Summary
Questo documento presenta un metodo per costruire e gestire un sistema di coltura cellulare a perfusione multicanale a basso costo per misurare la dinamica dei tassi di secrezione e assorbimento dei soluti nei processi cellulari. Il sistema può anche esporre le cellule a profili di stimolo dinamici.
Abstract
Alcune funzioni cellulari e tissutali operano all'interno della scala temporale dinamica da minuti a ore che sono scarsamente risolte dai sistemi di coltura convenzionali. Questo lavoro ha sviluppato un sistema di bioreattori a perfusione a basso costo che consente di perfondere continuamente il terreno di coltura in un modulo di coltura cellulare e frazionato in un modulo a valle per misurare la dinamica su questa scala. Il sistema è costruito quasi interamente da parti disponibili in commercio e può essere parallelizzato per condurre esperimenti indipendenti in piastre di coltura cellulare multi-pozzo convenzionali contemporaneamente. Questo articolo video illustra come assemblare la configurazione di base, che richiede solo una singola pompa a siringa multicanale e un collettore di frazioni modificato per perfondere fino a sei colture in parallelo. Vengono inoltre presentate varianti utili sul design modulare che consentono dinamiche di stimolazione controllate, come impulsi di soluto o profili simili a farmacocinetici. È importante sottolineare che, poiché i segnali dei soluti viaggiano attraverso il sistema, vengono distorti a causa della dispersione del soluto. Inoltre, viene descritto un metodo per misurare le distribuzioni del tempo di residenza (RTD) dei componenti della configurazione della perfusione con un tracciante utilizzando MATLAB. Gli RTD sono utili per calcolare come i segnali dei soluti sono distorti dal flusso nel sistema multi-compartimento. Questo sistema è altamente robusto e riproducibile, quindi i ricercatori di base possono facilmente adottarlo senza la necessità di strutture di fabbricazione specializzate.
Introduction
Molti importanti processi biologici si verificano in colture cellulari e tissutali sulla scala temporale da minuti a ore 1,2,3. Mentre alcuni di questi fenomeni possono essere osservati e registrati in modo automatizzato utilizzando la microscopia time-lapse4, la bioluminescenza1 o altri metodi, gli esperimenti che coinvolgono la raccolta di campioni di surnatante di coltura per l'analisi chimica vengono spesso eseguiti manualmente in colture cellulari statiche. Il campionamento manuale limita la fattibilità di alcuni studi a causa dell'inconveniente di punti temporali di campionamento frequenti o fuori orario. Ulteriori carenze dei metodi di coltura statica includono esperimenti che coinvolgono esposizioni controllate e transitorie a stimoli chimici. Nelle colture statiche, gli stimoli devono essere aggiunti e rimossi manualmente, e i profili di stimolo sono limitati ai cambiamenti di passo nel tempo, mentre i cambiamenti medi aggiungono e rimuovono anche altri componenti del mezzo, che possono influenzare le cellule in modo incontrollato5. I sistemi fluidici possono superare queste sfide, ma i dispositivi esistenti pongono altre sfide. I dispositivi microfluidici comportano i costi proibitivi di attrezzature specializzate e formazione da produrre e utilizzare, richiedono metodi microanalitici per elaborare i campioni e le cellule sono difficili da recuperare dai dispositivi dopo la perfusione6. Pochi sistemi macrofluidici sono stati creati per i tipi di esperimenti qui descritti 7,8,9,10, e sono costruiti con più parti personalizzate realizzate internamente e richiedono più pompe o collettori di frazioni. Inoltre, gli autori non sono a conoscenza di alcun sistema di coltura cellulare a perfusione macrofluidica disponibile in commercio diverso dai bioreattori a serbatoi agitati per la coltura in sospensione, che sono utili per la bioproduzione, sebbene non siano progettati per modellare e studiare la fisiologia.
Gli autori hanno precedentemente riferito sulla progettazione di un sistema di bioreattori a perfusione a basso costo composto quasi interamente da parti11 disponibili in commercio. La versione base del sistema consente di conservare più colture in una piastra di pozzo in un incubatore a CO2 e di fondere continuamente con il mezzo di una pompa a siringa, mentre i flussi del mezzo effluente provenienti dalle colture vengono automaticamente frazionati in campioni nel tempo utilizzando un collettore di frazioni con una modifica personalizzata. Pertanto, questo sistema consente il campionamento automatizzato del surnatante del terreno di coltura e l'input continuo del soluto alle colture nel tempo. Il sistema è macrofluidico e modulare e può essere facilmente modificato per soddisfare le esigenze di nuovi progetti di esperimenti.
L'obiettivo generale del metodo qui presentato è quello di costruire, caratterizzare e utilizzare un sistema di coltura cellulare a perfusione che consenta esperimenti in cui vengono misurati i tassi di secrezione o assorbimento di sostanze da parte delle cellule nel tempo e / o le cellule sono esposte a segnali di soluto precisi e transitori. Questo articolo video spiega come assemblare la configurazione di base, che è in grado di perfondere fino a sei colture cellulari contemporaneamente utilizzando una singola pompa a siringa e un collettore di frazioni modificate. Nella Figura 1 sono inoltre presentate due varianti utili sul sistema di base che utilizzano pompe e parti aggiuntive per consentire esperimenti che espongono le cellule a segnali transitori di concentrazione di soluto, inclusi brevi impulsi e profili farmacocinetici12.
Figura 1: Tre variazioni sul progetto del sistema di perfusione. (In alto) Il sistema di perfusione di base. (Al centro) Il sistema di perfusione con un rubinetto di arresto per più sorgenti medie. (In basso) Il sistema di perfusione con un serbatoio agitato per imitare un volume di distribuzione ben miscelato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
A causa della dispersione e della diffusione all'interno del flusso, i segnali del soluto diventano distorti o "imbrattati" mentre viaggiano attraverso il sistema di flusso. Questa distorsione può essere quantificata mediante l'uso di distribuzioni temporali di residenza (RTD)13. Questo articolo spiega come eseguire esperimenti traccianti sui componenti del sistema di perfusione (Figura 2) e fornisce script MATLAB per generare RTD dai dati misurati. Una spiegazione dettagliata di questa analisi può essere trovata nel precedente articolo11 degli autori. Ulteriori script MATLAB adattano funzioni appropriate agli RTD ed estraggono parametri fisici ed eseguono la convoluzione del segnale utilizzando RTD per prevedere come l'input del segnale di soluto da parte dell'utente si propagherà e si distorcerà attraverso il sistema di perfusione14.
Figura 2: Distribuzioni del tempo di residenza. Gli RTD dei componenti del sistema di flusso, come questa lunghezza del tubo, vengono misurati immettendo un impulso di tracciante nel sistema e misurando come "spalma" nel momento in cui esce nelle frazioni raccolte. Questa cifra è stata modificata da Erickson et al.11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Protocol
1. Preparare le parti per la perfusione della piastra del pozzo
- Preparare i tubi
- Tagliare due lunghezze di tubi in silicone (diametro interno 1,6 mm) per ogni coltura cellulare da perfusare. Assicurarsi che il pezzo utilizzato come tubo a monte sia abbastanza lungo da raggiungere dalla pompa della siringa alla coltura cellulare all'interno dell'incubatore e che il pezzo a valle possa raggiungere dalla coltura cellulare alla posizione più estesa del collettore di frazione.
- Dai a ogni pezzo di tubo un'etichetta unica su entrambe le estremità con nastro adesivo.
- Preparare i tappi per il piatto del pozzo
- Ottenere un tappo in silicone per ogni pozzetto della piastra del pozzo da perfusare, con un diametro appropriato per adattarsi comodamente ai pozzetti con una tenuta ermetica.
- Tagliare il materiale in eccesso dal fondo del tappo in modo che si inseriscano nei pozzetti lasciando spazio all'interno per l'aria al di sopra del livello di liquido previsto.
- Spingere due aghi smussati da 18 G attraverso ciascun tappo, nella parte superiore e fuori dal basso per fungere da ingresso e uscita per il flusso attraverso il pozzo, diametralmente opposti l'uno all'altro per massimizzare la distanza tra le loro punte all'interno del pozzo.
- Regolare le altezze degli aghi all'interno del pozzetto tappato, poiché l'altezza dell'ago di uscita determinerà l'altezza stabile del livello del liquido nel pozzo durante la perfusione.
NOTA: Se la perfusione viene avviata con l'ago di uscita sopra il livello del liquido, il liquido si accumulerà nel pozzo fino a quando il livello raggiunge l'ago. Se la perfusione viene avviata con l'ago di uscita al di sotto del livello del liquido, il livello del liquido rimarrà stabile a meno che le bolle d'aria non fluiscano nel pozzo, il che causerà l'abbassamento dell'altezza del liquido fino a quando non avrà la stessa altezza dell'ago di uscita.
- Raccogli parti aggiuntive
- Ottenere una siringa sterile per ogni coltura cellulare da perfusare che sia abbastanza grande da contenere abbastanza terreno per l'intera perfusione, più una quantità aggiuntiva di mezzo per riempire inizialmente il tubo.
- Per ogni coltura da perfusare, procuratevi un connettore Luer femmina-barbo e due connettori Luer maschio-barbo, oltre a due cappucci Luer femmina e due maschi.
- Pulire e sterilizzare le parti
- Se le parti sono state utilizzate in precedenza, pulirle perfondendole con 0,1 N NaOH, seguito da un risciacquo con acqua deionizzata.
- Con l'autoclave o in altro modo, garantire la sterilità di tutte le parti sopra elencate.
2. Tagliare al laser il distributore multitesta e collegarlo a un collettore di frazioni
- Ricreare il modello di dispenser multi-testa dalla Figura 3 in un programma di progettazione assistita da computer o scaricare il file DXF del modello fornito (File supplementare 1).
- Utilizzare una taglierina laser per tagliare il design da un foglio acrilico da 1/8.
- Rimuovere le tre viti che fissano la testa di erogazione alla base mobile del collettore di frazione.
- Allineare i tre fori più piccoli nel distributore multitesta con i fori delle viti nella base mobile e riavvitare le viti attraverso i fori da collegare.
- Regolare la tenuta delle tre viti per angolare il dispenser multitesta su e giù fino a quando la fila di fori di erogazione non è allineata con i tubi di raccolta sottostanti.
- Posizionare con attenzione le punte delle pipette da 300 μL attraverso i fori desiderati per fungere da punte di erogazione.
NOTA: il collettore di frazioni può essere utilizzato senza il distributore multitesta per perfondere una singola coltura cellulare.
3. Misurare gli RTD dei componenti ed eseguire la convoluzione del segnale
- Impostare pompe e siringhe per l'impulso tracciante come mostrato nella Figura 2.
- Ottenere due pompe a siringa monocanale o multicanale.
- Scegli una soluzione di sfondo per rappresentare il mezzo che verrà utilizzato nel sistema di flusso durante gli esperimenti di coltura cellulare. Assicurarsi che la soluzione in background abbia proprietà di trasferimento di massa simili al supporto. In molti casi, l'acqua deionizzata è una scelta appropriata.
- Scegli una sostanza tracciante per rappresentare il soluto che sarà di interesse durante gli esperimenti di coltura cellulare. Assicurarsi che il tracciante abbia proprietà di trasferimento di massa simili al soluto di interesse e che la sua concentrazione possa essere misurata. In molti casi, il colorante alimentare è una scelta appropriata.
- Sciogliere la sostanza tracciante nella soluzione di fondo per creare la soluzione tracciante.
- Riempire una siringa con una soluzione di fondo e caricarla in una pompa a siringa. Riempire un'altra siringa con una soluzione tracciante e caricarla nella seconda pompa della siringa.
- Collegare entrambe le siringhe a due delle tre porte di un rubinetto a quattro vie utilizzando i connettori Luer.
- Chiudere il rubinetto alla soluzione di sfondo e pompare la soluzione tracciante nel rubinetto fino a quando non inizia a gocciolare dalla porta aperta. Arrestare la pompa e non regolare ulteriormente la siringa.
NOTA: è importante che la barra mobile della pompa della siringa venga spinta verso l'alto contro gli stantuffi della siringa prima dell'inizio delle parti temporizzate dell'esperimento. Ciò consentirà al flusso di iniziare immediatamente all'avvio della pompa. In caso contrario, la pompa potrebbe essere avviata, ma il flusso non inizierà effettivamente fino a quando la barra in movimento non raggiungerà la posizione dello stantuffo. - Chiudere il rubinetto alla soluzione tracciante e pompare la soluzione di fondo nel rubinetto fino a quando tutta la soluzione di tracciante residua non è stata scaricata dalla porta aperta. Arrestare la pompa e non regolare ulteriormente la siringa.
- Impostare il componente del sistema di flusso di interesse e il collettore di frazioni
- Impostare il componente del sistema di flusso desiderato per l'analisi RTD. Assicurarsi che il componente da misurare finisca con un pezzo di tubo a valle di lunghezza e flessibilità adeguate per raggiungere il collettore di frazioni durante il funzionamento.
- Inserire l'estremità del tubo a valle in un distributore di punta della pipetta nel distributore a più teste in modo che sia collegato in modo avvolgente.
- Collegare la porta aperta del rubinetto a quattro vie all'ingresso del componente da misurare. Pompare la soluzione di fondo attraverso il componente fino a quando non è completamente riempito come sarebbe durante un esperimento di coltura cellulare, e inizia a gocciolare fuori dalla punta di erogazione del collettore di frazione. Arrestare la pompa.
- Iniettare l'impulso tracciante, raccogliere frazioni e misurare il tracciante
- Impostare la pompa per la soluzione tracciante sulla portata desiderata. Chiudere il rubinetto alla soluzione di sfondo e avviare il flusso della soluzione tracciante. Allo stesso tempo, avviare il collettore di frazioni.
- Continuare il flusso della soluzione tracciante per un breve periodo di tempo per approssimare un input di impulso del tracciante. Una durata dell'impulso di 10 minuti è risultata funzionare bene per gli RTD ad una portata di 1 mL/h.
NOTA: se l'impulso tracciante è troppo breve, il tracciante non sufficiente entrerà nel flusso per essere misurabile. Se l'impulso è troppo lungo, non si avvicinerà più a un impulso e cambierà la forma dell'RTD. - Al termine del periodo di impulso della soluzione tracciante, arrestare la pompa della soluzione tracciante. Chiudere rapidamente il rubinetto alla soluzione tracciante e avviare il flusso della soluzione di fondo alla stessa portata.
- Consentire alla soluzione di fondo di fluire e alle frazioni di essere raccolte fino a quando tutto il tracciante non è passato attraverso il sistema e nelle frazioni raccolte.
- Arrestare il sistema e misurare la concentrazione del tracciante nelle frazioni. Includere solo le frazioni che sono state dispensate completamente. Se la raccolta viene interrotta in parte attraverso la raccolta di una frazione, non includere tale frazione.
- Calcola la distribuzione del tempo di residenza (RTD) dai dati misurati in MATLAB
NOTA: Una spiegazione scritta dell'analisi eseguita da questo script MATLAB può essere trovata nella precedente pubblicazione11 degli autori e le discussioni sulla teoria sono ampiamente disponibili nella letteratura13.- Produrre un file .xlsx contenente i dati di concentrazione nel formato del foglio di calcolo example_tracer_data.xlsx fornito nel file supplementare 2. Immettere i valori di concentrazione del tracciante nelle frazioni (qualsiasi unità) in ordine cronologico da sinistra a destra nella riga 2. Immettere il tempo trascorso dall'inizio dell'impulso alla fine dell'ultima frazione nella cella A5 e immettere la lunghezza dell'impulso tracciante in minuti nella cella A8.
- Salva il file .xlsx nella directory MATLAB.
- Apri lo script RTD_From_Data.m, dal file supplementare 3, nell'editor MATLAB.
- Sostituire il nome del file di .xlsx tra parentesi nella prima riga della sezione Carica dati dello script con il nome del nuovo file di dati .xlsx, seguendo le istruzioni scritte all'interno del file di script. Eseguire lo script.
- Assicurarsi che lo script esegua correttamente l'analisi RTD13, producendo un grafico dell'RTD e restituendo il valore dell'integrale numerico sull'RTD uguale a 1. Trova il vettore temporale (t) e il vettore dei valori RTD associati (Et) salvati dallo script nella directory MATLAB.
- Adattare una funzione del modello all'RTD in MATLAB
- Apri lo script Fit_RTD_Function.m nell'editor MATLAB dal file supplementare 4.
- Scegli una delle tre funzioni del modello commentate per adattarsi all'RTD: il modello di dispersione assiale13, che si adatta agli RTD per il flusso laminare in tubi cilindrici; il modello CSTR13, che si adatta a serbatoi ben agitati; e il modello n-CSTR15, che si adatta approssimativamente a piastre di pozzo più grandi. Per adattarlo a un altro modello non incluso qui, aggiungilo allo script nello stesso formato.
- Rimuovete i commenti nella sezione dello script contenente il modello scelto per il montaggio.
- Modificare i valori delle ipotesi iniziali per i parametri in quelli appropriati per l'RTD.
- Eseguire lo script per produrre un grafico della funzione fit sovrapposta ai dati RTD e per stampare i valori dei parametri fit per la funzione. Se l'adattamento è molto scarso o si verificano errori, modificare le ipotesi iniziali del parametro ed eseguire nuovamente lo script.
- Eseguire la convoluzione del segnale in MATLAB
- Scegli un segnale e un RTD o due RTD da convolvere.
- Apri lo script Signal_Convolution.m, dal file supplementare 5, nell'editor MATLAB.
- Per ciascuno dei due segnali da convolvere (cioè un segnale e un RTD, o due RTD), definire un vettore di punti temporali uniformemente distanziati nelle unità desiderate e un vettore corrispondente di valori del segnale in quei momenti.
NOTA: i vettori dei due segnali devono avere lo stesso numero di elementi e le stesse dimensioni dei passi temporali. Questo è il motivo per cui è utile avere l'RTD come funzione continua che può essere campionata per un numero arbitrario di punti in qualsiasi intervallo di tempo. - Inserisci i due segnali in MATLAB ed esegui lo script per ottenere i vettori di tempo e segnale del segnale di uscita.
4. Impostare il sistema di perfusione di base con le cellule in una piastra di pozzo
- Preparare il piatto del pozzo
- Assicurarsi che la coltura della piastra del pozzo abbia la profondità media appropriata per l'esperimento di perfusione. Eseguire eventuali cambiamenti finali del mezzo, stimolazioni o altri passaggi come desiderato prima di iniziare la perfusione. Se le celle di sospensione vengono perfuse, centrifugare la piastra per assicurarsi che siano sul fondo.
- In condizioni sterili, inserire i tappi con aghi nelle colture di piastre del pozzo con gli aghi tirati su. Dopo che il tappo è in posizione, abbassare gli aghi all'altezza desiderata per la perfusione, poiché l'altezza dell'ago di uscita determina il livello di liquido stabile.
- Tappare gli aghi con tappi Luer maschi e tenere l'intera piastra del pozzo in un'incubatrice fino all'uso.
- Preparare le siringhe e i tubi a monte
- In condizioni sterili, riempire una siringa per ogni coltura da perfusare con un mezzo sufficiente per la durata desiderata della perfusione, più un mezzo aggiuntivo sufficiente per riempire il tubo a monte.
- Fissare il tubo a monte alla siringa utilizzando un connettore Luer femmina-barbo. All'altra estremità del tubo, inserire un connettore Luer maschio-barbo.
- Espensare il mezzo dalla siringa fino a quando il tubo a monte non è interamente riempito con il mezzo.
- Tappare l'estremità aperta del tubo con un cappuccio Luer femmina.
NOTA: tutte le siringhe replicate devono avere esattamente lo stesso volume a questo punto. Se i loro volumi non sono uguali, i loro stantuffi saranno in posizioni diverse e non si adatteranno tutti bene a una singola pompa a siringa multicanale.
- In condizioni sterili, inserire un connettore Luer maschio-barbo in un'estremità del tubo a valle e tapparlo con un cappuccio Luer femmina.
- Portare con cura tutti i tubi preparati, le siringhe e la piastra del pozzo nell'incubatore che verrà utilizzato per la perfusione.
- Posizionare la pompa della siringa e il collettore di frazione nelle posizioni desiderate vicino all'incubatore. Posizionare la pompa della siringa sopra o vicino all'incubatore e posizionare il collettore di frazioni accanto all'incubatore, vicino al porto.
- Raggruppare le estremità coperte di tutti i tubi a monte e a valle e spingerli dall'esterno dell'incubatore verso l'interno attraverso la porta.
- Caricare le siringhe nella pompa della siringa e inserire le estremità aperte dei tubi a valle nelle punte delle pipette di erogazione del distributore multitesta del collettore di frazione.
- All'interno dell'incubatore, tirare il più possibile l'allentamento dei tubi a monte nell'incubatore per massimizzare la lunghezza del tubo attraverso il quale il mezzo che scorre può ricevere calore e CO2 dall'aria dell'incubatore. Tenendoli in posizione, estrarre i tubi a valle dall'incubatore, quanto basta in modo che siano in grado di raggiungere il punto più esteso sul collettore di frazione mantenendo le estremità coperte all'interno dell'incubatore.
- Per ogni pozzetto collegato, scollegare rapidamente gli aghi e i tubi a monte e a valle per quel pozzo e collegarli insieme ai loro connettori Luer.
- Una volta collegate tutte le parti, far scorrere brevemente la pompa della siringa a una velocità relativamente elevata per assicurarsi che tutti i flussi scorrano correttamente.
- A questo punto, se si desidera iniziare l'esperimento con i tubi a valle pieni del mezzo, continuare a far funzionare la pompa fino a quando tutti non saranno riempiti. Altrimenti, arrestare la pompa.
- Impostare la portata della pompa della siringa e la frequenza di raccolta delle frazioni e avviare entrambe le macchine contemporaneamente per iniziare l'esperimento. Raccogli le frazioni per la durata dell'esperimento desiderata.
5. Impostare il sistema di perfusione con un rubinetto di arresto per più sorgenti medie
- Eseguire tutti i passaggi secondari del passaggio 4.1 precedente.
- Preparare i due mezzi da utilizzare nella perfusione, etichettando il mezzo che verrà erogato prima come 1 e l'altro come mezzo 2.
- Per ogni coltura da perfusare, riempire una siringa con un mezzo sufficiente 1 per la durata della sua erogazione, più un volume sufficiente per riempire inizialmente il sistema di perfusione. Riempire una seconda siringa con un mezzo sufficiente 2 per la durata della sua erogazione.
- Collegare entrambe le siringhe a due delle tre porte di un rubinetto a quattro vie.
NOTA: potrebbe essere necessaria una lunghezza del tubo per collegare le siringhe ai rubinetti. - Preparare il rubinetto e le siringhe in modo simile ai passaggi 3.1.7-3.1.8 di cui sopra chiudendo il rubinetto sul mezzo 1 ed erogando il mezzo 2 nel rubinetto fino a quando non inizia a gocciolare fuori dalla porta aperta.
- Chiudere il rubinetto sul mezzo 2 ed erogare il mezzo 1 nel rubinetto fino a quando tutto il mezzo residuo 2 non è stato scaricato dalla porta aperta.
- Collegare il tubo a monte alla porta del rubinetto aperto utilizzando un connettore Luer femmina-barbo. All'altra estremità del tubo, inserire un connettore Luer maschio-barbo.
- Espensare il mezzo 1 dalla siringa fino a quando il tubo a monte non è interamente riempito con il mezzo.
- Procedere con i passaggi 4.3-4.11 di cui sopra, caricando entrambe le siringhe in pompe a siringa separate e solo il mezzo di erogazione 1.
- Impostare la portata della pompa della siringa per il mezzo 1 e la frequenza di raccolta delle frazioni e avviare entrambe le macchine contemporaneamente per iniziare l'esperimento.
- Quando la sorgente del mezzo deve essere sostituita, arrestare rapidamente la pompa della siringa per il mezzo 1, ruotare il rubinetto chiuso al mezzo 1 e avviare la pompa della siringa per il mezzo 2. Se lo si desidera in seguito, riportare la sorgente al medio 1 in modo simile.
- Raccogli le frazioni per la durata dell'esperimento desiderata.
6. Impostare il sistema di perfusione con un serbatoio agitato per imitare la farmacocinetica
- Ottenere dati farmacocinetici per il farmaco di interesse e assicurarsi che consista in un picco di concentrazione seguito da un decadimento esponenziale.
- Dopo aver impostato il picco sul tempo 0 e aver rimosso i punti dati prima del picco, utilizzare lo script Stirred_Tank_Fit.m (file supplementare 6) per adattare l'equazione RTD del serbatoio agitato ai dati. Immettere v (la portata di perfusione desiderata) e i dati da inserire come coppia di vettori direttamente nello script, insieme a t e C rispettivamente per i valori temporali e i valori di concentrazione. Eseguire lo script per stampare il parametro V, che è il volume del serbatoio agitato richiesto.
- Pianificare un layout per il sistema di perfusione in modo da includere due pompe a siringa e uno shaker a piastre a monte dell'incubatore.
- Misurare gli RTD dei componenti del sistema di perfusione oltre il rubinetto di arresto ed eseguire la convoluzione del segnale degli RTD con varie durate e concentrazioni di impulsi farmacologici per trovare un profilo farmacocinetico appropriato. Utilizzare l'equazione RTD del serbatoio agitato adatta in questo calcolo.
- Procedere con i passaggi 5.1-5.8 precedenti.
- Utilizzare una piastra aggiuntiva del pozzo di dimensioni appropriate come serbatoio agitato per la configurazione. Ogni pozzo può servire come serbatoio agitato per una coltura perfusa. Riempire il pozzetto con il volume richiesto di mezzo, V, e tappare il pozzetto con gli aghi inizialmente tirati verso l'alto, quindi spinti sul fondo del pozzo e tappare gli aghi.
- Caricare le siringhe nelle pompe a siringa e collegare rapidamente il tubo dalle siringhe agli aghi di ingresso tappati dei serbatoi agitati. Quindi collegare le prese del tubo a monte della coltura cellulare agli aghi di uscita dei serbatoi agitati.
- Procedere con i passaggi 5.9-5.10.
- Al momento desiderato, passare al mezzo di erogazione 2 contenente il farmaco, come descritto nel passaggio 5.11. Tornare al mezzo 1 quando l'infusione del farmaco è completa.
- Procedere con il passaggio 5.12.
Figura 3: Il distributore multitesta. Design per il dispenser multitesta tagliato al laser. Questa cifra è stata modificata da Erickson et al.11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Representative Results
Il sistema di perfusione con più sorgenti medie della sezione 5 del protocollo è stato utilizzato per misurare le dinamiche di espressione di un gene reporter guidato dal fattore nucleare kappa-light-chain-enhancer del fattore di trascrizione delle cellule B attivate (NF-κB) nelle cellule del rene embrionale umano 293 (HEK293) in risposta a un impulso di 1,5 ore del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α). Le cellule HEK293 sono state stabilmente trasdotte utilizzando vettori lentivirali con un costrutto genico contenente Gaussia luciferasi (GLuc), guidato da un promotore chiamato NFKB contenente l'elemento di risposta NF-κB per creare cellule NFKB-GLuc HEK293, che sono state selezionate tramite fluorescence-activated cells sorting (FACS) per isolare le cellule trasdotte. Le cellule selezionate sono state crioconservate fino all'uso.
Per ogni coltura perfusa, la configurazione della perfusione includeva una sezione a monte di 1 m di tubo che portava a una piastra a 48 pozzetti tappata contenente le celle, seguita da 1 m di tubo a valle che conduceva al collettore di frazione multitesta, con una portata di 0,5 mL / h (0,0083 mL / min). Gli RTD del solo tubo da 1 m e della configurazione completa (tubo da 1 m + piastra a 48 pozzetti + tubo da 1 m) sono stati misurati utilizzando una portata di 0,5 ml / h con un impulso di tracciante di 20 minuti. La soluzione di fondo era acqua deionizzata, con una soluzione tracciante di colorante alimentare blu diluito in acqua deionizzata, e le frazioni venivano raccolte ad una velocità di 1 frazione / h utilizzando il distributore a più teste. Le concentrazioni di traccianti in campioni da 100 μL delle frazioni sono state misurate in un lettore di piastre tramite assorbanza a 628 nm.
I dati sulla concentrazione del tracciante sono stati elaborati in MATLAB per produrre RTD per entrambe le configurazioni. In primo luogo, gli RTD delle due configurazioni sono stati calcolati dai dati utilizzando lo script RTD_from_Data.m. I punti dati RTD del tubo da 1 m e la configurazione completa sono mostrati nella Figura 4.
Figura 4: Distribuzioni del tempo di permanenza. RTD (a sinistra) per un tubo da 1 m ad una portata di 0,5 mL/h (0,0083 mL/min). (Destra) RTD della configurazione completa della perfusione (tubo da 1 m + piastra a 48 pozzetti + tubo da 1 m) a una portata di 0,5 ml / h. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
L'RTD del solo tubo si adatta bene alla funzione di dispersione assiale, che è prevedibile sulla base della letteratura esistente13. Anche più pezzi di tubi in serie si adattano bene a un singolo modello di dispersione assiale e l'aggiunta della piastra a 48 pozzetti in linea causa una deviazione trascurabile da questo modello, quindi il tubo da 1 m da solo e il tubo da 1 m + piastra da 48 pozzetti + 1 m di configurazione del tubo dovevano essere adatti da un modello di dispersione assiale. È comune che si verifichino adattamenti scadenti del modello quando le ipotesi iniziali per i parametri del modello sono troppo lontane dai loro valori effettivi. Per dimostrarlo, in primo luogo, il modello di dispersione assiale è stato adattato ai dati del tubo da 1 m utilizzando lo script Fit_RTD_Function.m, utilizzando Pe = 10 e tau = 30 min come ipotesi iniziali per i parametri di funzione. La Figura 5 mostra che queste ipotesi hanno portato a modelli poco adatti, tracciati insieme ai dati RTD. Le ipotesi sono state cambiate in Pe = 10 e tau = 300 min, il che ha portato al buon modello mostrato nella Figura 5, poiché tau dovrebbe essere approssimativamente uguale al volume del sistema di perfusione diviso per la sua portata volumetrica. I parametri di adattamento per il tubo da 1 m sono Pe = 154,3, tau = 317,2 min, mentre i parametri per l'intero sistema sono Pe = 396,5, tau = 596,5 min.
Figura 5: Esempi di modelli buoni e scadenti adatti a un RTD. Un modello di dispersione assiale è stato adattato ai dati RTD per un tubo da 1 m ad una portata di 0,5 mL/h (0,0083 mL/min). (A sinistra) Le ipotesi iniziali per l'input dei parametri del modello nello script MATLAB erano troppo lontane dai loro valori reali, causando lo script a restituire una scarsa adattabilità del modello. (Destra) Nello script sono stati immessi valori di parametro migliori, con conseguente adattamento del modello. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La convoluzione del segnale è stata eseguita utilizzando queste funzioni RTD di adattamento nello script Signal_Convolution.m per prevedere come un impulso di 1,5 ore di mezzo contenente 10 ng / mL TNF-α all'ingresso del tubo a monte si sarebbe propagato attraverso il sistema. Il segnale di ingresso è stato inizialmente coinvolto con l'RTD del tubo da 1 m per determinare quale segnale di α TNF sarebbe entrato nella piastra del pozzo. Il segnale di ingresso è stato anche coinvolto con l'RTD del tubo da 1 m + piastra a 48 pozzetti + tubo da 1 m per determinare quale sarebbe il segnale TNF-α all'uscita del sistema nelle frazioni raccolte, dove apparirà accanto alla corrispondente risposta GLuc dalle cellule. La Figura 6 mostra l'ingresso TNF-α segnale di impulso viene mostrato insieme ai segnali previsti all'ingresso del pozzo e all'uscita del sistema.
Figura 6: Previsione dei segnali di concentrazione α del TNF nel sistema di perfusione. Il mezzo contenente α TNF è stato infuso nel sistema di perfusione a 10 ng/mL per i primi 90 minuti di funzionamento, rappresentato dal segnale rettangolare blu. (A sinistra) Coinvolgendo il segnale di ingresso con il modello di dispersione assiale di adattamento del tubo DA 1 m RTD, è stato previsto il segnale di concentrazione TNF-α all'ingresso della piastra a 48 pozzetti. (Destra) Allo stesso modo, utilizzando il modello RTD per l'intero sistema, è stato previsto il segnale TNF-α all'uscita del sistema. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Le cellule NFKB-GLuc HEK293 sono state scongelate e placcate in una piastra a 48 pozzetti a 1 x 104 cellule/pozzetto in 0,4 mL di Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS), e sono state incubate per 1 giorno a 37 °C con il 5% di CO2, dopo di che sono stati seguiti i passaggi nella sezione 5 del protocollo di cui sopra per impostare il sistema di perfusione con un rubinetto per più fonti medie. Quattro corsi d'acqua sono stati istituiti per perfondere quattro pozzi. Una pompa a siringa multicanale è stata caricata con quattro siringhe complete da 60 ml contenenti DMEM come mezzo 1. Una seconda pompa a siringa è stata caricata con siringhe da 5 mL contenenti mezzo 2, due delle quali contenevano DMEM semplice come controllo e due contenenti DMEM con 10 ng / mL TNF-α come stimolo. All'inizio dell'esperimento, le siringhe da 5 mL contenenti TNF-α o il mezzo di controllo sono state erogate a 0,5 mL/h per 1,5 h, dopo di che i rubinetti sono stati commutati e le siringhe da 60 mL contenenti DMEM sono state erogate per le successive 40 ore. A 24 ore e alla fine della perfusione, le frazioni dei quattro flussi, che sono state erogate in tubi di microcentrifuga, sono state etichettate e congelate a -80 ° C e il collettore di frazioni è stato ripristinato.
Dopo la perfusione, tutti i campioni sono stati scongelati e le loro concentrazioni di GLuc sono state misurate utilizzando un test di bioluminescenza, descritto in precedenza11,16. I valori di luminescenza sono stati convertiti in velocità di luminescenza/h dividendo la luminescenza di ciascun campione di frazione per la durata temporale di quella frazione e sono stati tracciati come serie temporali per ciascuno dei quattro flussi. Il tempo di ogni misurazione GLuc era il punto medio dell'intervallo di tempo durante il quale quella frazione veniva raccolta, meno il tempo medio di permanenza (tau = 317 min) del tubo a valle del sistema di perfusione. Il segnale TNF-α che si prevede sia contenuto all'interno delle frazioni è stato anche spostato nel tempo dal tempo medio di permanenza del tubo a valle ed è stato sovrapposto ai dati GLuc, rivelando la dinamica stimolo-risposta NF-κB-driven gene expression, mostrata nella Figura 7.
Figura 7: Dinamica stimolo-risposta misurata utilizzando il sistema di perfusione. Il sistema di perfusione con due sorgenti medie è stato utilizzato per esporre transitoriamente due colture cellulari a un impulso di TNF-α con due colture non esposte come controlli. Le celle HEK293 sono state progettate per secernere GLuc guidato da un promotore contenente l'elemento di risposta NF-κB, che è stato raccolto nelle frazioni di effluente. L'esperimento rivela un drammatico aumento dell'espressione guidato da NF-κB dopo l'esposizione al TNF-α. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La presenza di GLuc accumulato nelle colture all'inizio della perfusione ha causato l'apparente calo del segnale GLuc dalla prima alla seconda frazione in tutte e quattro le curve. Questo artefatto comune può essere evitato nel sistema di perfusione cambiando il mezzo nelle colture immediatamente prima di iniziare le perfusioni. Le due colture di controllo che non hanno ricevuto TNF-α hanno mantenuto un basso tasso di secrezione di GLuc che è gradualmente aumentato nel corso della durata dell'esperimento. Questo risultato può riflettere la crescita della popolazione cellulare. Le colture stimolate inizialmente avevano lo stesso tasso di secrezione di GLuc dei controlli e poi aumentavano drasticamente la secrezione quando l'espressione guidata da NF-κB viene attivata in risposta a un impulso di α TNF. La secrezione di GLuc raggiunge il picco circa 9 ore dopo il primo arrivo del TNF-α, dopo di che diminuisce con decadimento esponenziale.
File supplementare 1: File CAD: Multi-head_Dispenser.DFX: Questo file contiene il modello per il distributore multi-testa che può essere tagliato al laser e utilizzato per modificare i collettori di frazioni. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 2: example_tracer_data.xlsx. Contiene dati di esperimento traccianti di esempio che devono essere letti dallo script MATLAB RTD_from_Data.m. Può anche essere utilizzato come modello per nuovi dati. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 3: File MATLAB: RTD_from_Data.m. Questo script legge i dati dell'esperimento tracciante da un file .xlsx e restituisce i vettori t ed Et che rappresentano l'RTD. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 4: File MATLAB: Fit_RTD_Function.m. Questo script carica i vettori RTD dallo script RTD_from_Data.m e restituisce un modello adatto per l'RTD. Il tipo di modello è scelto dall'utente. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 5: File MATLAB: Signal_Convolution.m. Questo script prende un segnale di soluto definito dall'utente e un RTD come ingressi e prevede come il segnale verrà modificato dopo aver attraversato il sistema di flusso con quell'RTD. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 6: File MATLAB: Stirred_Tank_Fit.m. Questo script adatta una curva RTD CSTR all'input di dati farmacocinetici da parte dell'utente e restituisce il volume del serbatoio necessario per produrre l'RTD per la portata specificata. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Questo lavoro descrive l'assemblaggio e il funzionamento di un sistema di coltura cellulare a perfusione con più sorgenti medie dimostrate con un esempio specifico in cui sono state misurate le dinamiche dell'espressione genica guidata da NF-κB in risposta a un impulso transitorio di TNF-α. Gli RTD dei componenti del sistema di perfusione sono stati misurati e modellati e la convoluzione del segnale è stata utilizzata per prevedere sia l'esposizione delle cellule all'impulso TNF-α sia la distribuzione TNF-α nelle frazioni medie di effluente raccolte. Le cellule sono state esposte all'impulso e le frazioni sono state raccolte per 40 ore, dopo di che il GLuc è stato misurato nelle frazioni e tracciato insieme al segnale TNF-α previsto per rivelare le dinamiche di stimolazione-risposta.
Questo metodo di perfusione non è privo di carenze. In particolare, il sistema comporta un rischio di sterilità a causa della breve fase critica in cui il tubo è collegato alla piastra del pozzo dopo l'installazione all'interno dell'incubatore. Nell'esperienza degli autori, la contaminazione è piuttosto rara; tuttavia, il rischio di contaminazione può essere mitigato nei seguenti modi. Il primo è quello di eseguire tutte le procedure di manipolazione delle cellule e le connessioni sterili in un armadio di biosicurezza. Un'ulteriore precauzione che può essere presa in considerazione per migliorare la sterilità è l'inclusione di un filtro a siringa da 0,22 μm in linea all'ingresso delle colture cellulari. L'uso della filtrazione sterile intrappola i batteri o i microrganismi più grandi presenti nel mezzo prima che entrino nella coltura cellulare, anche se aumenta i requisiti di pressione per guidare il flusso e può ostruirsi a causa dell'incrostazione della membrana. I campioni in uscita vengono raccolti anche in ambienti aperti a rischio di contaminazione. La raccolta di campioni in un sistema di involucro, idealmente con filtrazione dell'aria, per il modulo di frazionamento eliminerebbe questo problema nelle future costruzioni del sistema.
Inoltre, i segnali secreti dalle cellule vengono distorti in base all'RTD del tubo a valle prima di essere frazionati e misurati. Pertanto, i segnali misurati sono versioni imbrattate di quelli secreti dalle cellule. Teoricamente, questa sbavatura può essere annullata eseguendo la deconvoluzione sul segnale misurato per rimuovere l'effetto dell'RTD14 a valle, ma è difficile applicare con successo questa tecnica numerica ai dati non ideali poiché il rumore del segnale diventa notevolmente amplificato. Tuttavia, molte dinamiche biologiche di interesse si svolgono sulla scala temporale da ore a decine di ore, e quindi sono influenzate molto poco dagli effetti di sbavatura dei tubing RTD, essendo spostati nel tempo ma cambiati poco nella forma. Il metodo di misurazione RTD qui mostrato può anche essere migliorato utilizzando impulsi traccianti più brevi e utilizzando soluzioni di fondo e sostanze traccianti che corrispondono a quelle che verranno utilizzate negli esperimenti di coltura cellulare. Tuttavia, i tempi di impulso suggeriti qui hanno dimostrato di dare RTD identici a tutti i tempi di impulso più brevi e quindi sono adatti per le misurazioni RTD, ma poiché i tempi di impulso sono aumentati, gli RTD cambiano in modo più significativo e quindi non dovrebbero essere utilizzati. Gli autori hanno scoperto in precedenza che sia il colorante alimentare che il GLuc hanno RTD molto simili tra loro sia nell'acqua che nel terrenodi coltura 11, quindi è improbabile che le specie molecolari cambino molto l'RTD. Infine, non è stata osservata alcuna differenza nelle RTD per il colorante alimentare in acqua quando misurato a 20 °C rispetto a 37 °C, o in tubi dritti rispetto a tubi altamente arrotolati11. Questi dati, e i dati di RST per una serie di geometrie e portate del sistema di perfusione, possono essere trovati nella precedente pubblicazione11 degli autori, insieme a una spiegazione dettagliata delle operazioni eseguite dallo script di analisi RTD in questo articolo. Ulteriori dettagli sulla teoria dell'analisi RTD13 ed esempi di applicazioni di RTD a sistemi di bioreattori 17,18,19,20,21 sono disponibili nei riferimenti forniti.
Questo metodo versatile può essere utilizzato per misurare i tassi di secrezione o assorbimento di sostanze solubili nelle colture cellulari e i segnali transitori di soluto possono essere consegnati alle colture commutando le fonti medie a monte. Segnali semplici come impulsi di soluto o cambi di passo possono essere erogati semplicemente commutando la valvola di ingresso. I segnali di tipo farmacocinetico possono essere prodotti posizionando un serbatoio agitato con il volume di liquido appropriato in linea a monte della coltura e fornendo un impulso di soluto attraverso di esso. Altri segnali possono essere creati applicando diverse combinazioni di impulsi, cambi di passo e componenti con nuovi RTD per distorcere gli impulsi nelle forme desiderate. I metodi di coltura cellulare statica esistenti non sono in grado di raccogliere continuamente campioni di medie dimensioni in modo automatizzato e non possono essere utilizzati per esporre le cellule a segnali di soluto che variano senza intoppi. I sistemi microfluidici sono costosi e richiedono competenze, e non esistono sistemi macrofluidici disponibili in commercio per questa classe di esperimenti. Il sistema semplice e a basso costo può essere adottato dai laboratori per studiare il comportamento naturale delle cellule, le risposte agli impulsi, gli effetti di diversi profili di soluto transitorio che possono imitare farmaci o dinamiche del segnale del soluto endogeno e possono essere riconfigurati per soddisfare le esigenze di nuovi esperimenti. Le applicazioni future di questa tecnica e di quelle attualmente in corso includono: misurare la dinamica del tasso di secrezione di citochine ed esosomi da una terapia cellulare ex vivo ; valutare l'effetto del tempo di orologio circadiano sulla risposta cellulare ai farmaci; misurare il tasso di crescita e il metabolismo dei biofilm batterici; produrre curve dose-risposta per vettori di virus adeno-associati (AAV) in vitro; misurare il tasso di produzione dinamico di vettori lentivirali dalle cellule produttrici; e incorporando profili di farmaci chemioterapici farmacocinetici in biopsie di medicina personalizzata per la terapia oncologica di precisione.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata condotta con il supporto di Grant Nos. R01EB012521, R01EB028782 e T32 GM008339 del National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 Gauge 1 1/2- in Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines | Grainger | 5FVK2 | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | HEK 293T cells used in the Representative Results experiment. |
| 96-Well Clear Bottom Plates, Corning | VWR | 89091-010 | Plates for measuring dye concentrations in RTD experiments and GLuc in representative results experiment. |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 5 mL | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| BioFrac Fraction Collector | Bio-Rad | 7410002 | Fraction collector that can be used for a single stream, or modified using our method to enable collection from multiple streams. |
| Clear High-Strength UV-Resistant Acrylic 12" x 12" x 1/8" | McMaster-Carr | 4615T93 | This sheet is cut using a laser cutter according to the DXF file in the supplemental materials to produce the multi-head dispenser that can be attached to the BioFrac fraction collector. |
| Coelenterazine native | NanoLight Technology | 303 | Substrate used in Gaussia luciferase bioluminescence assay in representative results. |
| Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, size 48 wells, polystyrene plate, flat bottom wells | Millipore Sigma | CLS3548 | Used to grow and perfuse 293T cells in representative results. |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells | Fisher Scientific | 720081 | Can be plugged and used as a stirred tank to produce pharmacokinetic profiles in perfusion. Can also contain cells for perfusion. |
| DMEM, high glucose | ThermoFisher Scientific | 11965126 | |
| Epilog Zing 24 Laser | Cutting Edge Systems | Epilog Zing 24 | Laser cutter used to produce multi-head dispenser from acrylic sheet. Other laser cutters may be used. |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 20 mL | Fisher Scientific | 14-955-460 | |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 60 mL | Fisher Scientific | 14-955-461 | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | Microcentrifuge tubes for collecting fractions. |
| Fisherbrand Round Bottom Disposable Borosilicate Glass Tubes with Plain End | Fisher Scientific | 14-961-26 | Glass tubes for collecting fractions. |
| Fisherbrand SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-Filtered | Fisher Scientific | 2707410 | 300 ul pipette tips that best fit the multi-head dispenser and tubing to act as dispensing tips. |
| Gibco DPBS, powder, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 21600010 | Phosphate buffered saline. |
| Labline 4625 Titer Shaker | Marshall Scientific | Labline 4625 Titer Shaker | Orbital shaker used to keep stirred tanks mixed. |
| Masterflex Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile; 10/PK | Cole-Parmer | EW-30600-04 | Used to join multiple inlet streams for RTD experiments and cell culture experiments. |
| Masterflex Fitting, Polycarbonate, Straight, Female Luer x Cap; 25/PK | Masterflex | UX-45501-28 | |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hosebarb Adapters, 1/16" | Cole-Parmer | EW-45508-00 | |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Hosebarb Adapter, 1/16" ID | Cole-Parmer | EW-45518-00 | |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Plug Adapter; 25/PK | Masterflex | EW-30800-30 | |
| Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 14; 25 ft | Masterflex | EW-96410-14 | |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | Version R2019b. Newer versions may also be used. Some older versions may work. |
| NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1600 | |
| Rack Set F1 | Bio-Rad | 7410010 | Racks to hold collecting tubes in the fraction collector. |
| Recombinant Human TNF-alpha (HEK293-expressed) Protein, CF | Bio-Techne | 10291-TA-020 | Cytokine used to stimulate 293T cells in representative results. |
| Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 00, Bottom 10.5mm | Saint Gobain | DX263015-50 | Fits 48-well plates. |
| Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 4 Bottom 21mm | Saint Gobain | DX263027-10 | Fits 12-well plates. |
| Sodium Hydroxide, 10.0 N Aqueous Solution APHA; 1 L | Spectrum Chemicals | S-395-1LT | |
| SolidWorks | Dassault Systems | SolidWorks | CAD software used to create the multi-head dispenser DXF file. |
| Varioskan LUX multimode microplate reader | ThermoFisher Scientific | VL0000D0 | Plate reader. |
| Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue | Michaels | 10404779 | Blue food dye containing Brilliant Blue FCF, used as a tracer in RTD experiments. Absorbance spectrum peaks at 628 nm. |
References
- Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Current Biology. 14 (24), 2289-2295 (2004).
- Talaei, K., et al. A mathematical model of the dynamics of cytokine expression and human immune cell activation in response to the pathogen Staphylococcus aureus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711153 (2021).
- Kemas, A. M., Youhanna, S., Zandi Shafagh, R., Lauschke, V. M. Insulin-dependent glucose consumption dynamics in 3D primary human liver cultures measured by a sensitive and specific glucose sensor with nanoliter input volume. FASEB Journal. 35 (3), 21305 (2021).
- Muzzey, D., van Oudenaarden, A. Quantitative time-lapse fluorescence microscopy in single cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 301-327 (2009).
- Calligaro, H., Kinane, C., Bennis, M., Coutanson, C., Dkhissi-Benyahya, O. A standardized method to assess the endogenous activity and the light-response of the retinal clock in mammals. Molecular Vision. 26, 106-116 (2020).
- Battat, S., Weitz, D. A., Whitesides, G. M. An outlook on microfluidics: the promise and the challenge. Lab on a Chip. 22 (3), 530-536 (2022).
- Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., Dibner, C. Parallel measurement of circadian clock gene expression and hormone secretion in human primary cell cultures. Journal of Visualized Experiments. (117), e54673 (2016).
- Yamagishi, K., Enomoto, T., Ohmiya, Y. Perfusion-culture-based secreted bioluminescence reporter assay in living cells. Analytical Biochemistry. 354 (1), 15-21 (2006).
- Watanabe, T., et al. Multichannel perfusion culture bioluminescence reporter system for long-term detection in living cells. Analytical Biochemistry. 402 (1), 107-109 (2010).
- Murakami, N., Nakamura, H., Nishi, R., Marumoto, N., Nasu, T. Comparison of circadian oscillation of melatonin release in pineal cells of house sparrow, pigeon and Japanese quail, using cell perfusion systems. Brain Research. 651 (1-2), 209-214 (1994).
- Erickson, P., Houwayek, T., Burr, A., Teryek, M., Parekkadan, B. A continuous flow cell culture system for precision cell stimulation and time-resolved profiling of cell secretion. Analytical Biochemistry. 625, 114213 (2021).
- Saltzman, W. M. Drug Delivery: Engineering Principles for Drug Therapy. , Oxford University Press. (2001).
- Fogler, H. S. Elements of Chemical Reaction Engineering. 4th edn. , Prentice Hall PTR. Boston. (2006).
- Conesa, J. A. Chemical Reactor Design: Mathematical Modeling and Applications. , Wiley. (2019).
- Toson, P., Doshi, P., Jajcevic, D. Explicit residence time distribution of a generalised cascade of continuous stirred tank reactors for a description of short recirculation time (bypassing). Processes. 7 (9), 615 (2019).
- Tamayo, A. G., Shukor, S., Burr, A., Erickson, P., Parekkadan, B. Tracking leukemic T-cell transcriptional dynamics in vivo with a blood-based reporter assay. FEBS Open Biology. 10 (9), 1868-1879 (2020).
- Newell, B., Bailey, J., Islam, A., Hopkins, L., Lant, P. Characterising bioreactor mixing with residence time distribution (RTD) tests. Water Science and Technology. 37 (12), 43-47 (1998).
- Dubois, J., Tremblay, L., Lepage, M., Vermette, P. Flow dynamics within a bioreactor for tissue engineering by residence time distribution analysis combined with fluorescence and magnetic resonance imaging to investigate forced permeability and apparent diffusion coefficient in a perfusion cell culture chamber. Biotechnology and Bioengineering. 108 (10), 2488-2498 (2011).
- Gaida, L. B., et al. Liquid and gas residence time distribution in a two-stage bioreactor with cell recycle. HAL Open Science. , (2008).
- Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Wave characterization for mammalian cell culture: residence time distribution. New Biotechnology. 29 (3), 402-408 (2012).
- Olivet, D., Valls, J., Gordillo, M. A., Freixó, A., Sánchez, A. Application of residence time distribution technique to the study of the hydrodynamic behaviour of a full-scale wastewater treatment plant plug-flow bioreactor. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 80 (4), 425-432 (2005).
