Summary
Denne artikkelen presenterer en metode for å konstruere og drive et billig, flerkanals perfusjonscellekultursystem for å måle dynamikken i sekresjon og absorpsjonshastigheter av løsemidler i cellulære prosesser. Systemet kan også utsette celler for dynamiske stimulusprofiler.
Abstract
Visse celle- og vevsfunksjoner opererer innenfor den dynamiske tidsskalaen minutter til timer som er dårlig løst av konvensjonelle kultursystemer. Dette arbeidet har utviklet et billig perfusjonsbioreaktorsystem som gjør at kulturmediet kontinuerlig kan perfunderes i en cellekulturmodul og fraksjoneres i en nedstrømsmodul for å måle dynamikk på denne skalaen. Systemet er konstruert nesten utelukkende av kommersielt tilgjengelige deler og kan parallelliseres for å utføre uavhengige eksperimenter i konvensjonelle flerbrønnscellekulturplater samtidig. Denne videoartikkelen viser hvordan du monterer baseoppsettet, som bare krever en enkelt flerkanals sprøytepumpe og en modifisert fraksjonssamler for å perfusere opptil seks kulturer parallelt. Nyttige varianter på den modulære designen presenteres også som muliggjør kontrollert stimuleringsdynamikk, for eksempel løsemiddelpulser eller farmakokinetisk-lignende profiler. Det er viktig at når løsemiddelsignaler beveger seg gjennom systemet, blir de forvrengt på grunn av løsemiddelspredning. Videre beskrives en metode for å måle oppholdstidsfordelingene (RTD) av komponentene i perfusjonsoppsettet med en tracer ved bruk av MATLAB. RTD-er er nyttige for å beregne hvordan løsemiddelsignaler forvrenges av strømmen i flerromssystemet. Dette systemet er svært robust og reproduserbart, slik at grunnleggende forskere enkelt kan ta det i bruk uten behov for spesialiserte fabrikasjonsanlegg.
Introduction
Mange viktige biologiske prosesser forekommer i celle- og vevskulturer på tidsskalaen fra minutter til timer 1,2,3. Mens noen av disse fenomenene kan observeres og registreres på en automatisert måte ved hjelp av time-lapse mikroskopi4, bioluminescens1 eller andre metoder, utføres eksperimenter som involverer innsamling av kultur supernatantprøver for kjemisk analyse ofte manuelt i statiske cellekulturer. Manuell prøvetaking begrenser muligheten for visse studier på grunn av ulempen med hyppige eller ettertidsprøver. Ytterligere mangler ved statiske kulturmetoder inkluderer eksperimenter som involverer kontrollerte, forbigående eksponeringer for kjemiske stimuli. I statiske kulturer må stimuli legges til og fjernes manuelt, og stimulusprofiler er begrenset til trinnendringer over tid, mens mediumendringer også legger til og fjerner andre mediumkomponenter, noe som kan påvirke celler på en ukontrollert måte5. Fluidiske systemer kan overvinne disse utfordringene, men eksisterende enheter utgjør andre utfordringer. Mikrofluidiske enheter kommer med de uoverkommelige kostnadene ved spesialutstyr og opplæring for å produsere og bruke, krever mikroanalytiske metoder for å behandle prøver, og celler er vanskelige å gjenopprette fra enhetene etter perfusjon6. Få makrofluidiske systemer er opprettet for de typer eksperimenter som er beskrevet her 7,8,9,10, og de er bygget av flere tilpassede deler laget internt og krever flere pumper eller fraksjonssamlere. Videre er forfatterne ikke klar over noen kommersielt tilgjengelige makrofluidiske perfusjonscellekultursystemer annet enn omrørte tankbioreaktorer for suspensjonskultur, som er nyttige for bioproduksjon, men er ikke designet for modellering og studier av fysiologi.
Forfatterne rapporterte tidligere om utformingen av et billig perfusjonsbioreaktorsystem som består nesten utelukkende av kommersielt tilgjengelige deler11. Basisversjonen av systemet gjør det mulig å oppbevare flere kulturer i en brønnplate i en CO2-inkubator og kontinuerlig perfunderes med medium fra en sprøytepumpe, mens avløpsvannmediumstrømmene fra kulturene automatisk fraksjoneres i prøver over tid ved hjelp av en fraksjonssamler med en tilpasset modifikasjon. Dermed muliggjør dette systemet automatisert prøvetaking av kulturmedium supernatant og kontinuerlig løsemiddelinngang til kulturene over tid. Systemet er makrofluidisk og modulært og kan enkelt endres for å møte behovene til nye eksperimentdesign.
Det overordnede målet med metoden som presenteres her er å konstruere, karakterisere og bruke et perfusjonscellekultursystem som muliggjør eksperimenter der sekresjonen eller absorpsjonshastighetene til stoffer av celler over tid måles, og / eller celler blir utsatt for presise, forbigående løsemiddelsignaler. Denne videoartikkelen forklarer hvordan du monterer baseoppsettet, som er i stand til å perfusere opptil seks cellekulturer samtidig ved hjelp av en enkelt sprøytepumpe og modifisert fraksjonssamler. To nyttige varianter på basesystemet som benytter seg av ekstra pumper og deler for å muliggjøre eksperimenter som utsetter celler for forbigående løsemiddelkonsentrasjonssignaler, inkludert korte pulser og farmakokinetisk-lignende profiler12, presenteres også, vist i figur 1.
Figur 1: Tre variasjoner på perfusjonssystemdesignet. (Øverst) Det grunnleggende perfusjonssystemet. (Midten) Perfusjonssystemet med stoppekran for flere middels kilder. (Nederst) Perfusjonssystemet med en omrørt tank for å etterligne et godt blandet distribusjonsvolum. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
På grunn av spredning og diffusjon i strømmen blir løsemiddelsignalene forvrengt eller "smurt" når de beveger seg gjennom strømningssystemet. Denne forvrengningen kan kvantifiseres ved bruk av oppholdstidsfordelinger (RTD)13. Denne artikkelen forklarer hvordan du utfører sporingseksperimenter på komponenter i perfusjonssystemet (figur 2), og gir MATLAB-skript for å generere RTD-er fra målte data. En detaljert forklaring på denne analysen finnes i forfatternes forrige artikkel11. Ytterligere MATLAB-skript tilpasser passende funksjoner til RTD-ene og trekker ut fysiske parametere, og utfører signalkonvolusjon ved hjelp av RTD-er for å forutsi hvordan løsemiddelsignalinngang fra brukeren vil forplante og forvrenge gjennom perfusjonssystemet14.
Figur 2: Fordeling av oppholdstid. RTD-ene til strømningssystemkomponenter, for eksempel denne lengden på slangen, måles ved å legge inn en puls av tracer til systemet og måle hvordan den "smører" når den går ut i de innsamlede fraksjonene. Dette tallet er modifisert fra Erickson et al.11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klargjør deler for brønnplateperfusjon
- Forbered slangen
- Skjær to lengder silikonrør (1,6 mm indre diameter) for hver cellekultur som skal perfunderes. Sørg for at stykket som brukes som oppstrøms slange er langt nok til å nå fra sprøytepumpen til cellekulturen inne i inkubatoren, og at nedstrømsstykket kan nå fra cellekulturen til den lengste utvidede posisjonen til fraksjonssamleren.
- Gi hvert stykke rør en unik etikett på begge ender med merket tape.
- Forbered proppene til brønnplaten
- Få en silikonpropp for hver brønn på brønnplaten som skal perfunderes, med en passende diameter for å passe godt inn i brønnene med en lufttett tetning.
- Klipp av overflødig materiale fra bunnen av proppen slik at de passer inn i brønnene mens de etterlater plass inne for luft over det tiltenkte væskenivået.
- Skyv to butte 18 G nåler gjennom hver propp, inn i toppen og ut fra bunnen for å tjene som innløp og utløp for strømmen gjennom brønnen, diametralt motsatt hverandre for å maksimere avstanden mellom spissene i brønnen.
- Juster høyden på nålene i den pluggede brønnen, da høyden på utløpsnålen vil bestemme den stabile høyden på væskenivået i brønnen under perfusjon.
MERK: Hvis perfusjonen startes med utløpsnålen over væskenivået, vil væsken samle seg i brønnen til nivået når nålen. Hvis perfusjonen startes med utløpsnålen under væskenivået, vil væskenivået forbli stabilt med mindre luftbobler strømmer inn i brønnen, noe som vil føre til at væskehøyden senkes til den er i samme høyde som utløpsnålen.
- Samle flere deler
- Få en steril sprøyte for hver cellekultur som skal perfunderes som er stor nok til å inneholde nok medium for hele perfusjonen, pluss en ekstra mengde medium for å fylle slangen først.
- For hver kultur som skal perfunderes, få en kvinne-til-barb og to mannlige-til-barb Luer-kontakter, samt to kvinnelige og to mannlige Luer-capser.
- Rengjør og steriliser deler
- Hvis deler har blitt brukt tidligere, rengjør du dem ved å blande dem med 0,1 N NaOH, etterfulgt av skylling med avionisert vann.
- Ved autoklavering eller på annen måte, sørg for steriliteten til alle delene som er oppført ovenfor.
2. Laserkutt multihodedispenseren og fest den til en brøksamler
- Gjenskap flerhodedispensermodellen fra figur 3 i et datamaskinstøttet designprogram, eller last ned den medfølgende DXF-modellen (tilleggsfil 1).
- Bruk en laserskjærer til å kutte designet fra en 1/8 i akrylplate.
- Fjern de tre skruene som fester dispenserhodet til den bevegelige basen til fraksjonssamleren.
- Juster de tre minste hullene i flerhodedispenseren med skruehullene i den bevegelige basen, og skru skruene inn igjen gjennom hullene for å feste.
- Juster tettheten til de tre skruene for å vinkle flerhodedispenseren opp og ned til raden med dispenseringshull er justert med oppsamlingsrørene under den.
- Plasser forsiktig 300 μL pipettespisser gjennom de ønskede hullene for å tjene som dispenseringsspisser.
MERK: Fraksjonssamleren kan brukes uten flerhodedispenseren for å tilføre en enkelt cellekultur.
3. Mål komponent RTD-er og utfør signalkonvolusjon
- Sett opp pumper og sprøyter for sporpuls som vist i figur 2.
- Få tak i to enkanals eller flerkanals sprøytepumper.
- Velg en bakgrunnsløsning for å representere mediet som skal brukes i strømningssystemet under cellekultureksperimenter. Forsikre deg om at bakgrunnsløsningen har lignende masseoverføringsegenskaper som mediet. I mange tilfeller er avionisert vann et passende valg.
- Velg et sporstoff for å representere løsemiddelet som vil være av interesse under cellekultureksperimenter. Sørg for at sporstoffet har lignende masseoverføringsegenskaper som løsningsmidlet av interesse, og konsentrasjonen må kunne måles. I mange tilfeller er matfargestoff et passende valg.
- Løs opp sporstoffstoffet i bakgrunnsløsningen for å lage sporingsløsningen.
- Fyll en sprøyte med en bakgrunnsløsning og legg den i en sprøytepumpe. Fyll en annen sprøyte med traceroppløsning og legg den inn i den andre sprøytepumpen.
- Koble begge sprøytene til to av de tre portene på en fireveis stoppekran ved hjelp av Luer-kontakter.
- Lukk stoppekranen til bakgrunnsløsningen og pump sporingsoppløsningen inn i stoppekranen til den begynner å dryppe ut den åpne porten. Stopp pumpen og ikke juster sprøyten ytterligere.
MERK: Det er viktig at den bevegelige stangen til sprøytepumpen skyves opp mot sprøytestemplene før de tidsbestemte delene av forsøket begynner. Dette vil tillate strømmen å starte umiddelbart når pumpen startes. Ellers kan pumpen startes, men strømmen vil faktisk ikke begynne før den bevegelige stangen fanger opp til stempelposisjonen. - Lukk stoppekranen til sporingsoppløsningen og pump bakgrunnsoppløsningen inn i stoppekranen til all gjenværende sporstoffløsning er skyllet ut av den åpne porten. Stopp pumpen og ikke juster sprøyten ytterligere.
- Definere strømningssystemkomponenten av interesse og brøkoppsamleren
- Definer ønsket strømningssystemkomponent for RTD-analyse. Sørg for at komponenten som skal måles ender med et stykke nedstrøms rør med passende lengde og fleksibilitet for å nå fraksjonskollektoren under drift.
- Sett enden av slangen nedstrøms inn i en pipettespissdispenser i flerhodedispenseren slik at den er godt tilkoblet.
- Fest den åpne porten på fireveis stoppekranen til innløpet til komponenten som skal måles. Pump bakgrunnsløsning gjennom komponenten til den er helt fylt som den ville være under et cellekultureksperiment, og det begynner å dryppe ut av fraksjonssamlerens dispenseringsspiss. Stopp pumpen.
- Injiser sporingspuls, samle fraksjoner og mål tracer
- Still pumpen for sporingsløsningen til ønsket strømningshastighet. Lukk stoppekranen til bakgrunnsløsningen og start strømmen av sporingsløsningen. Start samtidig brøksamleren.
- Fortsett strømmen av tracer-løsning i en kort periode for å tilnærme en impulsinngang fra sporstoffet. En pulsvarighet på 10 minutter ble funnet å fungere godt for RTD-er med en strømningshastighet på 1 ml / t.
MERK: Hvis sporingspulsen er for kort, vil ikke nok tracer komme inn i strømmen for å være målbar. Hvis pulsen er for lang, vil den ikke lenger tilnærme seg en impuls og vil endre formen på RTD. - På slutten av sporingsløsningspulsperioden må du stoppe sporingsløsningspumpen. Lukk stoppekranen raskt til tracerløsningen og start strømmen av bakgrunnsløsningen med samme strømningshastighet.
- La bakgrunnsløsningen flyte og fraksjoner samles inn til hele sporstoffet har passert gjennom systemet og inn i de innsamlede brøkene.
- Stopp systemet og mål sporingskonsentrasjonen i fraksjonene. Inkluder bare fraksjoner som ble dispensert helt. Hvis samlingen stoppes halvveis i samlingen av en brøk, må du ikke ta med den brøken.
- Beregne botidsfordelingen (RTD) ut fra målte data i MATLAB
MERK: En skriftlig forklaring av analysen utført av dette MATLAB-skriptet finnes i forfatternes forrige publikasjon11, og diskusjoner av teorien er allment tilgjengelige i litteratur13.- Produser en .xlsx-fil som inneholder konsentrasjonsdataene i formatet til det example_tracer_data.xlsx regnearket i tilleggsfil 2. Angi konsentrasjonsverdiene for sporingsenheten i brøkene (alle enheter) i kronologisk rekkefølge fra venstre til høyre i rad 2. Skriv inn tiden som er gått fra starten av pulsen til slutten av den siste fraksjonen i celle A5, og skriv inn lengden på sporingspulsen i minutter i celle A8.
- Lagre .xlsx-filen i MATLAB-katalogen.
- Åpne RTD_From_Data-skriptet, fra Tilleggsfil 3, i MATLAB-redigeringsprogrammet.
- Erstatt navnet på den .xlsx filen i parentesene i den første linjen i Delen Last inn data i skriptet med navnet på den nye .xlsx datafilen, og følg instruksjonene som er skrevet i skriptfilen. Kjør skriptet.
- Forsikre deg om at skriptet utfører RTD-analyse13, produserer et plott av RTD og returnerer verdien av det numeriske integralet over RTD som tilsvarer 1. Finn tidsvektoren (t) og tilhørende RTD-verdivektor (Et) lagret av skriptet i MATLAB-katalogen.
- Tilpass en modellfunksjon til RTD i MATLAB
- Åpne Fit_RTD_Function-skriptet i MATLAB-redigeringsprogrammet fra Tilleggsfil 4.
- Velg en av de tre kommenterte modellfunksjonene som passer til RTD: den aksiale dispersjonsmodellen13, som passer rtds for laminær strømning i sylindriske rør; CSTR modell13, som passer til godt omrørte tanker; og n-CSTR modell15, som omtrent passer til større brønnplater. For å passe til en annen modell som ikke er inkludert her, legg den til skriptet i samme format.
- Fjern kommentarene i delen av skriptet som inneholder modellen som er valgt for tilpasning.
- Endre verdiene for de første gjetningene for parameterne til de som passer for RTD.
- Kjør skriptet for å lage et plott av tilpasningsfunksjonen som er overlappet på RTD-dataene, og for å skrive ut tilpasningsparameterverdiene for funksjonen. Hvis passformen er svært dårlig eller det oppstår feil, endrer du parameterens innledende gjetninger og kjører skriptet på nytt.
- Utfør signalkonvolusjon i MATLAB
- Velg enten ett signal og en RTD eller to RTD-er for å konvolvere.
- Åpne Signal_Convolution-skriptet, fra Tilleggsfil 5, i MATLAB-redigeringsprogrammet.
- For hvert av de to signalene som skal roteres (dvs. ett signal og en RTD, eller to RTD), definer en vektor med jevnt fordelte tidspunkter i de ønskede enhetene og en tilsvarende vektor av signalverdier på disse tidspunktene.
MERK: Vektorene til de to signalene må ha samme antall elementer og samme størrelsestidstrinn. Dette er grunnen til at det er nyttig å ha RTD som en kontinuerlig funksjon som kan samples for et vilkårlig antall punkter når som helst. - Skriv inn de to signalene i MATLAB og kjør skriptet for å oppnå tids- og signalvektorene til utgangssignalet.
4. Sett opp det grunnleggende perfusjonssystemet med celler i en brønnplate
- Klargjør brønnplaten
- Sørg for at brønnplatekulturen har riktig medium dybde for perfusjonseksperimentet. Utfør eventuelle endelige mediumendringer, stimuleringer eller andre trinn etter ønske før du begynner perfusjon. Hvis suspensjonsceller blir perfundert, sentrifuger platen for å sikre at de er på bunnen.
- Under sterile forhold, sett proppene med nåler inn i brønnplatekulturene med nålene trukket opp. Etter at proppen er på plass, senk nålene til ønsket høyde for perfusjon, da høyden på utløpsnålen bestemmer det stabile væskenivået.
- Cap nålene med mannlige Luer caps og hold hele brønnplaten i en inkubator til bruk.
- Klargjøre sprøytene og slangen oppstrøms
- Under sterile forhold, fyll en sprøyte for hver kultur som skal perfunderes med nok medium for ønsket varighet av perfusjonen, pluss nok ekstra medium til å fylle oppstrøms slangen.
- Fest slangen oppstrøms til sprøyten ved hjelp av en Luer-kontakt mellom kvinner og barb. På den andre enden av røret, sett inn en mann-til-barb Luer-kontakt.
- Dispenser medium fra sprøyten til oppstrøms slangen er helt fylt med medium.
- Cap den åpne enden av røret med en kvinnelig Luer cap.
MERK: Alle replikasjonssprøyter må ha nøyaktig samme volum på dette tidspunktet. Hvis volumene ikke er like, vil stemplene være i forskjellige posisjoner, og de vil ikke alle passe godt inn i en enkelt flerkanals sprøytepumpe.
- Under sterile forhold, sett inn en luer-kontakt fra hann til barb i den ene enden av slangen nedstrøms, og dekk den med en kvinnelig Luer-hette.
- Ta forsiktig alle forberedte rør, sprøyter og brønnplaten til inkubatoren som skal brukes til perfusjon.
- Plasser sprøytepumpen og fraksjonssamleren på de ønskede stedene i nærheten av inkubatoren. Plasser sprøytepumpen på toppen av eller i nærheten av inkubatoren, og plasser fraksjonssamleren ved siden av inkubatoren, nær porten.
- Bunt sammen de kappede endene av alle oppstrøms og nedstrøms rør og skyv dem fra utsiden av inkubatoren til innsiden gjennom porten.
- Legg sprøytene i sprøytepumpen og sett de åpne endene av slangene nedstrøms i pipettespissene på flerhodedispenseren til fraksjonssamleren.
- Inne i inkubatoren, trekk så mye slakk av oppstrømsrørene som mulig inn i inkubatoren for å maksimere lengden på slangen gjennom hvilken det flytende mediet kan motta varme og CO2 fra inkubatorluften. Mens du holder disse på plass, trekk nedstrømsrørene ut av inkubatoren, akkurat nok til at de er i stand til å nå det lengste utvidede punktet på fraksjonssamleren mens du fortsatt holder de kappede endene inne i inkubatoren.
- For hver plugget brønn, fjern raskt nålene og oppstrøms og nedstrøms rør for den brønnen og fest dem sammen med Luer-kontaktene.
- Når alle delene er koblet til, kjører du sprøytepumpen kort med relativt høy hastighet for å sikre at alle strømmer flyter riktig.
- På dette tidspunktet, hvis det er ønskelig å starte eksperimentet med nedstrømsrørene fulle av mediet, fortsett å kjøre pumpen til alle er fylt. Ellers må du stoppe pumpen.
- Still inn sprøytepumpens strømningshastighet og hyppigheten av fraksjonsoppsamling og start begge maskinene samtidig for å starte eksperimentet. Samle brøker for ønsket eksperimentvarighet.
5. Sett opp perfusjonssystemet med en stoppekran for flere middels kilder
- Utfør alle undertrinnene i trinn 4.1 ovenfor.
- Forbered de to mediene som skal brukes i perfusjonen, og merk mediet som vil bli dispensert først som 1, og det andre som medium 2.
- For hver kultur som skal perfunderes, fyll en sprøyte med nok medium 1 i løpet av dispensasjonen, pluss nok volum til først å fylle perfusjonssystemet. Fyll en annen sprøyte med nok medium 2 i løpet av dispensasjonen.
- Koble begge sprøytene til to av de tre portene på en fireveis stoppekran.
MERK: En lengde på slangen for å koble sprøytene til stoppekranene kan være nødvendig. - Klargjør stoppekranen og sprøytene på samme måte som trinn 3.1.7-3.1.8 ovenfor ved å lukke stoppekranen til middels 1 og dispensere medium 2 inn i stoppekranen til den bare begynner å dryppe ut den åpne porten.
- Lukk stoppekranen til medium 2 og dispenser medium 1 inn i stoppekranen til alt gjenværende medium 2 er spylt ut av den åpne porten.
- Fest slangen oppstrøms til den åpne stoppekranporten ved hjelp av en Luer-kontakt for kvinner til barb. På den andre enden av røret, sett inn en mann-til-barb Luer-kontakt.
- Dispenser medium 1 fra sprøyten til oppstrøms slangen er helt fylt med medium.
- Fortsett med trinn 4.3-4.11 ovenfor, og legg begge sprøytene i separate sprøytepumper og bare dispenser medium 1.
- Still sprøytepumpens strømningshastighet for middels 1 og frekvensen av fraksjonsinnsamling, og start begge maskinene samtidig for å starte eksperimentet.
- Når medium kilde skal skiftes, må du raskt stoppe sprøytepumpen for medium 1, lukke stoppekranen til middels 1 og starte sprøytepumpen for medium 2. Hvis ønskelig senere, bytt kilden tilbake til middels 1 på en lignende måte.
- Samle brøker for ønsket eksperimentvarighet.
6. Sett opp perfusjonssystemet med en omrørt tank for å etterligne farmakokinetikken
- Innhent farmakokinetiske data for legemidlet av interesse og sørg for at det består av en konsentrasjonstopp etterfulgt av et eksponentielt forfall.
- Etter å ha satt toppen til tid 0 og fjernet datapunkter før toppen, bruk Stirred_Tank_Fit skriptet (Tilleggsfil 6) for å tilpasse RTD-ligningen for omrørt tank til dataene. Input v (ønsket perfusjonsstrømningshastighet) og dataene som skal passe som et par vektorer direkte inn i skriptet, sammen med t og C for henholdsvis tidsverdier og konsentrasjonsverdier. Kjør skriptet for å skrive ut parameteren V, som er det nødvendige omrørte tankvolumet.
- Planlegg et oppsett for perfusjonssystemet for å inkludere to sprøytepumper og en plate shaker oppstrøms inkubatoren.
- Mål RTD-ene til perfusjonssystemkomponentene utover stoppekranen og utfør signalkonvolusjon av RTD-ene med forskjellige legemiddelpulsvarigheter og konsentrasjoner for å finne en passende farmakokinetisk profil. Bruk RTD-ligningen for fit stirred tank i denne beregningen.
- Fortsett med trinn 5.1-5.8 ovenfor.
- Bruk en ekstra brønnplate av passende størrelse som omrørt tank for oppsettet. Hver brønn kan tjene som en omrørt tank for en perfusert kultur. Fyll brønnen med det nødvendige volumet av medium, V, og plugg brønnen med nålene først trukket opp, deretter presset til bunnen av brønnen, og dekk nålene.
- Legg sprøytene i sprøytepumpene og koble slangen raskt fra sprøytene til de avkappede innløpsnålene på de omrørte tankene. Koble deretter cellekulturen oppstrøms rørinntak til utløpsnålene til de omrørte tankene.
- Fortsett med trinn 5.9-5.10.
- På ønsket tidspunkt, bytt til dispenseringsmedium 2 som inneholder legemidlet, som beskrevet i trinn 5.11. Bytt tilbake til medium 1 når legemiddelinfusjonen er fullført.
- Fortsett med trinn 5.12.
Figur 3: Dispenseren med flere hoder. Design for den laserkuttede flerhodedispenseren. Dette tallet er modifisert fra Erickson et al.11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Perfusjonssystemet med flere mediumkilder fra seksjon 5 i protokollen ble brukt til å måle ekspresjonsdynamikken til et reportergen drevet av kjernefaktoren kappa-lyskjedeforsterker av aktiverte B-celler (NF-κB) transkripsjonsfaktor i human embryonal nyre 293 (HEK293) celler som svar på en 1,5 timers puls av tumornekrosefaktor alfa (TNF-α). HEK293-celler ble stabilt transdusert ved hjelp av lentivirale vektorer med en genkonstruksjon som inneholdt Gaussia luciferase (GLuc), drevet av en promotor kalt NFKB som inneholdt NF-κB-responselementet for å lage NFKB-GLuc HEK293-celler, som ble sortert via fluorescensaktivert cellesortering (FACS) for å isolere transducerte celler. Sorterte celler ble kryopreservert til bruk.
For hver perfuserte kultur inkluderte perfusjonsoppsettet en oppstrøms seksjon på 1 m rør som førte til en plugget 48-brønns plate som inneholdt cellene, etterfulgt av 1 m nedstrøms rør som førte til multi-head fraksjonskollektoren, med en strømningshastighet på 0,5 ml / t (0,0083 ml / min). RTD-ene til 1 m rør alene og av det fulle oppsettet (1 m rør + 48-brønnplate + 1 m rør) ble målt ved hjelp av en strømningshastighet på 0,5 ml / t med en 20 minutters sporpuls. Bakgrunnsløsningen var avionisert vann, med en sporstoffløsning av blått matfargestoff fortynnet i avionisert vann, og fraksjoner ble samlet med en hastighet på 1 fraksjon / t ved bruk av flerhodedispenseren. Tracerkonsentrasjoner i 100 μL prøver av fraksjonene ble målt i en plateavleser via absorbans ved 628 nm.
Sporingskonsentrasjonsdataene ble behandlet i MATLAB for å produsere RTD-er for begge oppsettene. Først ble RTDene til de to oppsettene beregnet fra dataene ved hjelp av RTD_from_Data.m-skriptet. RTD-datapunktene til 1 m-røret og hele oppsettet er vist i figur 4.
Figur 4: Oppholdstidsfordelinger. (Venstre) RTD for et 1 m rør ved en strømningshastighet på 0,5 ml / t (0,0083 ml / min). (Høyre) RTD av full perfusjonsoppsett (1 m rør + 48-brønns plate + 1 m rør) med en strømningshastighet på 0,5 ml / t. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
RTD for slanger alene passer godt av den aksiale dispersjonsfunksjonen, som kan forventes basert på eksisterende litteratur13. Flere deler av rør i serie passer også godt av en enkelt aksial dispersjonsmodell, og å legge til 48-brønnsplaten in-line forårsaker ubetydelig avvik fra denne modellen, så 1 m rør alene og 1 m rør + 48-brønns plate + 1 m røroppsett ble hver forventet å være godt egnet av en aksial dispersjonsmodell. Det er vanlig at dårlige modelltilpasninger oppstår når de første gjetningene for modellparametrene er for langt fra de faktiske verdiene. For å demonstrere dette ble først den aksiale dispersjonsmodellen tilpasset 1 m rørdataene ved hjelp av Fit_RTD_Function skriptet, ved å bruke Pe = 10 og tau = 30 min som de første gjetningene for funksjonsparametrene. Figur 5 viser at disse gjetningene resulterte i dårlig tilpassede modeller, plottet sammen med RTD-dataene. Gjetningene ble endret til Pe = 10 og tau = 300 min, noe som resulterte i de gode modelltilpasningene vist i figur 5, da tau skulle være omtrent lik perfusjonssystemvolumet dividert med dets volumetriske strømningshastighet. Passformparametrene for 1 m-røret er Pe = 154,3, tau = 317,2 min, mens parametrene for hele systemet er Pe = 396,5, tau = 596,5 min.
Figur 5: Eksempler på god og dårlig modell som passer for en RTD. En aksial dispersjonsmodell var tilpasset RTD-dataene for et 1 m rør med en strømningshastighet på 0,5 ml / t (0,0083 ml / min). (Venstre) De første gjetningene for modellparameterne som ble lagt inn i MATLAB-skriptet, var for langt fra de sanne verdiene, noe som førte til at skriptet returnerte en dårlig modelltilpasning. (Høyre) Bedre parameterverdier ble lagt inn i skriptet, noe som resulterte i en god modelltilpasning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Signalkonvolusjon ble utført ved hjelp av disse passende RTD-funksjonene i Signal_Convolution-skriptet for å forutsi hvordan en 1,5 timers puls av medium som inneholder 10 ng / ml TNF-α ved innløpet til oppstrøms slangen ville forplante seg gjennom systemet. Inngangssignalet ble først konvolvert med 1 m rør RTD for å bestemme hvilket TNF-α signal som ville komme inn i brønnplaten. Inngangssignalet ble også konvolvert med RTD av 1 m rør + 48-brønns plate + 1 m rør for å bestemme hva TNF-α signalet ville være ved utløpet av systemet i de innsamlede fraksjonene, hvor det vil vises sammen med den tilsvarende GLuc-responsen fra cellene. Figur 6 viser inngangen TNF- α pulssignal vises sammen med de forutsagte signalene ved brønninnløpet og ved systemuttaket.
Figur 6: Predikering av TNF-α konsentrasjonssignaler i perfusjonssystemet. TNF-α medium ble infundert i perfusjonssystemet ved 10 ng/ml de første 90 minuttene, representert ved det blå rektangulære signalet. (Venstre) Ved å sammenfatte inngangssignalet med passformens aksiale dispersjonsmodell av 1 m rør RTD, ble TNF-α konsentrasjonssignal ved innløpet til 48-brønnsplaten spådd. (Høyre) På samme måte, ved bruk av RTD-modellen for hele systemet, ble TNF-α-signalet ved utløpet av systemet spådd. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
NFKB-GLuc HEK293-celler ble tint og belagt i en 48-brønns plate ved 1 x 104 celler/brønn i 0,4 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10 % føtalt storfeserum (FBS), og ble inkubert i 1 dag ved 37 °C med 5 % CO2, hvoretter trinnene i avsnitt 5 i protokollen ovenfor ble fulgt for å sette opp perfusjonssystemet med en stoppekran for flere mediumkilder. Fire bekker ble satt opp for å perfusere fire brønner. En flerkanals sprøytepumpe var lastet med fire fulle 60 ml sprøyter med DMEM som medium 1. En annen sprøytepumpe var lastet med 5 ml sprøyter inneholdende medium 2, hvorav to inneholdt vanlig DMEM som kontroll, og to som inneholdt DMEM med 10 ng/ml TNF-α som stimulus. Ved starten av forsøket ble 5 ml sprøytene som inneholdt TNF-α eller kontrollmediet dispensert i 0,5 ml/t i 1,5 time, hvorpå stoppekranene ble byttet og 60 ml sprøytene med DMEM ble dispensert i de neste 40 timene. Ved 24 timer og på slutten av perfusjonen ble fraksjonene fra de fire strømmene, som ble dispensert i mikrosentrifugerør, merket og frosset ved -80 ° C, og fraksjonssamleren ble tilbakestilt.
Etter perfusjonen ble alle prøvene tint, og deres GLuc-konsentrasjoner ble målt ved hjelp av en bioluminescensanalyse, beskrevet tidligere11,16. Luminescensverdiene ble konvertert til luminescens/t-rater ved å dividere luminescensen til hver brøkprøve med tidsvarigheten til denne fraksjonen, og ble plottet som en tidsserie for hver av de fire strømmene. Tiden for hver GLuc-måling var midtpunktet i tidsintervallet da denne fraksjonen ble samlet inn, minus gjennomsnittlig oppholdstid (tau = 317 min) for nedstrøms slangen i perfusjonssystemet. TNF-α signalet som ble spådd å være inneholdt i fraksjonene, ble også forskjøvet i tid av gjennomsnittlig oppholdstid for nedstrømsslangen og ble lagt på GLuc-dataene, og avslørte stimulus-responsdynamikken NF-κB-drevet genuttrykk, vist i figur 7.
Figur 7: Stimulus-respons-dynamikk målt ved hjelp av perfusjonssystemet. Perfusjonssystemet med to mediumkilder ble brukt til forbigående å eksponere to cellekulturer for en puls av TNF-α med to ueksponerte kulturer som kontroller. HEK293-cellene ble konstruert for å utskille GLuc drevet av en promotor som inneholdt NF-κB-responselementet, som ble samlet inn i avløpsfraksjonene. Eksperimentet avslører en dramatisk uttrykksøkning drevet av NF-κB etter TNF-α eksponering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilstedeværelsen av akkumulert GLuc i kulturene i begynnelsen av perfusjonen forårsaket det tilsynelatende fallet i GLuc-signalet fra første til andre fraksjon i alle fire kurver. Denne vanlige artefakten kan unngås i perfusjonssystemet ved å endre mediet i kulturene umiddelbart før perfusjon begynner. De to kontrollkulturene som ikke fikk TNF-α opprettholdt en lav GLuc-sekresjonshastighet som gradvis økte i løpet av forsøket. Dette resultatet kan gjenspeile veksten i cellepopulasjonen. De stimulerte kulturene hadde i utgangspunktet samme GLuc-sekresjonshastighet som kontrollene og økte deretter dramatisk sekresjon ettersom NF-κB-drevet uttrykk aktiveres som respons på en TNF-α puls. GLuc sekresjon topper ca 9 timer etter den første ankomsten av TNF-α, hvoretter den avtar med eksponentielt forfall.
Tilleggsfil 1: CAD-fil: Multi-head_Dispenser.DFX: Denne filen inneholder modellen for flerhodedispenseren som kan laserkuttes og brukes til å modifisere fraksjonssamlere. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: example_tracer_data.xlsx. Inneholder eksempler på sporingseksperimentdata som skal leses av RTD_from_Data.m MATLAB-skriptet. Kan også brukes som mal for nye data. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 3: MATLAB-fil: RTD_from_Data.m. Dette skriptet leser sporingseksperimentdata fra en .xlsx-fil og returnerer t- og Et-vektorer som representerer RTD-en. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 4: MATLAB-fil: Fit_RTD_Function.m. Dette skriptet laster RTD-vektorer fra RTD_from_Data-skriptet og returnerer en tilpasningsmodell for RTD-en. Modelltypen er valgt av brukeren. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 5: MATLAB-fil: Signal_Convolution.m. Dette skriptet tar et brukerdefinert løsemiddelsignal og en RTD som innganger og forutsier hvordan signalet vil bli endret etter å ha passert gjennom strømningssystemet med den RTD. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 6: MATLAB-fil: Stirred_Tank_Fit.m. Dette skriptet passer til en CSTR RTD-kurve til farmakokinetiske datainngang av brukeren og returnerer tankvolumet som kreves for å produsere RTD for den gitte strømningshastigheten. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbeidet beskriver samlingen og driften av et perfusjonscellekultursystem med flere mediumkilder demonstrert med et spesifikt eksempel der dynamikken til NF-κB-drevet genuttrykk som respons på en forbigående puls av TNF-α ble målt. RTD-ene til perfusjonssystemkomponentene ble målt og modellert, og signalkonvolusjon ble brukt til å forutsi både cellens eksponering for TNF-α puls og TNF-α fordeling i de oppsamlede avløpsvannmediumfraksjonene. Cellene ble utsatt for puls og fraksjoner ble samlet i 40 timer, hvoretter GLuc ble målt i fraksjonene og plottet sammen med det forutsagte TNF-α signalet for å avsløre stimuleringsresponsdynamikken.
Denne perfusjonsmetoden er ikke uten mangler. Spesielt bærer systemet sterilitetsrisiko på grunn av det kritiske korte trinnet der slangen er koblet til brønnplaten etter oppsett i inkubatoren. Forfatternes erfaring er at forurensning er ganske sjelden; Likevel kan risikoen for kontaminering reduseres på følgende måter. Den første er å utføre alle cellehåndteringsprosedyrer og sterile tilkoblinger i et biosikkerhetsskap. En ekstra forholdsregel som kan vurderes for å forbedre steriliteten er inkluderingen av et 0,22 μm sprøytefilter in-line ved innløpet til cellekulturene. Bruken av steril filtrering vil fange bakterier eller større mikroorganismer som er tilstede i mediet før de kommer inn i cellekulturen, selv om det øker trykkkravene for å drive strømmen og kan tette på grunn av begroing av membranen. De utgående prøvene samles også inn i åpne miljøer med risiko for kontaminering. Innsamling av prøver i et kapslingssystem, ideelt med luftfiltrering, for fraksjoneringsmodulen vil eliminere dette problemet i fremtidige systembygg.
Videre blir signaler utskilt av celler forvrengt i henhold til RTD for nedstrøms rør før de blir fraksjonert og målt. Dermed er målte signaler smurt versjoner av de som utskilles av celler. Teoretisk sett kan denne smøringen angres ved å utføre dekonvolusjon på det målte signalet for å fjerne effekten av nedstrøms RTD14, men det er vanskelig å anvende denne numeriske teknikken vellykket på ikke-ideale data ettersom signalstøy blir sterkt forsterket. Imidlertid utfolder mange biologiske dynamikker av interesse seg på tidsskalaen fra timer til titalls timer, og påvirkes dermed svært lite av smøreeffektene av slange-RTD-er, som blir forskjøvet i tid, men endret lite i form. RTD-målemetoden vist her kan også forbedres ved å bruke kortere sporingspulser og bruke bakgrunnsløsninger og sporstoffer som samsvarer med de som skal brukes i cellekultureksperimenter. Imidlertid har pulstidene som er foreslått her vist seg å gi identiske RTD-er til alle kortere pulstider og er derfor egnet for RTD-målinger, men etter hvert som pulstidene økes, endres RTD-ene mer betydelig og bør derfor ikke brukes. Forfatterne har tidligere funnet ut at både matfargestoff og GLuc har svært like RTD-er til hverandre i både vann- og kulturmedium11, så det er lite sannsynlig at den molekylære arten vil endre RTD mye. Til slutt ble det ikke observert noen forskjell i RTD for matfargestoff i vann målt ved 20 ° C vs. 37 ° C, eller i rette rør vs. høyt kveilet rør11. Disse dataene, og RTD-data for en rekke perfusjonssystemgeometrier og strømningshastigheter, finnes i forfatternes forrige publikasjon11, sammen med en detaljert forklaring av operasjonene utført av RTD-analyseskriptet i denne artikkelen. Ytterligere detaljer om RTD-analyseteori13 og eksempler på anvendelser av RTD-er til bioreaktorsystemer 17,18,19,20,21 finnes i de oppgitte referansene.
Denne allsidige metoden kan brukes til å måle sekresjon eller absorpsjonshastigheter av løselige stoffer i cellekulturer, og forbigående løsemiddelsignaler kan leveres til kulturene ved å bytte oppstrøms mediumkilder. Enkle signaler som løsemiddelpulser eller trinnendringer kan leveres ganske enkelt ved å bytte innløpsventil. Farmakokinetisk-lignende signaler kan produseres ved å plassere en omrørt tank med riktig væskevolum i linje oppstrøms kulturen og levere en løsemiddelpuls gjennom den. Andre signaler kan opprettes ved å bruke forskjellige kombinasjoner av pulser, trinnendringer og komponenter med nye RTD-er for å forvride pulsene til ønskede former. Eksisterende statiske cellekulturmetoder kan ikke kontinuerlig samle mediumprøver på en automatisert måte og kan ikke brukes til å eksponere celler for jevnt varierende løsemiddelsignaler. Mikrofluidiske systemer er dyre og krever kompetanse, og det finnes ingen kommersielt tilgjengelige makrofluidiske systemer for denne klassen av eksperimenter. Det rimelige, enkle systemet kan vedtas av laboratorier for å studere naturlig celleadferd, impulsresponser, effekten av forskjellige forbigående løsemiddelprofiler som kan etterligne stoffer eller endogen løsningssignaldynamikk, og kan omkonfigureres for å møte behovene til nye eksperimenter. Fremtidige anvendelser av denne teknikken og de som for tiden pågår inkluderer: måling av sekresjonshastighetsdynamikken til cytokiner og eksosomer fra en ex vivo celleterapi; vurdere effekten av sirkadisk klokketid på cellulær respons på narkotika; måle veksthastigheten og metabolismen av bakterielle biofilmer; produsere dose-respons kurver for adenoassosiert virus (AAV) vektorer in vitro; måle den dynamiske produksjonshastigheten til lentivirale vektorer fra produsentceller; og inkorporering av farmakokinetiske kjemoterapi-legemiddelprofiler i persontilpassede medisinbiopsier for presisjonskreftbehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Denne forskningen ble utført med støtte under Grant Nos. R01EB012521, R01EB028782 og T32 GM008339 fra National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 Gauge 1 1/2- in Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines | Grainger | 5FVK2 | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | HEK 293T cells used in the Representative Results experiment. |
| 96-Well Clear Bottom Plates, Corning | VWR | 89091-010 | Plates for measuring dye concentrations in RTD experiments and GLuc in representative results experiment. |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 5 mL | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| BioFrac Fraction Collector | Bio-Rad | 7410002 | Fraction collector that can be used for a single stream, or modified using our method to enable collection from multiple streams. |
| Clear High-Strength UV-Resistant Acrylic 12" x 12" x 1/8" | McMaster-Carr | 4615T93 | This sheet is cut using a laser cutter according to the DXF file in the supplemental materials to produce the multi-head dispenser that can be attached to the BioFrac fraction collector. |
| Coelenterazine native | NanoLight Technology | 303 | Substrate used in Gaussia luciferase bioluminescence assay in representative results. |
| Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, size 48 wells, polystyrene plate, flat bottom wells | Millipore Sigma | CLS3548 | Used to grow and perfuse 293T cells in representative results. |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells | Fisher Scientific | 720081 | Can be plugged and used as a stirred tank to produce pharmacokinetic profiles in perfusion. Can also contain cells for perfusion. |
| DMEM, high glucose | ThermoFisher Scientific | 11965126 | |
| Epilog Zing 24 Laser | Cutting Edge Systems | Epilog Zing 24 | Laser cutter used to produce multi-head dispenser from acrylic sheet. Other laser cutters may be used. |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 20 mL | Fisher Scientific | 14-955-460 | |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 60 mL | Fisher Scientific | 14-955-461 | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | Microcentrifuge tubes for collecting fractions. |
| Fisherbrand Round Bottom Disposable Borosilicate Glass Tubes with Plain End | Fisher Scientific | 14-961-26 | Glass tubes for collecting fractions. |
| Fisherbrand SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-Filtered | Fisher Scientific | 2707410 | 300 ul pipette tips that best fit the multi-head dispenser and tubing to act as dispensing tips. |
| Gibco DPBS, powder, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 21600010 | Phosphate buffered saline. |
| Labline 4625 Titer Shaker | Marshall Scientific | Labline 4625 Titer Shaker | Orbital shaker used to keep stirred tanks mixed. |
| Masterflex Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile; 10/PK | Cole-Parmer | EW-30600-04 | Used to join multiple inlet streams for RTD experiments and cell culture experiments. |
| Masterflex Fitting, Polycarbonate, Straight, Female Luer x Cap; 25/PK | Masterflex | UX-45501-28 | |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hosebarb Adapters, 1/16" | Cole-Parmer | EW-45508-00 | |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Hosebarb Adapter, 1/16" ID | Cole-Parmer | EW-45518-00 | |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Plug Adapter; 25/PK | Masterflex | EW-30800-30 | |
| Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 14; 25 ft | Masterflex | EW-96410-14 | |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | Version R2019b. Newer versions may also be used. Some older versions may work. |
| NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1600 | |
| Rack Set F1 | Bio-Rad | 7410010 | Racks to hold collecting tubes in the fraction collector. |
| Recombinant Human TNF-alpha (HEK293-expressed) Protein, CF | Bio-Techne | 10291-TA-020 | Cytokine used to stimulate 293T cells in representative results. |
| Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 00, Bottom 10.5mm | Saint Gobain | DX263015-50 | Fits 48-well plates. |
| Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 4 Bottom 21mm | Saint Gobain | DX263027-10 | Fits 12-well plates. |
| Sodium Hydroxide, 10.0 N Aqueous Solution APHA; 1 L | Spectrum Chemicals | S-395-1LT | |
| SolidWorks | Dassault Systems | SolidWorks | CAD software used to create the multi-head dispenser DXF file. |
| Varioskan LUX multimode microplate reader | ThermoFisher Scientific | VL0000D0 | Plate reader. |
| Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue | Michaels | 10404779 | Blue food dye containing Brilliant Blue FCF, used as a tracer in RTD experiments. Absorbance spectrum peaks at 628 nm. |
References
- Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Current Biology. 14 (24), 2289-2295 (2004).
- Talaei, K., et al. A mathematical model of the dynamics of cytokine expression and human immune cell activation in response to the pathogen Staphylococcus aureus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711153 (2021).
- Kemas, A. M., Youhanna, S., Zandi Shafagh, R., Lauschke, V. M. Insulin-dependent glucose consumption dynamics in 3D primary human liver cultures measured by a sensitive and specific glucose sensor with nanoliter input volume. FASEB Journal. 35 (3), 21305 (2021).
- Muzzey, D., van Oudenaarden, A. Quantitative time-lapse fluorescence microscopy in single cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 301-327 (2009).
- Calligaro, H., Kinane, C., Bennis, M., Coutanson, C., Dkhissi-Benyahya, O. A standardized method to assess the endogenous activity and the light-response of the retinal clock in mammals. Molecular Vision. 26, 106-116 (2020).
- Battat, S., Weitz, D. A., Whitesides, G. M. An outlook on microfluidics: the promise and the challenge. Lab on a Chip. 22 (3), 530-536 (2022).
- Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., Dibner, C. Parallel measurement of circadian clock gene expression and hormone secretion in human primary cell cultures. Journal of Visualized Experiments. (117), e54673 (2016).
- Yamagishi, K., Enomoto, T., Ohmiya, Y. Perfusion-culture-based secreted bioluminescence reporter assay in living cells. Analytical Biochemistry. 354 (1), 15-21 (2006).
- Watanabe, T., et al. Multichannel perfusion culture bioluminescence reporter system for long-term detection in living cells. Analytical Biochemistry. 402 (1), 107-109 (2010).
- Murakami, N., Nakamura, H., Nishi, R., Marumoto, N., Nasu, T. Comparison of circadian oscillation of melatonin release in pineal cells of house sparrow, pigeon and Japanese quail, using cell perfusion systems. Brain Research. 651 (1-2), 209-214 (1994).
- Erickson, P., Houwayek, T., Burr, A., Teryek, M., Parekkadan, B. A continuous flow cell culture system for precision cell stimulation and time-resolved profiling of cell secretion. Analytical Biochemistry. 625, 114213 (2021).
- Saltzman, W. M. Drug Delivery: Engineering Principles for Drug Therapy. , Oxford University Press. (2001).
- Fogler, H. S. Elements of Chemical Reaction Engineering. 4th edn. , Prentice Hall PTR. Boston. (2006).
- Conesa, J. A. Chemical Reactor Design: Mathematical Modeling and Applications. , Wiley. (2019).
- Toson, P., Doshi, P., Jajcevic, D. Explicit residence time distribution of a generalised cascade of continuous stirred tank reactors for a description of short recirculation time (bypassing). Processes. 7 (9), 615 (2019).
- Tamayo, A. G., Shukor, S., Burr, A., Erickson, P., Parekkadan, B. Tracking leukemic T-cell transcriptional dynamics in vivo with a blood-based reporter assay. FEBS Open Biology. 10 (9), 1868-1879 (2020).
- Newell, B., Bailey, J., Islam, A., Hopkins, L., Lant, P. Characterising bioreactor mixing with residence time distribution (RTD) tests. Water Science and Technology. 37 (12), 43-47 (1998).
- Dubois, J., Tremblay, L., Lepage, M., Vermette, P. Flow dynamics within a bioreactor for tissue engineering by residence time distribution analysis combined with fluorescence and magnetic resonance imaging to investigate forced permeability and apparent diffusion coefficient in a perfusion cell culture chamber. Biotechnology and Bioengineering. 108 (10), 2488-2498 (2011).
- Gaida, L. B., et al. Liquid and gas residence time distribution in a two-stage bioreactor with cell recycle. HAL Open Science. , (2008).
- Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Wave characterization for mammalian cell culture: residence time distribution. New Biotechnology. 29 (3), 402-408 (2012).
- Olivet, D., Valls, J., Gordillo, M. A., Freixó, A., Sánchez, A. Application of residence time distribution technique to the study of the hydrodynamic behaviour of a full-scale wastewater treatment plant plug-flow bioreactor. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 80 (4), 425-432 (2005).
