Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integreret med Udløbsfraktionering til dynamisk cellekultur

Summary

Dette papir præsenterer en metode til at konstruere og drive et billigt, multikanals perfusionscellekultursystem til måling af dynamikken i sekretion og absorptionshastigheder for opløste stoffer i cellulære processer. Systemet kan også udsætte celler for dynamiske stimulusprofiler.

Abstract

Visse celle- og vævsfunktioner fungerer inden for den dynamiske tidsskala på minutter til timer, der er dårligt løst af konventionelle kultursystemer. Dette arbejde har udviklet et billigt perfusionsbioreaktorsystem, der gør det muligt for kulturmedium kontinuerligt at blive perfunderet i et cellekulturmodul og fraktioneret i et downstream-modul for at måle dynamik på denne skala. Systemet er konstrueret næsten udelukkende fra kommercielt tilgængelige dele og kan paralleliseres til at udføre uafhængige eksperimenter i konventionelle multi-well cellekulturplader samtidigt. Denne videoartikel demonstrerer, hvordan man monterer basisopsætningen, som kun kræver en enkelt multikanals sprøjtepumpe og en modificeret fraktionsopsamler for at gennemskue op til seks kulturer parallelt. Nyttige varianter på det modulære design præsenteres også, der giver mulighed for kontrolleret stimuleringsdynamik, såsom opløste impulser eller farmakokinetiske profiler. Det er vigtigt, at når opløste signaler bevæger sig gennem systemet, forvrænges de på grund af opløst dispersion. Desuden beskrives en metode til måling af opholdstidsfordelingerne (RTD'er) for komponenterne i perfusionsopsætningen med et sporstof ved hjælp af MATLAB. RTD'er er nyttige til at beregne, hvordan opløste signaler forvrænges af strømmen i multirumssystemet. Dette system er meget robust og reproducerbart, så grundlæggende forskere nemt kan vedtage det uden behov for specialiserede fabrikationsfaciliteter.

Introduction

Mange vigtige biologiske processer forekommer i celle- og vævskulturer på tidsskalaen minutter til timer ^1,2,3. Mens nogle af disse fænomener kan observeres og registreres på en automatiseret måde ved hjælp af time-lapse mikroskopi⁴, bioluminescens¹ eller andre metoder, udføres eksperimenter, der involverer indsamling af kultursupernatantprøver til kemisk analyse, ofte manuelt i statiske cellekulturer. Manuel prøveudtagning begrænser gennemførligheden af visse undersøgelser på grund af ulemperne ved hyppige eller efter-timers prøveudtagningstidspunkter. Yderligere mangler ved statiske dyrkningsmetoder omfatter eksperimenter, der involverer kontrollerede, forbigående eksponeringer for kemiske stimuli. I statiske kulturer skal stimuli tilføjes og fjernes manuelt, og stimulusprofiler er begrænset til trinændringer over tid, mens mellemstore ændringer også tilføjer og fjerner andre mediumkomponenter, som kan påvirke celler på en ukontrolleret måde⁵. Fluidiske systemer kan overvinde disse udfordringer, men eksisterende enheder udgør andre udfordringer. Mikrofluidiske enheder leveres med de uoverkommelige omkostninger ved specialudstyr og træning til at producere og bruge, kræver mikroanalytiske metoder til at behandle prøver, og celler er vanskelige at genvinde fra enhederne efter perfusion⁶. Få makrofluidiske systemer er blevet oprettet til de typer eksperimenter, der er beskrevet her 7,8,9,10, og de er bygget af flere brugerdefinerede dele fremstillet internt og kræver flere pumper eller fraktionsopsamlere. Desuden er forfatterne ikke bekendt med andre kommercielt tilgængelige makrofluidiske perfusionscellekultursystemer end omrørte tankbioreaktorer til suspensionskultur, som er nyttige til biofremstilling, men ikke er designet til modellering og undersøgelse af fysiologi.

Forfatterne har tidligere rapporteret om designet af et billigt perfusionsbioreaktorsystem, der næsten udelukkende består af kommercielt tilgængelige dele¹¹. Basisversionen af systemet gør det muligt at opbevare flere kulturer i en brøndplade i en CO₂ -inkubator og kontinuerligt perfunderes med medium fra en sprøjtepumpe, mens spildevandsmediet strømme fra kulturerne automatisk fraktioneres i prøver over tid ved hjælp af en fraktionsopsamler med en brugerdefineret modifikation. Dette system muliggør således automatiseret prøveudtagning af kulturmedium supernatant og kontinuerlig opløst stof input til kulturerne over tid. Systemet er makrofluidisk og modulært og kan let ændres for at imødekomme behovene i nye eksperimentdesign.

Det overordnede mål med den metode, der præsenteres her, er at konstruere, karakterisere og anvende et perfusionscellekultursystem, der muliggør eksperimenter, hvor cellernes sekretion eller absorptionshastigheder af stoffer over tid måles, og / eller celler udsættes for præcise, forbigående opløste signaler. Denne videoartikel forklarer, hvordan man samler basisopsætningen, som er i stand til at gennemsyre op til seks cellekulturer samtidigt ved hjælp af en enkelt sprøjtepumpe og modificeret fraktionsopsamler. To nyttige varianter af basissystemet, der gør brug af yderligere pumper og dele for at muliggøre forsøg, der udsætter celler for forbigående koncentrationssignaler fra opløst stof, herunder korte impulser og farmakokinetiske profiler¹², præsenteres også, vist i figur 1.

Figur 1: Tre variationer af perfusionssystemets design. (Øverst) Det grundlæggende perfusionssystem. (I midten) Perfusionssystemet med en stophane til flere mellemstore kilder. (Nederst) Perfusionssystemet med en omrørt tank for at efterligne et godt blandet fordelingsvolumen. Klik her for at se en større version af denne figur.

På grund af spredning og diffusion i strømmen bliver de opløste signaler forvrænget eller "smurt", når de bevæger sig gennem strømningssystemet. Denne fordrejning kan kvantificeres ved hjælp af opholdstidsfordelinger (FTU)¹³. Denne artikel forklarer, hvordan man udfører sporingseksperimenter på komponenter i perfusionssystemet (figur 2), og indeholder MATLAB-scripts til at generere RTD'er fra målte data. En detaljeret forklaring på denne analyse findes i forfatternes tidligere artikel¹¹. Yderligere MATLAB-scripts passer passende funktioner til RTD'erne og udtrækker fysiske parametre og udfører signalkonvolution ved hjælp af RTD'er for at forudsige, hvordan brugerens input af opløst stofsignal vil formere sig og forvrænge gennem perfusionssystemet¹⁴.

Figur 2: Fordeling af opholdstid. RTD'erne for flowsystemkomponenter, såsom denne slangelængde, måles ved at indtaste en puls af sporstof til systemet og måle, hvordan det "udtværes", når det kommer ud i de opsamlede fraktioner. Dette tal er blevet ændret fra Erickson et ^al.11. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

1. Forbered dele til brøndpladeperfusion

1. Forbered slanger
   1. Skær to længder silikonerør (1,6 mm indvendig diameter) for hver cellekultur, der skal perfunderes. Sørg for, at det stykke, der bruges som opstrømsrør, er langt nok til at nå fra sprøjtepumpen til cellekulturen inde i inkubatoren, og at nedstrømsstykket kan nå fra cellekulturen til den fjerneste udvidede position af fraktionsopsamleren.
   2. Giv hvert stykke slange en unik etiket på begge ender med mærket tape.
2. Forbered propper til brøndpladen
   1. Få en silikoneprop til hver brønd på brøndpladen, der skal perfunderes, med en passende diameter, der passer tæt ind i brøndene med en lufttæt tætning.
   2. Skær overskydende materiale af fra bunden af proppen, så de passer ind i brøndene, mens der er plads inde til luft over det tilsigtede væskeniveau.
   3. Skub to stumpe 18 G nåle gennem hver prop, ind i toppen og ud fra bunden for at tjene som indløb og udløb for strømmen gennem brønden, diametralt modsat hinanden for at maksimere afstanden mellem deres spidser i brønden.
   4. Juster nålenes højder i den tilsluttede brønd, da højden på udløbsnålen bestemmer den stabile højde af væskeniveauet i brønden under perfusion.
      BEMÆRK: Hvis perfusionen startes med udløbsnålen over væskeniveauet, akkumuleres væsken i brønden, indtil niveauet når nålen. Hvis perfusionen startes med udløbsnålen under væskeniveauet, forbliver væskeniveauet stabilt, medmindre luftbobler strømmer ind i brønden, hvilket får væskehøjden til at sænke, indtil den er samme højde som udløbsnålen.
3. Saml yderligere dele
   1. Få en steril sprøjte til hver cellekultur, der skal perfunderes, der er stor nok til at indeholde nok medium til hele perfusionen, plus en ekstra mængde medium til oprindeligt at fylde slangen.
   2. For hver kultur, der skal perfunderes, skal du få en hun-til-modhage og to han-til-modhage Luer-stik samt to kvindelige og to mandlige Luer-hætter.
4. Rengør og steriliser dele
   1. Hvis dele er blevet brugt tidligere, skal du rengøre dem ved at perfusere dem med 0,1 N NaOH efterfulgt af en skylning med deioniseret vand.
   2. Ved autoklavering eller på anden måde skal du sikre steriliteten af alle ovennævnte dele.

2. Laserskåret multihoveddispenseren og fastgør den til en fraktionsopsamler

1. Genskab dispensermodellen med flere hoveder fra figur 3 i et computerstøttet designprogram, eller download den medfølgende DXF-modelfil (supplerende fil 1).
2. Brug en laserskærer til at skære designet fra en 1/8 i akrylplade.
3. Fjern de tre skruer, der fastgør dispenseringshovedet til fraktionsopsamlerens bevægelige bund.
4. Juster de tre mindste huller i flerhoveddispenseren med skruehullerne i den bevægelige base, og skru skruerne ind igen gennem hullerne for at fastgøre.
5. Juster tætheden af de tre skruer for at vinkle multihoveddispenseren op og ned, indtil rækken af dispenserhuller er justeret med opsamlingsrørene under den.
6. Placer forsigtigt 300 μL pipettespidser gennem de ønskede huller for at fungere som dispenseringsspidser.
   BEMÆRK: Fraktionsopsamleren kan bruges uden flerhoveddispenseren til at gennemsyre en enkeltcellekultur.

3. Mål komponent-RTD'er og udfør signalkonvolution

1. Opsæt pumper og sprøjter til sporstofpuls som vist i figur 2.
   1. Få to enkeltkanals- eller multikanalssprøjtepumper.
   2. Vælg en baggrundsløsning til at repræsentere det medium, der skal bruges i flowsystemet under cellekultureksperimenter. Sørg for, at baggrundsløsningen har lignende masseoverførselsegenskaber som mediet. I mange tilfælde er deioniseret vand et passende valg.
   3. Vælg et sporstofstof til at repræsentere det opløste stof, der vil være af interesse under cellekultureksperimenter. Sørg for, at sporstoffet har lignende masseoverførselsegenskaber som det opløste stof af interesse, og dets koncentration skal kunne måles. I mange tilfælde er madfarvestof et passende valg.
   4. Opløs sporstoffet i baggrundsopløsningen for at fremstille sporstofopløsningen.
   5. Fyld en sprøjte med en baggrundsopløsning og læg den i en sprøjtepumpe. Fyld en anden sprøjte med sporstofopløsning og læg den i den anden sprøjtepumpe.
   6. Tilslut begge sprøjter til to af de tre porte på en firevejs stophane ved hjælp af Luer-stik.
   7. Luk stophanen til baggrundsopløsningen, og pump sporstofopløsningen ind i stophanen, indtil den begynder at dryppe ud af den åbne port. Stop pumpen, og juster ikke sprøjten yderligere.
      BEMÆRK: Det er vigtigt, at sprøjtepumpens bevægelige stang skubbes op mod sprøjtestemplerne, før de tidsindstillede dele af eksperimentet begynder. Dette gør det muligt for strømmen at begynde med det samme, når pumpen startes. Ellers kan pumpen startes, men strømmen begynder faktisk ikke, før bevægelsesstangen indhenter stempelpositionen.
   8. Luk stophanen til sporstofopløsningen, og pump baggrundsopløsningen ind i stophanen, indtil al resterende sporstofopløsning er skyllet ud af den åbne port. Stop pumpen, og juster ikke sprøjten yderligere.
2. Konfigurer flowsystemkomponenten af interesse og brøkopsamleren
   1. Konfigurer den ønskede flowsystemkomponent til FTU-analyse. Sørg for, at den komponent, der skal måles, ender med et stykke nedstrømsrør af passende længde og fleksibilitet til at nå fraktionsopsamleren under drift.
   2. Indsæt enden af nedstrømsrøret i en pipettespidsdispenser i flerhoveddispenseren, så den er tæt forbundet.
   3. Fastgør den åbne port på firevejs stophanen til indløbet til den komponent, der skal måles. Pump baggrundsopløsning gennem komponenten, indtil den er helt fyldt, som den ville være under et cellekultureksperiment, og den begynder at dryppe ud af fraktionsopsamlerens dispenseringsspids. Stop pumpen.
3. Injicer sporstofpuls, saml fraktioner og mål sporstof
   1. Indstil pumpen til sporstofopløsningen til den ønskede strømningshastighed. Luk stophanen til baggrundsopløsningen, og start strømmen af sporstofopløsningen. På samme tid skal du starte fraktionsopsamleren.
   2. Fortsæt strømmen af sporstofopløsning i en kort periode for at tilnærme en impulsindgang af sporstoffet. En pulsvarighed på 10 minutter viste sig at fungere godt for RTD'er ved en strømningshastighed på 1 ml/t.
      BEMÆRK: Hvis sporstofpulsen er for kort, kommer der ikke nok sporstof ind i strømmen til at være målbar. Hvis pulsen er for lang, vil den ikke længere nærme sig en impuls og vil ændre FTU'ens form.
   3. Ved afslutningen af sporstofopløsningens pulsperiode skal du stoppe sporstofopløsningspumpen. Luk hurtigt stophanen til sporstofopløsningen, og start strømmen af baggrundsopløsningen med samme strømningshastighed.
   4. Lad baggrundsopløsningen flyde og fraktioner opsamles, indtil hele sporstoffet har passeret gennem systemet og ind i de opsamlede fraktioner.
   5. Stop systemet og mål sporstofkoncentrationen i fraktionerne. Medtag kun fraktioner, der blev dispenseret fuldstændigt. Hvis indsamlingen stoppes halvvejs gennem indsamlingen af en brøk, må denne brøk ikke medtages.
4. Beregn opholdstidsfordelingen (RTD) ud fra målte data i MATLAB
   BEMÆRK: En skriftlig forklaring af analysen udført af dette MATLAB-script kan findes i forfatternes tidligere publikation¹¹, og diskussioner af teorien er bredt tilgængelige i litteratur¹³.
   1. Fremstil en .xlsx fil, der indeholder koncentrationsdataene i formatet af det example_tracer_data.xlsx regneark, der findes i supplerende fil 2. Angiv koncentrationsværdierne for sporstoffet i fraktionerne (eventuelle enheder) i kronologisk rækkefølge fra venstre mod højre i række 2. Indtast den tid, der er gået fra pulsens start til slutningen af den sidste fraktion i celle A5, og indtast længden af sporstofimpulsen i minutter i celle A8.
   2. Gem .xlsx-filen i MATLAB-mappen.
   3. Åbn scriptet RTD_From_Data fra Supplerende fil 3 i MATLAB-editoren.
   4. Erstat navnet på .xlsx-filen i parentesen i den første linje i afsnittet Indlæs data i scriptet med navnet på den nye .xlsx-datafil ved at følge instruktionerne i scriptfilen. Kør scriptet.
   5. Sørg for, at scriptet udfører RTD-analyse¹³, der producerer et plot af FTU og returnerer værdien af det numeriske integral over RTD svarende til 1. Find tidsvektoren (t) og den tilknyttede RTD-værdivektor (Et), der er gemt af scriptet i MATLAB-mappen.
5. Tilpasse en modelfunktion til FTU'en i MATLAB
   1. Åbn scriptet Fit_RTD_Function i MATLAB-editoren fra Supplementary File 4.
   2. Vælg en af de tre kommenterede modelfunktioner, der passer til RTD: den aksiale dispersionsmodel¹³, der passer til RTD'er til laminær strømning i cylindriske rør; CSTR model¹³, der passer til velomrørte tanke; og n-CSTR model¹⁵, som omtrent passer til større brøndplader. Hvis du vil have plads til en anden model, der ikke er inkluderet her, skal du føje den til scriptet i samme format.
   3. Fjern kommentarerne i den del af scriptet, der indeholder den model, der er valgt til montering.
   4. Skift værdierne for de indledende gæt for parametrene til dem, der passer til FTU.
   5. Kør scriptet for at oprette et plot af tilpasningsfunktionen, der er overlejret på RTD-dataene, og for at udskrive tilpasningsparameterværdierne for funktionen. Hvis pasformen er meget dårlig, eller der opstår fejl, skal du ændre parameterens indledende gæt og køre scriptet igen.
6. Udfør signalkonvolution i MATLAB
   1. Vælg enten et signal og en RTD eller to RTD'er for at konvolvere.
   2. Åbn scriptet Signal_Convolution fra Supplemental File 5 i MATLAB-editoren.
   3. For hvert af de to signaler, der skal koncentreres (dvs. et signal og en RTD eller to RTD'er), skal du definere en vektor af jævnt fordelte tidspunkter i de ønskede enheder og en tilsvarende vektor af signalværdier på disse tidspunkter.
      BEMÆRK: Vektorerne for de to signaler skal have det samme antal elementer og de samme størrelsestidstrin. Derfor er det nyttigt at have RTD'en som en kontinuerlig funktion, der kan udtages for et vilkårligt antal punkter ved ethvert tidsinterval.
   4. Indtast de to signaler i MATLAB, og kør scriptet for at opnå tids- og signalvektorerne for udgangssignalet.

4. Opsæt det grundlæggende perfusionssystem med celler i en brøndplade

1. Forbered brøndpladen
   1. Sørg for, at brøndpladekulturen har den passende mellemdybde til perfusionseksperimentet. Udfør eventuelle endelige mediumændringer, stimuleringer eller andre trin efter ønske, inden du begynder perfusion. Hvis suspensionsceller perfunderes, centrifugeres pladen for at sikre, at de er på bunden.
   2. Under sterile forhold indsættes propperne med nåle i brøndpladekulturerne med nålene trukket op. Når proppen er på plads, sænkes nålene til den ønskede højde for perfusion, da udløbsnålens højde bestemmer det stabile væskeniveau.
   3. Dæk nålene med mandlige Luer-hætter, og opbevar hele brøndpladen i en inkubator indtil brug.
2. Forbered sprøjterne og opstrøms slanger
   1. Under sterile forhold fyldes en sprøjte for hver kultur, der skal perfunderes med nok medium til den ønskede varighed af perfusionen, plus nok ekstra medium til at fylde opstrømsrøret.
   2. Fastgør opstrømsrøret til sprøjten ved hjælp af et hun-til-modhage Luer-stik. I den anden ende af røret skal du indsætte et han-til-modhage Luer-stik.
   3. Dispenser medium fra sprøjten, indtil opstrømsrøret er helt fyldt med medium.
   4. Dæk den åbne ende af røret med en kvindelig Luer-hætte.
      BEMÆRK: Alle replikatsprøjter skal have nøjagtig samme volumen på dette tidspunkt. Hvis deres volumener ikke er ens, vil deres stempler være i forskellige positioner, og de passer ikke alle godt ind i en enkelt multikanals sprøjtepumpe.
3. Under sterile forhold indsættes et han-til-modhage Luer-stik i den ene ende af nedstrømsrøret, og dæk det med en kvindelig Luer-hætte.
4. Bring forsigtigt alle forberedte slanger, sprøjter og brøndpladen til inkubatoren, der skal bruges til perfusion.
5. Placer sprøjtepumpen og fraktionsopsamleren på de ønskede steder i nærheden af inkubatoren. Placer sprøjtepumpen oven på eller i nærheden af inkubatoren, og placer fraktionsopsamleren ved siden af inkubatoren nær porten.
6. Bundt de afdækkede ender af alle opstrøms og nedstrøms rør sammen, og skub dem fra ydersiden af inkubatoren til indersiden gennem porten.
7. Læg sprøjterne i sprøjtepumpen, og indsæt de åbne ender af nedstrømsrørene i dispenseringspipettespidserne på fraktionsopsamlerens flerhoveddispenser.
8. Inde i inkubatoren skal du trække så meget slap af opstrømsrørene som muligt ind i inkubatoren for at maksimere længden af slangen, hvorigennem det flydende medium kan modtage varme og CO2 fra inkubatorluften. Mens du holder disse på plads, skal du trække nedstrømsrørene ud af inkubatoren, lige nok til at de er i stand til at nå det fjerneste forlængede punkt på fraktionsopsamleren, mens du stadig holder de lukkede ender inde i inkubatoren.
9. For hver tilsluttet brønd skal du hurtigt lukke nålene og opstrøms og nedstrøms rørene for den brønd og fastgøre dem sammen med deres Luer-stik.
10. Når alle dele er tilsluttet, skal du kortvarigt køre sprøjtepumpen med en relativt høj hastighed for at sikre, at alle strømme flyder korrekt.
11. På dette tidspunkt, hvis det ønskes at starte eksperimentet med nedstrømsrørene fulde af mediet, skal du fortsætte med at køre pumpen, indtil alle er fyldt. Ellers skal du stoppe pumpen.
12. Indstil sprøjtepumpens strømningshastighed og frekvensen af fraktionsopsamling, og start begge maskiner samtidigt for at starte eksperimentet. Saml fraktioner i den ønskede eksperimentvarighed.

5. Opsæt perfusionssystemet med en stophane til flere mellemstore kilder

1. Udfør alle undertrin i trin 4.1 ovenfor.
2. Forbered de to medier, der skal bruges i perfusionen, og mærk det medium, der først udleveres som 1, og det andet som medium 2.
3. For hver kultur, der skal perfunderes, skal du fylde en sprøjte med nok medium 1 i løbet af dens dispensation plus tilstrækkeligt volumen til oprindeligt at fylde perfusionssystemet. Fyld en anden sprøjte med nok medium 2 i løbet af dens dispensation.
4. Tilslut begge sprøjter til to af de tre porte på en firevejs stophane.
   BEMÆRK: En slangelængde for at forbinde sprøjterne til stophanerne kan være påkrævet.
5. Stophanen og sprøjterne klargøres på samme måde som trin 3.1.7-3.1.8 ovenfor ved at lukke stophanen til medium 1 og dispensere medium 2 i stophanen, indtil den bare begynder at dryppe ud af den åbne port.
6. Luk stophanen til medium 2, og hæld medium 1 i stophanen, indtil al resterende medium 2 er skyllet ud af den åbne port.
7. Fastgør opstrømsrøret til den åbne stophaneport ved hjælp af et hun-til-modhage Luer-stik. I den anden ende af røret skal du indsætte et han-til-modhage Luer-stik.
8. Dispenser medium 1 fra sprøjten, indtil opstrømsrøret er helt fyldt med medium.
9. Fortsæt med trin 4.3-4.11 ovenfor, hvor begge sprøjter fyldes i separate sprøjtepumper, og kun dispenseringsmedium 1.
10. Indstil sprøjtepumpens strømningshastighed for medium 1 og frekvensen af fraktionsopsamling, og start begge maskiner samtidigt for at starte eksperimentet.
11. Når mediumkilden skal skiftes, skal du hurtigt stoppe sprøjtepumpen til medium 1, dreje stophanen lukket til medium 1 og starte sprøjtepumpen til medium 2. Hvis det ønskes senere, skal du skifte kilden tilbage til medium 1 på en lignende måde.
12. Saml fraktioner i den ønskede eksperimentvarighed.

6. Opsæt perfusionssystemet med en omrørt tank for at efterligne farmakokinetik

1. Få farmakokinetiske data for lægemidlet af interesse, og sørg for, at det består af en koncentrationstop efterfulgt af et eksponentielt henfald.
2. Når du har indstillet toppen til tid 0 og fjernet datapunkter før toppen, skal du bruge scriptet Stirred_Tank_Fit (Supplerende fil 6) til at tilpasse RTD-ligningen for omrørte tanke til dataene. Input v (den ønskede perfusionsstrømningshastighed) og de data, der skal passes som et par vektorer direkte ind i scriptet sammen med t og C for henholdsvis tidsværdier og koncentrationsværdier. Kør scriptet for at udskrive parameteren V, som er det krævede omrørte tankvolumen.
3. Planlæg et layout for perfusionssystemet til at omfatte to sprøjtepumper og en pladeryster opstrøms for inkubatoren.
4. Mål RTD'erne for perfusionssystemkomponenterne ud over stophanen, og udfør signalkonvolution af RTD'erne med forskellige lægemiddelpulsvarigheder og -koncentrationer for at finde en passende farmakokinetisk profil. Brug RTD-ligningen for omrørt tank i denne beregning.
5. Fortsæt med trin 5.1-5.8 ovenfor.
6. Brug en ekstra brøndplade af passende størrelse som omrørt tank til opsætningen. Hver brønd kan tjene som en omrørt tank til en perfunderet kultur. Fyld brønden med det krævede volumen medium, V, og sæt brønden med nålene, der oprindeligt trækkes op, derefter skubbes til bunden af brønden, og dæk nålene.
7. Læg sprøjterne i sprøjtepumperne, og tilslut hurtigt slangen fra sprøjterne til de omrørte tankes indløbsnåle med låg. Tilslut derefter cellekulturen opstrøms rørindløb til udløbsnålene i de omrørte tanke.
8. Fortsæt med trin 5.9-5.10.
9. På det ønskede tidspunkt skal du skifte til dispenseringsmedium 2 indeholdende lægemidlet som beskrevet i trin 5.11. Skift tilbage til medium 1, når lægemiddelinfusionen er afsluttet.
10. Fortsæt med trin 5.12.

Figur 3: Multihoveddispenseren. Design til den laserskårne multihoveddispenser. Dette tal er blevet ændret fra Erickson et ^al.11. Klik her for at se en større version af denne figur.

Representative Results

Perfusionssystemet med flere mediumkilder fra afsnit 5 i protokollen blev brugt til at måle ekspressionsdynamikken i et reportergen drevet af den nukleare faktor kappa-lyskædeforstærker af aktiverede B-celler (NF-κB) transkriptionsfaktor i human embryonale nyre 293 (HEK293) celler som reaktion på en 1,5 timers puls af tumornekrosefaktor alfa (TNF-α). HEK293-celler blev stabilt transduceret ved hjælp af lentivirale vektorer med en genkonstruktion indeholdende Gaussia luciferase (GLuc), drevet af en promotor kaldet NFKB indeholdende NF-κB-responselementet for at skabe NFKB-GLuc HEK293-celler, som blev sorteret via fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) for at isolere transducerede celler. Sorterede celler blev kryopræserveret indtil brug.

For hver perfunderet kultur omfattede perfusionsopsætningen en opstrøms sektion på 1 m rør, der førte til en tilsluttet 48-brøndplade indeholdende cellerne, efterfulgt af 1 m nedstrømsrør, der fører til flerhovedfraktionsopsamleren, med en strømningshastighed på 0,5 ml / h (0,0083 ml / min). RTD'erne for 1 m slangen alene og for den fulde opsætning (1 m rør + 48-brøndplade + 1 m rør) blev målt ved hjælp af en strømningshastighed på 0,5 ml / h med en 20 minutters puls af sporstof. Baggrundsopløsningen var deioniseret vand med en sporstofopløsning af blåt madfarvestof fortyndet i deioniseret vand, og fraktioner blev opsamlet med en hastighed på 1 fraktion / t ved hjælp af multihoveddispenseren. Sporstofkoncentrationer i 100 μL prøver af fraktionerne blev målt i en pladelæser via absorbans ved 628 nm.

Sporkoncentrationsdataene blev behandlet i MATLAB for at producere RTD'er til begge opsætninger. For det første blev RTD'erne for de to opsætninger beregnet ud fra dataene ved hjælp af scriptet RTD_from_Data.m. RTD-datapunkterne for 1 m-røret og den fulde opsætning er vist i figur 4.

Figur 4: Fordeling af opholdstid. (Venstre) RTD for et 1 m rør med en strømningshastighed på 0,5 ml/t (0,0083 ml/min). (Højre) RTD for fuld perfusionsopsætning (1 m rør + 48-brøndplade + 1 m rør) ved en strømningshastighed på 0,5 ml / t. Klik her for at se en større version af denne figur.

FTU'en for slanger alene passer godt til den aksiale dispersionsfunktion, som kan forventes baseret på eksisterende litteratur¹³. Flere stykker rør i serie passer også godt til en enkelt aksial dispersionsmodel, og tilføjelse af 48-brøndpladen in-line forårsager ubetydelig afvigelse fra denne model, så 1 m røret alene og 1 m rør + 48-brøndplade + 1 m røropsætning forventedes hver at være godt egnet af en aksial dispersionsmodel. Det er almindeligt, at der opstår dårlige modeltilpasninger, når de første gæt for modelparametrene er for langt fra deres faktiske værdier. For at demonstrere dette var den aksiale dispersionsmodel for det første tilpasset 1 m rørdataene ved hjælp af Fit_RTD_Function.m-scriptet ved hjælp af Pe = 10 og tau = 30 min som de første gæt for funktionsparametrene. Figur 5 viser, at disse gæt resulterede i dårligt tilpassede modeller, plottet sammen med FTU-dataene. Gættene blev ændret til Pe = 10 og tau = 300 min, hvilket resulterede i, at den gode model passer vist i figur 5, da tau skulle være omtrent lig med perfusionssystemets volumen divideret med dets volumetriske strømningshastighed. Tilpasningsparametrene for 1 m-røret er Pe = 154,3, tau = 317,2 min, mens parametrene for hele systemet er Pe = 396,5, tau = 596,5 min.

Figur 5: Eksempler på god og dårlig model passer til en FTU. En aksial dispersionsmodel var egnet til RTD-dataene for et 1 m rør med en strømningshastighed på 0,5 ml / h (0,0083 ml / min). (Venstre) De første gæt for modelparametrene, der blev indtastet i MATLAB-scriptet, var for langt fra deres sande værdier, hvilket fik scriptet til at returnere en dårlig modeltilpasning. (Højre) Bedre parameterværdier blev indtastet i scriptet, hvilket resulterede i en god modeltilpasning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Signalkonvolution blev udført ved hjælp af disse fit RTD-funktioner i Signal_Convolution scriptet for at forudsige, hvordan en 1,5 timers puls af medium indeholdende 10 ng / ml TNF-α ved indløbet til opstrømsrøret ville sprede sig gennem systemet. Indgangssignalet blev først sammenblandet med 1 m slange RTD for at bestemme, hvilken TNF-α signal ville komme ind i brøndpladen. Indgangssignalet blev også sammenblandet med RTD'en for 1 m røret + 48-brøndpladen + 1 m rør for at bestemme, hvad TNF-α-signalet ville være ved systemets udløb i de opsamlede fraktioner, hvor det vises sammen med det tilsvarende GLuc-respons fra cellerne. Figur 6 viser indgangs-TNF- α pulssignalet vises sammen med de forudsagte signaler ved brøndindløbet og ved systemudgangen.

Figur 6: Forudsigelse af TNF-α koncentrationssignaler i perfusionssystemet. TNF-α-holdige medium blev infunderet i perfusionssystemet ved 10 ng / ml i de første 90 minutters drift, repræsenteret af det blå rektangulære signal. (Venstre) Ved at dreje indgangssignalet med den passende aksiale dispersionsmodel af 1 m rør RTD blev TNF-α koncentrationssignalet ved indløbet til 48-brøndpladen forudsagt. (Højre) På samme måde blev TNF-α-signalet ved systemets udløb forudsagt ved hjælp af RTD-modellen for hele systemet. Klik her for at se en større version af denne figur.

NFKB-GLuc HEK293-celler blev optøet og belagt i en 48-brøndplade ved 1 x 10⁴ celler / brønd i 0,4 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og blev inkuberet i 1 dag ved 37 ° C med 5% CO₂, hvorefter trinene i afsnit 5 i protokollen ovenfor blev fulgt for at oprette perfusionssystemet med en stophane til flere mellemstore kilder. Fire vandløb blev oprettet for at gennemstå fire brønde. En multikanals sprøjtepumpe blev fyldt med fire fulde 60 ml sprøjter indeholdende DMEM som medium 1. En anden sprøjtepumpe blev fyldt med 5 ml sprøjter indeholdende medium 2, hvoraf to indeholdt almindelig DMEM som kontrol, og to indeholdende DMEM med 10 ng / ml TNF-α som stimulus. Ved forsøgets start blev de 5 ml sprøjter indeholdende TNF-α eller kontrolmediet dispenseret ved 0,5 ml/t i 1,5 time, hvorefter stophanerne blev skiftet, og de 60 ml sprøjter indeholdende DMEM blev dispenseret i de næste 40 timer. Ved 24 timer og i slutningen af perfusionen blev fraktionerne fra de fire strømme, der blev dispenseret i mikrocentrifugerør, mærket og frosset ved -80 ° C, og fraktionsopsamleren blev nulstillet.

Efter perfusionen blev alle prøver optøet, og deres GLuc-koncentrationer blev målt ved hjælp af et bioluminescensassay, der tidligere er beskrevet^11,16. Luminescensværdierne blev konverteret til luminescens/h-hastigheder ved at dividere luminescensen af hver fraktionsprøve med tidsvarigheden af den pågældende fraktion og blev plottet som en tidsserie for hver af de fire strømme. Tidspunktet for hver GLuc-måling var midtpunktet for det tidsinterval, hvor denne fraktion blev opsamlet, minus den gennemsnitlige opholdstid (tau = 317 min) for perfusionssystemets nedstrømsrør. TNF-α-signalet, der forudsagdes at være indeholdt i fraktionerne, blev også forskudt i tid af den gennemsnitlige opholdstid for nedstrømsrøret og blev overlejret på GLuc-dataene, hvilket afslørede stimulus-responsdynamikken NF-κB-drevet genekspression, vist i figur 7.

Figur 7: Stimulus-respons dynamik målt ved hjælp af perfusionssystemet. Perfusionssystemet med to mediumkilder blev brugt til forbigående at udsætte to cellekulturer for en puls af TNF-α med to ueksponerede kulturer som kontroller. HEK293-cellerne blev konstrueret til at udskille GLuc drevet af en promotor indeholdende NF-κB-responselementet, som blev opsamlet i spildevandsfraktionerne. Eksperimentet afslører en dramatisk ekspressionsforøgelse drevet af NF-κB efter TNF-α eksponering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tilstedeværelsen af akkumuleret GLuc i kulturerne i begyndelsen af perfusionen forårsagede det tilsyneladende fald i GLuc-signalet fra den første til den anden fraktion i alle fire kurver. Denne almindelige artefakt kan undgås i perfusionssystemet ved at ændre mediet i kulturerne umiddelbart før begyndelsen af perfusioner. De to kontrolkulturer, der ikke modtog TNF-α opretholdt en lav GLuc-sekretionshastighed, der gradvist steg i løbet af eksperimentets varighed. Dette resultat kan afspejle væksten i cellepopulationen. De stimulerede kulturer havde oprindeligt den samme GLuc-sekretionshastighed som kontrollerne og øgede derefter dramatisk sekretionen, da NF-κB-drevet ekspression aktiveres som reaktion på en TNF-α puls. GLuc-sekretion topper ca. 9 timer efter den første ankomst af TNF-α, hvorefter den falder med eksponentielt henfald.

Supplerende fil 1: CAD-fil: Multi-head_Dispenser.DFX: Denne fil indeholder modellen til multi-head dispenser, som kan laserskæres og bruges til at modificere fraktionsopsamlere. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: example_tracer_data.xlsx. Indeholder eksempel på sporingseksperimentdata, der skal læses af MATLAB-scriptet RTD_from_Data. Kan også bruges som skabelon til nye data. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 3: MATLAB-fil: RTD_from_Data.m. Dette script læser sporingseksperimentdata fra en .xlsx-fil og returnerer t- og Et-vektorer, der repræsenterer RTD'en. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 4: MATLAB-fil: Fit_RTD_Function.m. Dette script indlæser RTD-vektorer fra scriptet RTD_from_Data og returnerer en passende model til RTD'en. Typen af model vælges af brugeren. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 5: MATLAB-fil: Signal_Convolution.m. Dette script tager et brugerdefineret opløst signal og en RTD som indgange og forudsiger, hvordan signalet vil blive ændret efter at have passeret gennem flowsystemet med den RTD. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 6: MATLAB-fil: Stirred_Tank_Fit.m. Dette script tilpasser en CSTR RTD-kurve til brugerens farmakokinetiske datainput og returnerer det tankvolumen, der kræves for at producere RTD for den givne strømningshastighed. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Dette arbejde beskriver samlingen og driften af et perfusionscellekultursystem med flere mediumkilder demonstreret med et specifikt eksempel, hvor dynamikken i NF-κB-drevet genekspression som reaktion på en forbigående puls af TNF-α blev målt. RTD'erne for perfusionssystemkomponenterne blev målt og modelleret, og signalkonvolution blev brugt til at forudsige både cellernes eksponering for TNF-α pulsen og TNF-α fordelingen i de opsamlede spildevandsmediumfraktioner. Cellerne blev udsat for pulsen, og fraktioner blev opsamlet i 40 timer, hvorefter GLuc blev målt i fraktionerne og plottet sammen med det forudsagte TNF-α signal for at afsløre stimuleringsresponsdynamikken.

Denne perfusionsmetode er ikke uden mangler. Især bærer systemet sterilitetsrisiko på grund af det kritiske korte trin, hvor slangen er forbundet til brøndpladen efter opsætning i inkubatoren. Efter forfatternes erfaring er forurening ret sjælden; Ikke desto mindre kan forureningsrisikoen mindskes på følgende måder. Den første er at udføre alle cellehåndteringsprocedurer og sterile forbindelser i et biosikkerhedsskab. En yderligere forholdsregel, der kan overvejes for at forbedre steriliteten, er inkluderingen af et 0,22 μm sprøjtefilter in-line ved cellekulturernes indløb. Brugen af steril filtrering vil fange bakterier eller større mikroorganismer, der er til stede i mediet, før de kommer ind i cellekulturen, selvom det øger trykkravene for at drive flow og kan tilstoppe på grund af tilsmudsning af membranen. De udgående prøver indsamles også i åbne miljøer med risiko for forurening. Indsamling af prøver i et kabinetsystem, ideelt med luftfiltrering, til fraktioneringsmodulet ville eliminere dette problem i de fremtidige systembygninger.

Desuden forvrænges signaler, der udskilles af celler, i henhold til RTD for nedstrømsrøret, før de fraktioneres og måles. Således er målte signaler udtværede versioner af dem, der udskilles af celler. Teoretisk set kan denne udtværing fortrydes ved at udføre dekonvolution på det målte signal for at fjerne effekten af downstream RTD¹⁴, men det er vanskeligt at anvende denne numeriske teknik med succes på ikke-ideelle data, da signalstøj bliver stærkt forstærket. Imidlertid udfolder mange biologiske dynamikker af interesse sig på tidsskalaen for timer til titusinder af timer og påvirkes således meget lidt af smørevirkningerne af slanger, der forskydes i tid, men ændres lidt i form. Den her viste FTU-målemetode kan også forbedres ved at anvende kortere sporstofimpulser og ved hjælp af baggrundsopløsninger og sporstofstoffer, der svarer til dem, der vil blive anvendt i cellekulturforsøg. De pulstider, der foreslås her, har imidlertid vist sig at give identiske FTU'er til alle kortere pulstider og er derfor velegnede til FTU-målinger, men efterhånden som pulstiderne øges, ændres FTU'erne mere markant og bør derfor ikke anvendes. Forfatterne har tidligere fundet ud af, at både madfarvestof og GLuc har meget lignende RTD'er til hinanden i både vand og kulturmedium¹¹, så det er usandsynligt, at den molekylære art vil ændre RTD meget. Endelig blev der ikke observeret nogen forskel i RTD'er for farvestof i fødevarer i vand målt ved 20 °C vs. 37 °C eller i lige rør vs. stærkt oprullede rør¹¹. Disse data og FTU-data for en række perfusionssystemgeometrier og strømningshastigheder findes i forfatternes tidligere publikation¹¹ sammen med en detaljeret forklaring af de operationer, der udføres af RTD-analysescriptet i dette papir. Yderligere detaljer om FTU-analyseteori¹³ og eksempler på anvendelser af FTU'er på bioreaktorsystemer 17,18,19,20,21 findes i de angivne referencer.

Denne alsidige metode kan bruges til at måle sekretions- eller absorptionshastighederne for opløselige stoffer i cellekulturer, og forbigående opløste signaler kan leveres til kulturerne ved at skifte opstrøms mediumkilder. Enkle signaler såsom opløste impulser eller trinskift kan leveres ved blot at skifte indløbsventilen. Farmakokinetiske signaler kan produceres ved at placere en omrørt tank med det passende væskevolumen in-line opstrøms for kulturen og levere en opløst stofpuls gennem den. Andre signaler kan oprettes ved at anvende forskellige kombinationer af impulser, trinændringer og komponenter med nye RTD'er for at forvrænge pulserne i ønskede former. Eksisterende statiske cellekulturmetoder er ikke i stand til kontinuerligt at indsamle mediumprøver på en automatiseret måde og kan ikke bruges til at udsætte celler for jævnt varierende opløste signaler. Mikrofluidiske systemer er dyre og kræver ekspertise, og der findes ingen kommercielt tilgængelige makrofluidiske systemer til denne klasse af eksperimenter. Det billige, enkle system kan vedtages af laboratorier til at studere naturlig celleadfærd, impulsresponser, virkningerne af forskellige forbigående opløste profiler, der kan efterligne lægemidler eller endogent opløst signaldynamik og kan omkonfigureres for at imødekomme behovene i nye eksperimenter. Fremtidige anvendelser af denne teknik og dem, der i øjeblikket er i gang, omfatter: måling af sekretionshastighedsdynamikken for cytokiner og exosomer fra en ex vivo-celleterapi ; vurdering af effekten af døgnrytmetid på cellulær respons på lægemidler; måling af væksthastighed og metabolisme af bakterielle biofilm; fremstilling af dosis-responskurver for adeno-associerede virusvektorer (AAV) in vitro måling af den dynamiske produktionshastighed for lentivirale vektorer fra producentceller og inkorporering af farmakokinetiske kemoterapi lægemiddelprofiler i personlige medicinbiopsier til præcisionskræftbehandling.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 Gauge 1 1/2- in Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines	Grainger	5FVK2
293T Cells	ATCC	CRL-3216	HEK 293T cells used in the Representative Results experiment.
96-Well Clear Bottom Plates, Corning	VWR	89091-010	Plates for measuring dye concentrations in RTD experiments and GLuc in representative results experiment.
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 5 mL	Fisher Scientific	14-829-45
BioFrac Fraction Collector	Bio-Rad	7410002	Fraction collector that can be used for a single stream, or modified using our method to enable collection from multiple streams.
Clear High-Strength UV-Resistant Acrylic 12" x 12" x 1/8"	McMaster-Carr	4615T93	This sheet is cut using a laser cutter according to the DXF file in the supplemental materials to produce the multi-head dispenser that can be attached to the BioFrac fraction collector.
Coelenterazine native	NanoLight Technology	303	Substrate used in Gaussia luciferase bioluminescence assay in representative results.
Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, size 48 wells, polystyrene plate, flat bottom wells	Millipore Sigma	CLS3548	Used to grow and perfuse 293T cells in representative results.
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells	Fisher Scientific	720081	Can be plugged and used as a stirred tank to produce pharmacokinetic profiles in perfusion. Can also contain cells for perfusion.
DMEM, high glucose	ThermoFisher Scientific	11965126
Epilog Zing 24 Laser	Cutting Edge Systems	Epilog Zing 24	Laser cutter used to produce multi-head dispenser from acrylic sheet. Other laser cutters may be used.
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 20 mL	Fisher Scientific	14-955-460
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 60 mL	Fisher Scientific	14-955-461
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-129	Microcentrifuge tubes for collecting fractions.
Fisherbrand Round Bottom Disposable Borosilicate Glass Tubes with Plain End	Fisher Scientific	14-961-26	Glass tubes for collecting fractions.
Fisherbrand SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-Filtered	Fisher Scientific	2707410	300 ul pipette tips that best fit the multi-head dispenser and tubing to act as dispensing tips.
Gibco DPBS, powder, no calcium, no magnesium	Fisher Scientific	21600010	Phosphate buffered saline.
Labline 4625 Titer Shaker	Marshall Scientific	Labline 4625 Titer Shaker	Orbital shaker used to keep stirred tanks mixed.
Masterflex Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile; 10/PK	Cole-Parmer	EW-30600-04	Used to join multiple inlet streams for RTD experiments and cell culture experiments.
Masterflex Fitting, Polycarbonate, Straight, Female Luer x Cap; 25/PK	Masterflex	UX-45501-28
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hosebarb Adapters, 1/16"	Cole-Parmer	EW-45508-00
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Hosebarb Adapter, 1/16" ID	Cole-Parmer	EW-45518-00
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Plug Adapter; 25/PK	Masterflex	EW-30800-30
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 14; 25 ft	Masterflex	EW-96410-14
MATLAB	MathWorks	R2019b	Version R2019b. Newer versions may also be used. Some older versions may work.
NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump	New Era Pump Systems	NE-1600
Rack Set F1	Bio-Rad	7410010	Racks to hold collecting tubes in the fraction collector.
Recombinant Human TNF-alpha (HEK293-expressed) Protein, CF	Bio-Techne	10291-TA-020	Cytokine used to stimulate 293T cells in representative results.
Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 00, Bottom 10.5mm	Saint Gobain	DX263015-50	Fits 48-well plates.
Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 4 Bottom 21mm	Saint Gobain	DX263027-10	Fits 12-well plates.
Sodium Hydroxide, 10.0 N Aqueous Solution APHA; 1 L	Spectrum Chemicals	S-395-1LT
SolidWorks	Dassault Systems	SolidWorks	CAD software used to create the multi-head dispenser DXF file.
Varioskan LUX multimode microplate reader	ThermoFisher Scientific	VL0000D0	Plate reader.
Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue	Michaels	10404779	Blue food dye containing Brilliant Blue FCF, used as a tracer in RTD experiments. Absorbance spectrum peaks at 628 nm.