Summary
تقدم هذه الورقة طريقة لبناء وتشغيل نظام منخفض التكلفة متعدد القنوات لزراعة خلايا التروية لقياس ديناميكيات إفراز ومعدلات امتصاص المذابات في العمليات الخلوية. يمكن للنظام أيضا تعريض الخلايا لملفات تعريف التحفيز الديناميكية.
Abstract
تعمل بعض وظائف الخلايا والأنسجة ضمن النطاق الزمني الديناميكي من دقائق إلى ساعات يتم حلها بشكل سيئ بواسطة أنظمة الزراعة التقليدية. وقد طور هذا العمل نظاما منخفض التكلفة للمفاعل الحيوي للتروية يسمح بدمج وسط الاستزراع باستمرار في وحدة زراعة الخلايا وتقسيمه في وحدة المصب لقياس الديناميكيات على هذا النطاق. تم بناء النظام بالكامل تقريبا من الأجزاء المتاحة تجاريا ويمكن موازاته لإجراء تجارب مستقلة في لوحات زراعة الخلايا التقليدية متعددة الآبار في وقت واحد. توضح مقالة الفيديو هذه كيفية تجميع الإعداد الأساسي ، والذي لا يتطلب سوى مضخة حقنة واحدة متعددة القنوات وجامع أجزاء معدل لدمج ما يصل إلى ست ثقافات بالتوازي. كما يتم تقديم متغيرات مفيدة على التصميم المعياري تسمح بديناميكيات التحفيز التي يتم التحكم فيها ، مثل النبضات المذابة أو الملامح الشبيهة بالحرائك الدوائية. الأهم من ذلك ، عندما تنتقل الإشارات المذابة عبر النظام ، فإنها مشوهة بسبب تشتت المذاب. علاوة على ذلك ، يتم وصف طريقة لقياس توزيعات وقت الإقامة (RTDs) لمكونات إعداد التروية باستخدام جهاز تتبع باستخدام MATLAB. RTDs مفيدة لحساب كيفية تشويه الإشارات المذابة بسبب التدفق في نظام المقصورات المتعددة. هذا النظام قوي للغاية وقابل للتكرار ، لذلك يمكن للباحثين الأساسيين اعتماده بسهولة دون الحاجة إلى مرافق تصنيع متخصصة.
Introduction
تحدث العديد من العمليات البيولوجية الهامة في مزارع الخلايا والأنسجة على مقياس زمني من دقائق إلى ساعات 1,2,3. في حين أن بعض هذه الظواهر يمكن ملاحظتها وتسجيلها بطريقة آلية باستخدام المجهربفاصل زمني 4 أو التلألؤ الحيوي1 أو طرق أخرى ، فإن التجارب التي تنطوي على جمع عينات من المستنبتات الفائقة للتحليل الكيميائي غالبا ما يتم إجراؤها يدويا في مزارع الخلايا الثابتة. يحد أخذ العينات اليدوي من جدوى بعض الدراسات بسبب إزعاج النقاط الزمنية المتكررة أو بعد ساعات العمل. وتشمل أوجه القصور الأخرى في أساليب الزراعة الثابتة التجارب التي تنطوي على التعرض الخاضع للرقابة والعابرة للمحفزات الكيميائية. في الثقافات الثابتة ، يجب إضافة المحفزات وإزالتها يدويا ، وتقتصر ملفات تعريف التحفيز على تغييرات الخطوة بمرور الوقت ، بينما تضيف التغييرات المتوسطة أيضا مكونات متوسطة أخرى وتزيلها ، والتي يمكن أن تؤثر على الخلايا بطريقة غير منضبطة5. يمكن للأنظمة الموائعة التغلب على هذه التحديات ، لكن الأجهزة الحالية تشكل تحديات أخرى. تأتي أجهزة الموائع الدقيقة مع التكاليف الباهظة للمعدات المتخصصة والتدريب على الإنتاج والاستخدام ، وتتطلب أساليب التحليل الدقيق لمعالجة العينات ، ويصعب استرداد الخلايا من الأجهزة بعد التروية6. تم إنشاء عدد قليل من أنظمة الموائع الكبيرة لأنواع التجارب الموضحة هنا7،8،9،10 ، وهي مبنية من أجزاء مخصصة متعددة مصنوعة داخليا وتتطلب مضخات متعددة أو جامعي كسر. علاوة على ذلك ، فإن المؤلفين ليسوا على دراية بأي أنظمة متاحة تجاريا لزراعة خلايا التروية الموائع الكبيرة بخلاف المفاعلات الحيوية للخزانات المقلوبة لزراعة التعليق ، والتي تعد مفيدة للتصنيع الحيوي ، على الرغم من أنها ليست مصممة لنمذجة ودراسة علم وظائف الأعضاء.
وكان المؤلفون قد أبلغوا سابقا عن تصميم نظام مفاعل حيوي منخفض التكلفة للإرواء يتكون بالكامل تقريبا من الأجزاء11 المتاحة تجاريا. تمكن النسخة الأساسية من النظام من الاحتفاظ بثقافات متعددة في صفيحة بئر في حاضنة CO2 ودمجها باستمرار مع وسيط من مضخة حقنة ، في حين يتم تقسيم تيارات وسط النفايات السائلة من الثقافات تلقائيا إلى عينات بمرور الوقت باستخدام جامع أجزاء مع تعديل مخصص. وبالتالي ، يتيح هذا النظام أخذ عينات آلية من المدخلات المتوسطة للثقافة الفائقة والمذابة المستمرة للثقافات بمرور الوقت. النظام هو macrofluidic ووحدات ويمكن تعديله بسهولة لتلبية احتياجات تصاميم التجارب الجديدة.
الهدف العام للطريقة المعروضة هنا هو بناء وتوصيف واستخدام نظام زراعة خلايا التروية الذي يتيح إجراء تجارب يتم فيها قياس معدلات إفراز أو امتصاص المواد بواسطة الخلايا بمرور الوقت ، و / أو تعرض الخلايا لإشارات مذابة دقيقة وعابرة. تشرح مقالة الفيديو هذه كيفية تجميع الإعداد الأساسي ، القادر على اختراق ما يصل إلى ست مزارع خلايا في وقت واحد باستخدام مضخة حقنة واحدة وجامع أجزاء معدلة. كما يتم عرض متغيرين مفيدين على النظام الأساسي يستخدمان مضخات وأجزاء إضافية للسماح بإجراء تجارب تعرض الخلايا لإشارات تركيز ذائبة عابرة ، بما في ذلك النبضات القصيرة والملامح الشبيهة بالحركية الدوائية12 ، كما هو موضح في الشكل 1.
الشكل 1: ثلاثة اختلافات في تصميم نظام التروية. (أعلى) نظام التروية الأساسي. (الوسط) نظام التروية مع stopcock لمصادر متوسطة متعددة. (أسفل) نظام التروية مع خزان مقلب لتقليد حجم مختلط جيدا من التوزيع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
بسبب التشتت والانتشار داخل التدفق ، تصبح الإشارات المذابة مشوهة أو "ملطخة" أثناء انتقالها عبر نظام التدفق. ويمكن تحديد هذا التشويه كميا من خلال استخدام توزيعات وقت الإقامة (RTDs)13. تشرح هذه المقالة كيفية إجراء تجارب التتبع على مكونات نظام التروية (الشكل 2)، وتوفر البرامج النصية MATLAB لإنشاء RTDs من البيانات المقاسة. ويمكن الاطلاع على شرح مفصل لهذا التحليل في الورقة السابقةللمؤلفين رقم 11. تناسب نصوص MATLAB الإضافية الوظائف المناسبة ل RTDs وتستخرج المعلمات الفيزيائية ، وتؤدي التفاف الإشارة باستخدام RTDs للتنبؤ بكيفية انتشار وتشويه إدخال الإشارة المذاب من قبل المستخدم من خلال نظام التروية14.
الشكل 2: توزيعات وقت الإقامة. يتم قياس RTDs لمكونات نظام التدفق ، مثل طول الأنابيب هذا ، عن طريق إدخال نبضة من المقتفي إلى النظام وقياس كيفية "تلطيخها" بحلول الوقت الذي تخرج فيه إلى الكسور التي تم جمعها. وقد عدل هذا الرقم من Erickson et al.11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد أجزاء لتروية لوحة البئر
- إعداد الأنابيب
- قطع طولين من أنابيب السيليكون (القطر الداخلي 1.6 مم) لكل مزرعة خلية ليتم اختراقها. تأكد من أن القطعة المستخدمة كأنبوب المنبع طويلة بما يكفي للوصول من مضخة المحاقن إلى مزرعة الخلايا داخل الحاضنة ، وأن القطعة النهائية يمكن أن تصل من مزرعة الخلايا إلى أبعد موضع ممتد لجامع الكسر.
- امنح كل قطعة من الأنابيب ملصقا فريدا على طرفيها بشريط لاصق.
- تحضير سدادات للوحة البئر
- احصل على سدادة سيليكون واحدة لكل بئر من صفيحة البئر ليتم اختراقها ، مع قطر مناسب ليتناسب بشكل مريح مع الآبار مع ختم محكم الإغلاق.
- اقطع المواد الزائدة من قيعان السدادة بحيث تتناسب مع الآبار مع ترك مساحة في الداخل للهواء فوق مستوى السائل المقصود.
- ادفع إبرتين حادتين بوزن 18 جراما من خلال كل سدادة ، إلى الأعلى والخارج من الأسفل لتكون بمثابة مدخل ومخرج للتدفق عبر البئر ، مقابل بعضهما البعض تماما لزيادة المسافة بين أطرافها داخل البئر.
- اضبط ارتفاعات الإبر داخل البئر الموصول ، حيث سيحدد ارتفاع إبرة المخرج الارتفاع المستقر لمستوى السائل في البئر أثناء التروية.
ملاحظة: إذا بدأ التروية بإبرة المخرج فوق مستوى السائل ، فسوف يتراكم السائل في البئر حتى يصل المستوى إلى الإبرة. إذا بدأ التروية بإبرة المخرج تحت مستوى السائل ، فسيبقى مستوى السائل ثابتا ما لم تتدفق فقاعات الهواء إلى البئر ، مما سيؤدي إلى انخفاض ارتفاع السائل حتى يكون نفس ارتفاع إبرة المخرج.
- جمع أجزاء إضافية
- احصل على حقنة معقمة واحدة لكل مزرعة خلية ليتم تشغيلها وهي كبيرة بما يكفي لاحتواء وسط كاف للتروية بأكملها ، بالإضافة إلى كمية إضافية من الوسط لملء الأنابيب في البداية.
- لكي يتم الاطلاع على كل ثقافة ، احصل على موصل Luer واحد من الإناث إلى الانتقادات اللاذعة وموصلين من الذكور إلى اللوح ، بالإضافة إلى اثنين من الإناث واثنين من قبعات Luer للذكور.
- تنظيف وتعقيم الأجزاء
- إذا تم استخدام الأجزاء من قبل ، فقم بتنظيفها عن طريق دمجها ب 0.1 N NaOH ، تليها شطف بالماء منزوع الأيونات.
- عن طريق التعقيم أو غير ذلك ، تأكد من عقم جميع الأجزاء المذكورة أعلاه.
2. قطع الموزع متعدد الرؤوس بالليزر وإرفاقه بجامع الكسر
- أعد إنشاء نموذج موزع متعدد الرؤوس من الشكل 3 في برنامج تصميم بمساعدة الكمبيوتر أو قم بتنزيل ملف DXF للنموذج المقدم (الملف التكميلي 1).
- استخدم قاطع ليزر لقطع التصميم من 1/8 في ورقة أكريليك.
- قم بإزالة البراغي الثلاثة التي تربط رأس التوزيع بالقاعدة المتحركة لجامع الكسور.
- قم بمحاذاة أصغر ثلاثة ثقوب في الموزع متعدد الرؤوس مع ثقوب المسمار في القاعدة المتحركة ، وقم بربط البراغي مرة أخرى من خلال الثقوب لتثبيتها.
- اضبط ضيق البراغي الثلاثة لزاوية الموزع متعدد الرؤوس لأعلى ولأسفل حتى يتم محاذاة صف فتحات التوزيع مع أنابيب التجميع الموجودة أسفله.
- ضع بعناية 300 ميكرولتر من أطراف الماصة من خلال الثقوب المطلوبة لتكون بمثابة نصائح للتوزيع.
ملاحظة: يمكن استخدام جامع الكسور بدون موزع متعدد الرؤوس لدمج مزرعة خلية واحدة.
3. قياس RTDs المكون وإجراء التفاف الإشارة
- قم بإعداد مضخات ومحاقن لنبض التتبع كما هو موضح في الشكل 2.
- احصل على مضختي محاقن أحادية القناة أو متعددة القنوات.
- اختر حلا للخلفية لتمثيل الوسط الذي سيتم استخدامه في نظام التدفق أثناء تجارب زراعة الخلايا. تأكد من أن حل الخلفية له خصائص نقل كتلة مماثلة للوسيط. في كثير من الحالات ، يكون الماء منزوع الأيونات خيارا مناسبا.
- اختر مادة تتبع لتمثيل المذاب الذي سيكون ذا أهمية أثناء تجارب زراعة الخلايا. تأكد من أن المقتفي له خصائص نقل كتلة مماثلة للمذاب ذي الاهتمام ، ويجب أن يكون تركيزه قابلا للقياس. في كثير من الحالات ، تكون صبغة الطعام خيارا مناسبا.
- قم بإذابة مادة التتبع في محلول الخلفية لصنع محلول التتبع.
- املأ حقنة واحدة بمحلول خلفية وقم بتحميلها في مضخة حقنة واحدة. املأ حقنة أخرى بمحلول التتبع وقم بتحميلها في مضخة المحقنة الثانية.
- قم بتوصيل كلا الحقنتين باثنين من المنافذ الثلاثة لجهاز إيقاف رباعي الاتجاهات باستخدام موصلات Luer.
- أغلق السدادة على محلول الخلفية وضخ محلول التتبع في المتوقف حتى يبدأ في التنقيط خارج المنفذ المفتوح. أوقف المضخة ولا تقم بضبط المحقنة أكثر.
ملاحظة: من المهم أن يتم دفع الشريط المتحرك لمضخة المحقنة لأعلى ضد غطاسات المحقنة قبل بدء الأجزاء الموقوتة من التجربة. سيسمح ذلك ببدء التدفق على الفور عند بدء تشغيل المضخة. خلاف ذلك ، قد يتم تشغيل المضخة ، ولكن التدفق لن يبدأ فعليا حتى يلحق الشريط المتحرك بموضع المكبس. - أغلق الموقوف على محلول التتبع وقم بضخ محلول الخلفية في المتوقف حتى يتم طرد جميع حلول التتبع المتبقية من المنفذ المفتوح. أوقف المضخة ولا تقم بضبط المحقنة أكثر.
- إعداد مكون نظام التدفق محل الاهتمام وجامع الكسور
- قم بإعداد مكون نظام التدفق المطلوب لتحليل RTD. تأكد من أن المكون المراد قياسه ينتهي بقطعة من أنابيب المصب ذات الطول والمرونة المناسبين للوصول إلى جامع الكسور أثناء التشغيل.
- أدخل نهاية أنبوب المصب في موزع طرف ماصة في موزع متعدد الرؤوس بحيث يكون متصلا بشكل مريح.
- قم بتوصيل المنفذ المفتوح لجهاز التوقف رباعي الاتجاهات بمدخل المكون المراد قياسه. قم بضخ محلول الخلفية من خلال المكون حتى يتم ملؤه بالكامل كما هو الحال أثناء تجربة زراعة الخلايا ، ويبدأ في التنقيط من طرف توزيع جامع الكسور. أوقف المضخة.
- حقن نبض المقتفي، وجمع الكسور، وقياس المقتفي
- اضبط مضخة محلول التتبع على معدل التدفق المطلوب. أغلق الموقوف إلى حل الخلفية وابدأ تدفق حل التتبع. في الوقت نفسه ، ابدأ جامع الكسور.
- استمر في تدفق محلول التتبع لفترة قصيرة من الزمن لتقريب إدخال الدافع للمقتفي. تم العثور على مدة نبض مدتها 10 دقائق تعمل بشكل جيد مع RTDs بمعدل تدفق 1 مل / ساعة.
ملاحظة: إذا كان نبض المقتفي قصيرا جدا، فلن يدخل المقتفي الكافي إلى التدفق ليكون قابلا للقياس. إذا كان النبض طويلا جدا ، فلن يقترب بعد الآن من الدافع وسيغير شكل RTD. - في نهاية فترة نبض محلول التتبع ، أوقف مضخة محلول التتبع. أغلق السدادة بسرعة إلى حل التتبع وابدأ تدفق محلول الخلفية بنفس معدل التدفق.
- اسمح لمحلول الخلفية بالتدفق وجمع الكسور حتى يمر كل المقتفي عبر النظام وإلى الكسور التي تم جمعها.
- أوقف النظام وقم بقياس تركيز المقتفي في الكسور. تشمل فقط الكسور التي تم الاستغناء عنها بالكامل. إذا تم إيقاف المجموعة جزئيا من خلال جمع كسر، فلا تقم بتضمين هذا الكسر.
- حساب توزيع وقت الإقامة (RTD) من البيانات المقاسة في MATLAB
ملاحظة: يمكن العثور على شرح مكتوب للتحليل الذي أجراه نص MATLAB هذا في المنشور السابق للمؤلفين11 ، وتتوفر مناقشات النظرية على نطاق واسع في الأدبيات13.- إنتاج ملف .xlsx يحتوي على بيانات التركيز بتنسيق جدول بيانات example_tracer_data.xlsx المتوفر في الملف التكميلي 2. أدخل قيم تركيز المقتفي في الكسور (أي وحدات) بترتيب زمني من اليسار إلى اليمين في الصف 2. أدخل الوقت المنقضي من بداية النبضة إلى نهاية الكسر الأخير في الخلية A5، وأدخل طول نبضة المقتفي بالدقائق في الخلية A8.
- احفظ ملف .xlsx في دليل MATLAB.
- افتح البرنامج النصي RTD_From_Data.m، من الملف التكميلي 3، في محرر MATLAB.
- استبدل اسم ملف .xlsx الموجود بين قوسين في السطر الأول من قسم تحميل البيانات من البرنامج النصي باسم ملف بيانات .xlsx الجديد، باتباع الإرشادات المكتوبة داخل ملف البرنامج النصي. قم بتشغيل البرنامج النصي.
- تأكد من أن البرنامج النصي ينفذ بنجاح تحليل RTD13 ، مما ينتج مخططا ل RTD ويعيد قيمة التكامل العددي على RTD يساوي 1. ابحث عن متجه الوقت (t) ومتجه قيم RTD المقترن (Et) المحفوظ بواسطة البرنامج النصي في دليل MATLAB.
- ملاءمة دالة نموذج ل RTD في MATLAB
- افتح البرنامج النصي Fit_RTD_Function.m في محرر MATLAB من الملف التكميلي 4.
- اختر واحدة من وظائف النموذج الثلاث المعلقة لتتناسب مع RTD: نموذج التشتت المحوري13 ، الذي يناسب RTDs للتدفق الرقائقي في أنابيب أسطوانية ؛ نموذج CSTR13 ، الذي يناسب الدبابات التي يتم تحريكها جيدا ؛ ونموذج n-CSTR15 ، الذي يناسب تقريبا لوحات الآبار الأكبر. لاحتواء نموذج آخر غير مضمن هنا، أضفه إلى البرنامج النصي بنفس التنسيق.
- قم بإزالة التعليقات الموجودة في قسم البرنامج النصي الذي يحتوي على النموذج المختار للتركيب.
- تغيير قيم التخمينات الأولية للمعلمات إلى قيم مناسبة ل RTD.
- قم بتشغيل البرنامج النصي لإنتاج مخطط لدالة الملاءمة المتراكبة على بيانات RTD ولطباعة قيم معلمة الملاءمة للدالة. إذا كان الملاءمة ضعيفا جدا أو حدثت أخطاء ، فقم بتغيير التخمينات الأولية للمعلمة وقم بتشغيل البرنامج النصي مرة أخرى.
- إجراء التفاف الإشارة في MATLAB
- اختر إما إشارة واحدة و RTD واحدة أو اثنين من RTDs للمشاركة.
- افتح البرنامج النصي Signal_Convolution.m، من الملف التكميلي 5، في محرر MATLAB.
- بالنسبة لكل من الإشارتين المراد الالتفاف بينهما (أي إشارة واحدة و RTD واحدة ، أو اثنين من RTDs) ، حدد متجها واحدا من النقاط الزمنية المتباعدة بالتساوي في الوحدات المطلوبة ومتجها مقابلا لقيم الإشارة في تلك الأوقات.
ملاحظة: يجب أن يكون لمتجهات الإشارتين نفس عدد العناصر ونفس خطوات وقت الحجم. هذا هو السبب في أنه من المفيد أن يكون RTD كدالة مستمرة يمكن أخذ عينات منها لعدد تعسفي من النقاط في أي فاصل زمني. - أدخل الإشارتين في MATLAB وقم بتشغيل البرنامج النصي للحصول على متجهات الوقت والإشارة لإشارة الإخراج.
4. إعداد نظام التروية الأساسي مع الخلايا في لوحة البئر
- تحضير طبق البئر
- تأكد من أن زراعة صفيحة البئر لديها العمق المتوسط المناسب لتجربة التروية. قم بإجراء أي تغييرات متوسطة نهائية أو محفزات أو خطوات أخرى حسب الرغبة قبل البدء في التروية. إذا كانت خلايا التعليق تنصهر ، فقم بطرد مركزي اللوحة للتأكد من أنها في القاع.
- في ظل ظروف معقمة ، أدخل السدادات بالإبر في مزارع لوحة البئر مع سحب الإبر. بعد أن تكون السدادة في مكانها ، اخفض الإبر إلى الارتفاع المطلوب للتروية ، حيث يحدد ارتفاع إبرة المخرج مستوى السائل المستقر.
- قم بتغطية الإبر بأغطية Luer الذكرية واحتفظ بلوحة البئر بأكملها في حاضنة حتى الاستخدام.
- تحضير المحاقن وأنابيب المنبع
- في ظل ظروف معقمة، املأ حقنة واحدة لكل مزرعة ليتم دمجها بوسط كاف للمدة المطلوبة من التروية، بالإضافة إلى وسط إضافي كاف لملء أنبوب المنبع.
- قم بتوصيل أنبوب المنبع بالحقنة باستخدام موصل Luer من أنثى إلى بارب. على الطرف الآخر من الأنبوب، أدخل موصل Luer من الذكور إلى الشرائح.
- قم بتوزيع الوسط من المحقنة حتى يمتلئ أنبوب المنبع بالكامل بالمتوسط.
- قم بتغطية الطرف المفتوح من الأنبوب بغطاء Luer أنثى.
ملاحظة: يجب أن يكون لجميع المحاقن المكررة نفس وحدة التخزين بالضبط في هذه المرحلة. إذا لم تكن أحجامها متساوية ، فستكون الغطاسات الخاصة بها في مواضع مختلفة ، ولن تتناسب جميعها بشكل جيد مع مضخة حقنة واحدة متعددة القنوات.
- في ظل الظروف المعقمة، أدخل موصل Luer من الذكور إلى القضبان في أحد طرفي الأنابيب السفلية، وقم بتغطيته بغطاء Luer أنثوي.
- أحضر بعناية جميع الأنابيب والمحاقن ولوحة البئر المعدة إلى الحاضنة التي سيتم استخدامها للتروية.
- ضع مضخة المحقنة وجامع الكسر في المواقع المطلوبة بالقرب من الحاضنة. ضع مضخة المحقنة فوق الحاضنة أو بالقرب منها ، وضع جامع الكسر بجوار الحاضنة ، بالقرب من الميناء.
- قم بتجميع الأطراف المغطاة لجميع أنابيب المنبع والمصب معا وادفعها من خارج الحاضنة إلى الداخل من خلال المنفذ.
- قم بتحميل المحاقن في مضخة المحاقن وأدخل الأطراف المفتوحة للأنابيب النهائية في أطراف ماصة التوزيع الخاصة بموزع الرؤوس المتعددة لمجمع الكسور.
- داخل الحاضنة ، اسحب أكبر قدر ممكن من الركود في أنابيب المنبع إلى الحاضنة لزيادة طول الأنابيب التي يمكن من خلالها للوسط المتدفق تلقي الحرارة و CO2 من هواء الحاضنة. أثناء تثبيتها في مكانها ، اسحب أنابيب المصب من الحاضنة ، بما يكفي فقط حتى تتمكن من الوصول إلى أبعد نقطة ممتدة على جامع الكسور مع الحفاظ على النهايات المغطاة داخل الحاضنة.
- لكل بئر موصول ، قم بفك الغطاء بسرعة الإبر وأنابيب المنبع والمصب لهذا البئر وقم بتوصيلها مع موصلات Luer الخاصة بها.
- بمجرد توصيل جميع الأجزاء ، قم بتشغيل مضخة المحقنة لفترة وجيزة بسرعة عالية نسبيا لضمان تدفق جميع التيارات بشكل صحيح.
- في هذه المرحلة ، إذا كان من المرغوب فيه بدء التجربة باستخدام أنابيب المصب المليئة بالوسط ، فاستمر في تشغيل المضخة حتى يتم ملء كل شيء. خلاف ذلك ، أوقف المضخة.
- اضبط معدل تدفق مضخة المحقنة وتواتر جمع الكسور وابدأ تشغيل كلا الجهازين في وقت واحد لبدء التجربة. جمع الكسور لمدة التجربة المطلوبة.
5. قم بإعداد نظام التروية باستخدام stopcock لمصادر متوسطة متعددة
- قم بتنفيذ كافة الخطوات الفرعية للخطوة 4.1 أعلاه.
- قم بإعداد الوسائطين لاستخدامهما في التروية ، مع وضع علامة على الوسيط الذي سيتم توزيعه أولا على أنه 1 ، والآخر على أنه متوسط 2.
- لكي يتم تشغيل كل ثقافة ، املأ حقنة واحدة بما يكفي من الوسط 1 طوال مدة صرفها ، بالإضافة إلى حجم كاف لملء نظام التروية في البداية. املأ حقنة ثانية بما يكفي من المتوسط 2 طوال مدة صرفها.
- قم بتوصيل كلا الحقنتين باثنين من المنافذ الثلاثة لجهاز إيقاف رباعي الاتجاهات.
ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى طول الأنابيب لتوصيل المحاقن بأجهزة التوقف. - قم بإعداد السدادة والمحاقن بطريقة مماثلة للخطوات 3.1.7-3.1.8 أعلاه عن طريق إغلاق الموقوف إلى المتوسط 1 وتوزيع الوسط 2 في الموقوف حتى يبدأ للتو في التنقيط من المنفذ المفتوح.
- أغلق السدادة إلى المتوسط 2 وقم بتوزيع الوسط 1 في الموقف حتى يتم طرد كل الوسط المتبقي 2 من المنفذ المفتوح.
- قم بتوصيل أنبوب المنبع بمنفذ التوقف المفتوح باستخدام موصل Luer من أنثى إلى بارب. على الطرف الآخر من الأنبوب، أدخل موصل Luer من الذكور إلى الشرائح.
- وزع الوسط 1 من المحقنة حتى يمتلئ أنبوب المنبع بالكامل بالمتوسط.
- تابع الخطوات 4.3-4.11 أعلاه ، وقم بتحميل كلا الحقنتين في مضخات حقنة منفصلة وقم بتوزيع الوسط 1 فقط.
- اضبط معدل تدفق مضخة المحقنة على المتوسط 1 وتواتر جمع الكسور ، وابدأ تشغيل كلا الجهازين في وقت واحد لبدء التجربة.
- عندما يتم تغيير المصدر المتوسط ، أوقف مضخة المحقنة بسرعة للمتوسط 1 ، وأدر الموقوف مغلقا إلى المتوسط 1 ، وابدأ تشغيل مضخة المحقنة للمتوسط 2. إذا رغبت في ذلك لاحقا، قم بتبديل المصدر مرة أخرى إلى الوسط 1 بطريقة مماثلة.
- جمع الكسور لمدة التجربة المطلوبة.
6. قم بإعداد نظام التروية بخزان مقلب لتقليد الحرائك الدوائية
- الحصول على بيانات الحرائك الدوائية للدواء محل الاهتمام والتأكد من أنه يتكون من ذروة تركيز تليها اضمحلال أسي.
- بعد تعيين الذروة إلى الوقت 0 وإزالة نقاط البيانات قبل الذروة، استخدم البرنامج النصي Stirred_Tank_Fit.m (الملف التكميلي 6) لملاءمة معادلة RTD للخزان المتحرك مع البيانات. الإدخال v (معدل تدفق التروية المطلوب) والبيانات التي سيتم ملاءمتها كزوج من المتجهات مباشرة في البرنامج النصي ، إلى جانب t و C لقيم الوقت وقيم التركيز ، على التوالي. قم بتشغيل البرنامج النصي لطباعة المعلمة V ، وهي وحدة تخزين الخزان المتحركة المطلوبة.
- خطط لتخطيط لنظام التروية ليشمل مضختين للحقنة وشاكر صفيحة في المنبع من الحاضنة.
- قم بقياس RTDs لمكونات نظام التروية خارج الإيقاف وإجراء التفاف إشارة RTDs مع فترات وتركيزات مختلفة لنبض الدواء للعثور على ملف تعريف حركي دوائي مناسب. استخدم معادلة RTD للخزان المتحرك في هذا الحساب.
- تابع الخطوات من 5.1 إلى 5.8 أعلاه.
- استخدم لوحة بئر إضافية ذات حجم مناسب كخزان متحرك للإعداد. قد يكون كل بئر بمثابة خزان مقلب لثقافة واحدة منصهرة. املأ البئر بالحجم المطلوب من المتوسط ، V ، وقم بتوصيل البئر بالإبر التي تم سحبها في البداية ، ثم دفعها إلى أسفل البئر ، وقم بتغطية الإبر.
- قم بتحميل المحاقن في مضخات المحاقن وقم بتوصيل الأنابيب بسرعة من المحاقن بإبر المدخل المغطاة للخزانات المقلوبة. ثم قم بتوصيل مداخل أنبوب المنبع لزراعة الخلايا بإبر المخرج للخزانات المقلوبة.
- تابع الخطوات من 5.9 إلى 5.10.
- في الوقت المطلوب ، قم بالتبديل إلى توزيع الوسط 2 الذي يحتوي على الدواء ، كما هو موضح في الخطوة 5.11. عد إلى الوسط 1 عند اكتمال ضخ الدواء.
- تابع الخطوة 5.12.
الشكل 3: موزع متعدد الرؤوس. تصميم لموزع متعدد الرؤوس المقطوع بالليزر. وقد عدل هذا الرقم من Erickson et al.11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم استخدام نظام التروية مع مصادر متوسطة متعددة من القسم 5 من البروتوكول لقياس ديناميكيات التعبير لجين مراسل مدفوع بالعامل النووي كابا - محسن سلسلة الضوء - لعامل النسخ للخلايا البائية المنشطة (NF-κB) في خلايا الكلى الجنينية البشرية 293 (HEK293) استجابة لنبضة 1.5 ساعة من عامل نخر الورم ألفا (TNF-α). تم نقل خلايا HEK293 بشكل مستقر باستخدام ناقلات فيروسية مع بنية جينية تحتوي على Gaussia luciferase (GLuc) ، مدفوعة من قبل مروج يسمى NFKB يحتوي على عنصر استجابة NF-κB لإنشاء خلايا NFKB-GLuc HEK293 ، والتي تم فرزها عبر فرز الخلايا المنشطة بالتألق (FACS) لعزل الخلايا المحولة. تم حفظ الخلايا التي تم فرزها بالتجميد حتى الاستخدام.
بالنسبة لكل مزرعة منفذة، تضمن إعداد التروية قسما أوليا يبلغ طوله 1 متر من الأنابيب يؤدي إلى صفيحة 48 بئرا موصولة تحتوي على الخلايا، تليها 1 متر من الأنابيب النهائية المؤدية إلى جامع الكسر متعدد الرؤوس، بمعدل تدفق يبلغ 0.5 مل/ساعة (0.0083 ملليلتر/دقيقة). تم قياس RTDs للأنابيب التي يبلغ طولها 1 متر وحدها والإعداد الكامل (أنبوب 1 م + لوحة 48 بئر + أنبوب 1 م) باستخدام معدل تدفق قدره 0.5 مل / ساعة مع نبضة 20 دقيقة من المقتفي. كان محلول الخلفية عبارة عن ماء منزوع الأيونات ، مع محلول تتبع من صبغة الطعام الزرقاء المخففة في الماء منزوع الأيونات ، وتم جمع الكسور بمعدل 1 جزء / ساعة باستخدام موزع متعدد الرؤوس. تم قياس تركيزات التتبع في عينات 100 ميكرولتر من الكسور في قارئ الصفائح عن طريق الامتصاص عند 628 نانومتر.
تمت معالجة بيانات تركيز التتبع في MATLAB لإنتاج RTDs لكلا الإعدادين. أولا ، تم حساب RTDs من الإعدادين من البيانات باستخدام البرنامج النصي RTD_from_Data.m. يتم عرض نقاط بيانات RTD للأنبوب 1 م والإعداد الكامل في الشكل 4.
الشكل 4: توزيعات وقت الإقامة . (يسار) RTD لأنبوب طوله 1 متر بمعدل تدفق 0.5 مل / ساعة (0.0083 مل / دقيقة). (يمين) RTD من إعداد التروية الكامل (أنبوب 1 م + لوحة 48 بئر + أنبوب 1 م) بمعدل تدفق 0.5 مل / ساعة .
إن RTD للأنابيب وحدها مناسب تماما لدالة التشتت المحوري ، والتي من المتوقع أن تستند إلى الأدبيات الموجودة13. كما أن القطع المتعددة من الأنابيب في سلسلة تتناسب بشكل جيد مع نموذج تشتت محوري واحد ، وإضافة لوحة 48 بئرا في الخط يسبب انحرافا ضئيلا عن هذا النموذج ، لذلك كان من المتوقع أن يكون كل من أنبوب 1 م وحده وأنبوب 1 م + لوحة 48 بئرا + إعداد أنبوب 1 م مناسبا تماما بواسطة نموذج تشتت محوري. من الشائع أن يحدث ضعف ملاءمة النموذج عندما تكون التخمينات الأولية لمعلمات النموذج بعيدة جدا عن قيمها الفعلية. لإثبات ذلك ، أولا ، كان نموذج التشتت المحوري مناسبا لبيانات أنبوب 1 m باستخدام البرنامج النصي Fit_RTD_Function.m ، باستخدام Pe = 10 و tau = 30 min كتخمينات أولية لمعلمات الدالة. ويبين الشكل 5 أن هذه التخمينات أدت إلى نماذج سيئة التركيب، رسمت جنبا إلى جنب مع بيانات RTD. تم تغيير التخمينات إلى Pe = 10 و tau = 300 دقيقة ، مما أدى إلى تناسب النموذج الجيد الموضح في الشكل 5 ، حيث يجب أن يكون تاو مساويا تقريبا لحجم نظام التروية مقسوما على معدل تدفقه الحجمي. معلمات الملاءمة لأنبوب 1 م هي Pe = 154.3 ، tau = 317.2 دقيقة ، في حين أن معلمات النظام بأكمله هي Pe = 396.5 ، tau = 596.5 دقيقة.
الشكل 5: أمثلة على النموذج الجيد والضعيف الذي يناسب RTD. كان نموذج التشتت المحوري مناسبا لبيانات RTD لأنبوب طوله 1 متر بمعدل تدفق قدره 0.5 مل / ساعة (0.0083 مل / دقيقة). (يسار) كانت التخمينات الأولية لمعلمات النموذج التي تم إدخالها إلى البرنامج النصي MATLAB بعيدة جدا عن قيمها الحقيقية ، مما تسبب في إرجاع البرنامج النصي لنموذج ضعيف. (يمين) تم إدخال قيم معلمات أفضل إلى البرنامج النصي ، مما أدى إلى ملاءمة نموذج جيد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم إجراء الالتفاف على الإشارة باستخدام وظائف RTD المناسبة هذه في البرنامج النصي Signal_Convolution.m للتنبؤ بكيفية انتشار نبضة 1.5 ساعة من الوسط تحتوي على 10 نانوغرام / مل TNF-α عند مدخل أنبوب المنبع عبر النظام. تم الالتفاف على إشارة الإدخال لأول مرة مع أنبوب RTD الذي يبلغ طوله 1 متر لتحديد إشارة TNF-α التي ستدخل إلى لوحة البئر. كما تم الالتفاف بين إشارة الإدخال و RTD لأنبوب 1 م + صفيحة 48 بئر + أنبوب 1 م لتحديد ما ستكون عليه إشارة TNF-α عند مخرج النظام في الكسور المجمعة ، حيث ستظهر جنبا إلى جنب مع استجابة GLuc المقابلة من الخلايا. ويبين الشكل 6 إشارة نبض TNF- α المدخلة إلى جانب الإشارات المتوقعة عند مدخل البئر وعند مخرج النظام.
الشكل 6: التنبؤ بإشارات تركيز TNF-α في نظام التروية. تم غرس الوسط المحتوي على TNF-α في نظام التروية عند 10 نانوغرام / مل لأول 90 دقيقة من التشغيل ، ممثلة في إشارة مستطيلة زرقاء. (يسار) من خلال تعقيد إشارة الإدخال مع نموذج التشتت المحوري المناسب لأنبوب RTD الذي يبلغ طوله 1 متر ، تم التنبؤ بإشارة تركيز TNF-α عند مدخل لوحة 48 بئرا. (يمين) وبالمثل ، باستخدام نموذج RTD للنظام بأكمله ، تم التنبؤ بإشارة TNF-α عند مخرج النظام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم إذابة خلايا NFKB-GLuc HEK293 وطلائها في صفيحة من 48 بئرا عند 1 × 10 4 خلايا / بئر في0.4 مل من Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، وتم احتضانها لمدة يوم واحد عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 ، وبعد ذلك تم اتباع الخطوات الواردة في القسم 5 من البروتوكول أعلاه لإعداد نظام التروية مع stopcock لمصادر متوسطة متعددة. تم إنشاء أربعة تيارات لاختراق أربعة آبار. تم تحميل مضخة حقنة واحدة متعددة القنوات بأربع محاقن كاملة سعة 60 مل تحتوي على DMEM كمتوسط 1. وتم تحميل مضخة حقنة ثانية بمحاقن سعة 5 مل تحتوي على متوسط 2، اثنان منها يحتويان على DMEM عادي كعنصر تحكم، واثنان يحتويان على DMEM مع 10 نانوغرام/مل TNF-α كحافز. في بداية التجربة ، تم توزيع المحاقن سعة 5 مل التي تحتوي على TNF-α أو وسيط التحكم عند 0.5 مل / ساعة لمدة 1.5 ساعة ، وبعد ذلك تم تبديل السدادات وتم توزيع المحاقن التي تحتوي على 60 مل التي تحتوي على DMEM لمدة 40 ساعة التالية. في الساعة 24 وفي نهاية التروية ، تم وضع علامة على الكسور من الجداول الأربعة ، التي تم توزيعها في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة ، وتجميدها عند -80 درجة مئوية ، وتم إعادة تعيين جامع الكسور.
بعد التروية ، تم إذابة جميع العينات ، وتم قياس تركيزات GLuc الخاصة بها باستخدام فحص التلألؤ الحيوي ، الموصوف سابقا11,16. تم تحويل قيم التلألؤ إلى معدلات لمعان / ساعة عن طريق قسمة لمعان كل عينة كسر على المدة الزمنية لذلك الكسر ، وتم رسمها كسلسلة زمنية لكل من التيارات الأربعة. كان وقت كل قياس GLuc هو نقطة الوسط للفاصل الزمني الذي تم خلاله جمع هذا الكسر ، مطروحا منه متوسط وقت الإقامة (تاو = 317 دقيقة) للأنابيب النهائية لنظام التروية. كما تم تغيير إشارة TNF-α المتوقع احتواؤها داخل الكسور في الوقت المناسب بمتوسط وقت الإقامة للأنابيب النهائية وتم تراكبها على بيانات GLuc ، مما كشف عن ديناميكيات الاستجابة التحفيزية NF-κB للتعبير الجيني المدفوع ب NF-κB ، كما هو موضح في الشكل 7.
الشكل 7: ديناميات الاستجابة للتحفيز تقاس باستخدام نظام التروية. تم استخدام نظام التروية مع مصدرين متوسطين لتعريض ثقافتين خلويتين بشكل عابر لنبض من TNF-α مع ثقافتين غير مكشوفتين كضوابط. تم تصميم خلايا HEK293 لإفراز GLuc مدفوعا بمروج يحتوي على عنصر استجابة NF-κB ، والذي تم جمعه في كسور النفايات السائلة. تكشف التجربة عن زيادة كبيرة في التعبير مدفوعة ب NF-κB بعد التعرض α TNF. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تسبب وجود GLuc المتراكم في الثقافات في بداية التروية في الانخفاض الواضح في إشارة GLuc من الجزء الأول إلى الجزء الثاني في جميع المنحنيات الأربعة. يمكن تجنب هذه القطعة الأثرية الشائعة في نظام التروية عن طريق تغيير الوسط في الثقافات مباشرة قبل البدء في التروية. حافظت ثقافتا التحكم اللتان لم تتلقيا α TNF على معدل إفراز GLuc منخفض زاد تدريجيا خلال مدة التجربة. قد تعكس هذه النتيجة نمو عدد الخلايا. كان للثقافات المحفزة في البداية نفس معدل إفراز GLuc مثل الضوابط ثم زاد الإفراز بشكل كبير حيث يتم تنشيط التعبير المدفوع ب NF-κB استجابة لنبضة TNF-α. جيبلغ إفراز اليورانيوم ذروته بعد حوالي 9 ساعات من أول وصول α TNF، وبعد ذلك ينخفض مع الاضمحلال الأسي.
الملف التكميلي 1: ملف CAD: متعدد head_Dispenser.DFX: يحتوي هذا الملف على نموذج موزع متعدد الرؤوس يمكن قطعه بالليزر واستخدامه لتعديل جامعي الكسور. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 2: example_tracer_data.xlsx. يحتوي على مثال لبيانات تجربة التتبع ليتم قراءتها بواسطة البرنامج النصي RTD_from_Data.m MATLAB. يمكن أيضا استخدامه كقالب للبيانات الجديدة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 3: ملف MATLAB: RTD_from_Data يقرأ هذا البرنامج النصي بيانات تجربة التتبع من ملف .xlsx ويقوم بإرجاع متجهات t و Et التي تمثل RTD. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 4: ملف MATLAB: Fit_RTD_Function يقوم هذا البرنامج النصي بتحميل متجهات RTD من البرنامج النصي RTD_from_Data.m وإرجاع نموذج مناسب ل RTD. يتم اختيار نوع النموذج من قبل المستخدم. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 5: ملف MATLAB: Signal_Convolution يأخذ هذا البرنامج النصي إشارة مذابة محددة من قبل المستخدم و RTD كمدخلات ويتنبأ بكيفية تغيير الإشارة بعد المرور عبر نظام التدفق باستخدام RTD هذا. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 6: ملف MATLAB: Stirred_Tank_Fit يناسب هذا البرنامج النصي منحنى CSTR RTD لإدخال البيانات الدوائية من قبل المستخدم وإرجاع حجم الخزان المطلوب لإنتاج RTD لمعدل التدفق المحدد. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا العمل تجميع وتشغيل نظام زراعة خلايا التروية مع مصادر متوسطة متعددة تم إثباتها مع مثال محدد تم فيه قياس ديناميكيات التعبير الجيني المدفوع ب NF-κB استجابة لنبضة عابرة من TNF-α. تم قياس ونمذجة RTDs لمكونات نظام التروية ، وتم استخدام التفاف الإشارة للتنبؤ بكل من تعرض الخلايا لنبضة TNF-α وتوزيع TNF-α في الكسور المتوسطة للنفايات السائلة التي تم جمعها. تعرضت الخلايا للنبض وتم جمع الكسور لمدة 40 ساعة ، وبعد ذلك تم قياس GLuc في الكسور ورسمها جنبا إلى جنب مع إشارة TNF-α المتوقعة للكشف عن ديناميكيات الاستجابة للتحفيز.
طريقة التروية هذه لا تخلو من أوجه القصور. والجدير بالذكر أن النظام ينطوي على مخاطر العقم بسبب الخطوة القصيرة الحرجة التي يتم فيها توصيل الأنابيب بصفيحة البئر بعد الإعداد داخل الحاضنة. ومن واقع تجربة صاحبي البلاغ، فإن التلوث نادر جدا؛ ومع ذلك ، يمكن تخفيف خطر التلوث بالطرق التالية. الأول هو تنفيذ جميع إجراءات مناولة الخلايا والوصلات المعقمة في خزانة السلامة الأحيائية. من الاحتياطات الإضافية التي يمكن اعتبارها لتحسين العقم إدراج مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر في خط عند مدخل مزارع الخلايا. سيؤدي استخدام الترشيح المعقم إلى حبس البكتيريا أو الكائنات الحية الدقيقة الأكبر الموجودة في الوسط قبل دخولها إلى مزرعة الخلايا ، على الرغم من أنه يزيد من متطلبات الضغط لدفع التدفق وقد يسد بسبب تلوث الغشاء. كما يتم جمع العينات الصادرة في بيئات مفتوحة معرضة لخطر التلوث. إن جمع العينات في نظام حاوية ، من الناحية المثالية مع ترشيح الهواء ، لوحدة التجزئة من شأنه أن يزيل هذه المشكلة في بناء النظام في المستقبل.
علاوة على ذلك ، يتم تشويه الإشارات التي تفرزها الخلايا وفقا ل RTD للأنابيب النهائية قبل تقسيمها وقياسها. وبالتالي ، فإن الإشارات المقاسة هي نسخ ملطخة من تلك التي تفرزها الخلايا. من الناحية النظرية ، قد يتم التراجع عن هذا التلطيخ عن طريق إجراء إزالة الالتفاف على الإشارة المقاسة لإزالة تأثير RTD14 في اتجاه المصب ، ولكن من الصعب تطبيق هذه التقنية العددية بنجاح على البيانات غير المثالية حيث تصبح ضوضاء الإشارة مضخمة بشكل كبير. ومع ذلك ، فإن العديد من الديناميكيات البيولوجية ذات الأهمية تتكشف على الجدول الزمني من ساعات إلى عشرات الساعات ، وبالتالي تتأثر قليلا جدا بآثار تلطيخ أنابيب RTDs ، التي يتم تغييرها في الوقت المناسب ولكنها تتغير قليلا في الشكل. يمكن أيضا تحسين طريقة قياس RTD الموضحة هنا باستخدام نبضات تتبع أقصر واستخدام حلول خلفية ومواد تتبع تتطابق مع تلك التي سيتم استخدامها في تجارب زراعة الخلايا. ومع ذلك ، فقد ثبت أن أوقات النبض المقترحة هنا تعطي RTDs متطابقة لجميع أوقات النبض الأقصر ، وبالتالي فهي مناسبة لقياسات RTD ، ولكن مع زيادة أوقات النبض ، تتغير RTDs بشكل أكبر وبالتالي لا ينبغي استخدامها. وقد وجد المؤلفون سابقا أن كلا من صبغة الطعام و GLuc لهما RTDs متشابهة جدا مع بعضها البعض في كل من وسط الماء والثقافة11 ، لذلك من غير المرجح أن تغير الأنواع الجزيئية RTD كثيرا. وأخيرا، لم يلاحظ أي اختلاف في RTDs لصبغة الطعام في الماء عند قياسها عند 20 درجة مئوية مقابل 37 درجة مئوية، أو في الأنابيب المستقيمة مقابل الأنابيب الملفوفة للغاية11. يمكن العثور على هذه البيانات ، وبيانات RTD لمجموعة من هندسات نظام التروية ومعدلات التدفق ، في المنشور السابق للمؤلفين11 ، إلى جانب شرح مفصل للعمليات التي يقوم بها برنامج تحليل RTD النصي في هذه الورقة. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول نظرية تحليل RTD 13 وأمثلة على تطبيقات RTDs على أنظمة المفاعلات الحيوية 17،18،19،20،21 في المراجع المقدمة.
يمكن استخدام هذه الطريقة متعددة الاستخدامات لقياس معدلات إفراز أو امتصاص المواد القابلة للذوبان في مزارع الخلايا ، ويمكن توصيل إشارات المذاب العابرة إلى الثقافات عن طريق تبديل المصادر المتوسطة المنبع. يمكن توصيل إشارات بسيطة مثل نبضات المذاب أو تغييرات الخطوة ببساطة عن طريق تبديل صمام المدخل. يمكن إنتاج إشارات تشبه الحركية الدوائية عن طريق وضع خزان مقلب مع حجم السائل المناسب في خط المنبع من الثقافة وتقديم نبضة مذابة من خلاله. يمكن إنشاء إشارات أخرى عن طريق تطبيق مجموعات مختلفة من النبضات وتغييرات الخطوات والمكونات باستخدام RTDs جديدة لتشويه النبضات إلى الأشكال المطلوبة. طرق زراعة الخلايا الثابتة الحالية غير قادرة على جمع العينات المتوسطة باستمرار بطريقة آلية ولا يمكن استخدامها لتعريض الخلايا لإشارات مذابة متغيرة بسلاسة. أنظمة الموائع الدقيقة باهظة الثمن وتتطلب خبرة ، ولا توجد أنظمة موائع كبيرة متاحة تجاريا لهذه الفئة من التجارب. يمكن اعتماد النظام البسيط منخفض التكلفة من قبل المختبرات لدراسة سلوك الخلايا الطبيعية ، واستجابات الاندفاع ، وتأثيرات الملامح المذابة العابرة المختلفة التي قد تحاكي الأدوية أو ديناميكيات الإشارة المذابة الداخلية ، ويمكن إعادة تكوينها لتلبية احتياجات التجارب الجديدة. وتشمل التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية وتلك الجارية حاليا ما يلي: قياس ديناميات معدل إفراز السيتوكينات والإكسوسومات من العلاج بالخلايا خارج الجسم الحي؛ وقياس معدل إفراز السيتوكينات والإكسوسومات من العلاج بالخلايا خارج الجسم الحي؛ وقياس معدل إفراز السيتوكينات والإكسوسومات من العلاج بالخلايا خارج الجسم الحي ؛ وقياس معدل إفراز السيتوكينات والإكسوسومات من العلاج بالخلايا خارج تقييم تأثير وقت الساعة البيولوجية على الاستجابة الخلوية للعقاقير ؛ قياس معدل النمو والتمثيل الغذائي للأغشية الحيوية البكتيرية ؛ إنتاج منحنيات استجابة الجرعة لنواقل الفيروسات المرتبطة بالغدية (AAV) في المختبر؛ قياس معدل الإنتاج الديناميكي لنواقل الفيروسات اللينية من الخلايا المنتجة؛ ودمج ملفات تعريف أدوية العلاج الكيميائي الحرائك الدوائية في خزعات الطب الشخصي لعلاج السرطان بدقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة.
Acknowledgments
تم إجراء هذا البحث بدعم بموجب رقم المنحة. R01EB012521 و R01EB028782 و T32 GM008339 من المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 Gauge 1 1/2- in Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines | Grainger | 5FVK2 | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | HEK 293T cells used in the Representative Results experiment. |
| 96-Well Clear Bottom Plates, Corning | VWR | 89091-010 | Plates for measuring dye concentrations in RTD experiments and GLuc in representative results experiment. |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 5 mL | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| BioFrac Fraction Collector | Bio-Rad | 7410002 | Fraction collector that can be used for a single stream, or modified using our method to enable collection from multiple streams. |
| Clear High-Strength UV-Resistant Acrylic 12" x 12" x 1/8" | McMaster-Carr | 4615T93 | This sheet is cut using a laser cutter according to the DXF file in the supplemental materials to produce the multi-head dispenser that can be attached to the BioFrac fraction collector. |
| Coelenterazine native | NanoLight Technology | 303 | Substrate used in Gaussia luciferase bioluminescence assay in representative results. |
| Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, size 48 wells, polystyrene plate, flat bottom wells | Millipore Sigma | CLS3548 | Used to grow and perfuse 293T cells in representative results. |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells | Fisher Scientific | 720081 | Can be plugged and used as a stirred tank to produce pharmacokinetic profiles in perfusion. Can also contain cells for perfusion. |
| DMEM, high glucose | ThermoFisher Scientific | 11965126 | |
| Epilog Zing 24 Laser | Cutting Edge Systems | Epilog Zing 24 | Laser cutter used to produce multi-head dispenser from acrylic sheet. Other laser cutters may be used. |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 20 mL | Fisher Scientific | 14-955-460 | |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 60 mL | Fisher Scientific | 14-955-461 | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | Microcentrifuge tubes for collecting fractions. |
| Fisherbrand Round Bottom Disposable Borosilicate Glass Tubes with Plain End | Fisher Scientific | 14-961-26 | Glass tubes for collecting fractions. |
| Fisherbrand SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-Filtered | Fisher Scientific | 2707410 | 300 ul pipette tips that best fit the multi-head dispenser and tubing to act as dispensing tips. |
| Gibco DPBS, powder, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 21600010 | Phosphate buffered saline. |
| Labline 4625 Titer Shaker | Marshall Scientific | Labline 4625 Titer Shaker | Orbital shaker used to keep stirred tanks mixed. |
| Masterflex Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile; 10/PK | Cole-Parmer | EW-30600-04 | Used to join multiple inlet streams for RTD experiments and cell culture experiments. |
| Masterflex Fitting, Polycarbonate, Straight, Female Luer x Cap; 25/PK | Masterflex | UX-45501-28 | |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hosebarb Adapters, 1/16" | Cole-Parmer | EW-45508-00 | |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Hosebarb Adapter, 1/16" ID | Cole-Parmer | EW-45518-00 | |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Plug Adapter; 25/PK | Masterflex | EW-30800-30 | |
| Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 14; 25 ft | Masterflex | EW-96410-14 | |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | Version R2019b. Newer versions may also be used. Some older versions may work. |
| NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1600 | |
| Rack Set F1 | Bio-Rad | 7410010 | Racks to hold collecting tubes in the fraction collector. |
| Recombinant Human TNF-alpha (HEK293-expressed) Protein, CF | Bio-Techne | 10291-TA-020 | Cytokine used to stimulate 293T cells in representative results. |
| Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 00, Bottom 10.5mm | Saint Gobain | DX263015-50 | Fits 48-well plates. |
| Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 4 Bottom 21mm | Saint Gobain | DX263027-10 | Fits 12-well plates. |
| Sodium Hydroxide, 10.0 N Aqueous Solution APHA; 1 L | Spectrum Chemicals | S-395-1LT | |
| SolidWorks | Dassault Systems | SolidWorks | CAD software used to create the multi-head dispenser DXF file. |
| Varioskan LUX multimode microplate reader | ThermoFisher Scientific | VL0000D0 | Plate reader. |
| Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue | Michaels | 10404779 | Blue food dye containing Brilliant Blue FCF, used as a tracer in RTD experiments. Absorbance spectrum peaks at 628 nm. |
References
- Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Current Biology. 14 (24), 2289-2295 (2004).
- Talaei, K., et al. A mathematical model of the dynamics of cytokine expression and human immune cell activation in response to the pathogen Staphylococcus aureus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711153 (2021).
- Kemas, A. M., Youhanna, S., Zandi Shafagh, R., Lauschke, V. M. Insulin-dependent glucose consumption dynamics in 3D primary human liver cultures measured by a sensitive and specific glucose sensor with nanoliter input volume. FASEB Journal. 35 (3), 21305 (2021).
- Muzzey, D., van Oudenaarden, A. Quantitative time-lapse fluorescence microscopy in single cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 301-327 (2009).
- Calligaro, H., Kinane, C., Bennis, M., Coutanson, C., Dkhissi-Benyahya, O. A standardized method to assess the endogenous activity and the light-response of the retinal clock in mammals. Molecular Vision. 26, 106-116 (2020).
- Battat, S., Weitz, D. A., Whitesides, G. M. An outlook on microfluidics: the promise and the challenge. Lab on a Chip. 22 (3), 530-536 (2022).
- Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., Dibner, C. Parallel measurement of circadian clock gene expression and hormone secretion in human primary cell cultures. Journal of Visualized Experiments. (117), e54673 (2016).
- Yamagishi, K., Enomoto, T., Ohmiya, Y. Perfusion-culture-based secreted bioluminescence reporter assay in living cells. Analytical Biochemistry. 354 (1), 15-21 (2006).
- Watanabe, T., et al. Multichannel perfusion culture bioluminescence reporter system for long-term detection in living cells. Analytical Biochemistry. 402 (1), 107-109 (2010).
- Murakami, N., Nakamura, H., Nishi, R., Marumoto, N., Nasu, T. Comparison of circadian oscillation of melatonin release in pineal cells of house sparrow, pigeon and Japanese quail, using cell perfusion systems. Brain Research. 651 (1-2), 209-214 (1994).
- Erickson, P., Houwayek, T., Burr, A., Teryek, M., Parekkadan, B. A continuous flow cell culture system for precision cell stimulation and time-resolved profiling of cell secretion. Analytical Biochemistry. 625, 114213 (2021).
- Saltzman, W. M. Drug Delivery: Engineering Principles for Drug Therapy. , Oxford University Press. (2001).
- Fogler, H. S. Elements of Chemical Reaction Engineering. 4th edn. , Prentice Hall PTR. Boston. (2006).
- Conesa, J. A. Chemical Reactor Design: Mathematical Modeling and Applications. , Wiley. (2019).
- Toson, P., Doshi, P., Jajcevic, D. Explicit residence time distribution of a generalised cascade of continuous stirred tank reactors for a description of short recirculation time (bypassing). Processes. 7 (9), 615 (2019).
- Tamayo, A. G., Shukor, S., Burr, A., Erickson, P., Parekkadan, B. Tracking leukemic T-cell transcriptional dynamics in vivo with a blood-based reporter assay. FEBS Open Biology. 10 (9), 1868-1879 (2020).
- Newell, B., Bailey, J., Islam, A., Hopkins, L., Lant, P. Characterising bioreactor mixing with residence time distribution (RTD) tests. Water Science and Technology. 37 (12), 43-47 (1998).
- Dubois, J., Tremblay, L., Lepage, M., Vermette, P. Flow dynamics within a bioreactor for tissue engineering by residence time distribution analysis combined with fluorescence and magnetic resonance imaging to investigate forced permeability and apparent diffusion coefficient in a perfusion cell culture chamber. Biotechnology and Bioengineering. 108 (10), 2488-2498 (2011).
- Gaida, L. B., et al. Liquid and gas residence time distribution in a two-stage bioreactor with cell recycle. HAL Open Science. , (2008).
- Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Wave characterization for mammalian cell culture: residence time distribution. New Biotechnology. 29 (3), 402-408 (2012).
- Olivet, D., Valls, J., Gordillo, M. A., Freixó, A., Sánchez, A. Application of residence time distribution technique to the study of the hydrodynamic behaviour of a full-scale wastewater treatment plant plug-flow bioreactor. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 80 (4), 425-432 (2005).
