Summary
Met behulp van het goedkope kationische polymeer polyethylenimine (PEI) produceerden we lentivirale deeltjes voor stabiele expressie van shRNA's in H9 menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en transiënt getransduceerde H9-afgeleide neurale voorlopercellen (NPC's) met een hoge efficiëntie.
Abstract
Het huidige protocol beschrijft het gebruik van lentivirale deeltjes voor de levering van korte haarspeldrna's (shRNA's) aan zowel menselijke embryonale stamcellen (hESCs) als neurale voorlopercellen (NPC's) afgeleid van hESCs met een hoge efficiëntie. Lentivirale deeltjes werden gegenereerd door hek293T-cellen te co-transfecteren met behulp van entryvectoren (die shRNA's dragen) samen met verpakkingsplasmiden (pAX en pMD2.G) met behulp van het goedkope kationische polymeer polyethylenimine (PEI). Virale deeltjes werden geconcentreerd met behulp van ultracentrifugatie, wat resulteerde in gemiddelde titers boven 5 x 107. Zowel hESCs als NPC's kunnen met hoge efficiëntie worden geïnfecteerd met behulp van deze lentivirale deeltjes, zoals blijkt uit puromycineselectie en stabiele expressie in hESCs, evenals voorbijgaande GFP-expressie in NPC's. Bovendien toonde western blot-analyse een significante vermindering van de expressie van genen gericht op shRNA's. Bovendien behielden de cellen hun pluripotentie en differentiatiepotentieel, zoals blijkt uit hun daaropvolgende differentiatie in verschillende afstammingslijnen van het CZS. Het huidige protocol gaat over de levering van shRNA's; dezelfde benadering kan echter worden gebruikt voor de ectopische expressie van cDA's voor overexpressiestudies.
Introduction
Menselijke embryonale stamcellen (hESCs) afgeleid van de blastocyst binnenste celmassa zijn pluripotent en kunnen worden gedifferentieerd in verschillende celtypen, afhankelijk van externe factoren onder in vitro omstandigheden 1,2. Om het potentieel van hESCs volledig te benutten, is het noodzakelijk om snelle en betrouwbare genafgiftemethoden voor deze cellen te hebben. Conventioneel kunnen de gebruikte technieken grofweg worden ingedeeld in twee typen: niet-virale en virale genafgiftesystemen 3,4. De meest gebruikte niet-virale genafgiftesystemen zijn lipofectie, elektroporatie en nucleofection. Niet-virale toedieningssystemen zijn voordelig vanwege minder insertiemutaties en een algehele afname van immunogeniciteit 5,6. Deze methoden resulteren echter in een lage transfectie-efficiëntie en een korte duur van voorbijgaande genexpressie, wat een belangrijke beperking is voor langetermijndifferentiatiestudies7. Elektroporatie resulteert in een betere transfectie-efficiëntie in vergelijking met lipofectie; het resulteert echter in meer dan 50% celdood 8,9,10. Met behulp van nucleofection kunnen de celoverleving en transfectie-efficiëntie worden verbeterd door lipofectie en elektroporatie te combineren, maar de aanpak heeft celspecifieke buffers en gespecialiseerde apparatuur nodig en wordt dus behoorlijk duur voor opgeschaalde toepassingen 11,12.
Daarentegen hebben virale vectoren verbeterde transfectie-efficiënties aangetoond, evenals een algehele lage cytotoxiciteit, na transductie. Bovendien zijn de geleverde genen stabiel tot expressie gebracht en maken deze methode dus ideaal voor langetermijnstudies13. Een van de meest gebruikte virale vectoren voor genafgifte in hESCs zijn lentivirale vectoren (LVS), die meer dan 80% transductie-efficiëntie kunnen geven met behulp van virale deeltjes met een hoge titer14,15. Lipofectie en CaPO 4-precipitatie behoren tot de meest gebruikte methoden om HEK293T-cellen of zijn derivaten tijdelijk te transfecteren met genoverdrachtsvectoren samen met verpakkingsplasmiden om lentivirale deeltjes16 te produceren. Hoewel lipofectie resulteert in een goede transfectie-efficiëntie en lage cytotoxiciteit, wordt de techniek belemmerd door de kosten, en opschalen om hoge titer lentivirale deeltjes te krijgen zou erg duur zijn. CaPO4-neerslag resulteert in relatief vergelijkbare transfectie-efficiënties als die verkregen met behulp van lipofectie. Hoewel kosteneffectief, resulteert CaPO4-neerslag in aanzienlijke celdood na transfecties, wat het moeilijk maakt om te standaardiseren en batch-to-batch variaties te vermijden17. In dit scenario is het ontwikkelen van een methode die een hoge transfectie-efficiëntie, lage cytotoxiciteit en kosteneffectiviteit geeft, cruciaal voor de productie van lentivirale deeltjes met een hoge titer die in hESCs worden gebruikt.
Polyethylenimine (PEI) is een kationisch polymeer dat HEK293T-cellen met een hoge efficiëntie kan transfecteren zonder veel cytotoxiciteit en heeft een verwaarloosbare kost in vergelijking met op lipofectie gebaseerde methoden18. In deze situatie kan PEI worden gebruikt voor opgeschaalde toepassingen van lvs-productie met een hoge titer door de concentratie van lentivirale deeltjes uit kweeksupernatanten met behulp van verschillende technieken. Het gepresenteerde artikel beschrijft het gebruik van PEI om HEK293T-cellen en lentivirale vectorconcentratie te transfecteren met behulp van ultracentrifugatie via een sucrosekussen. Met behulp van deze methode verkrijgen we regelmatig titers ruim boven 5 x 107 IE / ml met lage batch-to-batch variaties. De methode is eenvoudig, ongecompliceerd en kosteneffectief voor opgeschaalde toepassingen voor genafgifte aan hESCs en hESCs-afgeleide cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Transfectie van HEK293T-cellen met behulp van PEI- of Lipofectamine 3000-reagens
- Kweek HEK293T cellen in DMEM + 10% FBS + 1x penicilline/streptomycine bij 37 °C in een bevochtigde incubator met een atmosfeer van 5% CO2 en 21% O2 totdat ze 90% confluent zijn voordat ze worden gezaaid voor transfectie. Gebruik een relatief laag aantal cellen voor de productie van een hoog titervirus (idealiter minder dan P30).
- Zaai 4 x 106 cellen in 10 ml volledig groeimedium in een weefselkweekplaat van 100 mm en groei 's nachts in een bevochtigde weefselkweekincubator met een atmosfeer van 5% CO2 en 21% O2.
- Verdun voor elke transfectie plasmide-DNA (voorraden van 1 mg/ml) in 1 ml serumvrije DMEM-media in centrifugebuizen van 1,5 ml met behulp van de volgende verhouding van invoer- en verpakkingsplasmiden:
Entry vector = 10 μg
psPAX2.0 = 7,5 μg
pMD2.G = 5 μg - Vortex voor 10 s en draai de buis op 10.000 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur om te verzamelen.
- Voeg 70 μL (1 mg/ml stockoplossing) PEI toe aan de buis en vortex en draai kort zoals hierboven beschreven om te verzamelen. Het gebruikte volume PEI is gebaseerd op een verhouding van 1:3 van totaal DNA (μg):P EI (μg).
- Verdun voor transfectie op basis van lipofectamine de bovenstaande vectoren in 500 μL serumvrije DMEM-media met 45 μL reagens P in de kit en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verdun 70 μL reagens L in de kit met 500 μL serumvrije DMEM-media en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Combineer de inhoud van beide buizen en incubeer de buizen bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten om complexe vorming mogelijk te maken.
- Voeg druppelsgewijs 1 ml DNA/PEI of 1 ml DNA/lipofectaminecomplexen toe aan de plaat met cellen en incubeer gedurende 6 uur bij 37 °C in een bevochtigde incubator met een atmosfeer van 5% CO2 en 21% O2.
- Na 6 uur, verander naar verse complete groeimedia (10 ml) en breng de cellen terug naar de bevochtigde incubator met een atmosfeer van 5% CO2 en 21% O2.
2. LVS-collectie en ultracentrifugatie
- Na 2 dagen transfectie verzamelt u de virusbevattende media en bedekt u de cellen opnieuw met 10 ml verse volledige groeimedia.
- Verzamel na 3 dagen transfectie de virusbevattende media en combineer deze met de virusbevattende media die op het tijdstip van 2 dagen zijn verzameld.
- Centrifugeer het virale supernatant bij 2.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C tot pelletcellulair vuil.
- Filtreer het supernatant met behulp van een poriegrootte van 0,45 μm laag eiwitbindend filter (PES of SFCA) en bewaar het bij 4 °C totdat het klaar is voor ultracentrifugatie. Het gefilterde supernatant dat lentivirale deeltjes bevat, kan gedurende 5 dagen bij 4 °C worden bewaard zonder een significant verlies aan virale titers.
- Steriliseer de ultracentrifugebuizen met bekers door ze gedurende 10 minuten te wassen met 70% ethanol, aan de lucht te drogen, te sluiten en op 4 °C te bewaren.
- Voeg 36 ml gefilterde media met lentivirale deeltjes toe aan een steriele ultracentrifugebuis.
- Vul 5 ml steriele stripette met 4 ml steriele 20% sucrose-oplossing (bereid in PBS) en doseer deze tot op de bodem van de ultracentrifugebuis (UC) die LVS bevat. Het is belangrijk dat de sucrose-oplossing niet wordt gemengd met de media en een gradiënt maakt aan de onderkant van de buis.
- Balanceer alle ultracentrifugebuizen met serumvrije DMEM-media, plaats ze in de koude ultracentrifugebuis met bekers en sluit de deksels.
- Draai de buizen op 125.000 x g gedurende 2 uur bij 4 °C.
- Gooi na de spin het supernatant voorzichtig weg door de inhoud van de buis in een container met bleekmiddel om te keren zonder de pellet te verstoren. Markeer de pellet indien zichtbaar.
- Plaats de ultracentrifugebuis in een steriele buis van 50 ml en voeg 200 μL steriele DPBS precies aan de bovenkant van de pellet toe. Ongestoord bewaren bij 4 °C.
- Meng de volgende dag voorzichtig door 40x op en neer te pipetteren.
- Draai kort op 13.000 x g in een tafelcentrifuge om eventuele brokstukken te pelleteren.
- Breng het supernatant over in een nieuwe buis en aliquot het viruspreparaat als 20 μL aliquots. Bewaren bij −80 °C.
- Zet 5 μL van het preparaat opzij voor virale titermetingen.
3. LVS-titermeting voor op pLKO.1 gebaseerde vectoren
- Bepaal de titer van lentivirale deeltjes met behulp van een qPCR volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
- Bereid voor een standaardcurve vijf 10-voudige seriële verdunningen van Standard Control DNA (meegeleverd in de kit) door in elke stap 5 μL DNA te verdunnen tot 45 μL nucleasevrij H2O. Gebruik verdunningen van 1:100 tot 1:100.000 om een standaardcurve te genereren.
- Stel reacties op ijs in duplicaten op de volgende manier in:
2x qPCR master mix 10 μL
Primer mix 2 μL
Monster of standaard DNA 2 μL
Nucleasevrij H2O 6 μL - Voer qPCR uit met behulp van de fietsomstandigheden die worden vermeld in de handleiding van de kit voor een totaal van 35 cycli.
- Plotcyclusdrempelwaarden (Ct) op de Y-as versus virustiter op de X-as.
- Genereer een logaritmische regressie met behulp van vier standaard controle-DNA-verdunningen (1:100 tot 1:100.000) om de onbekende virusmonstertiter te bepalen met behulp van een trendlijnvergelijking.
4. LVS-titermeting voor op pll3.7 gebaseerde vectoren
- Zaad 1 x 105 HEK293T cellen in elke put van een P12-put plaat in 1 ml volledige groeimedia 24 uur vóór infecties.
- Vul de media aan met polybreen van 8 μg/ml en voeg 1 ml toe aan elke steriele buis van 1,5 ml.
- Verdun de virale deeltjes met behulp van 4 μL, 2 μL, 1 μL, 0,5 μL en 0,1 μL geconcentreerde lentivirale deeltjes in elk van de 1 ml polybreenbevattende media.
- Vervang de media van HEK293T-cellen door de media die aangegeven hoeveelheden lentivirale deeltjes bevatten, samen met 8 μg/ml polybreen en incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C in een bevochtigde incubator met een atmosfeer van 5% CO2 en 21% O2.
- De volgende dag, verander op verse media en zet de kweek voort gedurende 72 uur bij 37 °C in een bevochtigde incubator met een atmosfeer van 5% CO2 en 21% O2.
- Was na 72 uur de cellen met PBS, trypsinize bij 37 °C volgens het protocol van de fabrikant en resuspendeer in 1 ml PBS.
- Voer FACS-celsortering uit met behulp van een celsorteerder, volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Stel de poort in op 0% GFP-positieve cellen met behulp van niet-geïnfecteerde HEK293T-cellen en tel 50.000 gebeurtenissen voor elk monster om het percentage positieve cellen voor elke virale verdunning te bepalen.
- Gebruik alleen de volumes lentivirale deeltjes die %GFP-positieve cellen geven in het bereik van 2% -20% om de titer van lentivirale deeltjes te berekenen.
5. Infectie van hESCs en stabiele selectie
- Was de cellen met 2 ml PBS die in elke put van een 6-well cell culture multiwell plaat groeit.
- Maak de cellen los van de celkweekplaat met behulp van 1 ml 1x celdissociatiereagens door incubatie bij 37 °C gedurende 5 min.
- Verzamel de cellen in DMEM/F12-media en centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de celpellet te verzamelen.
- Aspirateer, resuspendeer de cellen in 1 ml en tel met behulp van een hemocytometer.
- Maak een celsuspensie met 2 x 105 cellen / ml volledige groeimedia met mTeSR1 aangevuld met 10 ng / ml basis fibroblastgroeifactor (bFGF), penicilline / streptomycine (P / S) en 10 μM ROCK-remmer (RI).
- Zaai 1 x 105 cellen op 50x verdunde complete keldermembraan matrix-gecoate P24-putplaten in 500 μL van volledige groeimedia en kweek de cellen bij 37 °C in een bevochtigde incubator met een atmosfeer van 5% CO2 en 21% O2.
- Infecteer de volgende dag hESCs bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 10 met 8 μg/ml polybreen en incubeer bij 37 °C gedurende 8 uur.
- Vervang na 8 uur de virusbevattende media door verse groeimedia (-RI) en zet de kweek voort totdat de cellen voor 90% samenvloeien.
- Start de selectie van puromycine (0,8 μg / ml) wanneer de cellen 90% samenvloeiing bereiken, wat meestal 48-72 uur na infectie is.
- Nadat de selectie is voltooid (meestal 4-6 dagen), splitst u de stabiele cellen (1:4) en breidt u de cellen uit voor cryopreservatie en verdere analyse.
6. Transductie van H9-afgeleide neurale voorlopercellen (NPC's)
OPMERKING: NPC's werden afgeleid van H9-cellen met behulp van een dual-Smad-remmingsprotocol, zoals eerder beschreven19.
- Behandel in het kort H9-cellen met celdissociatiereagens bij 37 °C gedurende 5 minuten om enkele cellen te genereren en resuspendatie in volledige groeimedia met mTeSR1 aangevuld met 10 ng / ml basis fibroblastgroeifactor (bFGF), penicilline / streptomycine (P / S) en 10 μM ROCK-remmer (RI). Zaad op 1:50 verdunde Matrigel-gecoate 6-well celkweekschalen met een dichtheid van 60.000 cellen /cm2 (dag 0).
- Initieer differentiatie wanneer de cellen 95% -100% confluentie bereiken door te veranderen in 100% KSR-media met LDN193189 (200 nM) en SB431542 (10 μM) (dag 1).
- Verander op dag 2 de media opnieuw met 100% KSR aangevuld met LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) en XAV939 (5 μM).
- Schakel op dag 4 van de differentiatie over op een mengsel van KSR-medium (75%) en N2-medium (25%) met LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) en XAV939 (5 μM).
- Schakel van dag 6 tot dag 12 geleidelijk de media over naar 100% N2 aangevuld met LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) en XAV939 (5 μM) door de N2-media elke dag met 25% te verhogen en de media na elke 2 dagen te veranderen.
- Cultuurdag 12 NPC's in N2:B27 media aangevuld met 20 ng/ml bFGF.
- Zaad 2 x 105 cellen in elke put van een 1:50 verdunde complete keldermembraan matrix-gecoate P6-plaat in 2 ml NPC-cultuurmedia en incubeer om de cellen te laten hechten.
- Infecteer de cellen de volgende dag met lentivirale deeltjes bij een MOI 6 in aanwezigheid van 8 μg/ml polybreen.
- Vervang na 8 uur de virusbevattende media door verse NPC-groeimedia.
- Herhaal de volgende dag de infecties en verander de media om 8 uur.
- Houd de cellen 72 uur in cultuur voordat u ze oogst voor verdere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na genoverdracht is onvermijdelijk een hoge levensvatbaarheid van hESCs vereist. Ondanks de inspanningen en optimalisatie van protocollen om celdood na elektroporatie van hESCs te verminderen, wordt nog steeds meer dan 50% celdood waargenomen na elektroporatie van deze cellen, samen met een lage transfectie-efficiëntie20. Lentivirale gemedieerde genoverdracht resulteert niet alleen in een hoge efficiëntie van genoverdracht, maar toont ook hoge niveaus van cel levensvatbaarheid na transductie. De onderstaande resultaten presenteren twee benaderingen: een met GFP als reporter en voorbijgaande expressie in hESCs-afgeleide NPC's en de andere met puromycine voor de stabiele selectie van hESCs voor langetermijndifferentiatie-experimenten.
In de eerste reeks experimenten werden lentivirale deeltjes geproduceerd door shRNA's te co-transfecteren die de pll3.7-vector met GFP als verslaggever droegen, samen met de tweede generatie lentivirale verpakkingsplasmiden psPAX2.0 en pMD2.G. Lentivirale deeltjes werden verzameld na 48 uur en 72 uur na transfectie en geconcentreerd met behulp van ultracentrifugatie. Figuur 1A toont de overvloedige GFP-expressie in HEK293T-cellen na 72 h transfectie. De expressie van virale eiwitten resulteerde ook in syncytievorming van HEK293T-cellen waarbij afzonderlijke cellen samensmolten, zoals weergegeven door pijlen in figuur 1A. De titers werden bepaald met behulp van FACS-analyse. We vergeleken ook de lentivirale titers met behulp van goedkope PEI en Lipofectamine 3000-reagens en vonden geen significant verschil tussen de twee in termen van virale titers (figuur 2A). Vervolgens werden H9 hESCs-afgeleide NPC's tweemaal geïnfecteerd met deze GFP-bevattende lentivirale deeltjes bij een MOI van 6 en geoogst voor analyse na 72 h. Figuur 1B toont een duidelijke expressie van GFP in NPC's na infectie. Zoals hierboven besproken, is het voor langetermijndifferentiatie-experimenten noodzakelijk om hESCs te hebben die stabiel shRNA's uitdrukken. In een poging om stabiele cellijnen te creëren die shRNA tot expressie brengen voor verschillende genen, gebruikten we plKO.1-gebaseerde vectoren en gekloonde shRNA's volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Vervolgens werden lentivirale deeltjes geproduceerd zoals hierboven beschreven en werden titers bepaald met behulp van een commerciële lentivirale titermeetkit met behulp van op qPCR gebaseerde methoden (figuur 2B). hESCs werden geïnfecteerd met lentivirale deeltjes bij een MOI van 10 en geselecteerd met behulp van puromycineselectie. Figuur 3 toont de resultaten van een stabiele selectie van hESCs na transductie. Na 5 dagen selectie met 0,8 μg/ml puromycine vertoonden lentivirale getransfecteerde cellen meer dan 80% cel levensvatbaarheid in vergelijking met niet-getransduceerde cellen, waar geen cellen de behandeling overleefden. Na de selectie werden de stabiel getransduceerde H9-cellen verder uitgebreid, gecryopreserveerd en geanalyseerd met behulp van western blot om te testen voor efficiënte gen knockdown.
In ons laboratorium hebben we meerdere stabiele cellijnen van H9 hESCs gecreëerd die shRNA's tot expressie brengen voor verschillende genen met behulp van de bovenstaande aanpak. Hier hebben we de resultaten gepresenteerd van een daarvan, namelijk het L-2-hydroxyglutaraatdehydrogenase (L2HGDH) -gen met behulp van western blot-analyse. Overvloedige expressie van L2HGDH wordt waargenomen in cellen getransduceerd met lege vectorruggegraat. Er wordt echter geen expressie van L2HGDH waargenomen in cellen die worden getransduceerd met een vector die shRNA's draagt voor L2HGDH, waaruit de werkzaamheid blijkt van de stabiele generatie van een H9 hESCs-cellijn met verminderde expressie van L2HGDH, die kan worden gebruikt voor verdere differentiatiestudies (figuur 4).
Figuur 1: Expressie van GFP in HEK293T-cellen en viraal geïnfecteerde NPC's. (A) shRNA's werden gekloond in een pll3.7-vector met GFP als reporter en co-getransfecteerd met verpakkingsplasmiden in HEK293T-cellen met behulp van PEI. De hoge GFP-expressie toont een efficiënte transfectie-efficiëntie na 72 h transfectie. Pijlen wijzen op syncytiavorming in de HEK293T-cellen, waar groepen individuele HEK293T-cellen zijn samengesmolten als gevolg van de expressie van virale eiwitten. (B) H9-afgeleide NPC's werden tweemaal geïnfecteerd bij een MOI van 6 met lentivirale deeltjes die GFP als reporter bevatten, en GFP-expressie werd waargenomen bij 72 uur na infectie. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: LVS-titermetingen. (A) Virale titers voor op pll3.7 gebaseerde vectoren werden gemeten met behulp van FACS-analyse door de %GFP-positieve cellen te kwantificeren voor die virale verdunningen die 2% -20% GFP-positieve cellen gaven. (B) Virale titers voor op pLKO.1 gebaseerde vectoren werden bepaald met behulp van een commerciële qPCR lentivirustiterkit, volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Vaststelling van stabiele shRNA-expresserende H9 hESC-lijnen. shRNA's werden gekloond in op pLKO.1 gebaseerde lentivirale vectoren die het puromycineselectiegen dragen. H9 hESCs werden geïnfecteerd met lentivirale deeltjes bij een MOI van 10 en geselecteerd met puromycine. Met behulp van 0,8 μg / ml puromycine gedurende 5 dagen, werd 100% van de niet-geïnfecteerde cellen gedood, terwijl de meeste cellen de behandeling in de virale geïnfecteerde groep overleefden. Deze cellen werden uitgebreid zonder klonale selectie voor cryopreservatie en verdere analyse. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Een representatieve western blot analyse voor stabiele knockdown van het L2HGDH gen in H9 hESCs. Totale cellysaten van negatieve controle (H9, puro uncut) cellen, evenals cellen die stabiel shRNA's tot expressie brengen tegen L2HGDH (H9, sh-L2HGDH) werden onderworpen aan western blot met behulp van het anti-L2HGDH-antilichaam. Zoals te zien is in de figuur, werd er geen expressie van L2HGDH waargenomen in H9 hESCs die stabiel shRNA's uitdrukken voor L2HGDH. Een niet-specifieke band werd waargenomen net boven de specifieke band die overeenkomt met het juiste molecuulgewicht van 46-48 kDa (aangegeven door een driehoek) voor het L2HGDH-antilichaam. Anti-GAPDH werd gebruikt als laadcontrole. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het vermogen om stamcellen genetisch te modificeren voor studie of klinische doeleinden wordt beperkt door zowel technologie als het basisbegrip van de biologie van hESCs. Technieken die een aanzienlijk potentieel hebben aangetoond in muis-SER's, zoals lipofectie en elektroporatie, zijn niet erg efficiënt voor hESCs, die notoir moeilijk zijn voor genafgifte met conventionele methoden20. Dit idee heeft niet alleen geleid tot de optimalisatie van bestaande technieken, maar ook tot de ontwikkeling van nieuwe methoden voor verhoogde transfectie-efficiëntie in hESCs. De focus van deze nieuwe ontwikkelingen lag op efficiënte en stabiele genafgifte aan hESCs met behoud van een minimaal effect op de groei, pluripotentie en differentiatiepotentieel van hESCs gedurende langere perioden. Een van de verschillende nieuwe ontwikkelingen die aan deze strenge criteria voldoen, is lentivirale gemedieerde genoverdracht naar hESCs21,22. Voor de productie van lentivirale deeltjes die een bepaald gen tot expressie brengen, wordt het gewenste gen gekloond in een van de transfervectoren en getransfecteerd in HEK293T-cellen samen met verpakkingsplasmiden om een celkweeksupernatant te oogsten dat lentivirale deeltjes bevat. Voor gebruik in hESCs is het essentieel om deze virale deeltjes te concentreren met behulp van verschillende technieken om hoge titers van virussen te produceren, ten minste in het bereik van 1 x 107-1 x 108 IE / ml. Over het algemeen worden grote volumes LVS geconcentreerd van 200x-500x het oorspronkelijke volume om deze titers te bereiken. Dit betekent dat het gebruik van een zeer kosteneffectieve methode zonder afbreuk te doen aan de transfectie-efficiëntie in HEK293T-cellen een voorwaarde is voor het routinematig gebruik van deze methoden in het laboratorium. De huidige methode beschrijft het gebruik van het kationische polymeer PEI als een kosteneffectieve methode om grote volumes LVS te produceren met een transfectie-efficiëntie vergelijkbaar met op lipofectie gebaseerde methoden, die als gouden standaard worden beschouwd. Met behulp van de gepresenteerde methode kunnen we gemiddelde LVS-titers ruim boven 5 x 107 IE / ml krijgen na een concentratiefactor van 200x het oorspronkelijke volume. Met behulp van deze LVS-deeltjes hebben we verschillende stabiele cellijnen van H9 hESCs kunnen vaststellen die shRNA's tot expressie brengen voor verschillende genen door de cellen op hoge MOIs te infecteren. De hier gepresenteerde methode omzeilt het gebruik van vervelende en tijdrovende methoden van klonale selectie en expansie, terwijl het nog steeds knockdown-efficiënties van bijna 100% krijgt, zoals blijkt uit een van de representatieve western blot-resultaten voor L2HGDH-gen knockdown in figuur 4. Hieronder volgen enkele van de aanbevelingen voor een succesvolle aanpak.
Het gebruik van een laag passage aantal HEK293T-cellen is vereist (idealiter minder dan 30) voor hoge virale titers. De samenvloeiing van HEK293T-cellen is een andere belangrijke factor in dit verband. HEK293T-cellen moeten vóór transfectie voor ten minste 80% confluent zijn, omdat cel-celcontact de cytotoxiciteit sterk vermindert en de virusproductie verbetert. De gebruikte vectoren moeten worden bereid met behulp van endotoxinevrije plasmide-isolatiekits, gevolgd door ethanolprecipitatie en gereconstitueerd met een minimumconcentratie van 1 mg / ml vóór gebruik voor transfectie. Er kunnen batch-to-batch variaties van PEI-oplossingen worden bereid op verschillende data. Om die reden moet elke partij PEI-oplossing eerst op prestaties worden getest met behulp van GFP-vectoren en moet de oplossing worden bewaard bij −20 °C in aliquots voor eenmalig gebruik om herhaalde vries-dooicycli te voorkomen. Voor hoge titers wordt het verzamelen van LVS-supernatant na 72 uur transfectie van HEK293T-cellen alleen aanbevolen als de cellen gezond en gehecht zijn. Filtratie van het LVS-bevattende supernatant verhoogt de oplosbaarheid van LVS na ultracentrifugatie aanzienlijk. Het wordt afgeraden om het LVS-supernatant langer dan 5 dagen bij 4 °C te bewaren, omdat dit zal resulteren in een significante vermindering van virustiters. Sucrose gradiënt tijdens ultracentrifugatie is vereist voor optimale titers. De temperatuur moet tijdens alle stappen van ultracentrifugatie dicht bij 4 °C worden gehouden. Nachtelijke incubatie van geconcentreerde LVS-deeltjes in DPBS is vereist voor volledige resuspensie. Centrifugatie na resuspensie van LVS verwijdert cellulair puin (indien aanwezig) omdat het cytotoxiciteit kan veroorzaken bij gebruik op doelcellen. Na de infectie van H9-cellen is het belangrijk om de virusbevattende media na 8 uur te vervangen door verse groeimedia, omdat langdurige incubatie met het virus zou leiden tot een aanzienlijke celdood van de H9 hESCs. De puromycineselectie mag alleen worden gestart wanneer de samenvloeiing meer dan 80% is.
De hierboven beschreven methode is oorspronkelijk aangepast voor de expressie van shRNA's. Een vergelijkbare benadering zou kunnen worden gebruikt om de ectopische expressie van cDA's te klonen in expressievectoren. Een belangrijke beperking van lentivirale gemedieerde genafgifte is echter de groottebeperking. Naarmate de grootte toeneemt, is de verpakking van lentivirale vectoren niet optimaal, wat resulteert in verminderde virale titers23. Toekomstig onderzoek moet gericht zijn op het optimaliseren van het protocol om deze beperkingen te overwinnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door onderzoeksbeurzen van de United Arab Emirates University (UAEU), grant # 31R170 (Zayed Center for Health Sciences) en # 12R010 (UAEU-AUA-beurs). We bedanken Prof Randall Morse (Wadsworth Center, Albany, NY) voor het helpen bewerken van het manuscript voor stijl en grammatica.
Alle gegevens zijn op aanvraag beschikbaar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 31350010 | |
| 38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes | Beckman Coulter | C14292 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| bFGF Recombinant human | Invitrogen | PHG0261 | |
| Bovine serum albumin FRAC V | Invitrogen | 15260037 | |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | |
| Cyclopamine | Stem Cell Technologies | 72074 | |
| DMEM media | Invitrogen | 11995073 | |
| DMEM Nutrient mix F12 | Invitrogen | 11320033 | |
| DPBS w/o: Ca and Mg | PAN Biotech | P04-36500 | |
| Fetal bovie serum | Invitrogen | 10270106 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody | CST | 2118S | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
| HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution | GE healthcare | SH30238.01 | |
| L Glutamine, 100X | Invitrogen | 2924190090 | |
| L2HGDH Polyclonal antibody | Proteintech | 15707-1-AP | |
| L2HGDH shRNA | Macrogen | Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT | |
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher | L3000001 | |
| mTesR1 complete media | Stem Cell Technologies | 85850 | |
| Neurobasal medium 1X CTS | Invitrogen | A1371201 | |
| Neuropan 2 Supplement 100x | PAN Biotech | P07-11050 | |
| Neuropan 27 Supplement 50x | PAN Biotech | P07-07200 | |
| Penicillin streptomycin SOL | Invitrogen | 15140122 | |
| pLKO.1 TRC vector | Addgene | 10878 | |
| pLL3.7 vector | Addgene | 11795 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Polybrene infection reagent | Sigma | TR1003- G | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma | 408727 | |
| psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
| Purmorphamine | Tocris | 4551/10 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride |
Tocris | 1254 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614/10 | |
| Trypsin .05% EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| XAV 939 | Tocris | 3748/10 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in vitro. Nature Biotechnology. 18 (4), 399-404 (2000).
- Strulovici, Y., Leopold, P. L., O'Connor, T. P., Pergolizzi, R. G., Crystal, R. G. Human embryonic stem cells and gene therapy. Molecular Therapy. 15 (5), 850-866 (2007).
- Kane, N., McRae, S., Denning, C., Baker, A. Viral and nonviral gene delivery and its role in pluripotent stem cell engineering. Drug Discovery Today. Technologies. 5 (4), 105 (2008).
- Li, S. D., Huang, L. Nonviral is superior to viral gene delivery. Journal of Controlled Release. 123 (3), 181-183 (2007).
- Mastrobattista, E., Bravo, S. A., vander Aa, M., Crommelin, D. J. Nonviral gene delivery systems: From simple transfection agents to artificial viruses. Drug Discovery Today. Technologies. 2 (1), 103-109 (2005).
- Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection. Biotechnology Progress. 22 (3), 825-834 (2006).
- Sukhorukov, V. L., et al. Surviving high-intensity field pulses: Strategies for improving robustness and performance of electrotransfection and electrofusion. The Journal of Membrane Biology. 206 (3), 187-201 (2005).
- Floch, V., et al. Cationic phosphonolipids as non viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells. Blood Cells, Molecules and Diseases. 23 (1), 69-87 (1997).
- Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22 (4), 531-543 (2004).
- Siemen, H., et al. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (4), 378-383 (2005).
- Zhang, X., Godbey, W. T. Viral vectors for gene delivery in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (4), 515-534 (2006).
- Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors. Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).
- Gropp, M., et al. Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors. Molecular Therapy. 7 (2), 281-287 (2003).
- Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 796991 (2021).
- Merten, O. W., Hebben, M., Bovolenta, C.
- Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Göpferich, A. Polyethylenimine-based nonviral gene delivery systems. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).
- Parween, S., et al. Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation during in-vitro human embryonic cortical neurogenesis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 415 (2017).
- Weissinger, F., et al. Gene transfer in purified human hematopoietic peripheral-blood stem cells by means of electroporation without prestimulation. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141 (2), 138-149 (2003).
- Cui, Y., et al. Targeting transgene expression to antigen-presenting cells derived from lentivirus-transduced engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells. Blood. 99 (2), 399-408 (2002).
- Yu, X., et al. Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells. Molecular Therapy. 7 (6), 827-838 (2003).
- Sweeney, N. P., Vink, C. A. The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 21, 574-584 (2021).
