Summary
Используя недорогой катионный полимер полиэтиленимин (PEI), мы произвели лентивирусные частицы для стабильной экспрессии шРНК в эмбриональных стволовых клетках человека H9 (hESCs) и транзиторно трансдуцированных нейронных клетках-предшественниках H9 (NPC) с высокой эффективностью.
Abstract
Текущий протокол описывает использование лентивирусных частиц для доставки коротких шпильковых РНК (шРНК) как к эмбриональным стволовым клеткам человека (hESCs), так и к нейронным клеткам-предшественникам (NPC), полученным из hESCs с высокой эффективностью. Лентивирусные частицы генерировали путем котрансфекции клеток HEK293T с использованием входных векторов (несущих шРНК) вместе с упаковочными плазмидами (pAX и pMD2.G) с использованием недорогого катионного полимера полиэтиленимина (PEI). Вирусные частицы концентрировали с помощью ультрацентрифугирования, что приводило к средним титрам выше 5 х 107. Как hESCs, так и NPC могут быть инфицированы с высокой эффективностью с использованием этих лентивирусных частиц, как показано отбором пуромицина и стабильной экспрессией в hESCs, а также транзиторной экспрессией GFP в NPC. Кроме того, анализ вестерн-блот показал значительное снижение экспрессии генов, нацеленных на шРНК. Кроме того, клетки сохраняли свою плюрипотентность, а также дифференцировочный потенциал, о чем свидетельствует их последующая дифференцировка в различные линии ЦНС. Действующий протокол касается доставки шРНК; однако тот же подход может быть использован для эктопической экспрессии кДНК для исследований гиперэкспрессии.
Introduction
Эмбриональные стволовые клетки человека (hESCs), полученные из внутренней клеточной массы бластоцисты, являются плюрипотентными и могут быть дифференцированы в различные типы клеток в зависимости от внешних факторов в условиях in vitro 1,2. Чтобы в полной мере использовать потенциал hESCs, необходимо иметь быстрые и надежные методы доставки генов для этих клеток. Условно используемые методы можно в широком смысле классифицировать на два типа: невирусные и вирусные системы доставки генов 3,4. Наиболее часто используемыми невирусными системами доставки генов являются липофекция, электропорация и нуклеофекция. Невирусные системы доставки являются выгодными из-за меньшего количества мутаций вставки и общего снижения иммуногенности 5,6. Однако эти методы приводят к низкой эффективности трансфекции и короткой продолжительности экспрессии транзиторных генов, что является основным ограничением для долгосрочных исследований дифференцировки7. Электропорация приводит к лучшей эффективности трансфекции по сравнению с липофекцией; однако это приводит к гибели более 50% клеток 8,9,10. Используя нуклеофекцию, выживаемость клеток и эффективность трансфекции могут быть улучшены путем сочетания липофекции и электропорации, но подход требует клеточных буферов и специализированного оборудования и, таким образом, становится довольно дорогостоящим для масштабируемых приложений11,12.
Напротив, вирусные векторы показали улучшенную эффективность трансфекции, а также общую низкую цитотоксичность после трансдукции. Кроме того, доставленные гены стабильно экспрессируются и, следовательно, делают этот метод идеальным для долгосрочных исследований13. Среди наиболее часто используемых вирусных векторов для доставки генов в hESCs - лентивирусные векторы (LVS), которые могут дать более 80% эффективности трансдукции с использованием высоких титров вирусных частиц14,15. Липофекция и осаждение CaPO4 являются одними из наиболее часто используемых методов временной трансфекции клеток HEK293T или их производных с помощью векторов переноса генов вместе с упаковкой плазмид для получения лентивирусных частиц16. Хотя липофекция приводит к хорошей эффективности трансфекции и низкой цитотоксичности, методу препятствует его стоимость, и масштабирование для получения высоких титров лентивирусных частиц было бы очень дорогостоящим. Осаждение CaPO4 приводит к относительно сходной эффективности трансфекции с теми, которые получены с помощью липофекции. Несмотря на рентабельность, осаждение CaPO4 приводит к значительной гибели клеток после трансфекции, что затрудняет стандартизацию и позволяет избежать вариаций от партии к партии17. В этом сценарии разработка метода, который дает высокую эффективность трансфекции, низкую цитотоксичность и экономическую эффективность, имеет решающее значение для производства высокотитерных лентивирусных частиц, которые будут использоваться в гЭСК.
Полиэтиленимин (PEI) представляет собой катионный полимер, который может трансфектировать клетки HEK293T с высокой эффективностью без особой цитотоксичности и имеет незначительную стоимость по сравнению с методами18 на основе липофекции. В этой ситуации PEI может быть использован для расширенного применения производства LVS с высоким титром за счет концентрации лентивирусных частиц из супернатантов культуры с использованием различных методов. В представленной статье описано применение PEI для трансфекции клеток HEK293T и концентрации лентивирусных векторов с использованием ультрацентрифугирования через сахарозную подушку. Используя этот метод, мы регулярно получаем титры значительно выше 5 x 107 МЕ/мл с низкими вариациями от партии к партии. Метод прост, прост и экономически эффективен для масштабируемых приложений для доставки генов в гЭСК и клетки, полученные из гЭСК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Трансфекция клеток HEK293T с использованием реагента PEI или Lipofectamine 3000
- Культивирование клеток HEK293T в DMEM + 10% FBS + 1x пенициллин/стрептомицин при 37 °C в увлажненном инкубаторе с атмосферой 5% CO2 и 21% O2 до тех пор, пока они не станут 90% сливающимися перед посевом для трансфекции. Используйте относительно низкое количество прохождения клеток для производства вируса с высоким титром (в идеале менее P30).
- Семена 4 х 106 клеток в 10 мл полной питательной среды в 100 мм тканевой культуральной пластине и растут в течение ночи в инкубаторе культуры увлажненной ткани с атмосферой 5% CO2 и 21% O2.
- Для каждой трансфекции разбавляют плазмидную ДНК (запасы 1 мг/мл) в 1 мл свободной от сыворотки среды DMEM в центрифужных пробирках объемом 1,5 мл, используя следующее соотношение плазмид входа и упаковки:
Входной вектор = 10 мкг
psPAX2.0 = 7.5 мкг
pMD2.G = 5 мкг - Вихрь в течение 10 с и вращение трубки при 10 000 х г в течение 30 с при комнатной температуре для сбора.
- Добавьте 70 мкл (1 мг/мл стокового раствора) PEI в трубку, а затем кратковременно вращайте и вращайте, как описано выше, чтобы собрать. Объем используемого PEI основан на соотношении 1:3 общей ДНК (мкг) :P EI (мкг).
- Для трансфекции на основе липофектамина разводят вышеуказанные векторы в 500 мкл бессывороточной DMEM-среды, содержащей 45 мкл реагента Р, поставляемого в комплекте, и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Разбавить 70 мкл реагента L, поставляемого в комплекте, используя 500 мкл бессывороточной DMEM среды, и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Соедините содержимое обоих трубок и инкубируйте трубки при комнатной температуре в течение 20 минут, чтобы обеспечить образование комплекса.
- Добавьте по каплям 1 мл ДНК/PEI или 1 мл комплексов ДНК/липофектамина к пластине, содержащей клетки, и инкубируйте в течение 6 ч при 37 °C в увлажненном инкубаторе с атмосферой 5% CO2 и 21% O2.
- Через 6 ч переходят на свежие полные питательные среды (10 мл) и возвращают клетки обратно в увлажненный инкубатор с атмосферой 5% CO2 и 21%O2.
2. Сбор LVS и ультрацентрифугирование
- После 2 дней трансфекции соберите вирусосодержащую среду и снова наложите на клетки 10 мл свежих полноценных питательных сред.
- После 3 дней трансфекции соберите вирусосодержащую среду и объедините ее с вируссодержащей средой, собранной в 2-дневный момент времени.
- Центрифугировать вирусный супернатант при 2000 х г в течение 10 мин при 4 °C в гранулированный клеточный мусор.
- Фильтруйте супернатант с помощью фильтра с низким содержанием белка размером пор 0,45 мкм (PES или SFCA) и храните при 4 °C до готовности к ультрацентрифугированию. Фильтрованный супернатант, содержащий лентивирусные частицы, может храниться при 4 °C в течение 5 дней без значительной потери вирусных титров.
- Стерилизуйте ультрацентрифужные трубки, удерживающие чашки, промыв их 70% этанолом в течение 10 минут, высушите на воздухе, закройте и держите при температуре 4 °C.
- Добавьте 36 мл фильтрованного материала, содержащего лентивирусные частицы, в стерильную ультрацентрифужную трубку.
- Заполните 5 мл стерильной полосы 4 мл стерильного 20% раствора сахарозы (приготовленного в PBS) и дозируйте его прямо на дно ультрацентрифужной трубки (UC), содержащей LVS. Важно, чтобы раствор сахарозы не смешивался со средой и делал градиент в нижней части трубки.
- Сбалансируйте все ультрацентрифужные трубки с помощью бессывороточной среды DMEM, поместите в холодную ультрацентрифужную трубку, удерживающую чашки, и закройте крышки.
- Вращайте трубки при 125 000 х г в течение 2 ч при 4 °C.
- После отжима осторожно выбросьте супернатант, перевернув содержимое трубки в контейнер, содержащий отбеливатель, не нарушая гранулу. Отметьте гранулу, если она видна.
- Поместите ультрацентрифужную трубку в стерильную трубку объемом 50 мл и добавьте 200 мкл стерильного DPBS точно в верхнюю часть гранулы. Хранить при температуре 4 °C в течение ночи без помех.
- На следующий день аккуратно перемешайте, пипеткой вверх и вниз 40x.
- Ненадолго вращайте при 13 000 х г в настольной центрифуге, чтобы гранулировать любой мусор.
- Перенесите супернатант в новую трубку и аликвотируйте препарат вируса в виде 20 мкл аликвот. Хранить при температуре −80 °C.
- Откладывают 5 мкл препарата для измерения титра вируса.
3. Измерение титра LVS для векторов на основе pLKO.1
- Определите титр лентивирусных частиц с помощью qPCR в соответствии с рекомендациями производителя.
- Для стандартной кривой подготовьте пять 10-кратных последовательных разведений стандартной контрольной ДНК (поставляемой в комплекте) путем разбавления 5 мкл ДНК в 45 мкл свободного от нуклеазыH2Oна каждой стадии. Используйте разбавления от 1:100 до 1:100 000 для создания стандартной кривой.
- Настраивайте реакции на льду в дубликатах следующим образом:
2x qPCR мастер микс 10 мкл
Грунтовочная смесь 2 мкл
Образец или стандарт ДНК 2 мкл
Не содержащий нуклеаз H2O 6 мкл - Выполняйте qPCR с использованием условий цикла, указанных в руководстве по эксплуатации комплекта, в общей сложности 35 циклов.
- Построение пороговых значений цикла (Ct) по оси Y и титру вируса по оси X.
- Генерация логарифмической регрессии с использованием четырех стандартных контрольных разведений ДНК (от 1:100 до 1:100 000) для определения титра неизвестного образца вируса с использованием уравнения линии тренда.
4. Измерение титра LVS для векторов на основе pll3.7
- Семена 1 х 105 клеток HEK293T в каждой лунке P12-луночной пластины в 1 мл полной питательной среды за 24 ч до заражения.
- Дополните среду полибреном 8 мкг/мл и добавьте 1 мл в каждую стерильную трубку объемом 1,5 мл.
- Разбавляют вирусные частицы, используя 4 мкл, 2 мкл, 1 мкл, 0,5 мкл и 0,1 мкл концентрированных лентивирусных частиц в каждом из 1 мл полибреносодержащей среды.
- Заменить среду из клеток HEK293T средой, содержащей указанные количества лентивирусных частиц вместе с полибреном 8 мкг/мл, и инкубировать в течение 24 ч при 37 °C в увлажненном инкубаторе с атмосферой 5% CO2 и 21% O2.
- На следующий день переходят на свежие носители и продолжают культивирование в течение 72 ч при 37 °C в увлажненном инкубаторе с атмосферой 5% CO2 и 21% O2.
- Через 72 ч промыть ячейки PBS, трипсинизировать при 37 °C по протоколу производителя и повторно использовать в 1 мл PBS.
- Выполняйте сортировку ячеек FACS с помощью сортировщика ячеек в соответствии с рекомендациями производителя. Установите затвор на 0% положительных клеток GFP с использованием неинфицированных клеток HEK293T и подсчитайте 50 000 событий для каждого образца, чтобы определить процент положительных клеток для каждого вирусного разведения.
- Используйте только объемы лентивирусных частиц, которые дают %GFP положительные клетки в диапазоне 2%-20% для расчета титра лентивирусных частиц.
5. Заражение гЭСК и стабильный отбор
- Промыть клетки 2 мл PBS, растущих в каждой лунке многолуночной пластины клеточной культуры с 6 лунками.
- Отсоедините клетки от пластины клеточной культуры с помощью 1 мл 1x клеточного диссоциационного реагента путем инкубации при 37 °C в течение 5 мин.
- Соберите ячейки в среде DMEM/F12 и центрифуге при 1,500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре для сбора гранулы ячейки.
- Аспират, повторно суспендируют клетки в 1 мл, и подсчитывают с помощью гемоцитометра.
- Сделать клеточную суспензию с 2 х 105 клетками / мл полной питательной среды, содержащей mTeSR1, дополненную 10 нг / мл основного фактора роста фибробластов (bFGF), пенициллина / стрептомицина (P / S) и ингибитора ROCK (RI) 10 мкМ (RI).
- Семена 1 х 105 клеток на 50x разбавлены полной базальной мембраной с матричным покрытием P24-луночных пластин в 500 мкл полной питательной среды и культивируют клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе с атмосферой 5% CO2 и 21% O2.
- На следующий день инфицируют гЭСК при кратности инфекции (MOI) 10 с полибреном 8 мкг/мл и инкубируют при 37 °C в течение 8 ч.
- Через 8 ч замените вируссодержащую среду свежими питательными средами (-RI) и продолжайте культивирование до тех пор, пока клетки не сольются на 90%.
- Начинают выделение пуромицина (0,8 мкг/мл), когда клетки достигают 90% конфлюентности, которая обычно составляет 48-72 ч после заражения.
- После завершения отбора (обычно через 4-6 дней) расщепляют стабильные клетки (1:4) и расширяют клетки для криоконсервации и дальнейшего анализа.
6. Трансдукция нейронных клеток-предшественников H9 (NPC)
ПРИМЕЧАНИЕ: NPC были получены из клеток H9 с использованием протокола двойного ингибирования Smad, как описано ранее19.
- Вкратце, обрабатывайте клетки H9 реагентом диссоциации клеток при 37 °C в течение 5 мин для получения одиночных клеток и повторного суспендирования в полной среде роста, содержащей mTeSR1, дополненную 10 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF), пенициллина/стрептомицина (P/S) и ингибитора ROCK 10 мкМ (RI). Семена на 1:50 разбавляют покрытые Матригелем 6-луночные чашки для культивирования клеток при плотности 60 000 клеток/см2 (день 0).
- Инициируют дифференцировку, когда клетки достигают 95%-100% конфлюзии, изменяясь на 100% KSR среды, содержащие LDN193189 (200 нМ) и SB431542 (10 мкМ) (день1).
- На 2-й день снова замените носитель 100% KSR, дополненным LDN193189 (200 нМ), SB431542 (10 мкМ) и XAV939 (5 мкМ).
- На 4-й день дифференциации переключитесь на смесь среды KSR (75%) и среды N2 (25%) с LDN193189 (200 нМ), SB431542 (10 мкМ) и XAV939 (5 мкМ).
- С 6-го по 12-й день постепенно переключайте носитель на 100% N2, дополненный LDN193189 (200 нМ), SB431542 (10 мкМ) и XAV939 (5 мкМ), увеличивая носитель N2 на 25% каждый день и меняя носитель через каждые 2 дня.
- День культуры 12 NPC в среде N2:B27 дополнен 20 нг/мл bFGF.
- Семена 2 х 105 клеток в каждой лунке 1:50 разбавлены полной базальной мембраной с покрытием P6-пластины в 2 мл культуральной среды NPC и инкубируют, чтобы позволить клеткам прикрепляться.
- На следующий день заражают клетки лентивирусными частицами при MOI 6 в присутствии полибрена 8 мкг/мл.
- Через 8 ч заменить вирусосодержащую среду свежими средами роста NPC.
- На следующий день повторите инфекции и смените среду через 8 ч.
- Храните клетки в культуре в течение 72 ч перед сбором урожая для дальнейшего анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После переноса генов неизбежно требуется высокая жизнеспособность гЭСК. Несмотря на усилия и оптимизацию протоколов по снижению гибели клеток после электропорации гЭСК, более 50% гибели клеток все еще наблюдается после электропорации этих клеток, наряду с низкой эффективностью трансфекции20. Лентивирусный опосредованный перенос генов не только приводит к высокой эффективности переноса генов, но и демонстрирует высокий уровень жизнеспособности клеток после трансдукции. В приведенных ниже результатах представлены два подхода: один с использованием GFP в качестве репортера и переходной экспрессии в NPC, полученных из hESCs, а другой с использованием puromycin для стабильного отбора hESCs для долгосрочных экспериментов по дифференцировке.
В первой серии экспериментов лентивирусные частицы были получены путем совместной трансфекции шРНК, несущих вектор pll3.7 с GFP в качестве репортера вместе с плазмидами лентивирусной упаковки второго поколения psPAX2.0 и pMD2.G. Лентивирусные частицы собирали после 48 ч и 72 ч после трансфекции и концентрировали с использованием ультрацентрифугирования. На рисунке 1A показана обильная экспрессия GFP в клетках HEK293T после 72 ч трансфекции. Экспрессия вирусных белков также привела к образованию синцитии клеток HEK293T, где отдельные клетки сливаются вместе, как показано стрелками на рисунке 1A. Титры были определены с помощью анализа FACS. Мы также сравнили лентивирусные титры с использованием недорогих реагентов PEI и Lipofectamine 3000 и не обнаружили существенной разницы между ними с точки зрения вирусных титров (рисунок 2A). Затем NPC, полученные из H9 hESCs, были дважды инфицированы этими ГФП-содержащими лентивирусными частицами при MOI 6 и собраны для анализа через 72 ч. На рисунке 1B показана выраженная экспрессия GFP у NPC после заражения. Как обсуждалось выше, для долгосрочных экспериментов по дифференциации крайне важно иметь гЭСК, которые стабильно экспрессируют шРНК. В попытке создать стабильные клеточные линии, экспрессирующие шРНК для различных генов, мы использовали векторы на основе plKO.1 и клонировали шРНК в соответствии с рекомендациями производителя. Затем лентивирусные частицы получали, как описано выше, и титры определяли с использованием коммерческого набора для измерения лентивирусного титра с использованием методов на основе qPCR (рисунок 2B). hESCs были инфицированы лентивирусными частицами при MOI 10 и выбраны с использованием отбора пуромицина. На рисунке 3 показаны результаты стабильного отбора гЭСК после трансдукции. После 5 дней отбора с 0,8 мкг / мл пуромицина лентивирусные трансфектированные клетки показали жизнеспособность клеток более чем на 80% по сравнению с нетрансдуцированными клетками, где ни одна клетка не пережила лечение. После отбора стабильно трансдуцированные клетки H9 были дополнительно расширены, криоконсервированы и проанализированы с использованием западного пятна для анализа эффективного нокдауна генов.
В нашей лаборатории мы создали несколько стабильных клеточных линий H9 hESCs, экспрессирующих шРНК для разных генов, используя вышеуказанный подход. Здесь мы представили результаты одного из них, который является геном L-2-гидроксиглутаратдегидрогеназы (L2HGDH) с использованием анализа вестерн-блоттинга. Обильная экспрессия L2HGDH наблюдается в клетках, трансдуцированных с пустой векторной магистралью. Однако экспрессия L2HGDH не наблюдается в клетках, трансдуцированных вектором, несущим шРНК для L2HGDH, что свидетельствует об эффективности стабильной генерации клеточной линии H9 hESCs со сниженной экспрессией L2HGDH, которая может быть использована для дальнейших исследований дифференцировки (рисунок 4).
Рисунок 1: Экспрессия GFP в клетках HEK293T и инфицированных вирусом NPC. (A) шРНК были клонированы в вектор pll3.7, несущий GFP в качестве репортера, и котрансфектированы упаковочными плазмидами в клетках HEK293T с использованием PEI. Высокая экспрессия GFP показывает эффективную эффективность трансфекции после 72 ч трансфекции. Стрелки указывают на образование синцитии в клетках HEK293T, где группы отдельных клеток HEK293T слились вместе из-за экспрессии вирусных белков. (B) NPC, полученные из H9, были инфицированы дважды при MOI 6 лентивирусными частицами, содержащими GFP в качестве репортера, и экспрессия GFP наблюдалась через 72 ч после заражения. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Измерения титра LVS. (A) Вирусные титры для векторов на основе pll3.7 были измерены с использованием анализа FACS путем количественной оценки %GFP положительных клеток для тех вирусных разведений, которые давали 2%-20% GFP положительных клеток. (B) Вирусные титры для векторов на основе pLKO.1 были определены с использованием коммерческого набора титров лентивируса qPCR в соответствии с рекомендациями производителя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Создание стабильных шРНК-экспрессирующих линий H9 hESC. шРНК были клонированы в лентивирусные векторы на основе pLKO.1, несущие ген селекции пуромицина. H9 hESCs были инфицированы лентивирусными частицами при MOI 10 и отобраны с использованием пуромицина. Используя 0,8 мкг/ мл пуромицина в течение 5 дней, 100% неинфицированных клеток были убиты, в то время как большинство клеток пережили лечение в вирус-инфицированной группе. Эти клетки были расширены без клонального отбора для криоконсервации и дальнейшего анализа. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативный анализ вестерн-блоттинга для стабильного нокдауна гена L2HGDH в H9 hESCs. Общие клеточные лизаты из отрицательных контрольных (H9, puro uncut) клеток, а также клетки, стабильно экспрессирующие шРНК против L2HGDH (H9, sh-L2HGDH), подвергались вестерн-блотированию с использованием антитела против L2HGDH. Как показано на рисунке, в H9 hESCs стабильно экспрессирующих шРНК для L2HGDH экспрессии L2HGDH не наблюдалось экспрессии L2HGDH. Неспецифическая полоса наблюдалась чуть выше специфической полосы, соответствующей правильной молекулярной массе 46-48 кДа (обозначенной треугольником) для антитела L2HGDH. Anti-GAPDH использовался в качестве контроля нагрузки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Способность генетически модифицировать стволовые клетки для изучения или клинических целей ограничена как технологией, так и базовым пониманием биологии hESCs. Методы, которые показали значительный потенциал в мышиных ЭСК, такие как липофекция и электропорация, не очень эффективны для hESCs, которые, как известно, трудны для доставки генов обычными методами20. Это понятие привело не только к оптимизации существующих методов, но и к разработке новых методов повышения эффективности трансфекции в hESCs. В центре внимания этих новых разработок была эффективная и стабильная доставка генов в hESCs при сохранении минимального влияния на рост, плюрипотентность и дифференцировочный потенциал hESC в течение длительных периодов времени. Среди различных новых разработок, которые соответствуют этим строгим критериям, - лентивирусный опосредованный перенос генов на hESCs21,22. Для производства лентивирусных частиц, экспрессирующих определенный ген, желаемый ген клонируется в одном из переносных векторов и трансфектируется в клетках HEK293T вместе с упаковкой плазмид для сбора супернатанта клеточной культуры, содержащего лентивирусные частицы. Для использования в hESCs важно концентрировать эти вирусные частицы с использованием различных методов для получения высоких титров вирусов, по крайней мере, в диапазоне 1 x 107-1 x 108 МЕ/мл. В целом, большие объемы LVS концентрируются от 200x-500x первоначального объема для достижения этих титров. Это означает, что использование высокоэффективного метода без ущерба для эффективности трансфекции в клетках HEK293T является необходимым условием для того, чтобы эти методы регулярно использовались в лаборатории. Настоящий способ описывает использование катионного полимера PEI в качестве экономически эффективного метода получения больших объемов LVS с эффективностью трансфекции, аналогичной методам на основе липофекции, которые считаются золотым стандартом. Используя представленный метод, мы можем получить средние титры LVS значительно выше 5 x 107 МЕ/мл после коэффициента концентрации в 200 раз от первоначального объема. Используя эти частицы LVS, мы смогли установить несколько стабильных клеточных линий H9 hESCs, экспрессирующих шРНК для нескольких генов, заражая клетки при высоких MOI. Метод, представленный здесь, обходит использование утомительных и трудоемких методов клонального отбора и расширения, в то же время получая эффективность нокдауна, близкую к 100%, как показано одним из репрезентативных результатов вестерн-блот для нокдауна гена L2HGDH на рисунке 4. Ниже приводятся некоторые рекомендации в отношении успешного подхода.
Для высоких вирусных титров требуется использование низкого проходного числа клеток HEK293T (в идеале ниже 30). Слияние клеток HEK293T является еще одним важным фактором в этом отношении. Клетки HEK293T должны быть не менее 80% сливающимися перед трансфекцией, поскольку клеточный контакт значительно снижает цитотоксичность и улучшает выработку вируса. Используемые векторы должны быть подготовлены с использованием наборов для изоляции плазмид без эндотоксинов с последующим осаждением этанола и восстановлены в минимальной концентрации 1 мг/мл перед использованием для трансфекции. Могут быть пособные вариации растворов PEI, приготовленных в разные даты. По этой причине каждая партия раствора PEI должна быть сначала проверена на производительность с использованием векторов GFP, и раствор должен храниться при температуре −20 °C в одноразовых аликвотах, чтобы избежать повторных циклов замораживания-оттаивания. Для высоких титров сбор супернатанта LVS после 72 ч трансфекции клеток HEK293T рекомендуется только при условии, что клетки здоровы и прикреплены. Фильтрация LVS-содержащего супернатанта значительно повышает растворимость LVS после ультрацентрифугирования. Не рекомендуется хранить супернатант LVS при 4 °C более 5 дней, так как это приведет к значительному снижению титров вируса. Градиент сахарозы при ультрацентрифугировании необходим для оптимальных титров. Температура должна поддерживаться вблизи 4 °C на всех этапах ультрацентрифугирования. Для полного повторного суспендирования требуется ночная инкубация концентрированных частиц LVS в DPBS. Центрифугирование после повторного суспендирования LVS удаляет клеточный мусор (если таковой имеется), поскольку он может вызвать цитотоксичность при использовании на клетках-мишенях. После заражения клеток H9 важно заменить вируссодержащую среду свежими питательными средами через 8 ч, так как длительная инкубация с вирусом приведет к значительной гибели клеток H9 hESCs. Отбор пуромицина следует начинать только тогда, когда слияние составляет более 80%.
Описанный выше способ был первоначально адаптирован для экспрессии шРНК. Аналогичный подход может быть использован для эктопической экспрессии cDNAs, которая будет клонирована в векторы экспрессии. Однако основным ограничением лентивирусной опосредованной доставки генов является ограничение размера. По мере увеличения размера упаковка лентивирусных векторов не является оптимальной, что приводит к снижению вирусных титров23. Будущие исследования должны быть направлены на оптимизацию протокола для преодоления этих ограничений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что конфликта интересов нет.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана исследовательскими грантами Университета Объединенных Арабских Эмиратов (ОАЭУ), грантом No 31R170 (Центр медицинских наук Зайеда) и No 12R010 (грант ОАЭУ-АУА). Мы благодарим профессора Рэндалла Морса (Центр Уодсворта, Олбани, Нью-Йорк) за помощь в редактировании рукописи для стиля и грамматики.
Все данные предоставляются по запросу.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 31350010 | |
| 38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes | Beckman Coulter | C14292 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| bFGF Recombinant human | Invitrogen | PHG0261 | |
| Bovine serum albumin FRAC V | Invitrogen | 15260037 | |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | |
| Cyclopamine | Stem Cell Technologies | 72074 | |
| DMEM media | Invitrogen | 11995073 | |
| DMEM Nutrient mix F12 | Invitrogen | 11320033 | |
| DPBS w/o: Ca and Mg | PAN Biotech | P04-36500 | |
| Fetal bovie serum | Invitrogen | 10270106 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody | CST | 2118S | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
| HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution | GE healthcare | SH30238.01 | |
| L Glutamine, 100X | Invitrogen | 2924190090 | |
| L2HGDH Polyclonal antibody | Proteintech | 15707-1-AP | |
| L2HGDH shRNA | Macrogen | Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT | |
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher | L3000001 | |
| mTesR1 complete media | Stem Cell Technologies | 85850 | |
| Neurobasal medium 1X CTS | Invitrogen | A1371201 | |
| Neuropan 2 Supplement 100x | PAN Biotech | P07-11050 | |
| Neuropan 27 Supplement 50x | PAN Biotech | P07-07200 | |
| Penicillin streptomycin SOL | Invitrogen | 15140122 | |
| pLKO.1 TRC vector | Addgene | 10878 | |
| pLL3.7 vector | Addgene | 11795 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Polybrene infection reagent | Sigma | TR1003- G | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma | 408727 | |
| psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
| Purmorphamine | Tocris | 4551/10 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride |
Tocris | 1254 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614/10 | |
| Trypsin .05% EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| XAV 939 | Tocris | 3748/10 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in vitro. Nature Biotechnology. 18 (4), 399-404 (2000).
- Strulovici, Y., Leopold, P. L., O'Connor, T. P., Pergolizzi, R. G., Crystal, R. G. Human embryonic stem cells and gene therapy. Molecular Therapy. 15 (5), 850-866 (2007).
- Kane, N., McRae, S., Denning, C., Baker, A. Viral and nonviral gene delivery and its role in pluripotent stem cell engineering. Drug Discovery Today. Technologies. 5 (4), 105 (2008).
- Li, S. D., Huang, L. Nonviral is superior to viral gene delivery. Journal of Controlled Release. 123 (3), 181-183 (2007).
- Mastrobattista, E., Bravo, S. A., vander Aa, M., Crommelin, D. J. Nonviral gene delivery systems: From simple transfection agents to artificial viruses. Drug Discovery Today. Technologies. 2 (1), 103-109 (2005).
- Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection. Biotechnology Progress. 22 (3), 825-834 (2006).
- Sukhorukov, V. L., et al. Surviving high-intensity field pulses: Strategies for improving robustness and performance of electrotransfection and electrofusion. The Journal of Membrane Biology. 206 (3), 187-201 (2005).
- Floch, V., et al. Cationic phosphonolipids as non viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells. Blood Cells, Molecules and Diseases. 23 (1), 69-87 (1997).
- Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22 (4), 531-543 (2004).
- Siemen, H., et al. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (4), 378-383 (2005).
- Zhang, X., Godbey, W. T. Viral vectors for gene delivery in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (4), 515-534 (2006).
- Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors. Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).
- Gropp, M., et al. Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors. Molecular Therapy. 7 (2), 281-287 (2003).
- Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 796991 (2021).
- Merten, O. W., Hebben, M., Bovolenta, C.
- Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Göpferich, A. Polyethylenimine-based nonviral gene delivery systems. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).
- Parween, S., et al. Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation during in-vitro human embryonic cortical neurogenesis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 415 (2017).
- Weissinger, F., et al. Gene transfer in purified human hematopoietic peripheral-blood stem cells by means of electroporation without prestimulation. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141 (2), 138-149 (2003).
- Cui, Y., et al. Targeting transgene expression to antigen-presenting cells derived from lentivirus-transduced engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells. Blood. 99 (2), 399-408 (2002).
- Yu, X., et al. Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells. Molecular Therapy. 7 (6), 827-838 (2003).
- Sweeney, N. P., Vink, C. A. The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 21, 574-584 (2021).
