरिंज लोड और अंश कलेक्टर के बहु सिर डिस्पेंसर के वितरण विंदुक युक्तियों में डाउनस्ट्रीम ट्यूबों के खुले सिरों डालें।
  8. इनक्यूबेटर के अंदर, ट्यूबिंग की लंबाई को अधिकतम करने के लिए इनक्यूबेटर में अपस्ट्रीम ट्यूबों के जितना संभव हो उतना ढीला खींचें जिसके माध्यम से बहने वाला माध्यम इनक्यूबेटर हवा से गर्मी और सीओ 2 प्राप्त कर सकता है। इन्हें जगह में रखते हुए, इनक्यूबेटर से डाउनस्ट्रीम ट्यूबों को खींचें, बस इतना है कि वे अंश कलेक्टर पर सबसे दूर विस्तारित बिंदु तक पहुंचने में सक्षम हों, जबकि अभी भी इनक्यूबेटर के अंदर कैप्ड सिरों को रखते हुए।
  9. प्रत्येक प्लग किए गए अच्छी तरह से के लिए, सुइयों और अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम ट्यूबों को उस कुएं के लिए जल्दी से अनकैप करें और उन्हें अपने लुअर कनेक्टर्स के साथ संलग्न करें।
  10. एक बार जब सभी भाग जुड़े हो जाते हैं, तो यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी धाराएं ठीक से बह रही हैं, अपेक्षाकृत उच्च गति पर सिरिंज पंप को संक्षेप में चलाएं।
  11. इस बिंदु पर, यदि माध्यम से भरे डाउनस्ट्रीम ट्यूबों के साथ प्रयोग शुरू करना वांछित है, तो सभी भरने तक पंप चलाना जारी रखें। अन्यथा, पंप बंद करो।
  12. सिरिंज पंप प्रवाह दर और अंश संग्रह की आवृत्ति सेट करें और प्रयोग शुरू करने के लिए दोनों मशीनों को एक साथ शुरू करें। वांछित प्रयोग अवधि के लिए अंशों को इकट्ठा करें।

5. कई मध्यम स्रोतों के लिए स्टॉपकॉक के साथ छिड़काव प्रणाली स्थापित करें

  1. उपरोक्त चरण 4.1 के सभी उप-चरण निष्पादित करें।
  2. छिड़काव में उपयोग किए जाने वाले दो मीडिया को तैयार करें, उस माध्यम को लेबल करें जिसे पहले 1 के रूप में वितरित किया जाएगा, और दूसरा मध्यम 2 के रूप में।
  3. प्रत्येक संस्कृति को सुगंधित करने के लिए, इसकी व्यवस्था की अवधि के लिए पर्याप्त माध्यम 1 के साथ एक सिरिंज भरें, साथ ही शुरू में छिड़काव प्रणाली को भरने के लिए पर्याप्त मात्रा। इसकी व्यवस्था की अवधि के लिए पर्याप्त माध्यम 2 के साथ एक दूसरी सिरिंज भरें।
  4. दोनों सिरिंज को चार-तरफ़ा स्टॉपकॉक के तीन बंदरगाहों में से दो से कनेक्ट करें।
    नोट: सिरिंज को स्टॉपकॉक से कनेक्ट करने के लिए ट्यूबिंग की लंबाई की आवश्यकता हो सकती है।
  5. स्टॉपकॉक को मध्यम 1 में बंद करके और स्टॉपकॉक में मध्यम 2 को वितरित करके ऊपर दिए गए चरणों 3.1.7-3.1.8 के समान तरीके से स्टॉपकॉक और सिरिंज तैयार करें जब तक कि यह खुले बंदरगाह को ड्रिप करना शुरू न कर दे।
  6. स्टॉपकॉक को मध्यम 2 पर बंद करें और स्टॉपकॉक में मध्यम 1 को वितरित करें जब तक कि सभी अवशिष्ट माध्यम 2 को खुले बंदरगाह से बाहर नहीं निकाल दिया जाता है।
  7. एक महिला-से-बार्ब लुएर कनेक्टर का उपयोग करके खुले स्टॉपकॉक पोर्ट में अपस्ट्रीम ट्यूबिंग संलग्न करें। ट्यूब के दूसरे छोर पर, एक पुरुष-से-बार्ब लुअर कनेक्टर डालें।
  8. सिरिंज से मध्यम 1 वितरित करें जब तक कि अपस्ट्रीम ट्यूब पूरी तरह से माध्यम से भर न जाए।
  9. ऊपर दिए गए चरण 4.3-4.11 के साथ आगे बढ़ें, दोनों सिरिंज को अलग-अलग सिरिंज पंपों में लोड कर रहे हैं और केवल मध्यम 1 वितरित कर रहे हैं।
  10. मध्यम 1 और अंश संग्रह की आवृत्ति के लिए सिरिंज पंप प्रवाह दर सेट करें, और प्रयोग शुरू करने के लिए दोनों मशीनों को एक साथ शुरू करें।
  11. जब मध्यम स्रोत को बदलना है, तो मध्यम 1 के लिए सिरिंज पंप को जल्दी से रोकें, स्टॉपकॉक को मध्यम 1 पर बंद करें, और मध्यम 2 के लिए सिरिंज पंप शुरू करें। यदि बाद में वांछित है, तो स्रोत को उसी तरह से मध्यम 1 पर वापस स्विच करें।
  12. वांछित प्रयोग अवधि के लिए अंशों को इकट्ठा करें।

6. फार्माकोकाइनेटिक्स की नकल करने के लिए एक उत्तेजित टैंक के साथ छिड़काव प्रणाली स्थापित करें

  1. ब्याज की दवा के लिए फार्माकोकाइनेटिक डेटा प्राप्त करें और सुनिश्चित करें कि इसमें घातीय क्षय के बाद एक एकाग्रता शिखर शामिल है।
  2. चोटी को समय 0 पर सेट करने और चोटी से पहले डेटा बिंदुओं को हटाने के बाद, डेटा में उत्तेजित टैंक आरटीडी समीकरण को फिट करने के लिए Stirred_Tank_Fit स्क्रिप्ट (पूरक फ़ाइल 6) का उपयोग करें। इनपुट वी (वांछित छिड़काव प्रवाह दर) और डेटा को क्रमशः समय मूल्यों और एकाग्रता मूल्यों के लिए टी और सी के साथ स्क्रिप्ट में सीधे वैक्टर की एक जोड़ी के रूप में फिट किया जाना चाहिए। पैरामीटर वी मुद्रित करने के लिए स्क्रिप्ट चलाएं, जो आवश्यक उत्तेजित टैंक वॉल्यूम है।
  3. इनक्यूबेटर के ऊपर दो सिरिंज पंप और एक प्लेट शेकर शामिल करने के लिए छिड़काव प्रणाली के लिए एक लेआउट की योजना बनाएं।
  4. स्टॉपकॉक से परे छिड़काव प्रणाली घटकों के आरटीडी को मापें और एक उपयुक्त फार्माकोकाइनेटिक प्रोफ़ाइल खोजने के लिए विभिन्न दवा पल्स अवधि और सांद्रता के साथ आरटीडी के सिग्नल कंवोल्यूशन का प्रदर्शन करें। इस गणना में फिट टैंक आरटीडी समीकरण का उपयोग करें।
  5. ऊपर दिए गए चरण 5.1-5.8 के साथ आगे बढ़ें।
  6. सेटअप के लिए हलचल टैंक के रूप में उपयुक्त आकार की एक अतिरिक्त अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग करें। प्रत्येक कुआं एक सुगंधित संस्कृति के लिए एक उत्तेजित टैंक के रूप में काम कर सकता है। मध्यम, वी की आवश्यक मात्रा के साथ कुएं को भरें, और सुइयों को शुरू में खींचने वाली सुइयों के साथ अच्छी तरह से प्लग करें, फिर कुएं के नीचे धकेल दें, और सुइयों को कैप करें।
  7. सिरिंज पंपों में सिरिंज लोड करें और जल्दी से सिरिंज से टयूबिंग को उत्तेजित टैंकों की छाया हुआ इनलेट सुइयों से कनेक्ट करें। फिर सेल संस्कृति अपस्ट्रीम ट्यूब इनलेट्स को उत्तेजित टैंकों की आउटलेट सुइयों से कनेक्ट करें।
  8. चरण 5.9-5.10 के साथ आगे बढ़ें।
  9. वांछित समय पर, दवा युक्त मध्यम 2 पर स्विच करें, जैसा कि चरण 5.11 में वर्णित है। दवा जलसेक पूरा होने पर मध्यम 1 पर वापस स्विच करें।
  10. चरण 5.12 के साथ आगे बढ़ें।

Figure 3
चित्रा 3: मल्टी-हेड डिस्पेंसर। लेजर-कट मल्टी-हेड डिस्पेंसर के लिए डिज़ाइन। इस आंकड़े को एरिक्सन एट अल 11 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Representative Results

प्रोटोकॉल की धारा 5 से कई मध्यम स्रोतों के साथ छिड़काव प्रणाली का उपयोग ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर अल्फा (टीएनएफ-α) के 1.5 घंटे पल्स के जवाब में मानव भ्रूण गुर्दे 293 (एचईके 293) कोशिकाओं में सक्रिय बी कोशिकाओं (एनएफ -εबी) प्रतिलेखन कारक के परमाणु कारक कप्पा-प्रकाश-श्रृंखला-बढ़ाने वाले द्वारा संचालित रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति गतिशीलता को मापने के लिए किया गया था। एचईके 293 कोशिकाओं को गॉसिया ल्यूसिफेरेज़ (जीएलयूसी) युक्त जीन निर्माण के साथ लेंटिवायरल वैक्टर का उपयोग करके स्थिर रूप से ट्रांसड्यूस किया गया था, जो एनएफकेबी नामक एक प्रमोटर द्वारा संचालित होता है जिसमें एनएफकेबी-जीएलयूसी एचईके 293 कोशिकाएं बनाने के लिए एनएफ-┖B प्रतिक्रिया तत्व होता है, जिसे ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्रतिदीप्ति-सक्रिय कोशिकाओं की छंटाई (एफएसीएस) के माध्यम से क्रमबद्ध किया गया था। सॉर्ट की गई कोशिकाओं को उपयोग तक क्रायोप्रिजर्व किया गया था।

प्रत्येक सुगंधित संस्कृति के लिए, छिड़काव सेटअप में 1 मीटर टयूबिंग का एक अपस्ट्रीम सेक्शन शामिल था, जिससे कोशिकाओं से युक्त प्लग की गई 48-अच्छी तरह से प्लेट होती है, इसके बाद 1 मीटर डाउनस्ट्रीम ट्यूबिंग मल्टी-हेड अंश कलेक्टर की ओर जाता है, जिसमें 0.5 एमएल / अकेले 1 मीटर ट्यूबिंग और पूर्ण सेटअप (1 मीटर ट्यूब + 48-अच्छी तरह से प्लेट + 1 मीटर ट्यूब) के आरटीडी को ट्रेसर के 20 मिनट की नाड़ी के साथ 0.5 एमएल / पृष्ठभूमि समाधान विआयनीकृत पानी था, जिसमें नीले खाद्य डाई के अनुरेखक समाधान को विआयनीकृत पानी में पतला किया गया था, और मल्टी-हेड डिस्पेंसर का उपयोग करके अंशों को 1 अंश / अंशों के 100 μL नमूनों में अनुरेखक सांद्रता 628 एनएम पर अवशोषण के माध्यम से एक प्लेट रीडर में मापा गया था।

दोनों सेटअपों के लिए आरटीडी का उत्पादन करने के लिए अनुरेखक एकाग्रता डेटा को मैटलैब में संसाधित किया गया था। सबसे पहले, दो सेटअपों के आरटीडी की गणना RTD_from_Data स्क्रिप्ट का उपयोग करके डेटा से की गई थी। 1 मीटर ट्यूब और पूर्ण सेटअप के आरटीडी डेटा बिंदु चित्रा 4 में दिखाए गए हैं।

Figure 4
घंटा (0.0083 एमएल / मिनट) की प्रवाह दर पर 1 मीटर ट्यूब के लिए आरटीडी। (दाएं) घंटा की प्रवाह दर पर पूर्ण छिड़काव सेटअप (1 मीटर ट्यूब + 48-अच्छी तरह से प्लेट + 1 मीटर ट्यूब) का आरटीडी कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अकेले ट्यूबिंग का आरटीडी अक्षीय फैलाव समारोह द्वारा अच्छी तरह से फिट है, जिसे मौजूदा साहित्य13 के आधार पर अपेक्षित किया जाना है। श्रृंखला में ट्यूबिंग के कई टुकड़े भी एक अक्षीय फैलाव मॉडल द्वारा अच्छी तरह से फिट होते हैं, और 48-अच्छी तरह से प्लेट इन-लाइन जोड़ने से इस मॉडल से नगण्य विचलन होता है, इसलिए अकेले 1 मीटर ट्यूब और 1 मीटर ट्यूब + 48-वेल प्लेट + 1 मीटर ट्यूब सेटअप प्रत्येक अक्षीय फैलाव मॉडल द्वारा अच्छी तरह से फिट होने की उम्मीद थी। खराब मॉडल फिट बैठता है जब मॉडल मापदंडों के लिए प्रारंभिक अनुमान उनके वास्तविक मूल्यों से बहुत दूर होते हैं। यह प्रदर्शित करने के लिए, सबसे पहले, अक्षीय फैलाव मॉडल Fit_RTD_Function स्क्रिप्ट का उपयोग करके 1 मीटर ट्यूब डेटा के लिए फिट था, पे = 10 और ताऊ = 30 मिनट का उपयोग फ़ंक्शन मापदंडों के लिए प्रारंभिक अनुमान के रूप में। चित्रा 5 से पता चलता है कि इन अनुमानों के परिणामस्वरूप खराब फिटिंग मॉडल, आरटीडी डेटा के साथ प्लॉट किए गए थे। अनुमानों को पे = 10 और ताऊ = 300 मिनट में बदल दिया गया था, जिसके परिणामस्वरूप चित्रा 5 में दिखाया गया अच्छा मॉडल फिट बैठता है, क्योंकि ताऊ लगभग छिड़काव प्रणाली की मात्रा के बराबर होना चाहिए जो इसकी वॉल्यूमेट्रिक प्रवाह दर से विभाजित है। 1 मीटर ट्यूब के लिए फिट पैरामीटर पीई = 154.3, ताऊ = 317.2 मिनट हैं, जबकि पूरे सिस्टम के पैरामीटर पीई = 396.5, ताऊ = 596.5 मिनट हैं।

Figure 5
चित्रा 5: अच्छे और खराब मॉडल के उदाहरण आरटीडी के लिए फिट बैठते हैं। घंटा (0.0083 एमएल / मिनट) की प्रवाह दर पर 1 मीटर ट्यूब के लिए एक अक्षीय फैलाव मॉडल आरटीडी डेटा के लिए फिट था। (बाएं) MATLAB स्क्रिप्ट के लिए मॉडल पैरामीटर इनपुट के लिए प्रारंभिक अनुमान उनके वास्तविक मूल्यों से बहुत दूर थे, जिससे स्क्रिप्ट एक खराब मॉडल फिट वापस आ गई। (दाएं) स्क्रिप्ट में बेहतर पैरामीटर मान इनपुट थे, जिसके परिणामस्वरूप एक अच्छा मॉडल फिट था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Signal_Convolution स्क्रिप्ट में इन फिट आरटीडी कार्यों का उपयोग करके सिग्नल कंवोल्यूशन किया गया था ताकि यह अनुमान लगाया जा सके कि अपस्ट्रीम ट्यूबिंग के इनलेट पर 10 एनजी / एमएल टीएनएफ-α युक्त माध्यम की 1.5 घंटे की नाड़ी सिस्टम के माध्यम से कैसे प्रचारित होगी। इनपुट सिग्नल को पहले 1 मीटर ट्यूबिंग आरटीडी के साथ जोड़ा गया था ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि टीएनएफ-α सिग्नल अच्छी तरह से प्लेट में प्रवेश करेगा। इनपुट सिग्नल को 1 मीटर ट्यूब + 48-वेल प्लेट + 1 मीटर ट्यूब के आरटीडी के साथ भी जोड़ा गया था ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि टीएनएफ-α सिग्नल एकत्र किए गए अंशों में सिस्टम के आउटलेट पर क्या होगा, जहां यह कोशिकाओं से संबंधित जीएलयूसी प्रतिक्रिया के साथ दिखाई देगा। चित्रा 6 इनपुट टीएनएफ से पता चलता है- α पल्स सिग्नल अच्छी तरह से इनलेट और सिस्टम आउटलेट पर भविष्यवाणी संकेतों के साथ दिखाया गया है।

Figure 6
चित्रा 6: छिड़काव प्रणाली में टीएनएफ-α एकाग्रता संकेतों की भविष्यवाणी करना। टीएनएफ-α युक्त माध्यम को ऑपरेशन के पहले 90 मिनट के लिए 10 एनजी / एमएल पर छिड़काव प्रणाली में संक्रमित किया गया था, जिसे नीले आयताकार सिग्नल द्वारा दर्शाया गया था। (बाएं) 1 मीटर ट्यूब आरटीडी के फिट अक्षीय फैलाव मॉडल के साथ इनपुट सिग्नल को संयोजित करके, 48-अच्छी तरह से प्लेट के इनलेट पर टीएनएफ-α एकाग्रता संकेत की भविष्यवाणी की गई थी। (दाएं) इसी तरह, पूरे सिस्टम के लिए आरटीडी मॉडल का उपयोग करके, सिस्टम के आउटलेट पर टीएनएफ-α सिग्नल की भविष्यवाणी की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एनएफकेबी-जीएलयूसी एचईके 293 कोशिकाओं को 1 एक्स 10 4 कोशिकाओं / अच्छी तरह से 10%4 कोशिकाओं / अच्छी तरह से 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक डलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) के 0.4 एमएल में 48-अच्छी तरह से प्लेट में पिघलाया गया था, और 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 दिन के लिए ऊष्मायन किया गया था, जिसके बाद उपरोक्त प्रोटोकॉल की धारा 5 में चरणों का पालन किया गया था। चार कुओं को बुझाने के लिए चार धाराएं स्थापित की गईं। एक मल्टीचैनल सिरिंज पंप मध्यम 1 के रूप में डीएमईएम युक्त चार पूर्ण 60 एमएल सिरिंज के साथ लोड किया गया था। एक दूसरा सिरिंज पंप मध्यम 2 युक्त 5 एमएल सिरिंज के साथ लोड किया गया था, जिनमें से दो में नियंत्रण के रूप में सादा डीएमईएम था, और दो में उत्तेजना के रूप में 10 एनजी / एमएल टीएनएफ-α के साथ डीएमईएम था। प्रयोग की शुरुआत में, टीएनएफ-α या नियंत्रण माध्यम वाले 5 एमएल सिरिंज को 1.5 घंटे के लिए 0.5 एमएल / घंटा पर वितरित किया गया था, जिसके बाद स्टॉपकॉक स्विच किए गए थे और डीएमईएम युक्त 60 एमएल सिरिंज को अगले 40 घंटे के लिए वितरित किया गया था। 24 घंटे में और छिड़काव के अंत में, चार धाराओं के अंश, जिन्हें माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में वितरित किया गया था, को लेबल किया गया था और -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए थे, और अंश कलेक्टर को रीसेट किया गया था।

छिड़काव के बाद, सभी नमूनों को पिघलाया गया था, और उनके जीएलयूसी सांद्रता को बायोल्यूमिनेसेंस परख का उपयोग करके मापा गया था, जिसे पहले11,16 वर्णित किया गया था। ल्यूमिनेसेंस मानों को उस अंश की समय अवधि से प्रत्येक अंश नमूने के ल्यूमिनेसेंस को विभाजित करके ल्यूमिनेसेंस / एच दरों में परिवर्तित किया गया था, और चार धाराओं में से प्रत्येक के लिए एक समय श्रृंखला के रूप में प्लॉट किया गया था। प्रत्येक जीएलयूसी माप का समय उस समय अंतराल का मध्य बिंदु था जिसके दौरान उस अंश को एकत्र किया गया था, छिड़काव प्रणाली के डाउनस्ट्रीम ट्यूबिंग के औसत निवास समय (ताऊ = 317 मिनट) को घटाकर। अंशों के भीतर निहित होने की भविष्यवाणी की गई टीएनएफ-α सिग्नल को डाउनस्ट्रीम ट्यूबिंग के औसत निवास समय से समय पर स्थानांतरित कर दिया गया था और जीएलयूसी डेटा पर मढ़ा गया था, उत्तेजना-प्रतिक्रिया गतिशीलता एनएफ-^बी-संचालित जीन अभिव्यक्ति का खुलासा किया गया था, चित्रा 7 में दिखाया गया है।

Figure 7
चित्रा 7: उत्तेजना प्रतिक्रिया गतिशीलता छिड़काव प्रणाली का उपयोग कर मापा. दो मध्यम स्रोतों के साथ छिड़काव प्रणाली का उपयोग दो सेल संस्कृतियों को टीएनएफ-α की एक नाड़ी में क्षणिक रूप से उजागर करने के लिए किया गया था, जिसमें नियंत्रण के रूप में दो अप्रकाशित संस्कृतियां थीं। एचईके 293 कोशिकाओं को एनएफ-κB प्रतिक्रिया तत्व वाले प्रमोटर द्वारा संचालित जीएलयूसी को स्रावित करने के लिए इंजीनियर किया गया था, जिसे प्रवाह अंशों में एकत्र किया गया था। प्रयोग टीएनएफ-α एक्सपोजर के बाद एनएफ-κबी द्वारा संचालित एक नाटकीय अभिव्यक्ति वृद्धि का पता चलता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

छिड़काव की शुरुआत में संस्कृतियों में संचित जीएलयूसी की उपस्थिति ने सभी चार वक्रों में पहले से दूसरे अंश तक जीएलयूसी सिग्नल में स्पष्ट गिरावट का कारण बना। छिड़काव शुरू करने से तुरंत पहले संस्कृतियों में माध्यम को बदलकर छिड़काव प्रणाली में इस सामान्य विरूपण साक्ष्य से बचा जा सकता है। टीएनएफ-α प्राप्त नहीं करने वाली दो नियंत्रण संस्कृतियों ने कम जीएलयूसी स्राव दर बनाए रखी जो धीरे-धीरे प्रयोग की अवधि में बढ़ गई। यह परिणाम कोशिका जनसंख्या की वृद्धि को प्रतिबिंबित कर सकता है। उत्तेजित संस्कृतियों में शुरू में नियंत्रण के समान जीएलयूसी स्राव दर थी और फिर नाटकीय रूप से स्राव में वृद्धि हुई क्योंकि टीएनएफ-α पल्स के जवाब में एनएफ-κबी-संचालित अभिव्यक्ति सक्रिय होती है। टीएनएफ-α के पहले आगमन के लगभग 9 घंटे बाद जीएलयूसी स्राव चोटियों, जिसके बाद यह घातीय क्षय के साथ गिरावट आती है।

पूरक फ़ाइल 1: सीएडी फ़ाइल: मल्टी-head_Dispenser.DFX: इस फ़ाइल में मल्टी-हेड डिस्पेंसर के लिए मॉडल होता है जिसे लेजर कट किया जा सकता है और अंश कलेक्टरों को संशोधित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: example_tracer_data.xlsx. RTD_from_Data.m MATLAB स्क्रिप्ट द्वारा पढ़ा जा करने के लिए उदाहरण अनुरेखक प्रयोग डेटा शामिल हैं। नए डेटा के लिए टेम्पलेट के रूप में भी इस्तेमाल किया जा सकता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 3: MATLAB फ़ाइल: RTD_from_Data.m. यह स्क्रिप्ट एक .xlsx फ़ाइल से अनुरेखक प्रयोग डेटा पढ़ती है और आरटीडी का प्रतिनिधित्व करने वाले टी और एट वैक्टर लौटाती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 4: MATLAB फ़ाइल: Fit_RTD_Function.m. यह स्क्रिप्ट RTD_from_Data स्क्रिप्ट से आरटीडी वैक्टर लोड करती है और आरटीडी के लिए एक फिट मॉडल लौटाती है। मॉडल का प्रकार उपयोगकर्ता द्वारा चुना जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 5: MATLAB फ़ाइल: Signal_Convolution.एम. यह स्क्रिप्ट इनपुट के रूप में एक उपयोगकर्ता-परिभाषित विलेय सिग्नल और एक आरटीडी लेती है और भविष्यवाणी करती है कि उस आरटीडी के साथ प्रवाह प्रणाली से गुजरने के बाद सिग्नल कैसे बदल जाएगा। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 6: MATLAB फ़ाइल: Stirred_Tank_Fit.एम. यह स्क्रिप्ट उपयोगकर्ता द्वारा फार्माकोकाइनेटिक डेटा इनपुट के लिए एक सीएसटीआर आरटीडी वक्र फिट बैठती है और दिए गए प्रवाह दर के लिए आरटीडी का उत्पादन करने के लिए आवश्यक टैंक वॉल्यूम लौटाती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह काम एक विशिष्ट उदाहरण के साथ प्रदर्शित कई मध्यम स्रोतों के साथ एक छिड़काव सेल संस्कृति प्रणाली की असेंबली और संचालन का वर्णन करता है जिसमें टीएनएफ-α की क्षणिक नाड़ी के जवाब में एनएफ-κबी-संचालित जीन अभिव्यक्ति की गतिशीलता को मापा गया था। छिड़काव प्रणाली घटकों के आरटीडी को मापा और मॉडलिंग किया गया था, और सिग्नल कन्वोल्यूशन का उपयोग टीएनएफ-α पल्स और एकत्रित प्रवाह माध्यम अंशों में टीएनएफ-α वितरण दोनों के लिए कोशिकाओं के जोखिम की भविष्यवाणी करने के लिए किया गया था। कोशिकाओं को नाड़ी के संपर्क में लाया गया था और अंशों को 40 घंटे के लिए एकत्र किया गया था, जिसके बाद जीएलयूसी को अंशों में मापा गया था और उत्तेजना-प्रतिक्रिया गतिशीलता को प्रकट करने के लिए अनुमानित टीएनएफ-α सिग्नल के साथ प्लॉट किया गया था।

यह छिड़काव विधि कमियों के बिना नहीं है। विशेष रूप से, सिस्टम महत्वपूर्ण संक्षिप्त चरण के कारण बाँझपन जोखिम वहन करता है जिसमें इनक्यूबेटर के भीतर स्थापित होने के बाद ट्यूबिंग अच्छी तरह से प्लेट से जुड़ा होता है। लेखकों के अनुभव में, संदूषण काफी दुर्लभ है; फिर भी, संदूषण जोखिम को निम्नलिखित तरीकों से कम किया जा सकता है। पहला एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में सभी सेल हैंडलिंग प्रक्रियाओं और बाँझ कनेक्शन करना है। बाँझपन में सुधार करने के लिए विचार किया जा सकता है कि एक अतिरिक्त एहतियात सेल संस्कृतियों के इनलेट पर लाइन में एक 0.22 μm सिरिंज फिल्टर का समावेश है। बाँझ निस्पंदन का उपयोग सेल संस्कृति में प्रवेश करने से पहले माध्यम में मौजूद बैक्टीरिया या बड़े सूक्ष्मजीवों को फंसाएगा, हालांकि यह प्रवाह को चलाने के लिए दबाव आवश्यकताओं को बढ़ाता है और झिल्ली के फाउलिंग के कारण बंद हो सकता है। संदूषण के जोखिम पर खुले वातावरण में आउटगोइंग नमूने भी एकत्र किए जाते हैं। एक संलग्नक प्रणाली में नमूनों का संग्रह, आदर्श रूप से वायु निस्पंदन के साथ, विभाजन मॉड्यूल के लिए भविष्य के सिस्टम बिल्ड में इस मुद्दे को समाप्त कर देगा।

इसके अलावा, कोशिकाओं द्वारा स्रावित संकेतों को डाउनस्ट्रीम ट्यूबिंग के आरटीडी के अनुसार विकृत किया जाता है, इससे पहले कि वे विभाजित और मापा जाए। इस प्रकार, मापा संकेत कोशिकाओं द्वारा स्रावित लोगों के धुंधले संस्करण हैं। सैद्धांतिक रूप से, डाउनस्ट्रीम आरटीडी14 के प्रभाव को हटाने के लिए मापा सिग्नल पर डिकॉन्वोल्यूशन करके इस स्मीयरिंग को पूर्ववत किया जा सकता है, लेकिन इस संख्यात्मक तकनीक को गैर-आदर्श डेटा पर सफलतापूर्वक लागू करना मुश्किल है क्योंकि सिग्नल शोर बहुत प्रवर्धित हो जाता है। हालांकि, ब्याज की कई जैविक गतिशीलता घंटों के टाइमस्केल पर दसियों घंटे तक प्रकट होती है, और इस प्रकार ट्यूबिंग आरटीडी के स्मीयरिंग प्रभावों से बहुत कम प्रभावित होती है, समय में स्थानांतरित हो जाती है लेकिन आकार में थोड़ा बदल जाती है। यहां दिखाए गए आरटीडी माप विधि को छोटे ट्रेसर दालों का उपयोग करके और पृष्ठभूमि समाधान और ट्रेसर पदार्थों का उपयोग करके भी सुधार किया जा सकता है जो सेल संस्कृति प्रयोगों में उपयोग किए जाएंगे। हालांकि, यहां सुझाए गए पल्स समय को सभी छोटे पल्स समय के लिए समान आरटीडी देने के लिए दिखाया गया है और इसलिए आरटीडी माप के लिए उपयुक्त हैं, लेकिन जैसे-जैसे पल्स समय बढ़ता है, आरटीडी अधिक महत्वपूर्ण रूप से बदलते हैं और इसलिए इसका उपयोग नहीं किया जाना चाहिए। लेखकों ने पहले पाया है कि खाद्य डाई और जीएलयूसी दोनों में पानी और संस्कृति माध्यम11 दोनों में एक दूसरे के समान आरटीडी हैं, इसलिए आणविक प्रजातियां आरटीडी को बहुत बदलने की संभावना नहीं है। अंत में, 20 डिग्री सेल्सियस बनाम 37 डिग्री सेल्सियस पर मापा जाने पर पानी में खाद्य डाई के लिए आरटीडी में कोई अंतर नहीं देखा गया था, या सीधे ट्यूबिंग बनाम अत्यधिक कुंडलित ट्यूबिंग11 में। ये डेटा, और छिड़काव प्रणाली ज्यामिति और प्रवाह दरों की एक श्रृंखला के लिए आरटीडी डेटा, लेखकों के पिछले प्रकाशन11 में पाया जा सकता है, साथ ही इस पत्र में आरटीडी विश्लेषण स्क्रिप्ट द्वारा किए गए कार्यों की विस्तृत व्याख्या के साथ। आरटीडी विश्लेषण सिद्धांत 13 और बायोरिएक्टर सिस्टम 17,18,19,20,21 के लिए आरटीडी के अनुप्रयोगों के उदाहरणों के बारे में अधिक जानकारी प्रदान किए गए संदर्भों में पाई जा सकती है।

इस बहुमुखी विधि का उपयोग सेल संस्कृतियों में घुलनशील पदार्थों के स्राव या अवशोषण दर को मापने के लिए किया जा सकता है, और अपस्ट्रीम मध्यम स्रोतों को स्विच करके संस्कृतियों को क्षणिक विलेय संकेत दिए जा सकते हैं। सरल संकेत जैसे विलेय दालें या चरण परिवर्तन इनलेट वाल्व को स्विच करके वितरित किए जा सकते हैं। फार्माकोकाइनेटिक जैसे संकेतों को संस्कृति के ऊपर की ओर उपयुक्त तरल मात्रा के साथ एक उत्तेजित टैंक रखकर और इसके माध्यम से एक विलेय नाड़ी वितरित करके उत्पादित किया जा सकता है। दालों को वांछित आकार में विकृत करने के लिए उपन्यास आरटीडी के साथ दालों, चरण परिवर्तनों और घटकों के विभिन्न संयोजनों को लागू करके अन्य संकेत बनाए जा सकते हैं। मौजूदा स्थैतिक सेल संस्कृति विधियां लगातार एक स्वचालित फैशन में मध्यम नमूने एकत्र करने में असमर्थ हैं और कोशिकाओं को आसानी से अलग-अलग विलेय संकेतों को उजागर करने के लिए उपयोग नहीं किया जा सकता है। माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम महंगे हैं और विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है, और प्रयोगों के इस वर्ग के लिए कोई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मैक्रोफ्लुइडिक सिस्टम मौजूद नहीं है। प्राकृतिक सेल व्यवहार, आवेग प्रतिक्रियाओं, विभिन्न क्षणिक विलेय प्रोफाइल के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए प्रयोगशालाओं द्वारा कम लागत वाली, सरल प्रणाली को अपनाया जा सकता है जो दवाओं या अंतर्जात विलेय सिग्नल गतिशीलता की नकल कर सकते हैं, और उपन्यास प्रयोगों की जरूरतों को पूरा करने के लिए पुन: कॉन्फ़िगर किया जा सकता है। इस तकनीक के भविष्य के अनुप्रयोगों और वर्तमान में चल रहे लोगों में शामिल हैं: एक पूर्व विवो सेल थेरेपी से साइटोकिन्स और एक्सोसोम की स्राव दर गतिशीलता को मापना; दवाओं के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया पर सर्कैडियन घड़ी के समय के प्रभाव का आकलन करना; बैक्टीरियल बायोफिल्म्स की वृद्धि दर और चयापचय को मापना; इन विट्रो में एडेनो-जुड़े वायरस (एएवी) वैक्टर के लिए खुराक-प्रतिक्रिया घटता का उत्पादन; उत्पादक कोशिकाओं से लेंटिवायरल वैक्टर की गतिशील उत्पादन दर को मापना; और सटीक कैंसर थेरेपी के लिए व्यक्तिगत दवा बायोप्सी में फार्माकोकाइनेटिक कीमोथेरेपी दवा प्रोफाइल को शामिल करना।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

यह शोध ग्रांट नं. राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान से आर 01 ईबी 012521, आर 01 ईबी 028782, और टी 32 जीएम 008339।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 Gauge 1 1/2- in Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines Grainger 5FVK2
293T Cells ATCC CRL-3216 HEK 293T cells used in the Representative Results experiment.
96-Well Clear Bottom Plates, Corning VWR 89091-010 Plates for measuring dye concentrations in RTD experiments and GLuc in representative results experiment.
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 5 mL Fisher Scientific 14-829-45
BioFrac Fraction Collector  Bio-Rad 7410002 Fraction collector that can be used for a single stream, or modified using our method to enable collection from multiple streams.
Clear High-Strength UV-Resistant Acrylic 12" x 12" x 1/8" McMaster-Carr 4615T93 This sheet is cut using a laser cutter according to the DXF file in the supplemental materials to produce the multi-head dispenser that can be attached to the BioFrac fraction collector.
Coelenterazine native NanoLight Technology 303 Substrate used in Gaussia luciferase bioluminescence assay in representative results.
Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, size 48 wells, polystyrene plate, flat bottom wells Millipore Sigma CLS3548 Used to grow and perfuse 293T cells in representative results.
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells Fisher Scientific 720081 Can be plugged and used as a stirred tank to produce pharmacokinetic profiles in perfusion. Can also contain cells for perfusion.
DMEM, high glucose ThermoFisher Scientific 11965126
Epilog Zing 24 Laser Cutting Edge Systems Epilog Zing 24 Laser cutter used to produce multi-head dispenser from acrylic sheet. Other laser cutters may be used.
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 20 mL Fisher Scientific 14-955-460
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 60 mL Fisher Scientific 14-955-461
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-129 Microcentrifuge tubes for collecting fractions.
Fisherbrand Round Bottom Disposable Borosilicate Glass Tubes with Plain End Fisher Scientific 14-961-26 Glass tubes for collecting fractions.
Fisherbrand SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-Filtered Fisher Scientific 2707410 300 ul pipette tips that best fit the multi-head dispenser and tubing to act as dispensing tips.
Gibco DPBS, powder, no calcium, no magnesium Fisher Scientific 21600010 Phosphate buffered saline.
Labline 4625 Titer Shaker Marshall Scientific Labline 4625 Titer Shaker Orbital shaker used to keep stirred tanks mixed.
Masterflex Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile; 10/PK Cole-Parmer EW-30600-04 Used to join multiple inlet streams for RTD experiments and cell culture experiments.
Masterflex Fitting, Polycarbonate, Straight, Female Luer x Cap; 25/PK Masterflex UX-45501-28
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hosebarb Adapters, 1/16" Cole-Parmer EW-45508-00
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Hosebarb Adapter, 1/16" ID Cole-Parmer EW-45518-00
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Plug Adapter; 25/PK Masterflex EW-30800-30
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 14; 25 ft Masterflex EW-96410-14
MATLAB MathWorks R2019b Version R2019b. Newer versions may also be used. Some older versions may work.
NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump New Era Pump Systems NE-1600
Rack Set F1 Bio-Rad 7410010 Racks to hold collecting tubes in the fraction collector.
Recombinant Human TNF-alpha (HEK293-expressed) Protein, CF Bio-Techne 10291-TA-020 Cytokine used to stimulate 293T cells in representative results.
Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 00, Bottom 10.5mm Saint Gobain DX263015-50 Fits 48-well plates.
Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 4 Bottom 21mm Saint Gobain DX263027-10 Fits 12-well plates.
Sodium Hydroxide, 10.0 N Aqueous Solution APHA; 1 L Spectrum Chemicals S-395-1LT
SolidWorks Dassault Systems SolidWorks CAD software used to create the multi-head dispenser DXF file.
Varioskan LUX multimode microplate reader ThermoFisher Scientific VL0000D0 Plate reader.
Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue Michaels 10404779 Blue food dye containing Brilliant Blue FCF, used as a tracer in RTD experiments. Absorbance spectrum peaks at 628 nm.

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 185
मल्टी-स्ट्रीम छिड़काव बायोरिएक्टर गतिशील सेल संस्कृति के लिए आउटलेट विभाजन के साथ एकीकृत
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Erickson, P., Doshi, A., Jetley, G., … More

Erickson, P., Doshi, A., Jetley, G., Amin, P., Mejevdiwala, A., Patel, A., Bento, R., Parekkadan, B. Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture. J. Vis. Exp. (185), e63935, doi:10.3791/63935 (2022).

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