Summary
이 논문은 세포 과정에서 용질의 분비 및 흡수 속도의 역학을 측정하기 위한 저비용의 다채널 관류 세포 배양 시스템을 구축하고 운영하는 방법을 제시한다. 시스템은 또한 세포를 동적 자극 프로파일에 노출시킬 수 있다.
Abstract
특정 세포 및 조직 기능은 기존의 배양 시스템에 의해 제대로 해결되지 않는 분에서 시간의 동적 시간 척도 내에서 작동합니다. 이 작업은 배양 배지를 세포 배양 모듈에 지속적으로 관류하고 다운스트림 모듈에서 분획하여이 규모의 역학을 측정 할 수있는 저비용 관류 생물 반응기 시스템을 개발했습니다. 이 시스템은 거의 전적으로 상업적으로 이용 가능한 부품으로 구성되며 병렬화되어 기존의 다중 웰 세포 배양 플레이트에서 동시에 독립적 인 실험을 수행 할 수 있습니다. 이 비디오 기사에서는 단일 다중 채널 주사기 펌프와 최대 여섯 개의 배양물을 병렬로 관류하기 위해 수정된 분획 수집기만 있으면 되는 기본 설정을 조립하는 방법을 보여 줍니다. 모듈형 설계에 유용한 변형이 또한 제시되어 용질 펄스 또는 약동학적 유사 프로파일과 같은 제어된 자극 역학을 허용한다. 중요한 것은 용질 신호가 시스템을 통과할 때 용질 분산으로 인해 왜곡된다는 것입니다. 또한, MATLAB을 사용하여 트레이서를 사용하여 관류 설정의 구성 요소의 체류 시간 분포(RTD)를 측정하는 방법이 설명된다. RTD는 다중 구획 시스템의 흐름에 의해 용질 신호가 어떻게 왜곡되는지 계산하는 데 유용합니다. 이 시스템은 매우 견고하고 재현 가능하므로 기본 연구원은 전문 제조 시설 없이도 쉽게 채택 할 수 있습니다.
Introduction
많은 중요한 생물학적 과정은 세포 및 조직 배양물에서 분 내지 시간 1,2,3의 시간 척도에서 일어난다. 이러한 현상 중 일부는 타임랩스 현미경4, 생체발광1 또는 기타 방법을 사용하여 자동화된 방식으로 관찰되고 기록될 수 있지만, 화학 분석을 위해 배양 상등액 샘플의 수집을 포함하는 실험은 종종 정적 세포 배양물에서 수동으로 수행됩니다. 수동 샘플링은 빈번한 또는 근무 후 샘플링 시간대의 불편 함으로 인해 특정 연구의 실현 가능성을 제한합니다. 정적 배양 방법의 또 다른 단점은 화학 자극에 대한 통제되고 일시적인 노출을 포함하는 실험을 포함한다. 정적 배양에서, 자극은 수동으로 추가 및 제거되어야 하며, 자극 프로파일은 시간에 따른 단계 변화로 제한되는 반면, 배지 변경은 또한 통제되지 않는 방식으로 세포에 영향을 미칠 수 있는 다른 배지 성분을 추가 및 제거한다5. 유체 시스템은 이러한 문제를 극복 할 수 있지만 기존 장치는 다른 문제를 제기합니다. 미세 유체 장치는 생산 및 사용을위한 특수 장비 및 교육의 엄청난 비용을 수반하며, 샘플을 처리하기 위해 미세 분석 방법이 필요하며 관류 후 세포가 장치에서 복구하기가 어렵습니다6. 7,8,9,10에 설명 된 실험 유형을 위해 매크로 유체 시스템이 거의 만들어지지 않았으며 사내에서 제작 된 여러 맞춤형 부품으로 제작되었으며 여러 펌프 또는 분수 수집기가 필요합니다. 또한, 저자들은 현탁 배양을 위한 교반 탱크 생물반응기 이외의 상업적으로 이용가능한 거대유체 관류 세포 배양 시스템을 알지 못하지만, 이는 생리학을 모델링하고 연구하기 위해 설계되지는 않았지만, 바이오제조에 유용하다.
저자들은 이전에 거의 전적으로 상업적으로 이용가능한 부분들(11)로 구성된 저비용 관류 생물반응기 시스템의 설계에 대해 보고하였다. 시스템의 기본 버전은 웰 플레이트의 여러 배양물을CO2 인큐베이터에 보관하고 시린지 펌프의 배지와 지속적으로 관류할 수 있게 하며, 배양물로부터의 유출 배지 스트림은 맞춤형 변형을 통해 분획 수집기를 사용하여 시간이 지남에 따라 샘플로 자동 분획됩니다. 따라서, 이 시스템은 배양 배지 상청액의 자동 샘플링 및 시간에 따른 배양물에 대한 연속 용질 투입을 가능하게 한다. 이 시스템은 거대 유동적이고 모듈식이며 새로운 실험 설계의 요구를 충족시키기 위해 쉽게 수정할 수 있습니다.
여기에 제시된 방법의 전반적인 목표는 시간에 따른 세포에 의한 물질의 분비 또는 흡수 속도가 측정되고 / 또는 세포가 정확하고 일시적인 용질 신호에 노출되는 실험을 가능하게하는 관류 세포 배양 시스템을 구성, 특성화 및 사용하는 것입니다. 이 비디오 기사에서는 단일 주사기 펌프와 변형된 분획 수집기를 사용하여 최대 여섯 개의 세포 배양물을 동시에 관류할 수 있는 기본 설정을 조립하는 방법을 설명합니다. 짧은 펄스 및 약동학 유사 프로파일(12)을 포함하는 세포를 일시적인 용질 농도 신호에 노출시키는 실험을 허용하기 위해 추가적인 펌프 및 부품을 사용하는 베이스 시스템 상의 두 가지 유용한 변이체가 또한 도 1에 제시된다.
그림 1: 관류 시스템 설계의 세 가지 변형 . (Top) 기본 관류 시스템. (중간) 여러 매체 소스에 대한 스톱콕이있는 관류 시스템. (하단) 교반된 탱크를 갖는 관류 시스템은 잘 혼합된 부피의 분포를 모방한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
흐름 내의 분산 및 확산으로 인해 용질 신호는 흐름 시스템을 통과 할 때 왜곡되거나 "번짐"됩니다. 이러한 왜곡은 체류 시간 분포(RTD)13의 사용을 통해 정량화될 수 있다. 이 문서에서는 관류 시스템의 구성 요소에 대한 추적기 실험을 수행하는 방법을 설명하고(그림 2), 측정된 데이터에서 RTD를 생성하는 MATLAB 스크립트를 제공합니다. 이 분석에 대한 자세한 설명은 저자의 이전 논문11에서 찾을 수 있습니다. 추가적인 MATLAB 스크립트는 RTD에 적절한 기능을 적합시키고 물리적 파라미터를 추출하고, RTD를 사용하여 신호 컨볼루션을 수행하여 사용자에 의해 입력된 용질 신호가 관류 시스템(14)을 통해 어떻게 전파되고 왜곡되는지를 예측한다.
그림 2: 체류 시간 분포. 이 튜브 길이와 같은 흐름 시스템 구성 요소의 RTD는 트레이서의 펄스를 시스템에 입력하고 수집 된 분획으로 빠져 나올 때까지 "번짐"을 측정하여 측정됩니다. 이 수치는 Erickson et al.11에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
1. 우물 격판덮개 관류를 위한 부속을 준비하십시오
- 튜브 준비
- 각 세포 배양물이 관류되도록 두 개의 길이의 실리콘 튜빙(1.6 mm 내경)을 절단한다. 업스트림 튜빙으로 사용되는 조각이 주사기 펌프에서 인큐베이터 내부의 세포 배양까지 도달하기에 충분히 길고, 하류 조각이 세포 배양물에서 분획 수집기의 가장 먼 확장 위치까지 도달 할 수 있는지 확인하십시오.
- 튜브의 각 조각에 라벨이 붙은 테이프로 양쪽 끝에 고유 한 라벨을 붙이십시오.
- 우물 접시를위한 마개 준비
- 관류될 웰 플레이트의 각 웰에 대해 하나의 실리콘 마개를 얻고, 밀폐된 씰로 웰에 꼭 맞도록 적절한 직경을 가집니다.
- 마개 바닥에서 과도한 물질을 차단하여 우물에 맞게하고 의도 한 액체 수준 이상의 공기를 위해 내부 공간을 남겨 둡니다.
- 두 개의 둔한 18G 바늘을 각 마개를 통해 아래쪽에서 위쪽과 바깥쪽으로 밀어 넣어 우물을 통과하는 흐름의 입구 및 출구 역할을하며 서로 정반대쪽으로 이동하여 우물 내의 팁 사이의 거리를 극대화하십시오.
- 출구 바늘의 높이가 관류 중에 우물에있는 액체 수준의 안정된 높이를 결정하기 때문에 플러그가 달린 우물 내의 바늘의 높이를 조정하십시오.
참고 : 관류가 액체 레벨 위의 출구 바늘로 시작되면 레벨이 바늘에 도달 할 때까지 액체가 우물에 축적됩니다. 관류가 액체 레벨 아래의 출구 바늘로 시작되면, 기포가 우물로 흘러 들어가지 않는 한 액체 레벨은 일정하게 유지되며, 이로 인해 액체 높이가 출구 바늘과 동일한 높이가 될 때까지 낮아집니다.
- 추가 부품 수집
- 전체 관류를 위한 충분한 배지를 함유하기에 충분히 큰 각각의 세포 배양물에 대해 하나의 멸균 주사기를 수득하고, 초기에 튜빙을 채우기 위한 추가의 양의 배지를 포함한다.
- 각 배양물을 관류하려면 암컷 대 미늘 한 개와 남성 대 바브 루어 커넥터 두 개와 여성 및 남성 루어 캡 두 개를 얻으십시오.
- 부품을 청소하고 살균하십시오.
- 이전에 부품을 사용한 적이 있다면 0.1 N NaOH로 관류하여 닦은 다음 탈이온수로 헹구십시오.
- 오토클레이빙 또는 다른 방법으로 위에 나열된 모든 부품의 멸균성을 보장하십시오.
2. 멀티 헤드 디스펜서를 레이저로 자르고 분수 수집기에 부착하십시오.
- 그림 3의 다중 헤드 디스펜서 모델을 컴퓨터 지원 설계 프로그램에서 다시 생성하거나 제공된 모델 DXF 파일(보충 파일 1)을 다운로드합니다.
- 레이저 커터를 사용하여 아크릴 시트의 1/8에서 디자인을 자릅니다.
- 분배 헤드를 분수 컬렉터의 이동 베이스에 부착하는 세 개의 나사를 분리합니다.
- 멀티 헤드 디스펜서의 가장 작은 구멍 세 개를 이동 베이스의 나사 구멍에 맞추고 나사를 구멍을 통해 다시 조여서 부착합니다.
- 세 개의 나사의 조임새를 조정하여 분배 구멍의 행이 그 아래의 수집 튜브와 정렬될 때까지 다중 헤드 디스펜서를 위아래로 기울입니다.
- 300 μL 피펫 팁을 원하는 구멍을 통해 조심스럽게 배치하여 분배 팁으로 사용하십시오.
참고: 분획 수집기는 단일 세포 배양물을 관류하기 위해 다중 헤드 디스펜서 없이 사용될 수 있다.
3. 컴포넌트 RTD 측정 및 신호 컨볼루션 수행
- 그림 2와 같이 트레이서 펄스용 펌프와 주사기를 설정합니다.
- 두 개의 단일 채널 또는 다중 채널 주사기 펌프를 확보하십시오.
- 세포 배양 실험 동안 유동 시스템에서 사용될 배지를 나타내기 위해 배경 용액을 선택하십시오. 배경 용액이 매체와 유사한 질량 전달 특성을 갖는지 확인하십시오. 많은 경우에, 탈이온수는 적절한 선택이다.
- 세포 배양 실험 중에 관심을 가질 용질을 나타내는 트레이서 물질을 선택하십시오. 추적기가 관심있는 용질과 유사한 질량 전달 특성을 가지며 그 농도를 측정 할 수 있어야합니다. 많은 경우, 식품 염료는 적절한 선택입니다.
- 트레이서 물질을 배경 용액에 용해시켜 트레이서 용액을 만듭니다.
- 하나의 주사기를 배경 용액으로 채우고 하나의 주사기 펌프에로드하십시오. 다른 주사기를 트레이서 용액으로 채우고 두 번째 주사기 펌프에 적재하십시오.
- Luer 커넥터를 사용하여 두 주사기를 네 방향 스톱콕의 세 포트 중 두 개에 연결합니다.
- 스톱콕을 배경 용액으로 닫고 트레이서 용액을 열린 포트에서 떨어지기 시작할 때까지 스톱콕에 펌핑하십시오. 펌프를 멈추고 주사기를 더 이상 조정하지 마십시오.
참고: 주사기 펌프의 이동 막대가 실험의 시간 초과 부분이 시작되기 전에 주사기 플런저에 대해 위로 밀려나는 것이 중요합니다. 이렇게하면 펌프가 시작될 때 즉시 흐름이 시작될 수 있습니다. 그렇지 않으면, 펌프가 시작될 수 있지만, 이동 막대가 플런저 위치까지 따라잡을 때까지 흐름이 실제로 시작되지 않을 것이다. - 트레이서 용액에 스톱콕을 닫고 모든 잔류 트레이서 용액이 열린 포트에서 플러시될 때까지 배경 용액을 스톱콕으로 펌핑합니다. 펌프를 멈추고 주사기를 더 이상 조정하지 마십시오.
- 관심 있는 흐름 시스템 구성 요소와 분수 수집기 설정
- RTD 분석에 원하는 흐름 시스템 구성 요소를 설정합니다. 측정될 부품이 작동 중에 분수 수집기에 도달하기에 적합한 길이와 유연성의 다운스트림 튜브 조각으로 끝나도록 하십시오.
- 다운스트림 튜브의 끝을 멀티 헤드 디스펜서의 피펫 팁 디스펜서에 삽입하여 단단히 연결되도록 합니다.
- 네 방향 스톱콕의 열린 포트를 측정할 구성 요소의 입구에 연결합니다. 배경 용액을 세포 배양 실험 동안과 같이 완전히 채워질 때까지 성분을 통해 펌핑하고, 분획 수집기 분배 팁에서 물방울을 흘리기 시작한다. 펌프를 중지하십시오.
- 트레이서 펄스를 주입하고, 분수를 수집하고, 트레이서 측정
- 트레이서 용액의 펌프를 원하는 유량으로 설정하십시오. 백그라운드 솔루션에 대한 stopcock을 닫고 트레이서 솔루션의 흐름을 시작하십시오. 동시에 분수 수집기를 시작하십시오.
- 트레이서 솔루션의 흐름을 짧은 시간 동안 계속하여 트레이서의 임펄스 입력을 근사화합니다. 10분의 펄스 지속 시간은 1mL/h의 유속으로 RTD에 대해 잘 작동하는 것으로 밝혀졌다.
참고: 트레이서 펄스가 너무 짧으면 추적기가 충분하지 않아 측정 가능한 흐름에 들어갑니다. 펄스가 너무 길면 더 이상 임펄스를 근사하지 않으며 RTD의 모양이 변경됩니다. - 트레이서 솔루션 펄스 기간이 끝나면 트레이서 솔루션 펌프를 중지하십시오. 트레이서 솔루션에 대한 스톱콕을 빠르게 닫고 동일한 유속으로 배경 솔루션의 흐름을 시작하십시오.
- 배경 용액이 흐르도록 허용하고 모든 트레이서가 시스템을 통과하여 수집 된 분획으로 들어갈 때까지 분획을 수집하십시오.
- 시스템을 중지하고 분획의 트레이서 농도를 측정하십시오. 완전히 분배 된 분수 만 포함하십시오. 분수 수집을 통해 수집이 부분적으로 중지되면 해당 분수를 포함하지 마십시오.
- MATLAB에서 측정된 데이터로부터 체류 시간 분포(RTD) 계산
참고: 이 MATLAB 스크립트에 의해 수행된 분석에 대한 서면 설명은 저자의 이전 간행물11에서 찾을 수 있으며, 이론에 대한 논의는 문헌13에서 널리 이용 가능하다.- 보충 파일 2에 제공된 .xlsx 스프레드시트 형식으로 농도 데이터가 포함된 example_tracer_data.xlsx 파일을 생성합니다. 2행의 왼쪽에서 오른쪽으로 시간순으로 분수(모든 단위)에 트레이서의 농도 값을 입력합니다. 펄스의 시작부터 A5 셀의 마지막 분획의 끝까지 경과된 시간을 입력하고 A8 셀에 트레이서 펄스의 길이를 분 단위로 입력합니다.
- .xlsx 파일을 MATLAB 디렉토리에 저장합니다.
- MATLAB 편집기에서 보충 파일 3에서 RTD_From_Data.m 스크립트를 엽니다.
- 스크립트 파일에 작성된 지침에 따라 스크립트의 데이터 로드 섹션의 첫 번째 줄에 있는 괄호 안에 있는 .xlsx 파일의 이름을 새 .xlsx 데이터 파일의 이름으로 바꿉니다. 스크립트를 실행합니다.
- 스크립트가 RTD 분석13을 성공적으로 수행하여 RTD의 플롯을 생성하고 RTD와 동일한 1에 대한 숫자 적분 값을 반환하는지 확인하십시오. 스크립트가 MATLAB 디렉토리에 저장한 시간 벡터(t) 및 연관된 RTD 값 벡터(Et)를 찾습니다.
- 모델 함수를 MATLAB의 RTD에 맞추기
- 보충 파일 4에서 MATLAB 편집기에서 Fit_RTD_Function.m 스크립트를 엽니다.
- RTD에 맞게 세 가지 주석 처리 된 모델 기능 중 하나를 선택하십시오 : 원통형 튜브의 층류에 RTD에 맞는 축 분산 모델13; 잘 교반 탱크에 맞는 CSTR 모델13; 및 n-CSTR 모델15를 포함하는데, 이는 대략 더 큰 웰 플레이트에 적합하다. 여기에 포함되지 않은 다른 모델에 맞게 동일한 형식으로 스크립트에 추가합니다.
- 피팅을 위해 선택한 모델이 포함된 스크립트 섹션에서 주석을 제거합니다.
- 매개변수에 대한 초기 추측의 값을 RTD에 적합한 값으로 변경합니다.
- 스크립트를 실행하여 RTD 데이터에 오버레이된 fit 함수의 플롯을 생성하고 함수에 대한 fit 매개변수 값을 인쇄합니다. 적합도가 매우 좋지 않거나 오류가 발생하면 매개 변수 초기 추측을 변경하고 스크립트를 다시 실행합니다.
- MATLAB에서 신호 컨볼루션 수행
- 하나의 신호와 하나의 RTD 또는 두 개의 RTD를 선택하여 컨볼브합니다.
- MATLAB 편집기에서 보충 파일 5에서 Signal_Convolution.m 스크립트를 엽니다.
- 컨볼브될 두 신호들 각각(즉, 하나의 신호와 하나의 RTD, 또는 두 개의 RTD들)에 대해, 원하는 유닛들 내에 균등하게 이격된 시점들의 하나의 벡터와 그 시간들에서의 신호 값들의 대응하는 벡터를 정의한다.
참고: 두 신호의 벡터는 동일한 수의 요소와 동일한 크기 시간 단계를 가져야 합니다. 그렇기 때문에 RTD를 임의의 수의 포인트에 대해 언제든지 샘플링 할 수있는 연속 함수로 사용하는 것이 유용합니다. - 두 신호를 MATLAB에 입력하고 스크립트를 실행하여 출력 신호의 시간 및 신호 벡터를 가져옵니다.
4. 우물 접시에 세포가있는 기본 관류 시스템 설정
- 웰 플레이트 준비
- 웰 플레이트 배양물이 관류 실험을 위한 적절한 배지 깊이를 갖는지 확인한다. 관류를 시작하기 전에 원하는 대로 최종 배지 변경, 자극 또는 기타 단계를 수행합니다. 현탁액 세포가 관류되는 경우, 플레이트가 바닥에 있는지 확인하기 위해 플레이트를 원심 분리하십시오.
- 멸균 조건 하에서, 바늘이 있는 마개를 바늘을 뽑아 웰 플레이트 배양물에 삽입한다. 마개가 제자리에 놓인 후, 출구 바늘의 높이가 안정한 액체 수준을 결정하기 때문에 관류를 위해 바늘을 원하는 높이로 낮추십시오.
- 바늘을 수컷 루어 캡으로 뚜껑을 덮고 사용할 때까지 전체 우물 플레이트를 인큐베이터에 보관하십시오.
- 주사기와 업스트림 튜브 준비
- 멸균 조건 하에서, 각 배양물에 대해 하나의 주사기를 채워 관류의 원하는 기간 동안 충분한 배지로 관류시키고, 상류 튜빙을 채우기에 충분한 추가 배지를 채운다.
- 암-헛간 Luer 커넥터를 사용하여 업스트림 튜브를 주사기에 부착하십시오. 튜브의 다른 쪽 끝에 수컷-바브 Luer 커넥터를 삽입합니다.
- 상류 튜브가 완전히 배지로 채워질 때까지 주사기로부터 배지를 분배한다.
- 튜브의 열린 끝을 여성 루어 캡으로 캡하십시오.
참고: 모든 복제 주사기는 이 시점에서 정확히 동일한 부피를 가져야 합니다. 볼륨이 동일하지 않으면 플런저가 다른 위치에 있으며 단일 다중 채널 주사기 펌프에 모두 잘 맞지 않습니다.
- 멸균 조건에서 수컷-바브 Luer 커넥터를 다운스트림 튜브의 한쪽 끝에 삽입하고 암 Luer 캡으로 캡핑합니다.
- 준비된 모든 튜브, 주사기 및 웰 플레이트를 관류에 사용할 인큐베이터로 조심스럽게 가져 오십시오.
- 주사기 펌프와 분획 수집기를 인큐베이터 근처의 원하는 위치에 놓습니다. 주사기 펌프를 인큐베이터 위 또는 근처에 놓고 분획 수집기를 포트 근처의 인큐베이터 옆에 놓습니다.
- 모든 상류 및 하류 튜브의 뚜껑이 덮인 끝을 함께 묶어서 인큐베이터 외부에서 포트를 통해 내부로 밀어 넣으십시오.
- 주사기를 주사기 펌프에 적재하고 다운스트림 튜브의 열린 끝을 분획 콜렉터의 다중 헤드 디스펜서의 분배 피펫 팁에 삽입합니다.
- 인큐베이터 내부에서는 가능한 한 많은 상류 튜브를 인큐베이터로 끌어 들여 흐르는 매체가 인큐베이터 공기로부터 열과 CO2를 수신 할 수있는 튜브의 길이를 최대화하십시오. 이들을 제자리에 고정시키면서 인큐베이터에서 하류 튜브를 당겨서 분수 수집기에서 가장 멀리 확장 된 지점에 도달 할 수 있도록 충분히 허용하면서 인큐베이터 내부의 뚜껑을 덮은 끝을 유지합니다.
- 각 플러그가 꽂힌 우물에 대해 바늘과 상류 및 하류 튜브의 뚜껑을 신속하게 풀고 Luer 커넥터와 함께 부착하십시오.
- 모든 부품이 연결되면 주사기 펌프를 비교적 빠른 속도로 간단히 실행하여 모든 스트림이 제대로 흐르고 있는지 확인하십시오.
- 이 시점에서, 매체로 가득 찬 하류 튜브로 실험을 시작하려는 경우, 모두가 채워질 때까지 펌프를 계속 가동하십시오. 그렇지 않으면 펌프를 중지하십시오.
- 주사기 펌프 유량과 분획 수집 빈도를 설정하고 두 기계를 동시에 시작하여 실험을 시작하십시오. 원하는 실험 기간 동안 분수를 수집합니다.
5. 여러 매체 소스에 대한 스톱콕으로 관류 시스템 설정
- 위의 4.1 단계의 모든 하위 단계를 수행하십시오.
- 관류에 사용할 두 개의 배지를 준비하여 먼저 분배 될 배지를 1로, 다른 배지를 배지 2로 표시하십시오.
- 각 배양물이 관류될 수 있도록, 하나의 주사기를 그 분배 기간 동안 충분한 배지 1로 채우고, 관류 시스템을 초기에 채우기에 충분한 부피를 더한다. 두 번째 주사기를 경륜의 시대 기간 동안 충분한 매체 2로 채 웁니다.
- 두 주사기를 네 방향 스톱콕의 세 포트 중 두 개에 연결하십시오.
참고: 주사기를 스톱콕에 연결하기 위한 튜브 길이가 필요할 수 있습니다. - 스톱콕을 중간 1로 닫고 매체 2를 스톱콕에 분배하여 위의 단계 3.1.7-3.1.8과 유사한 방식으로 스톱콕 및 주사기를 준비하여 열린 포트에서 물방울을 떨어 뜨리기 시작할 때까지 스톱콕에 넣습니다.
- 스톱콕을 매체 2로 닫고 모든 잔류 매체 2가 개방 포트에서 플러시될 때까지 매체 1을 스톱콕에 분배한다.
- 암-바브 Luer 커넥터를 사용하여 업스트림 튜브를 개방형 스톱콕 포트에 연결합니다. 튜브의 다른 쪽 끝에 수컷-바브 Luer 커넥터를 삽입합니다.
- 상류 튜브가 완전히 배지로 채워질 때까지 주사기로부터 배지 1을 분배한다.
- 위의 4.3-4.11 단계를 진행하여 두 주사기를 별도의 주사기 펌프에 넣고 분배 매체 1 만 로딩하십시오.
- 매체 1에 대한 주사기 펌프 유량과 분획 수집 빈도를 설정하고 두 기계를 동시에 시작하여 실험을 시작하십시오.
- 배지 공급원이 변경될 때, 배지 1에 대한 시린지 펌프를 신속하게 정지시키고, 스톱콕을 매체 1로 닫고, 배지 2에 대한 시린지 펌프를 시작한다. 나중에 원하는 경우 비슷한 방식으로 소스를 다시 매체 1로 전환하십시오.
- 원하는 실험 기간 동안 분수를 수집합니다.
6. 약동학을 모방하기 위해 교반 탱크로 관류 시스템을 설정하십시오.
- 관심있는 약물에 대한 약동학 데이터를 얻고 그것이 농도 피크 다음에 지수 붕괴로 구성되는지 확인하십시오.
- 피크를 시간 0으로 설정하고 피크 이전의 데이터 포인트를 제거한 후 Stirred_Tank_Fit.m 스크립트(보충 파일 6)를 사용하여 교반된 탱크 RTD 방정식을 데이터에 맞춥니다. 입력 v(원하는 관류 유량) 및 시간 값 및 농도 값에 대한 t 및 C와 함께 스크립트에 직접 벡터 쌍으로 적합할 데이터를 입력합니다. 스크립트를 실행하여 필요한 교반 탱크 볼륨인 파라미터 V를 인쇄합니다.
- 관류 시스템에 두 개의 주사기 펌프와 인큐베이터 상류의 플레이트 셰이커를 포함하도록 레이아웃을 계획하십시오.
- 스톱콕 너머의 관류 시스템 구성 요소의 RTD를 측정하고 다양한 약물 펄스 지속 시간 및 농도로 RTD의 신호 컨볼루션을 수행하여 적절한 약동학 프로파일을 찾습니다. 이 계산에서 적합 교반 탱크 RTD 방정식을 사용하십시오.
- 위의 5.1-5.8단계를 진행합니다.
- 설치를 위해 교반 탱크로서 적절한 크기의 추가 웰 플레이트를 사용하십시오. 각각의 웰은 하나의 관류 배양을 위한 교반 탱크로서 작용할 수 있다. 필요한 양의 매체, V로 우물을 채우고 바늘을 처음에 끌어 올린 다음 우물 바닥으로 밀어 넣고 바늘을 뚜껑을 덮습니다.
- 주사기를 주사기 펌프에 넣고 주사기의 튜브를 교반 탱크의 캡핑 된 입구 바늘에 신속하게 연결하십시오. 그런 다음 세포 배양 상류 튜브 입구를 교반 탱크의 출구 바늘에 연결한다.
- 5.9-5.10단계를 진행합니다.
- 원하는 시간에, 단계 5.11에 기재된 바와 같이, 약물을 함유하는 분배 매질 2로 전환한다. 약물 주입이 완료되면 매체 1로 다시 전환하십시오.
- 5.12단계로 진행하십시오.
그림 3: 다중 헤드 디스펜서. 레이저 컷 멀티 헤드 디스펜서를 위한 디자인. 이 수치는 Erickson et al.11에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Representative Results
상기 프로토콜의 섹션 5로부터의 다중 배지 공급원을 갖는 관류 시스템은 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포에서 활성화된 B 세포 (NF-κB) 전사 인자의 핵 인자 카파-경쇄 인핸서에 의해 구동되는 리포터 유전자의 발현 동역학을 측정하기 위해 사용되었고, 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α)의 1.5 h 펄스에 반응하였다. HEK293 세포는 가우시아 루시퍼라아제 (GLuc)를 함유하는 유전자 작제물을 갖는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 안정적으로 형질도입되었고, NF-κB 반응 요소를 함유하는 NFKB라는 프로모터에 의해 구동되어 NFKB-GLuc HEK293 세포를 생성하고, 형질도입된 세포를 분리하기 위해 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 통해 분류하였다. 분류된 세포는 사용 전까지 동결보존하였다.
각 관류 배양에 대해, 관류 셋업에는 세포를 포함하는 플러그형 48웰 플레이트로 이어지는 1m의 튜빙의 상류 섹션이 포함되었고, 이어서 0.5 mL/h(0.0083 mL/min)의 유속과 함께 다중 헤드 분획 콜렉터로 이어지는 1m의 다운스트림 튜빙이 뒤따랐다. 1m 튜빙 단독 및 전체 셋업(1m 튜브 + 48웰 플레이트 + 1m 튜브)의 RTD는 트레이서의 20분 펄스로 0.5mL/h의 유속을 사용하여 측정되었습니다. 배경 용액은 탈이온수에 희석된 청색 식품 염료의 트레이서 용액과 함께 탈이온수였으며, 분획은 다중 헤드 디스펜서를 사용하여 1 fraction/h의 속도로 수집되었다. 분획의 100 μL 샘플에서의 트레이서 농도는 628 nm에서의 흡광도를 통해 플레이트 리더에서 측정되었다.
트레이서 농도 데이터는 MATLAB에서 처리되어 두 설정 모두에 대한 RTD를 생성했습니다. 먼저 두 설정의 RTD가 RTD_from_Data.m 스크립트를 사용하여 데이터에서 계산되었습니다. 1m 튜브의 RTD 데이터 포인트와 전체 설정은 그림 4에 나와 있습니다.
그림 4: 0.5 mL/h (0.0083 mL/min)의 유속으로 1 m 튜브에 대한 RTD (왼쪽) (오른쪽) 0.5mL/h의 유속으로 전체 관류 설정(1m 튜브 + 48웰 플레이트 + 1m 튜브)의 RTD입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
튜빙 단독의 RTD는 축방향 분산 기능에 의해 잘 적합하며, 이는 기존 문헌13에 기초하여 기대되는 것이다. 직렬로 된 여러 개의 튜브 조각도 단일 축 분산 모델에 의해 잘 맞고, 48-웰 플레이트를 인라인으로 추가하면 이 모델에서 무시할 수 있는 편차가 발생하므로 1 m 튜브 단독 및 1 m 튜브 + 48-웰 플레이트 + 1 m 튜브 셋업은 각각 축 분산 모델에 의해 잘 맞을 것으로 예상되었다. 모델 매개변수에 대한 초기 추측이 실제 값과 너무 멀리 떨어져 있을 때 불량 모델 적합이 발생하는 것이 일반적입니다. 이를 입증하기 위해, 먼저, 축방향 분산 모델을 함수 파라미터에 대한 초기 추측으로서 Pe=10 및 타우=30분을 사용하여 Fit_RTD_Function.m 스크립트를 사용하여 1 m 튜브 데이터에 적합시켰다. 그림 5는 이러한 추측으로 인해 RTD 데이터와 함께 플롯된 피팅 모델이 불량했음을 보여 줍니다. 추측은 Pe = 10 및 타우 = 300 분으로 변경되었으며, 이는 타우가 용적 유량으로 나눈 관류 시스템 부피와 거의 같아야하기 때문에 그림 5에 표시된 양호한 모델 적합도를 초래했습니다. 1m 튜브에 대한 적합 파라미터는 Pe = 154.3, 타우 = 317.2분이며, 전체 시스템에 대한 파라미터는 Pe = 396.5, 타우 = 596.5분이다.
그림 5: RTD에 적합한 양호 및 불량 모델의 예. 축방향 분산 모델을 0.5 mL/h (0.0083 mL/분)의 유속으로 1 m 튜브에 대한 RTD 데이터에 적합시켰다. (왼쪽) MATLAB 스크립트에 입력된 모델 파라미터에 대한 초기 추측은 실제 값과 너무 거리가 멀어서 스크립트가 모델 적합성이 좋지 않은 것으로 나타났습니다. (오른쪽) 더 나은 매개 변수 값이 스크립트에 입력되어 모델 적합성이 향상되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
신호 컨볼루션은 Signal_Convolution.m 스크립트에서 이러한 적합 RTD 기능을 사용하여 수행되어 업스트림 튜빙의 입구에서 10ng/mL TNF-α을 포함하는 배지의 1.5h 펄스가 시스템을 통해 어떻게 전파되는지 예측했습니다. 입력 신호는 먼저 1m 튜빙 RTD와 얽혀 TNF-α 신호가 웰 플레이트에 진입할 것인지를 결정하였다. 입력 신호는 또한 1 m 튜브 + 48-웰 플레이트 + 1 m 튜브의 RTD와 얽혀 TNF-α 신호가 수집 된 분획에서 시스템의 출구에 어떤 것이 될 것인지를 결정하고, 여기서 세포로부터의 상응하는 GLuc 반응과 함께 나타날 것이다. 도 6 은 입력 TNF-α 펄스 신호가 웰 입구 및 시스템 출구에서 예측된 신호와 함께 도시됨을 보여준다.
도 6: 관류 시스템에서 TNF-α 농도 신호 예측. TNF-α-함유 배지를 처음 90분 동안 10 ng/mL로 관류 시스템에 주입하였고, 청색 직사각형 신호로 나타내었다. (왼쪽) 입력 신호를 1 m 튜브 RTD의 적합 축 분산 모델과 컨볼빙함으로써, 48-웰 플레이트로의 입구에서의 TNF-α 농도 신호를 예측하였다. (오른쪽) 유사하게, 전체 시스템에 대한 RTD 모델을 사용하여, 시스템의 출구에서의 TNF-α 신호를 예측하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
NFKB-GLuc HEK293 세포를 해동시키고, 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)의 0.4 mL에 1 x 104 세포/ 웰의 48-웰 플레이트에 플레이팅하고, 5%CO2로 37°C에서 1일 동안 인큐베이션하였고, 그 후 상기 프로토콜의 섹션 5의 단계를 이어서 다수의 배지 소스에 대한 스톱콕을 갖는 관류 시스템을 설정하였다. 네 개의 시냇물이 네 개의 우물을 관류하도록 설정되었다. 하나의 다채널 시린지 펌프에 배지 1로서 DMEM을 함유하는 4개의 전체 60 mL 주사기로 로딩하였다. 두 번째 주사기 펌프에는 배지 2를 포함하는 5 mL 주사기가 적재되었으며, 그 중 두 개는 대조군으로 일반 DMEM을 포함하고 두 개는 자극으로 10 ng / mL TNF-α을 가진 DMEM을 함유했다. 실험 시작시, TNF-α 또는 대조군 배지를 함유하는 5 mL 주사기를 1.5 h 동안 0.5 mL/h로 분주한 후, 스토콕을 전환하고 DMEM을 함유하는 60 mL 주사기를 다음 40 시간 동안 분주하였다. 24 h 및 관류의 끝에서, 네 개의 스트림으로부터의 분획을 마이크로원심분리 튜브 내로 분주하고, 라벨링하고, -80°C에서 동결시키고, 분획 수집기를 리셋하였다.
관류 후, 모든 샘플을 해동시키고, 이들의 GLuc 농도를 이전에 기술된11,16에 기재된 생체발광 검정을 사용하여 측정하였다. 발광 값은 각 분획 샘플의 발광을 해당 분획의 시간 지속 시간으로 나눔으로써 발광/h 속도로 변환되었으며, 네 개의 스트림 각각에 대한 시계열로 플롯되었습니다. 각각의 GLuc 측정의 시간은 그 분획이 수집되는 동안의 시간 간격의 중간점이었고, 관류 시스템의 하류 튜빙의 평균 체류 시간(타우 = 317분)을 뺀 값이었다. 분획 내에 포함될 것으로 예측된 TNF-α 신호는 또한 하류 튜빙의 평균 체류 시간에 의해 시간 내에 시프트되었고, GLuc 데이터 상에 오버레이되었고, 자극-반응 동역학을 밝혀내고, 도 7에 나타낸 NF-κB-구동 유전자 발현을 드러냈다.
도 7: 관류 시스템을 사용하여 측정된 자극-반응 역학. 두 개의 배지 공급원을 갖는 관류 시스템은 두 개의 세포 배양물을 대조군으로서 두 개의 노출되지 않은 배양물을 갖는 TNF-α의 펄스에 일시적으로 노출시키기 위해 사용되었다. HEK293 세포를 NF-κB 반응 요소를 함유하는 프로모터에 의해 구동된 GLuc를 분비하도록 조작하였고, 유출물 분획을 수집하였다. 실험은 TNF-α 노출 후 NF-κB에 의해 구동되는 극적인 발현 증가를 밝혀낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
관류의 시작에서 배양물에서 축적된 GLuc의 존재는 네 가지 곡선 모두에서 첫 번째 분획에서 두 번째 분획까지의 GLuc 신호의 명백한 하락을 야기했다. 이러한 일반적인 아티팩트는 관류를 시작하기 직전에 배양물 내의 배지를 변경함으로써 관류 시스템에서 피할 수 있다. TNF-α을 투여받지 않은 두 대조군 배양물은 실험 기간에 걸쳐 점진적으로 증가하는 낮은 GLuc 분비율을 유지하였다. 이러한 결과는 세포 집단의 성장을 반영할 수 있다. 자극된 배양물은 초기에 대조군과 동일한 GLuc 분비 속도를 가졌고, 이어서 TNF-α 펄스에 반응하여 NF-κB 구동 발현이 활성화됨에 따라 분비가 극적으로 증가하였다. GLuc 분비는 TNF-α의 첫 번째 도착 후 약 9 시간 후에 피크를 이루며, 그 후에는 기하 급수적 인 붕괴와 함께 감소합니다.
보충 파일 1 : CAD 파일 : 다중 head_Dispenser.DFX : 이 파일에는 레이저 절단이 가능하고 분수 수집기를 수정하는 데 사용할 수 있는 다중 헤드 디스펜서에 대한 모델이 포함되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2 : example_tracer_data.xlsx. RTD_from_Data.m MATLAB 스크립트에서 읽을 예제 추적기 실험 데이터를 포함합니다. 새 데이터의 템플릿으로 사용할 수도 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 3: MATLAB 파일: RTD_from_Data분 이 스크립트는 .xlsx 파일에서 추적기 실험 데이터를 읽고 RTD를 나타내는 t 및 Et 벡터를 반환합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 4: MATLAB 파일: Fit_RTD_Function분 이 스크립트는 RTD_from_Data.m 스크립트에서 RTD 벡터를 로드하고 RTD에 적합한 모델을 반환합니다. 모델 유형은 사용자가 선택합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 5: MATLAB 파일: Signal_Convolution분 이 스크립트는 사용자 정의 용질 신호와 RTD를 입력으로 사용하고 해당 RTD로 흐름 시스템을 통과한 후 신호가 어떻게 변경될지 예측합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 6: MATLAB 파일: Stirred_Tank_Fit분 이 스크립트는 CSTR RTD 곡선을 사용자가 입력한 약동학 데이터에 적합시키고 주어진 유량에 대한 RTD를 생성하는 데 필요한 탱크 부피를 반환합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 작업은 TNF-α의 일시적인 펄스에 반응하여 NF-κB 구동 유전자 발현의 역학이 측정되는 구체적인 예와 함께 입증된 다수의 배지 공급원을 갖는 관류 세포 배양 시스템의 조립 및 작동을 기술한다. 관류 시스템 성분의 RTD를 측정하고 모델링하고, 신호 컨볼루션을 사용하여 수집된 유출수 배지 분획에서의 TNF-α 펄스에 대한 세포의 노출과 TNF-α 분포를 모두 예측하였다. 세포를 펄스에 노출시키고, 분획을 40시간 동안 수집하였고, 그 후 GLuc를 분획에서 측정하고, 자극-반응 동α동성을 밝히기 위해 예측된 TNF- 신호와 함께 플롯팅하였다.
이 관류 방법은 단점이없는 것은 아닙니다. 특히, 시스템은 인큐베이터 내에 설치된 후 튜브가 웰 플레이트에 연결되는 중요한 간단한 단계로 인해 멸균 위험을 수반합니다. 저자의 경험에서 오염은 매우 드뭅니다. 그럼에도 불구하고 오염 위험은 다음과 같은 방법으로 완화 될 수 있습니다. 첫 번째는 생물 안전 캐비닛에서 모든 세포 처리 절차 및 멸균 연결을 수행하는 것입니다. 멸균성을 개선하기 위해 고려될 수 있는 추가적인 예방책은 세포 배양물의 입구에 0.22 μm 주사기 필터를 인라인으로 포함시키는 것이다. 멸균 여과를 사용하면 세포 배양에 들어가기 전에 배지에 존재하는 박테리아 또는 더 큰 미생물을 포획 할 수 있지만 흐름을 유도하기위한 압력 요구 사항이 증가하고 멤브레인의 파울링으로 인해 막힐 수 있습니다. 나가는 샘플은 오염의 위험이있는 열린 환경에서도 수집됩니다. 분별 모듈에 대한 공기 여과가 이상적으로 가능한 인클로저 시스템에서 샘플을 수집하면 향후 시스템 빌드에서이 문제가 해결됩니다.
또한, 세포에 의해 분비되는 신호는 분별되고 측정되기 전에 하류 튜빙의 RTD에 따라 왜곡된다. 따라서, 측정된 신호는 세포에 의해 분비되는 것들의 번진 버전이다. 이론적으로, 이러한 번짐은 다운스트림 RTD(14)의 효과를 제거하기 위해 측정된 신호에 대해 디컨볼루션을 수행함으로써 언행될 수 있지만, 신호 잡음이 크게 증폭됨에 따라 이 수치 기술을 비이상적인 데이터에 성공적으로 적용하기는 어렵다. 그러나 관심있는 많은 생물학적 역학은 수십 시간에서 수십 시간의 시간 척도로 전개되므로 튜브 RTD의 번짐 효과에 의해 거의 영향을받지 않으며 시간이 지남에 따라 이동하지만 모양은 거의 변하지 않습니다. 여기에 표시된 RTD 측정 방법은 더 짧은 트레이서 펄스를 사용하고 세포 배양 실험에 사용될 것과 일치하는 배경 솔루션 및 트레이서 물질을 사용하여 개선 될 수 있습니다. 그러나 여기에 제안 된 펄스 시간은 더 짧은 펄스 시간에 동일한 RTD를 제공하므로 RTD 측정에 적합한 것으로 밝혀졌지만 펄스 시간이 증가하면 RTD가 더 크게 변하므로 사용해서는 안됩니다. 저자들은 이전에 식품 염료와 GLuc 모두 물과 배양 배지11에서 서로 매우 유사한 RTD를 가지고 있으므로 분자 종은 RTD를 많이 변화시키지 않을 것이라는 것을 발견했습니다. 마지막으로, RTDs의 차이는 20°C 대 37°C에서 측정하였을 때, 또는 직선 튜브 대 고도로 코일된 튜빙(11)에서 측정되었을 때 물에서의 식품 염료에 대해 관찰되지 않았다. 이러한 데이터 및 다양한 관류 시스템 형상 및 유량에 대한 RTD 데이터는 저자의 이전 간행물11에서 찾을 수 있으며, 이 논문의 RTD 분석 스크립트에 의해 수행되는 동작에 대한 자세한 설명과 함께 찾을 수 있다. RTD 분석 이론(13) 및 생물반응기 시스템(17,18,19,20,21)에 대한 RTD의 적용의 예에 대한 자세한 내용은 제공된 참고문헌에서 찾을 수 있다.
이 다목적 방법은 세포 배양물에서 가용성 물질의 분비 또는 흡수율을 측정하는데 사용될 수 있고, 일시적인 용질 신호는 상류 배지 공급원을 전환함으로써 배양물에 전달될 수 있다. 용질 펄스 또는 스텝 변경과 같은 간단한 신호는 입구 밸브를 전환하여 간단히 전달할 수 있습니다. 약동학-유사 신호는 배양물의 상류에 적절한 액체 부피의 교반 탱크를 배치하고 이를 통해 용질 펄스를 전달함으로써 생성될 수 있다. 펄스, 스텝 변경 및 구성 요소의 다양한 조합을 새로운 RTD와 함께 적용하여 펄스를 원하는 모양으로 왜곡하여 다른 신호를 만들 수 있습니다. 기존의 정적 세포 배양 방법은 자동화된 방식으로 배지 샘플을 지속적으로 수집할 수 없으며 세포를 부드럽게 변화하는 용질 신호에 노출시키는 데 사용할 수 없습니다. 미세유체 시스템은 비용이 많이 들고 전문 지식이 필요하며 이러한 종류의 실험을 위해 상업적으로 이용 가능한 거대 유체 시스템은 존재하지 않습니다. 저비용의 간단한 시스템은 자연 세포 행동, 충동 반응, 약물 또는 내인성 용질 신호 역학을 모방 할 수있는 다양한 과도 용질 프로파일의 효과를 연구하기 위해 실험실에서 채택 될 수 있으며 새로운 실험의 요구를 충족시키기 위해 재구성 될 수 있습니다. 이 기술 및 현재 진행중인 것들의 미래 응용은 다음을 포함한다: 생체외 세포 요법으로부터 사이토카인 및 엑소좀의 분비 속도 역학을 측정하는 단계; 약물에 대한 세포 반응에 대한 일주기 시계 시간의 효과를 평가; 박테리아 생물막의 성장 속도 및 신진 대사를 측정하는 단계; 시험관내에서 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터에 대한 용량-반응 곡선을 생산하는 단계; 생산자 세포로부터 렌티바이러스 벡터의 동적 생산 속도를 측정하는 단계; 약물 동태 화학 요법 약물 프로파일을 정밀 암 치료를위한 개인화 된 의학 생검에 통합합니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 그랜트 번호 (Grant Nos)의 지원을 받아 수행되었습니다. 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 R01EB012521, R01EB028782 및 T32 GM008339.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 Gauge 1 1/2- in Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines | Grainger | 5FVK2 | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | HEK 293T cells used in the Representative Results experiment. |
| 96-Well Clear Bottom Plates, Corning | VWR | 89091-010 | Plates for measuring dye concentrations in RTD experiments and GLuc in representative results experiment. |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 5 mL | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| BioFrac Fraction Collector | Bio-Rad | 7410002 | Fraction collector that can be used for a single stream, or modified using our method to enable collection from multiple streams. |
| Clear High-Strength UV-Resistant Acrylic 12" x 12" x 1/8" | McMaster-Carr | 4615T93 | This sheet is cut using a laser cutter according to the DXF file in the supplemental materials to produce the multi-head dispenser that can be attached to the BioFrac fraction collector. |
| Coelenterazine native | NanoLight Technology | 303 | Substrate used in Gaussia luciferase bioluminescence assay in representative results. |
| Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, size 48 wells, polystyrene plate, flat bottom wells | Millipore Sigma | CLS3548 | Used to grow and perfuse 293T cells in representative results. |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells | Fisher Scientific | 720081 | Can be plugged and used as a stirred tank to produce pharmacokinetic profiles in perfusion. Can also contain cells for perfusion. |
| DMEM, high glucose | ThermoFisher Scientific | 11965126 | |
| Epilog Zing 24 Laser | Cutting Edge Systems | Epilog Zing 24 | Laser cutter used to produce multi-head dispenser from acrylic sheet. Other laser cutters may be used. |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 20 mL | Fisher Scientific | 14-955-460 | |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 60 mL | Fisher Scientific | 14-955-461 | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | Microcentrifuge tubes for collecting fractions. |
| Fisherbrand Round Bottom Disposable Borosilicate Glass Tubes with Plain End | Fisher Scientific | 14-961-26 | Glass tubes for collecting fractions. |
| Fisherbrand SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-Filtered | Fisher Scientific | 2707410 | 300 ul pipette tips that best fit the multi-head dispenser and tubing to act as dispensing tips. |
| Gibco DPBS, powder, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 21600010 | Phosphate buffered saline. |
| Labline 4625 Titer Shaker | Marshall Scientific | Labline 4625 Titer Shaker | Orbital shaker used to keep stirred tanks mixed. |
| Masterflex Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile; 10/PK | Cole-Parmer | EW-30600-04 | Used to join multiple inlet streams for RTD experiments and cell culture experiments. |
| Masterflex Fitting, Polycarbonate, Straight, Female Luer x Cap; 25/PK | Masterflex | UX-45501-28 | |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hosebarb Adapters, 1/16" | Cole-Parmer | EW-45508-00 | |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Hosebarb Adapter, 1/16" ID | Cole-Parmer | EW-45518-00 | |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Plug Adapter; 25/PK | Masterflex | EW-30800-30 | |
| Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 14; 25 ft | Masterflex | EW-96410-14 | |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | Version R2019b. Newer versions may also be used. Some older versions may work. |
| NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1600 | |
| Rack Set F1 | Bio-Rad | 7410010 | Racks to hold collecting tubes in the fraction collector. |
| Recombinant Human TNF-alpha (HEK293-expressed) Protein, CF | Bio-Techne | 10291-TA-020 | Cytokine used to stimulate 293T cells in representative results. |
| Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 00, Bottom 10.5mm | Saint Gobain | DX263015-50 | Fits 48-well plates. |
| Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 4 Bottom 21mm | Saint Gobain | DX263027-10 | Fits 12-well plates. |
| Sodium Hydroxide, 10.0 N Aqueous Solution APHA; 1 L | Spectrum Chemicals | S-395-1LT | |
| SolidWorks | Dassault Systems | SolidWorks | CAD software used to create the multi-head dispenser DXF file. |
| Varioskan LUX multimode microplate reader | ThermoFisher Scientific | VL0000D0 | Plate reader. |
| Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue | Michaels | 10404779 | Blue food dye containing Brilliant Blue FCF, used as a tracer in RTD experiments. Absorbance spectrum peaks at 628 nm. |
References
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