Summary
Bu yazıda, hücresel proseslerde çözünenlerin sekresyon dinamiklerini ve absorpsiyon oranlarını ölçmek için düşük maliyetli, çok kanallı bir perfüzyon hücre kültürü sistemi kurmak ve çalıştırmak için bir yöntem sunulmaktadır. Sistem ayrıca hücreleri dinamik uyaran profillerine maruz bırakabilir.
Abstract
Bazı hücre ve doku fonksiyonları, geleneksel kültür sistemleri tarafından zayıf bir şekilde çözülen dakikalar ila saatler arasındaki dinamik zaman ölçeği içinde çalışır. Bu çalışma, kültür ortamının sürekli olarak bir hücre kültürü modülüne perfüze edilmesini ve bu ölçekteki dinamikleri ölçmek için bir aşağı akış modülünde fraksiyone edilmesini sağlayan düşük maliyetli bir perfüzyon biyoreaktör sistemi geliştirmiştir. Sistem neredeyse tamamen ticari olarak temin edilebilen parçalardan inşa edilmiştir ve aynı anda geleneksel çok kuyulu hücre kültürü plakalarında bağımsız deneyler yapmak için paralelleştirilebilir. Bu video makalesinde, yalnızca tek bir çok kanallı şırınga pompası ve paralel olarak altı kültüre kadar perfüze etmek için modifiye edilmiş bir fraksiyon kolektörü gerektiren taban kurulumunun nasıl monte edileceği gösterilmektedir. Modüler tasarımdaki yararlı varyantlar, çözünen darbeler veya farmakokinetik benzeri profiller gibi kontrollü stimülasyon dinamiklerine izin veren de sunulmaktadır. Daha da önemlisi, çözünen sinyaller sistemden geçerken, çözünmüş dağılım nedeniyle bozulurlar. Ayrıca, perfüzyon kurulumunun bileşenlerinin ikamet süresi dağılımlarını (RTD'ler) MATLAB kullanarak bir izleyici ile ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. RTD'ler, çözünen sinyallerin çok bölmeli sistemdeki akış tarafından nasıl bozulduğunu hesaplamak için kullanışlıdır. Bu sistem son derece sağlam ve tekrarlanabilir, bu nedenle temel araştırmacılar özel üretim tesislerine ihtiyaç duymadan kolayca benimseyebilirler.
Introduction
Birçok önemli biyolojik süreç, hücre ve doku kültürlerinde dakikalar ila saatlerarasında 1,2,3 zaman ölçeğinde gerçekleşir. Bu fenomenlerin bazıları hızlandırılmış mikroskopi4, biyolüminesans1 veya diğer yöntemler kullanılarak otomatik bir şekilde gözlemlenebilir ve kaydedilebilirken, kimyasal analiz için kültür süpernatant örneklerinin toplanmasını içeren deneyler genellikle statik hücre kültürlerinde manuel olarak gerçekleştirilir. Manuel örnekleme, sık veya mesai saatleri dışında örnekleme zaman noktalarının rahatsızlığı nedeniyle belirli çalışmaların fizibilitesini sınırlar. Statik kültür yöntemlerinin diğer eksiklikleri, kimyasal uyaranlara kontrollü, geçici maruziyetleri içeren deneyleri içerir. Statik kültürlerde, uyaranlar manuel olarak eklenmeli ve çıkarılmalıdır ve uyaran profilleri zaman içindeki adım değişiklikleriyle sınırlıdır, orta değişiklikler de hücreleri kontrolsüz bir şekilde etkileyebilecek diğer ortam bileşenlerini ekler ve kaldırır5. Akışkan sistemler bu zorlukların üstesinden gelebilir, ancak mevcut cihazlar başka zorluklar da doğurur. Mikroakışkan cihazlar, özel ekipmanın ve üretim ve kullanım eğitiminin engelleyici maliyetleri ile birlikte gelir, numuneleri işlemek için mikroanalitik yöntemler gerektirir ve perfüzyon6'dan sonra hücrelerin cihazlardan kurtarılması zordur. Burada açıklanandeney türleri için birkaç makroakışkan sistem oluşturulmuştur 7,8,9,10 ve bunlar şirket içinde yapılan birden fazla özel parçadan yapılmıştır ve birden fazla pompa veya fraksiyon toplayıcı gerektirir. Ayrıca, yazarlar, biyoüretim için yararlı olan, ancak fizyolojiyi modellemek ve incelemek için tasarlanmamış, süspansiyon kültürü için karıştırılmış tank biyoreaktörleri dışında, ticari olarak temin edilebilen herhangi bir makroakışkan perfüzyon hücre kültürü sisteminin farkında değildir.
Yazarlar daha önce neredeyse tamamen ticari olarak temin edilebilen parçalardan oluşan düşük maliyetli bir perfüzyon biyoreaktör sisteminin tasarımı hakkında rapor vermişlerdi11. Sistemin baz versiyonu, bir kuyu plakasındaki birden fazla kültürün bir CO2 inkübatöründe tutulmasını ve bir şırınga pompasından gelen ortamla sürekli olarak perfüze edilmesini sağlarken, kültürlerden gelen atık su ortam akışları, özel bir modifikasyona sahip bir fraksiyon toplayıcı kullanılarak zaman içinde otomatik olarak numunelere bölünür. Böylece, bu sistem kültür ortamı süpernatantının otomatik örneklemesini ve zaman içinde kültürlere sürekli çözünen girdiyi mümkün kılar. Sistem makroakışkan ve modülerdir ve yeni deney tasarımlarının ihtiyaçlarını karşılamak için kolayca değiştirilebilir.
Burada sunulan yöntemin genel amacı, maddelerin zaman içinde hücreler tarafından salgılanma veya emilim oranlarının ölçüldüğü ve / veya hücrelerin hassas, geçici çözünen sinyallere maruz kaldığı deneylere olanak tanıyan bir perfüzyon hücre kültürü sistemi oluşturmak, karakterize etmek ve kullanmaktır. Bu video makalesinde, tek bir şırınga pompası ve modifiye fraksiyon toplayıcı kullanarak aynı anda altı adede kadar hücre kültürünü perfüze edebilen baz kurulumunun nasıl monte edileceği açıklanmaktadır. Baz sistemde, hücreleri kısa darbeler ve farmakokinetik benzeri profiller12 dahil olmak üzere geçici çözünen konsantrasyon sinyallerine maruz bırakan deneylere izin vermek için ek pompalar ve parçalardan yararlanan iki yararlı varyant da Şekil 1'de gösterilmiştir.
Resim 1: Perfüzyon sistemi tasarımı üzerinde üç varyasyon . (Top) Temel perfüzyon sistemi. (Orta) Birden fazla orta kaynak için bir stopcock ile perfüzyon sistemi. (Altta) İyi karıştırılmış bir dağılım hacmini taklit etmek için karıştırılmış bir tanka sahip perfüzyon sistemi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Akış içindeki dağılım ve difüzyon nedeniyle, çözünen sinyaller akış sisteminden geçerken bozulur veya "bulaşır". Bu bozulma, ikamet süresi dağılımları (RTD'ler) kullanılarak ölçülebilir13. Bu makalede, perfüzyon sisteminin bileşenleri üzerinde izleyici deneylerinin nasıl gerçekleştirileceği açıklanmaktadır (Şekil 2) ve ölçülen verilerden RTD'ler oluşturmak için MATLAB komut dosyaları sağlanmaktadır. Bu analizin ayrıntılı bir açıklaması, yazarların önceki makalesi11'de bulunabilir. Ek MATLAB komut dosyaları, RTD'lere uygun işlevler sığdırır ve fiziksel parametreleri çıkarır ve kullanıcı tarafından çözünen sinyal girişinin perfüzyon sistemi14 aracılığıyla nasıl yayılacağını ve bozulacağını tahmin etmek için RTD'leri kullanarak sinyal evrişimi gerçekleştirir.
Şekil 2: İkamet süresi dağılımları. Bu boru uzunluğu gibi akış sistemi bileşenlerinin RTD'leri, sisteme bir izleyici darbesi girerek ve toplanan fraksiyonlara çıktığı zamana kadar nasıl "bulaştığını" ölçerek ölçülür. Bu rakam Erickson ve ark.11'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kuyu plakası perfüzyonu için parçalar hazırlayın
- Boru hazırlama
- Perfüze edilecek her hücre kültürü için iki uzunlukta silikon boru (1,6 mm iç çap) kesin. Yukarı akış borusu olarak kullanılan parçanın, şırınga pompasından inkübatörün içindeki hücre kültürüne ulaşacak kadar uzun olduğundan ve aşağı akış parçasının hücre kültüründen fraksiyon toplayıcının en uzatılmış konumuna ulaşabildiğinden emin olun.
- Her boru parçasına, etiketli bant ile her iki ucunda benzersiz bir etiket verin.
- Kuyu plakası için tıpalar hazırlayın
- Perfüze edilecek kuyu plakasının her bir kuyucuğu için, hava geçirmez bir conta ile kuyucuklara sıkıca oturması için uygun bir çapa sahip bir silikon tıpa elde edin.
- Tıpanın diplerinden fazla malzemeyi kesin, böylece kuyucuklara sığacak şekilde içeride amaçlanan sıvı seviyesinin üzerinde hava için yer bırakın.
- İki künt 18 G iğneyi her bir durdurucudan, kuyudan geçen akış için giriş ve çıkış görevi görecek şekilde üstten ve alttan dışarı doğru itin, kuyu içindeki uçları arasındaki mesafeyi en üst düzeye çıkarmak için birbirine taban tabana zıttır.
- Tıkanmış kuyu içindeki iğnelerin yüksekliklerini ayarlayın, çünkü çıkış iğnesinin yüksekliği, perfüzyon sırasında kuyudaki sıvı seviyesinin sabit yüksekliğini belirleyecektir.
NOT: Perfüzyon, çıkış iğnesi sıvı seviyesinin üzerinde olacak şekilde başlatılırsa, seviye iğneye ulaşana kadar sıvı kuyuda birikecektir. Perfüzyon, sıvı seviyesinin altındaki çıkış iğnesi ile başlatılırsa, hava kabarcıkları kuyuya akmadığı sürece sıvı seviyesi sabit kalır, bu da sıvı yüksekliğinin çıkış iğnesiyle aynı yüksekliğe gelene kadar düşmesine neden olur.
- Ek parçalar toplayın
- Perfüzyona tabi tutulacak her hücre kültürü için, tüm perfüzyon için yeterli ortam içerecek kadar büyük, ayrıca başlangıçta boruyu doldurmak için ek miktarda ortam içeren bir steril şırınga elde edin.
- Perfüze edilecek her kültür için, bir dişi-diken-ve iki erkek-diken-Luer konektörünün yanı sıra iki dişi ve iki erkek Luer başlığı elde edin.
- Parçaları temizleyin ve sterilize edin
- Parçalar daha önce kullanılmışsa, 0.1 N NaOH ile perfüze ederek temizleyin, ardından deiyonize su ile durulayın.
- Otoklavlama veya başka bir şekilde, yukarıda listelenen tüm parçaların sterilitesini sağlayın.
2. Çok kafalı dağıtıcıyı lazerle kesin ve bir fraksiyon toplayıcıya takın
- Bilgisayar destekli bir tasarım programında Şekil 3'teki çok kafalı dağıtıcı modelini yeniden oluşturun veya sağlanan model DXF dosyasını indirin (Ek Dosya 1).
- Tasarımı 1/8 akrilik levhadan kesmek için bir lazer kesici kullanın.
- Dağıtım kafasını fraksiyon toplayıcının hareketli tabanına bağlayan üç vidayı çıkarın.
- Çok kafalı dağıtıcıdaki en küçük üç deliği hareketli tabandaki vida delikleriyle hizalayın ve vidaları takılacak deliklerden tekrar vidalayın.
- Üç vidanın sızdırmazlığını, çok kafalı dağıtıcıyı, dağıtım delikleri sırası altındaki toplama borularıyla aynı hizaya gelene kadar yukarı ve aşağı açılandıracak şekilde ayarlayın.
- 300 μL pipet uçlarını, dağıtım uçları olarak kullanılmak üzere istenen deliklerden dikkatlice yerleştirin.
NOT: Fraksiyon toplayıcı, tek bir hücre kültürünü perfüze etmek için çok kafalı dağıtıcı olmadan kullanılabilir.
3. Bileşen RTD'lerini ölçün ve sinyal evrişimi gerçekleştirin
- İzleyici darbesi için pompaları ve şırıngaları Şekil 2'de gösterildiği gibi ayarlayın.
- İki adet tek kanallı veya çok kanallı şırınga pompası edinin.
- Hücre kültürü deneyleri sırasında akış sisteminde kullanılacak ortamı temsil etmek için bir arka plan çözümü seçin. Arka plan çözümünün ortama benzer kütle transfer özelliklerine sahip olduğundan emin olun. Çoğu durumda, deiyonize su uygun bir seçimdir.
- Hücre kültürü deneyleri sırasında ilgi çekici olacak çözünürlüğü temsil etmek için bir izleyici madde seçin. İzleyicinin, ilgilenilen çözünene benzer kütle transfer özelliklerine sahip olduğundan ve konsantrasyonunun ölçülebildiğinden emin olun. Çoğu durumda, gıda boyası uygun bir seçimdir.
- İzleyici çözeltisini yapmak için izleyici maddesini arka plan çözeltisinde çözün.
- Bir şırıngayı bir arka plan çözeltisiyle doldurun ve bir şırınga pompasına yükleyin. Başka bir şırıngayı izleyici çözeltisiyle doldurun ve ikinci şırınga pompasına yükleyin.
- Luer konektörlerini kullanarak her iki şırıngayı da dört yönlü bir stopcock'un üç bağlantı noktasından ikisine bağlayın.
- Stopcock'u arka plan çözeltisine kapatın ve izleyici çözeltisini açık porttan damlamaya başlayana kadar stopcock'a pompalayın. Pompayı durdurun ve şırıngayı daha fazla ayarlamayın.
NOT: Şırınga pompasının hareketli çubuğunun, deneyin zamanlanmış kısımları başlamadan önce şırınga pistonlarına doğru itilmesi önemlidir. Bu, pompa başlatıldığında akışın hemen başlamasını sağlayacaktır. Aksi takdirde, pompa başlatılabilir, ancak hareketli çubuk piston konumuna gelene kadar akış aslında başlamaz. - Durdurucuyu izleyici çözeltisine kapatın ve tüm artık izleyici çözeltisi açık bağlantı noktasından temizlenene kadar arka plan solüsyonunu stopcock'a pompalayın. Pompayı durdurun ve şırıngayı daha fazla ayarlamayın.
- İlgilenilen akış sistemi bileşenini ve kesir toplayıcıyı ayarlayın
- RTD analizi için istenen akış sistemi bileşenini ayarlayın. Ölçülecek bileşenin, çalışma sırasında fraksiyon toplayıcıya ulaşmak için uygun uzunlukta ve esneklikte bir parça aşağı akış borusu ile uçtuğundan emin olun.
- Çıkış yönündeki borunun ucunu, çok kafalı dağıtıcıdaki pipet ucu dağıtıcısına, sıkıca bağlanacak şekilde yerleştirin.
- Dört yönlü durdurmanın açık portunu, ölçülecek bileşenin girişine takın. Bir hücre kültürü deneyi sırasında olduğu gibi tamamen dolana kadar bileşenden arka plan çözeltisini pompalayın ve fraksiyon toplayıcı dağıtım ucundan damlamaya başlar. Pompayı durdurun.
- İzleyici darbesini enjekte edin, fraksiyonları toplayın ve izleyiciyi ölçün
- İzleyici çözeltisi için pompayı istenen akış hızına ayarlayın. Stopcock'u arka plan çözümüne kapatın ve izleyici çözümünün akışını başlatın. Aynı zamanda, kesir toplayıcıyı başlatın.
- İzleyicinin impuls girişine yaklaşmak için izleyici çözeltisinin akışına kısa bir süre devam edin. 10 dakikalık bir darbe süresinin, RTD'ler için 1 mL / s akış hızında iyi çalıştığı bulunmuştur.
NOT: İzleyici darbesi çok kısaysa, ölçülebilir olması için akışa yeterli izleyici girmeyecektir. Nabız çok uzunsa, artık bir dürtüye yaklaşmayacak ve RTD'nin şeklini değiştirecektir. - İzleyici çözeltisi darbe periyodunun sonunda, izleyici çözeltisi pompasını durdurun. Durdurmayı hızlı bir şekilde izleyici çözeltisine kapatın ve arka plan çözeltisinin akışını aynı akış hızında başlatın.
- Arka plan çözeltisinin akmasına ve fraksiyonların toplanmasına, izleyicinin tamamı sistemden ve toplanan fraksiyonlara geçene kadar izin verin.
- Sistemi durdurun ve fraksiyonlardaki izleyici konsantrasyonunu ölçün. Sadece tamamen dağıtılan kesirleri içerir. Koleksiyon, bir kesirin toplanması yoluyla yarı yolda durdurulursa, bu kesri dahil etmeyin.
- MATLAB'da ölçülen verilerden ikamet süresi dağılımını (RTD) hesaplayın
NOT: Bu MATLAB senaryosu tarafından gerçekleştirilen analizin yazılı bir açıklaması, yazarların önceki yayını11'de bulunabilir ve teorinin tartışmaları literatür13'te yaygın olarak mevcuttur.- Ek Dosya 2'de sağlanan .xlsx elektronik tablosu biçiminde konsantrasyon verilerini içeren bir example_tracer_data.xlsx dosyası oluşturun. İzleyicinin kesirlerdeki (herhangi bir birim) konsantrasyon değerlerini, satır 2'de soldan sağa kronolojik sırayla girin. Nabzın başlangıcından A5 hücresindeki son fraksiyonun sonuna kadar geçen süreyi girin ve izleyici darbesinin uzunluğunu A8 hücresine dakika cinsinden girin.
- .xlsx dosyasını MATLAB dizinine kaydedin.
- Ek Dosya 3'teki RTD_From_Data.m komut dosyasını MATLAB düzenleyicisinde açın.
- Komut dosyasının Veri Yükle bölümünün ilk satırındaki parantez içindeki .xlsx dosyasının adını, komut dosyasında yazılan yönergeleri izleyerek yeni .xlsx veri dosyasının adıyla değiştirin. Komut dosyasını çalıştırın.
- Komut dosyasının RTD analizi13'ü başarıyla gerçekleştirdiğinden, RTD'nin bir grafiğini oluşturduğundan ve sayısal integralin değerini RTD'ye eşit 1 üzerinden döndürdüğünden emin olun. Komut dosyası tarafından MATLAB dizinine kaydedilen zaman vektörünü (t) ve ilişkili RTD değerleri vektörünü (Et) bulun.
- MATLAB'da RTD'ye model işlevi sığdırma
- Ek Dosya 4'ten MATLAB düzenleyicisinde Fit_RTD_Function.m komut dosyasını açın.
- RTD'ye uyacak şekilde yorumlanmış üç model fonksiyonundan birini seçin: silindirik tüplerde laminer akış için RTD'lere uyan eksenel dağılım modeli13; iyi karıştırılmış tanklara uyan CSTR model13; ve yaklaşık olarak daha büyük kuyu plakalarına uyan n-CSTR model15. Burada bulunmayan başka bir modele sığdırmak için, aynı biçimde komut dosyasına ekleyin.
- Komut dosyasının sığdırmak için seçilen modeli içeren bölümündeki yorumları kaldırın.
- Parametreler için ilk tahminlerin değerlerini RTD için uygun olanlarla değiştirin.
- RTD verilerinin üzerine bindirilmiş fit işlevinin grafiğini oluşturmak ve işlevin fit parametre değerlerini yazdırmak için komut dosyasını çalıştırın. Sığdırma çok zayıfsa veya hatalar oluşursa, parametrenin ilk tahminlerini değiştirin ve komut dosyasını yeniden çalıştırın.
- MATLAB'da sinyal evrişimi gerçekleştirme
- Birleştirmek için bir sinyal ve bir RTD veya iki RTD seçin.
- Ek Dosya 5'teki Signal_Convolution.m komut dosyasını MATLAB düzenleyicisinde açın.
- Bükülecek iki sinyalin her biri için (yani, bir sinyal ve bir RTD veya iki RTD), istenen birimlerde eşit aralıklı zaman noktalarının bir vektörünü ve bu zamanlarda karşılık gelen bir sinyal değerleri vektörünü tanımlayın.
NOT: İki sinyalin vektörleri aynı sayıda elemana ve aynı boyutta zaman adımlarına sahip olmalıdır. Bu nedenle, RTD'nin herhangi bir zaman aralığında rasgele sayıda nokta için örneklenebilen sürekli bir işlev olarak kullanılması yararlıdır. - İki sinyali MATLAB'a girin ve çıkış sinyalinin zaman ve sinyal vektörlerini elde etmek için komut dosyasını çalıştırın.
4. Temel perfüzyon sistemini bir kuyu plakasındaki hücrelerle kurun
- Kuyu plakasını hazırlayın
- Kuyu plakası kültürünün perfüzyon deneyi için uygun orta derinliğe sahip olduğundan emin olun. Perfüzyona başlamadan önce son ortam değişikliklerini, stimülasyonları veya diğer adımları istediğiniz gibi gerçekleştirin. Süspansiyon hücreleri perfüze ediliyorsa, altta olduklarından emin olmak için plakayı santrifüj edin.
- Steril koşullar altında, iğneli tıpaları, iğneler yukarı çekilmiş olarak kuyu plakası kültürlerine yerleştirin. Durdurucu yerleştirildikten sonra, çıkış iğnesinin yüksekliği kararlı sıvı seviyesini belirlediğinden, iğneleri perfüzyon için istenen yüksekliğe indirin.
- İğneleri erkek Luer kapaklarıyla kapatın ve tüm kuyu plakasını kullanıma kadar bir inkübatörde tutun.
- Şırıngaları ve yukarı akış borularını hazırlayın
- Steril koşullar altında, perfüzyonun istenen süresi boyunca yeterli ortam ve ayrıca yukarı akış borusunu doldurmak için yeterli ek ortam ile perfüze edilecek her kültür için bir şırınga doldurun.
- Dişi-dikenli Luer konektörü kullanarak yukarı akış borusunu şırıngaya takın. Tüpün diğer ucunda, erkekten dikenlere Luer konektörü takın.
- Yukarı akış tüpü tamamen ortamla dolana kadar şırıngadan ortam dağıtın.
- Tüpün açık ucunu dişi bir Luer başlığı ile kapatın.
NOT: Tüm çoğaltılan şırıngalar bu noktada tam olarak aynı hacme sahip olmalıdır. Hacimleri eşit değilse, pistonları farklı pozisyonlarda olacak ve hepsi tek bir çok kanallı şırınga pompasına iyi sığmayacaktır.
- Steril koşullar altında, aşağı akış borusunun bir ucuna erkekten dikenlere bir Luer konektörü takın ve dişi bir Luer kapağı ile kapatın.
- Hazırlanan tüm boruları, şırıngaları ve kuyu plakasını perfüzyon için kullanılacak inkübatöre dikkatlice getirin.
- Şırınga pompasını ve fraksiyon toplayıcıyı inkübatörün yakınında istenen yerlere yerleştirin. Şırınga pompasını inkübatörün üstüne veya yanına yerleştirin ve fraksiyon toplayıcıyı inkübatörün yanına, portun yanına yerleştirin.
- Tüm yukarı ve aşağı akış tüplerinin kapaklı uçlarını bir araya getirin ve bunları inkübatörün dışından liman üzerinden içeriye doğru itin.
- Şırıngaları şırınga pompasına yükleyin ve çıkış yönündeki tüplerin açık uçlarını, fraksiyon toplayıcının çok kafalı dağıtıcısının dağıtım pipet uçlarına yerleştirin.
- İnkübatörün içinde, akan ortamın inkübatör havasından ısı ve CO2 alabileceği boru uzunluğunu en üst düzeye çıkarmak için inkübatöre mümkün olduğunca fazla yukarı akış borusu gevşetin. Bunları yerinde tutarken, aşağı akış tüplerini inkübatörden dışarı çekin, böylece fraksiyon toplayıcı üzerindeki en uzak uzatılmış noktaya ulaşabilmeleri için kapaklı uçları inkübatörün içinde tutmaya devam edin.
- Tıkanan her kuyu için, iğneleri ve bu kuyu için yukarı ve aşağı akış tüplerini hızlı bir şekilde açın ve bunları Luer konektörleriyle birbirine takın.
- Tüm parçalar bağlandıktan sonra, tüm akışların düzgün bir şekilde aktığından emin olmak için şırınga pompasını nispeten yüksek bir hızda kısaca çalıştırın.
- Bu noktada, deneye ortamla dolu çıkış yönündeki tüplerle başlamak istenirse, hepsi dolana kadar pompayı çalıştırmaya devam edin. Aksi takdirde, pompayı durdurun.
- Şırınga pompası akış hızını ve fraksiyon toplama sıklığını ayarlayın ve deneye başlamak için her iki makineyi aynı anda başlatın. İstenilen deneme süresi boyunca kesirleri toplayın.
5. Perfüzyon sistemini, birden fazla ortam kaynağı için bir stopcock ile kurun
- Yukarıdaki adım 4.1'in tüm alt adımlarını gerçekleştirin.
- Perfüzyonda kullanılacak iki ortamı hazırlayın, ilk önce dağıtılacak ortamı 1, diğerini orta 2 olarak etiketleyin.
- Perfüze edilecek her kültür için, bir şırıngayı dispenzasyon süresi boyunca yeterli ortam 1 ile doldurun, ayrıca başlangıçta perfüzyon sistemini doldurmak için yeterli hacim. İkinci bir şırıngayı, veriliş süresi boyunca yeterli orta 2 ile doldurun.
- Her iki şırıngayı da dört yönlü bir stopcock'un üç portundan ikisine bağlayın.
NOT: Şırıngaları tıkayıcılara bağlamak için bir boru uzunluğu gerekebilir. - Stopcock'u ve şırıngaları, yukarıdaki 3.1.7-3.1.8 adımlarına benzer şekilde, stopcock'u orta 1'e kapatarak ve orta 2'yi açık porttan damlamaya başlayana kadar stopcock'a dağıtarak hazırlayın.
- Stopcock'u orta 2'ye kapatın ve kalan tüm orta 2 açık porttan atılana kadar orta 1'i stopcock'a dağıtın.
- Dişi-dikenli Luer konektörü kullanarak yukarı akış borusunu açık stopcock portuna takın. Tüpün diğer ucunda, erkekten dikenlere Luer konektörü takın.
- Yukarı akış tüpü tamamen ortamla dolana kadar şırıngadan orta 1'i dağıtın.
- Yukarıdaki 4.3-4.11 adımlarıyla devam edin, her iki şırıngayı ayrı şırınga pompalarına ve sadece dağıtım ortamı 1'e yükleyin.
- Şırınga pompası akış hızını orta 1 ve fraksiyon toplama sıklığı için ayarlayın ve deneye başlamak için her iki makineyi aynı anda başlatın.
- Orta kaynak değiştirilecekse, şırınga pompasını orta 1 için hızlı bir şekilde durdurun, durdurma musluğunu orta 1'e kapatın ve şırınga pompasını orta 2 için başlatın. Daha sonra isterseniz, kaynağı benzer şekilde orta 1'e geri döndürün.
- İstenilen deneme süresi boyunca kesirleri toplayın.
6. Farmakokinetiği taklit etmek için perfüzyon sistemini karıştırılmış bir tankla kurun
- İlgilenilen ilaç için farmakokinetik veriler elde edin ve bunun bir konsantrasyon zirvesinden ve ardından üstel bir çürümeden oluştuğundan emin olun.
- Zirveyi 0 zamanına ayarladıktan ve tepe noktasından önceki veri noktalarını kaldırdıktan sonra, karıştırılan tank RTD denklemini verilere sığdırmak için Stirred_Tank_Fit.m komut dosyasını (Ek Dosya 6) kullanın. Giriş v (istenen perfüzyon akış hızı) ve bir çift vektör olarak doğrudan komut dosyasına sığdırılacak veriler, sırasıyla zaman değerleri ve konsantrasyon değerleri için t ve C ile birlikte. Gerekli karıştırılmış tank hacmi olan V parametresini yazdırmak için komut dosyasını çalıştırın.
- Perfüzyon sistemi için iki şırınga pompası ve inkübatörün yukarı yönünde bir plaka çalkalayıcı içerecek şekilde bir düzen planlayın.
- Perfüzyon sistemi bileşenlerinin RTD'lerini stopcock'un ötesinde ölçün ve uygun bir farmakokinetik profil bulmak için çeşitli ilaç nabız süreleri ve konsantrasyonları ile RTD'lerin sinyal evrişimini gerçekleştirin. Bu hesaplamada uygun karıştırılmış tank RTD denklemini kullanın.
- Yukarıdaki 5.1-5.8 arası adımlarla devam edin.
- Kurulum için karıştırılmış tank olarak uygun boyutta ek bir kuyu plakası kullanın. Her kuyu, perfüze edilmiş bir kültür için karıştırılmış bir tank görevi görebilir. Kuyuyu gerekli miktarda orta, V ile doldurun ve kuyuyu başlangıçta yukarı çekilen iğnelerle takın, daha sonra kuyunun dibine itin ve iğneleri kapatın.
- Şırıngaları şırınga pompalarına yükleyin ve boruyu şırıngalardan karıştırılmış tankların kapaklı giriş iğnelerine hızlı bir şekilde bağlayın. Daha sonra hücre kültürü yukarı akış tüp girişlerini karıştırılmış tankların çıkış iğnelerine bağlayın.
- 5.9-5.10 arasındaki adımlarla devam edin.
- İstenilen zamanda, adım 5.11'de açıklandığı gibi, ilacı içeren dağıtım ortamı 2'ye geçin. İlaç infüzyonu tamamlandığında orta 1'e geri dönün.
- Adım 5.12 ile devam edin.
Resim 3: Çok kafalı dağıtıcı. Lazer kesimli çok kafalı dağıtıcı için tasarım. Bu rakam Erickson ve ark.11'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokolün 5. bölümünden çoklu ortam kaynaklarına sahip perfüzyon sistemi, tümör nekroz faktörü alfasının (TNF-α) 1.5 saatlik nabzına yanıt olarak, insan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücrelerinde aktive edilmiş B hücrelerinin (NF-κB) transkripsiyon faktörünün nükleer faktör kappa-hafif zincir-arttırıcısı tarafından yönlendirilen bir muhabir genin ekspresyon dinamiklerini ölçmek için kullanıldı. HEK293 hücreleri, dönüştürülmüş hücreleri izole etmek için floresan ile aktive edilmiş hücreler sıralama (FACS) yoluyla sıralanan NFKB-GLuc HEK293 hücrelerini oluşturmak için NF-κB yanıt elemanını içeren NFKB adlı bir promotör tarafından yönlendirilen Gaussia lusiferaz (GLuc) içeren bir gen yapısına sahip lentiviral vektörler kullanılarak kararlı bir şekilde dönüştürüldü. Sıralanmış hücreler kullanıma kadar kriyokorunmuştur.
Perfüzyon kurulumu, perfüzyon kurulumu, hücreleri içeren tıkanmış 48 delikli bir plakaya yol açan 1 m'lik bir borunun yukarı akış bölümünü, ardından 0,5 mL / s (0,0083 mL / dak) akış hızına sahip çok kafalı fraksiyon toplayıcısına giden 1 m aşağı akış borusunu içeriyordu. Tek başına 1 m borunun ve tam kurulumun (1 m tüp + 48 kuyucuklu plaka + 1 m tüp) RTD'leri, 20 dakikalık bir izleyici darbesi ile 0,5 mL / s'lik bir akış hızı kullanılarak ölçülmüştür. Arka plan çözeltisi, deiyonize suda seyreltilmiş mavi gıda boyasının bir izleyici çözeltisi ile deiyonize sudur ve fraksiyonlar, çok kafalı dağıtıcı kullanılarak 1 fraksiyon / s oranında toplanmıştır. Fraksiyonların 100 μL numunelerindeki izleyici konsantrasyonları, 628 nm'de absorbans yoluyla bir plaka okuyucuda ölçülmüştür.
İzleyici konsantrasyon verileri, her iki kurulum için RTD'ler üretmek üzere MATLAB'da işlendi. İlk olarak, iki kurulumun RTD'leri RTD_from_Data.m betiği kullanılarak verilerden hesaplandı. 1 m'lik tüpün RTD veri noktaları ve tam kurulum Şekil 4'te gösterilmiştir.
Şekil 4: İkamet süresi dağılımları . (Sol) 0,5 mL/s (0,0083 mL/dak) akış hızında 1 m'lik bir tüp için RTD. (Sağda) 0,5 mL/s akış hızında tam perfüzyon kurulumunun (1 m tüp + 48 delikli plaka + 1 m tüp) RTD'si.
Tek başına boruların RTD'si, mevcut literatüre dayanarak beklenen eksenel dağılım fonksiyonu ile iyi uyum sağlar13. Seri olarak birden fazla boru parçası da tek bir eksenel dağılım modeli tarafından iyi bir şekilde uyar ve 48 delikli plakanın sıralı olarak eklenmesi bu modelden ihmal edilebilir sapmaya neden olur, bu nedenle tek başına 1 m tüp ve 1 m tüp + 48 kuyucuklu plaka + 1 m tüp kurulumunun her birinin eksenel dağılım modeli tarafından iyi bir şekilde uyması bekleniyordu. Model parametreleri için ilk tahminler gerçek değerlerinden çok uzak olduğunda zayıf model uyumlarının oluşması yaygındır. Bunu göstermek için, ilk olarak, eksenel dağılım modeli, fonksiyon parametreleri için ilk tahminler olarak Pe = 10 ve tau = 30 dakika kullanılarak, Fit_RTD_Function.m betiği kullanılarak 1 m tüp verilerine uydurulmuştur. Şekil 5 , bu tahminlerin RTD verileriyle birlikte çizilen zayıf uyum modelleriyle sonuçlandığını göstermektedir. Tahminler Pe = 10 ve tau = 300 dakika olarak değiştirildi, bu da Şekil 5'te gösterilen iyi model uyumu ile sonuçlandı, çünkü tau, hacimsel akış hızına bölünen perfüzyon sistemi hacmine yaklaşık olarak eşit olmalıdır. 1 m tüp için uygun parametreler Pe = 154.3, tau = 317.2 dakika iken, tüm sistem için parametreler Pe = 396.5, tau = 596.5 dakikadır.
Şekil 5: Bir RTD için uygun iyi ve kötü model örnekleri. Eksenel dağılım modeli, 0,5 mL/s (0,0083 mL/dak) akış hızında 1 m'lik bir tüp için RTD verilerine uygundu. (Solda) MATLAB betiğine girilen model parametreleri için ilk tahminler gerçek değerlerinden çok uzaktı ve bu da betiğin zayıf bir model uyumu döndürmesine neden oldu. (Sağda) Komut dosyasına daha iyi parametre değerleri girildi ve bu da iyi bir model uyumu sağladı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Sinyal evrişimi, yukarı akış borusunun girişinde 10 ng / mL TNF-Signal_Convolution içeren 1,5 saatlik bir ortam darbesinin sistem boyunca nasıl yayılacağını tahmin etmek için α.m betiğindeki bu uygun RTD işlevleri kullanılarak gerçekleştirildi. Giriş sinyali, TNF-α sinyalinin kuyu plakasına gireceğini belirlemek için ilk önce 1 m boru RTD ile birleştirildi. Giriş sinyali ayrıca, TNF-α sinyalinin toplanan fraksiyonlarda sistemin çıkışında ne olacağını belirlemek için 1 m tüp + 48 kuyucuklu plaka + 1 m tüpün RTD'si ile birleştirildi ve burada hücrelerden karşılık gelen GLuc tepkisinin yanında görünecekti. Şekil 6, TNF girişini göstermektedir - α darbe sinyali, kuyu girişinde ve sistem çıkışında tahmin edilen sinyallerin yanında gösterilmektedir.
Şekil 6: Perfüzyon sistemindeki TNF-α konsantrasyon sinyallerinin tahmin edilmesi. TNF α içeren ortam, mavi dikdörtgen sinyalle temsil edilen ilk 90 dakikalık çalışma için 10 ng / mL'de perfüzyon sistemine aşılandı. (Solda) Giriş sinyalini 1 m tüp RTD'nin uygun eksenel dağılım modeli ile birleştirerek, girişteki TNF α konsantrasyon sinyalinin 48 delikli plakaya yönlendirilmesi öngörülmüştür. (Sağda) Benzer şekilde, tüm sistem için RTD modeli kullanılarak, sistemin çıkışındaki TNF-α sinyali tahmin edildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
NFKB-GLuc HEK293 hücreleri çözüldü ve % 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamının (DMEM) 0.4 mL'sinde 1 x 104 hücreli / kuyucuklu bir 48 kuyucuklu plakada çözüldü ve kaplandı ve% 5 CO2 ile 37 ° C'de 1 gün boyunca inkübe edildi, daha sonra yukarıdaki protokolün 5. bölümündeki adımlar, birden fazla ortam kaynağı için bir stopcock ile perfüzyon sistemini kurmak için takip edildi. Dört kuyuyu delmek için dört dere kuruldu. Bir çok kanallı şırınga pompasına, orta 1 olarak DMEM içeren dört adet tam 60 mL şırınga yüklendi. İkinci bir şırınga pompasına, ikisi kontrol olarak düz DMEM içeren ve ikisi uyaran olarak 10 ng / mL TNF-α içeren DMEM içeren 2 orta 2 içeren 5 mL şırınga yüklendi. Deneyin başlangıcında, TNF-α veya kontrol ortamı içeren 5 mL şırıngalar 1.5 saat boyunca 0.5 mL / s'de dağıtıldı, daha sonra stopcocklar değiştirildi ve DMEM içeren 60 mL şırıngalar sonraki 40 saat boyunca dağıtıldı. 24 saatte ve perfüzyonun sonunda, mikrosantrifüj tüplerine dağıtılan dört akıştan fraksiyonlar -80 ° C'de etiketlendi ve donduruldu ve fraksiyon toplayıcı sıfırlandı.
Perfüzyondan sonra, tüm örnekler çözüldü ve GLuc konsantrasyonları, daha önce 11,16'da tarif edilen bir biyolüminesans testi kullanılarak ölçüldü. Lüminesans değerleri, her bir kesir örneğinin lüminesansını o fraksiyonun zaman süresine bölerek lüminesans / h oranlarına dönüştürüldü ve dört akışın her biri için bir zaman serisi olarak çizildi. Her GLuc ölçümünün zamanı, bu fraksiyonun toplandığı zaman aralığının orta noktasıydı, eksi perfüzyon sisteminin aşağı akış borusunun ortalama ikamet süresi (tau = 317 dakika). Fraksiyonlar içinde yer aldığı tahmin edilen TNF-α sinyali, aşağı akış borusunun ortalama ikamet süresi ile zaman içinde kaydırıldı ve GLuc verileri üzerine bindirildi ve Şekil 7'de gösterilen uyaran-tepki dinamikleri NF-κB güdümlü gen ekspresyonunu ortaya çıkardı.
Şekil 7: Perfüzyon sistemi kullanılarak ölçülen uyaran-tepki dinamikleri. İki orta kaynağa sahip perfüzyon sistemi, iki hücre kültürünü, kontrol olarak maruz kalmamış iki kültürle TNF-α nabzına geçici olarak maruz bırakmak için kullanıldı. HEK293 hücreleri, atık su fraksiyonlarında toplanan NF-κB tepki elemanını içeren bir promotör tarafından tahrik edilen GLuc'u salgılamak üzere tasarlanmıştır. Deney, TNF-α maruz kalmayı takiben NF-κB tarafından yönlendirilen dramatik bir ifade artışını ortaya koymaktadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Perfüzyonun başlangıcındaki kültürlerde biriken GLuc'un varlığı, GLuc sinyalinde dört eğrinin hepsinde birinci fraksiyondan ikinci fraksiyona belirgin bir düşüşe neden oldu. Bu yaygın artefakt, perfüzyonlara başlamadan hemen önce kültürlerdeki ortamı değiştirerek perfüzyon sisteminde önlenebilir. TNF-α almayan iki kontrol kültürü, deney süresince kademeli olarak artan düşük bir GLuc sekresyon oranını korudu. Bu sonuç, hücre popülasyonunun büyümesini yansıtabilir. Uyarılmış kültürler başlangıçta kontrollerle aynı GLuc sekresyon hızına sahipti ve daha sonra TNF α nabzına yanıt olarak NF-κB güdümlü ekspresyon aktive edildiğinden sekresyonu önemli ölçüde arttırdı. GLuc sekresyonu, TNF-α ilk gelişinden yaklaşık 9 saat sonra zirveye ulaşır, daha sonra üstel bozunma ile azalır.
Ek Dosya 1: CAD dosyası: Multi-head_Dispenser.DFX: Bu dosya, lazer kesimli olabilen ve fraksiyon toplayıcılarını değiştirmek için kullanılabilen çok kafalı dağıtıcının modelini içerir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 2: example_tracer_data.xlsx. RTD_from_Data.m MATLAB komut dosyası tarafından okunacak örnek izleyici deneyi verilerini içerir. Yeni veriler için şablon olarak da kullanılabilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 3: MATLAB dosyası: RTD_from_Data.m. Bu komut dosyası, bir .xlsx dosyasından izleyici deneyi verilerini okur ve RTD'yi temsil eden t ve Et vektörlerini döndürür. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 4: MATLAB dosyası: Fit_RTD_Function.m. Bu komut dosyası, RTD_from_Data.m betiğinden RTD vektörlerini yükler ve RTD için uygun bir model döndürür. Model türü kullanıcı tarafından seçilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 5: MATLAB dosyası: Signal_Convolution.m. Bu komut dosyası, kullanıcı tanımlı bir çözünen sinyali ve bir RTD'yi giriş olarak alır ve bu RTD ile akış sisteminden geçtikten sonra sinyalin nasıl değiştirileceğini tahmin eder. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 6: MATLAB dosyası: Stirred_Tank_Fit.m. Bu komut dosyası, kullanıcı tarafından farmakokinetik veri girişine bir CSTR RTD eğrisine uyar ve verilen akış hızı için RTD'yi üretmek için gereken tank hacmini döndürür. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma, TNF-α geçici bir darbesine yanıt olarak NF-κB güdümlü gen ekspresyonunun dinamiklerinin ölçüldüğü spesifik bir örnekle gösterilen çoklu ortam kaynaklarına sahip bir perfüzyon hücre kültürü sisteminin montajını ve çalışmasını açıklamaktadır. Perfüzyon sistemi bileşenlerinin RTD'leri ölçüldü ve modellendi ve hem hücrelerin TNF-α darbesine maruz kalmasını hem de toplanan atık su orta fraksiyonlarındaki TNF-α dağılımını tahmin etmek için sinyal evrişimi kullanıldı. Hücreler darbeye maruz bırakıldı ve fraksiyonlar 40 saat boyunca toplandı, daha sonra GLuc fraksiyonlarda ölçüldü ve stimülasyon-tepki dinamiklerini ortaya çıkarmak için öngörülen TNF-α sinyalinin yanında çizildi.
Bu perfüzyon yöntemi eksik değildir. Özellikle, sistem, tüpün inkübatör içinde kurulduktan sonra kuyu plakasına bağlandığı kritik kısa adım nedeniyle sterilite riski taşır. Yazarların deneyimlerine göre, kontaminasyon oldukça nadirdir; Bununla birlikte, kontaminasyon riski aşağıdaki şekillerde azaltılabilir. Birincisi, tüm hücre taşıma prosedürlerini ve steril bağlantıları bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirmektir. Steriliteyi iyileştirmek için düşünülebilecek ek bir önlem, hücre kültürlerinin girişine 0.22 μm'lik bir şırınga filtresinin sıralı olarak dahil edilmesidir. Steril filtrasyonun kullanılması, hücre kültürüne girmeden önce ortamda bulunan bakterileri veya daha büyük mikroorganizmaları yakalayacaktır, ancak akışı yönlendirmek için basınç gereksinimlerini arttırır ve membranın kirlenmesi nedeniyle tıkanabilir. Giden numuneler ayrıca kontaminasyon riski taşıyan açık ortamlarda da toplanır. Bir muhafaza sisteminde numunelerin toplanması, ideal olarak hava filtreleme ile, fraksiyonasyon modülü için gelecekteki sistem yapılarında bu sorunu ortadan kaldıracaktır.
Ayrıca, hücreler tarafından salgılanan sinyaller, fraksiyone edilmeden ve ölçülmeden önce aşağı akış borusunun RTD'sine göre bozulur. Böylece, ölçülen sinyaller, hücreler tarafından salgılananların bulaşmış versiyonlarıdır. Teorik olarak, bu bulaşma, aşağı akış RTD14'ün etkisini ortadan kaldırmak için ölçülen sinyal üzerinde dekonvolüsyon gerçekleştirilerek geri alınabilir, ancak sinyal gürültüsü büyük ölçüde arttığından, bu sayısal tekniği ideal olmayan verilere başarıyla uygulamak zordur. Bununla birlikte, ilgilenilen birçok biyolojik dinamik, saatler ila onlarca saat arasındaki zaman ölçeğinde ortaya çıkar ve bu nedenle, boru RTD'lerinin bulaşma etkilerinden çok az etkilenir, zamanla değiştirilir, ancak şekil olarak çok az değişir. Burada gösterilen RTD ölçüm yöntemi, daha kısa izleyici darbeleri kullanılarak ve hücre kültürü deneylerinde kullanılacak olanlarla eşleşen arka plan çözeltileri ve izleyici maddeleri kullanılarak da geliştirilebilir. Bununla birlikte, burada önerilen darbe sürelerinin, tüm kısa darbe sürelerine aynı RTD'leri verdiği ve bu nedenle RTD ölçümleri için uygun olduğu gösterilmiştir, ancak nabız süreleri arttıkça, RTD'ler daha belirgin şekilde değişir ve bu nedenle kullanılmamalıdır. Yazarlar daha önce hem gıda boyasının hem de GLuc'un hem su hem de kültür ortamı11'de birbirine çok benzer RTD'lere sahip olduğunu bulmuşlardır, bu nedenle moleküler türlerin RTD'yi çok fazla değiştirmesi muhtemel değildir. Son olarak, 20 ° C'ye karşı 37 ° C'de ölçüldüğünde sudaki gıda boyası için veya düz borularda yüksek sarmal boru11'e karşı RTD'lerde hiçbir fark gözlenmemiştir. Bu veriler ve bir dizi perfüzyon sistemi geometrisi ve akış hızı için RTD verileri, yazarların önceki yayını11'de ve bu makalede RTD analiz betiği tarafından gerçekleştirilen işlemlerin ayrıntılı bir açıklamasında bulunabilir. RTD analiz teorisi13 ve RTD'lerin biyoreaktör sistemlerine17,18,19,20,21 uygulamalarına ilişkin örnekler hakkında daha fazla ayrıntı sağlanan referanslarda bulunabilir.
Bu çok yönlü yöntem, hücre kültürlerinde çözünür maddelerin salgılanma veya emilim oranlarını ölçmek için kullanılabilir ve geçici çözünen sinyaller, yukarı akış ortam kaynaklarını değiştirerek kültürlere iletilebilir. Çözünen darbeler veya adım değişiklikleri gibi basit sinyaller, giriş valfi değiştirilerek kolayca iletilebilir. Farmakokinetik benzeri sinyaller, kültürün yukarı yönünde uygun sıvı hacmine sahip karıştırılmış bir tank yerleştirilerek ve içinden çözünmüş bir darbe verilerek üretilebilir. Diğer sinyaller, darbeleri istenen şekillere dönüştürmek için yeni RTD'lere sahip farklı darbe kombinasyonları, adım değişiklikleri ve bileşenler uygulanarak oluşturulabilir. Mevcut statik hücre kültürü yöntemleri, orta ölçekli örnekleri otomatik bir şekilde sürekli olarak toplayamaz ve hücreleri sorunsuz bir şekilde değişen çözünen sinyallere maruz bırakmak için kullanılamaz. Mikroakışkan sistemler pahalıdır ve uzmanlık gerektirir ve bu deney sınıfı için ticari olarak temin edilebilen makroakışkan sistemler yoktur. Düşük maliyetli, basit sistem, doğal hücre davranışlarını, dürtü tepkilerini, ilaçları veya endojen çözünen sinyal dinamiklerini taklit edebilecek farklı geçici çözünen profillerin etkilerini incelemek için laboratuvarlar tarafından benimsenebilir ve yeni deneylerin ihtiyaçlarını karşılamak için yeniden yapılandırılabilir. Bu tekniğin ve şu anda devam etmekte olanların gelecekteki uygulamaları şunları içerir: bir ex vivo hücre terapisinden sitokinlerin ve eksozomların sekresyon hızı dinamiklerinin ölçülmesi; sirkadiyen saat zamanının ilaçlara hücresel yanıt üzerindeki etkisini değerlendirmek; bakteriyel biyofilmlerin büyüme hızını ve metabolizmasını ölçmek; in vitro adeno ilişkili virüs (AAV) vektörleri için doz-yanıt eğrileri üretmek; üretici hücrelerden lentiviral vektörlerin dinamik üretim hızını ölçmek; ve farmakokinetik kemoterapi ilaç profillerini hassas kanser tedavisi için kişiselleştirilmiş tıp biyopsilerine dahil etmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu araştırma Hibe No'lu destek ile yürütülmüştür. Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden R01EB012521, R01EB028782 ve T32 GM008339.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 Gauge 1 1/2- in Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines | Grainger | 5FVK2 | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | HEK 293T cells used in the Representative Results experiment. |
| 96-Well Clear Bottom Plates, Corning | VWR | 89091-010 | Plates for measuring dye concentrations in RTD experiments and GLuc in representative results experiment. |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 5 mL | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| BioFrac Fraction Collector | Bio-Rad | 7410002 | Fraction collector that can be used for a single stream, or modified using our method to enable collection from multiple streams. |
| Clear High-Strength UV-Resistant Acrylic 12" x 12" x 1/8" | McMaster-Carr | 4615T93 | This sheet is cut using a laser cutter according to the DXF file in the supplemental materials to produce the multi-head dispenser that can be attached to the BioFrac fraction collector. |
| Coelenterazine native | NanoLight Technology | 303 | Substrate used in Gaussia luciferase bioluminescence assay in representative results. |
| Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, size 48 wells, polystyrene plate, flat bottom wells | Millipore Sigma | CLS3548 | Used to grow and perfuse 293T cells in representative results. |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells | Fisher Scientific | 720081 | Can be plugged and used as a stirred tank to produce pharmacokinetic profiles in perfusion. Can also contain cells for perfusion. |
| DMEM, high glucose | ThermoFisher Scientific | 11965126 | |
| Epilog Zing 24 Laser | Cutting Edge Systems | Epilog Zing 24 | Laser cutter used to produce multi-head dispenser from acrylic sheet. Other laser cutters may be used. |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 20 mL | Fisher Scientific | 14-955-460 | |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 60 mL | Fisher Scientific | 14-955-461 | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | Microcentrifuge tubes for collecting fractions. |
| Fisherbrand Round Bottom Disposable Borosilicate Glass Tubes with Plain End | Fisher Scientific | 14-961-26 | Glass tubes for collecting fractions. |
| Fisherbrand SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-Filtered | Fisher Scientific | 2707410 | 300 ul pipette tips that best fit the multi-head dispenser and tubing to act as dispensing tips. |
| Gibco DPBS, powder, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 21600010 | Phosphate buffered saline. |
| Labline 4625 Titer Shaker | Marshall Scientific | Labline 4625 Titer Shaker | Orbital shaker used to keep stirred tanks mixed. |
| Masterflex Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile; 10/PK | Cole-Parmer | EW-30600-04 | Used to join multiple inlet streams for RTD experiments and cell culture experiments. |
| Masterflex Fitting, Polycarbonate, Straight, Female Luer x Cap; 25/PK | Masterflex | UX-45501-28 | |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hosebarb Adapters, 1/16" | Cole-Parmer | EW-45508-00 | |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Hosebarb Adapter, 1/16" ID | Cole-Parmer | EW-45518-00 | |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Plug Adapter; 25/PK | Masterflex | EW-30800-30 | |
| Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 14; 25 ft | Masterflex | EW-96410-14 | |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | Version R2019b. Newer versions may also be used. Some older versions may work. |
| NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1600 | |
| Rack Set F1 | Bio-Rad | 7410010 | Racks to hold collecting tubes in the fraction collector. |
| Recombinant Human TNF-alpha (HEK293-expressed) Protein, CF | Bio-Techne | 10291-TA-020 | Cytokine used to stimulate 293T cells in representative results. |
| Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 00, Bottom 10.5mm | Saint Gobain | DX263015-50 | Fits 48-well plates. |
| Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 4 Bottom 21mm | Saint Gobain | DX263027-10 | Fits 12-well plates. |
| Sodium Hydroxide, 10.0 N Aqueous Solution APHA; 1 L | Spectrum Chemicals | S-395-1LT | |
| SolidWorks | Dassault Systems | SolidWorks | CAD software used to create the multi-head dispenser DXF file. |
| Varioskan LUX multimode microplate reader | ThermoFisher Scientific | VL0000D0 | Plate reader. |
| Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue | Michaels | 10404779 | Blue food dye containing Brilliant Blue FCF, used as a tracer in RTD experiments. Absorbance spectrum peaks at 628 nm. |
References
- Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Current Biology. 14 (24), 2289-2295 (2004).
- Talaei, K., et al. A mathematical model of the dynamics of cytokine expression and human immune cell activation in response to the pathogen Staphylococcus aureus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711153 (2021).
- Kemas, A. M., Youhanna, S., Zandi Shafagh, R., Lauschke, V. M. Insulin-dependent glucose consumption dynamics in 3D primary human liver cultures measured by a sensitive and specific glucose sensor with nanoliter input volume. FASEB Journal. 35 (3), 21305 (2021).
- Muzzey, D., van Oudenaarden, A. Quantitative time-lapse fluorescence microscopy in single cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 301-327 (2009).
- Calligaro, H., Kinane, C., Bennis, M., Coutanson, C., Dkhissi-Benyahya, O. A standardized method to assess the endogenous activity and the light-response of the retinal clock in mammals. Molecular Vision. 26, 106-116 (2020).
- Battat, S., Weitz, D. A., Whitesides, G. M. An outlook on microfluidics: the promise and the challenge. Lab on a Chip. 22 (3), 530-536 (2022).
- Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., Dibner, C. Parallel measurement of circadian clock gene expression and hormone secretion in human primary cell cultures. Journal of Visualized Experiments. (117), e54673 (2016).
- Yamagishi, K., Enomoto, T., Ohmiya, Y. Perfusion-culture-based secreted bioluminescence reporter assay in living cells. Analytical Biochemistry. 354 (1), 15-21 (2006).
- Watanabe, T., et al. Multichannel perfusion culture bioluminescence reporter system for long-term detection in living cells. Analytical Biochemistry. 402 (1), 107-109 (2010).
- Murakami, N., Nakamura, H., Nishi, R., Marumoto, N., Nasu, T. Comparison of circadian oscillation of melatonin release in pineal cells of house sparrow, pigeon and Japanese quail, using cell perfusion systems. Brain Research. 651 (1-2), 209-214 (1994).
- Erickson, P., Houwayek, T., Burr, A., Teryek, M., Parekkadan, B. A continuous flow cell culture system for precision cell stimulation and time-resolved profiling of cell secretion. Analytical Biochemistry. 625, 114213 (2021).
- Saltzman, W. M. Drug Delivery: Engineering Principles for Drug Therapy. , Oxford University Press. (2001).
- Fogler, H. S. Elements of Chemical Reaction Engineering. 4th edn. , Prentice Hall PTR. Boston. (2006).
- Conesa, J. A. Chemical Reactor Design: Mathematical Modeling and Applications. , Wiley. (2019).
- Toson, P., Doshi, P., Jajcevic, D. Explicit residence time distribution of a generalised cascade of continuous stirred tank reactors for a description of short recirculation time (bypassing). Processes. 7 (9), 615 (2019).
- Tamayo, A. G., Shukor, S., Burr, A., Erickson, P., Parekkadan, B. Tracking leukemic T-cell transcriptional dynamics in vivo with a blood-based reporter assay. FEBS Open Biology. 10 (9), 1868-1879 (2020).
- Newell, B., Bailey, J., Islam, A., Hopkins, L., Lant, P. Characterising bioreactor mixing with residence time distribution (RTD) tests. Water Science and Technology. 37 (12), 43-47 (1998).
- Dubois, J., Tremblay, L., Lepage, M., Vermette, P. Flow dynamics within a bioreactor for tissue engineering by residence time distribution analysis combined with fluorescence and magnetic resonance imaging to investigate forced permeability and apparent diffusion coefficient in a perfusion cell culture chamber. Biotechnology and Bioengineering. 108 (10), 2488-2498 (2011).
- Gaida, L. B., et al. Liquid and gas residence time distribution in a two-stage bioreactor with cell recycle. HAL Open Science. , (2008).
- Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Wave characterization for mammalian cell culture: residence time distribution. New Biotechnology. 29 (3), 402-408 (2012).
- Olivet, D., Valls, J., Gordillo, M. A., Freixó, A., Sánchez, A. Application of residence time distribution technique to the study of the hydrodynamic behaviour of a full-scale wastewater treatment plant plug-flow bioreactor. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 80 (4), 425-432 (2005).
