Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Rekonstituering av membranbundet minimal aktin cortices på støttede lipid dobbeltlag

Published: July 12, 2022 doi: 10.3791/63968
Automatic Translation
1, 2, 2, 2
1Centre for Mechanochemical Cell Biology and Division of Biomedical Sciences, Warwick Medical School, University of Warwick, 2National Centre for Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research

Summary

Denne protokollen beskriver dannelsen av støttede lipid-dobbeltlag og tilsetning av cytoskeletale filamenter og motorproteiner for å studere dynamikken i rekonstituerte, membranbundne cytoskeletale nettverk ved bruk av fluorescensmikroskopi.

Abstract

Overflaten av en levende celle gir en allsidig aktiv plattform for mange cellulære prosesser, som oppstår fra samspillet mellom plasmamembranen og den underliggende aktinbarken. I de siste tiårene har rekonstituerte, minimale systemer basert på støttede lipid-dobbeltlag i kombinasjon med aktinfilamentnettverk vist seg å være svært medvirkende til å avdekke grunnleggende mekanismer og konsekvenser av membranbundne aktinnettverk, samt i å studere funksjonene til individuelle membranassosierte proteiner. Her beskriver vi hvordan man rekonstituerer slike aktive komposittsystemer in vitro som består av væskestøttede lipid-dobbeltlag koblet via membranassosierte aktinbindende proteiner til dynamiske aktinfilamenter og myosinmotorer som lett kan observeres via total intern refleksjonsfluorescensmikroskopi. En åpen kammerdesign gjør det mulig å sette sammen systemet trinnvis og systematisk kontrollere mange parametere som linkerproteinkonsentrasjon, aktinkonsentrasjon, aktinfilamentlengde, aktin / myosinforhold, samt ATP-nivåer. Til slutt diskuterer vi hvordan du kontrollerer kvaliteten på systemet, hvordan du oppdager og feilsøker vanlige problemer, og noen begrensninger i dette systemet i forhold til den levende celleoverflaten.

Introduction

Plasmamembranen til en levende dyrecelle interagerer kontinuerlig med det tilstøtende aktincytoskelettet, og sammen danner de et aktivt komposittmateriale som oppfyller en rekke cellulære funksjoner 1,2. For å studere prosesser ved dette lipidmembran-aktingrensesnittet har rekonstituering av cytoskjelettnettverk på toppen av støttede lipid-dobbeltlag (SLB) vist seg å være svært nyttig. Denne minimale systemtilnærmingen tillater nøyaktig kontroll av cytoskelettnettverkskomponenter og lipidsammensetning. Sammenlignet med de frittstående lipidmembranene til gigantiske unilamellære vesikler, tillater den plane geometrien til SLBer effektiv bruk av toppmoderne mikroskopiteknikker som superoppløsning3,4, total intern refleksjonsfluorescens (TIRF) 5,6,7 eller interferometrisk spredning 8 å studere den romlige organisasjonen og dynamikken til cytoskeletale nettverk. TIRF gir den høyeste kontrasten for fluorescerende merkede komponenter, siden signalet fra ubundne merkede molekyler i løsningen som bidrar til bakgrunnssignalet er minimalt.

Her beskriver vi en grunnleggende protokoll for dannelse av aktomyosinnettverk bundet til støttede lipid dobbeltlag, som er mye brukt i feltet for å studere fysikken til aktive, kvasi-2D-nettverk 9,10,11 og deres effekt på membranorganisasjon 3,5,12,13,14,15,16 (Figur 1 ). Denne tilnærmingen er ikke begrenset til aktinbaserte nettverk, men kan også enkelt tilpasses for å utforske mikrotubuli, mellomliggende filamenter eller sammensatte nettverk av blandet natur og å studere en rekke interaksjoner mellom lipidmembranproteiner og cytoskeletale komponenter ved hjelp av overflatefølsomme mikroskopimetoder.

For å holde denne protokollen fokusert, har vi ekskludert en detaljert beskrivelse av rensing og merking av aktin- og myosinproteiner eller detaljer om hvordan man justerer og kontrollerer kontraktiliteten og organiseringen av aktomyosinnettverk. Man bør referere til andre protokoller som er publisert sammen med denne i JoVE Methods Collection, In Vitro Reconstitution of Cytoskeleton Networks for Biomaterials, Biophysics and Active Matter Research17.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk for in vitro actin-membran aktivt komposittsystem. Laget med Biorender. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

1. Reagenser og utstyr

  1. Forbered nye buffere som listet opp i tabell 1. Bruk ultrarent, avionisert vann med en resistivitet på 18,2 MΩ · cm ved 25 ° C. Steriliser alle bufferne ved å føre dem gjennom 0,22 μm filtre under vakuum. Degas bufferne som brukes til kolonnekromatografi.
  2. Rens skjelettmuskelaktin som beskrevet tidligere18,19. Tilsett 20% glyserol til den endelige rensede G-aktinoppløsningen og gjør aliquots på 500 μL (for merking eller bulkeksperimenter) og 10 μL (for individuelle eksperimenter) volum. Flash fryser aliquotene ved å dyppe rørene i flytende nitrogen i 30 sekunder og deretter oppbevare dem ved -80 °C i opptil 18 måneder.
    MERK: Alternativt kan renset aktin eller acetonpulver kjøpes kommersielt.
  3. Merk renset skjelettmuskulatur G-aktin med fluorescerende maleimidfarger som beskrevet tidligere5. Bestem konsentrasjonen og graden av merking av proteinet ved spektrofotometri ved hjelp av korrigert A290nm for aktin (εactin = 26.600 M-1 cm-1) og A λmax av fargestoffet. Lag aliquots på 10 μL og flash fryse ved å dyppe rørene i flytende nitrogen i 30 s og lagre ved -80 ° C i opptil 18 måneder.
    MERK: Merking med lysinkonjugerende NHS-estere vil skape ikke-funksjonell aktin og bør unngås.
  4. Rens skjelettmuskel myosin II ved å følge protokoll20. Kjør SDS-PAGE med 10% polyakrylamidgel etterfulgt av Coomassie-farging for å bestemme renhetsnivået til proteinet21. Oppbevar renset skjelettmuskulatur myosin-II ved −20 °C i flytende form i myosin II-buffer med 50 % glyserol.
    MERK: Den lagrede myosin II kan brukes i opptil 2 år.
  5. Merk renset myosin-II med fluorescerende maleimidfarger som beskrevet tidligere5. Unngå å merke myosinmotorer med NHS-estere fargestoffer. Bestem konsentrasjonen og graden av merking ved spektrofotometri ved hjelp av korrigertA 280 nm myosin II og Aλmax av fargestoffet. Oppbevar det resirkulerte myosin II (mørkt eller merket) ved 4 °C og bruk innen 6 uker.
  6. Rensing av capping protein
    1. Få murine capping protein ved å følge en tidligere protokoll22. Kjør SDS-PAGE med 10% polyakrylamidgel etterfulgt av Coomassie-farging for å bestemme renhetsnivået til proteinet. Mål konsentrasjonen ved å bruke A280 nm kappeprotein (εCP = 99 530 M-1 cm-1).
    2. Tilsett 20% glyserol til proteinoppløsningen og lag 5 μL aliquots i 200 μL PCR-rør. Kast slangene i flytende nitrogen og oppbevar dem ved -80 °C i opptil 2 år.
      MERK: Capping proteinaktivitet kontrolleres ved å polymerisere faste mengder fluorescerende G-aktin i nærvær av forskjellige capping proteinmengder. Filamentene blir deretter avbildet under et mikroskop, og deres lengdefordeling kvantifiseres. Jo høyere den relative konsentrasjonen av kapslingsprotein, desto kortere er aktinfilamentfordelingene. Se Köster et al.5.
  7. Uttrykk et fluorescerende membranaktinlinkerprotein, for eksempel for denne protokollen, bruk 10xHis-YFP-EzrinABD (HYE), uttrykk det i Bl21DE3 * Escherichia Coli, og rens som beskrevet tidligere23. Bestem konsentrasjonen av proteinet ved spektrofotometri.
  8. Oppbevar proteinet i små aliquots i gelfiltreringskromatografibuffer (eller annen passende buffer) med 20% glyserol ved -80 ° C. Under disse forholdene er proteinet stabilt i over 2 år.
    MERK: Valget av aktin-membran linker protein og fluorescerende markør avhenger av hvilken type spørsmål man tar opp. Et bredt spekter av lipidbindingsstrategier har blitt utviklet de siste årene, inkludert histidinmerkede proteiner24, biotin-streptavidin 25 og enkeltstrenget DNA26.
  9. Tilberedning av multi-lamellære vesikler (MLVs)
    MERK: Arbeidsflyten fra MLV-er til støttede lipid-dobbeltlag er avbildet i figur 2.
    1. Plasser 5-10 hetteglass av gult glass i et 200 ml glassbeger. Fyll begeret med 2% rengjøringsmiddel, akkurat nok til å senke glassflaskene. Sonikere dem i et vannbad i 30 minutter ved full puls og 65 ° C.
    2. Ta ut hetteglassene fra løsningen og skyll dem grundig med destillert vann. Plasser hetteglassene i et glassbeger som inneholder 2 N NaOH og sonikert i 20 minutter. Ingen oppvarming er nødvendig i løpet av dette trinnet.
    3. Ta ut hetteglassene fra NaOH-løsningen og skyll grundig med destillert vann. Tørk hetteglassene inne i en varmluftsovn som er satt til 65 °C i 2 timer eller lenger.
    4. Oppbevar de rensede hetteglassene i et rent beger forseglet med gjennomsiktig film i opptil 6 uker.
      FORSIKTIG: Utfør følgende trinn inne i en kjemisk avtrekkshette. Håndter kloroform og lipidløsninger med gasstette Hamilton glasssprøyter for å unngå forurensning av plast.
    5. Skyll Hamilton-sprøytene og noen få hetteglass av gult glass flere ganger med ren kloroform. Ta lipidpulveret lagret i glassampuller fra -20 ° C fryseren og tilsett tilstrekkelige mengder kloroform for å oppløse lipidpulverene til konsentrasjoner på 10-25 mg / ml.
    6. Overfør oppløsningen fra ampullen til et nyrenset hetteglass av gult glass og merk den på riktig måte. Utfør dette trinnet på is for å redusere fordampning av kloroform.
    7. Lag en DOPC-stamløsning med en konsentrasjon på 10-25 mg/ml og DGS-NTA-Ni2+ med en konsentrasjon på 1-10 mg/ml.
    8. For å lage en fungerende lipidblanding, ta et rent hetteglass og skyll det 2x med kloroform. Tilsett 300 μL ren kloroform til hetteglasset for å tjene som base for bedre blanding av komponentene. Dette vil ikke påvirke de endelige konsentrasjonene av lipidene, da all kloroform vil bli tørket ut i de neste trinnene.
    9. Tilsett målte mengder lipidoppløsninger til hetteglasset for å lage de ønskede lipidblandingene. Mållipidkonsentrasjonen i lipidrehydreringsbufferen er 4 mM. Tørk lipidblandingen under en langsom strøm av N2 gass inne i den kjemiske hetten ved romtemperatur. Dette trinnet kan ta opptil 30 minutter for hvert hetteglass.
    10. Etter at alt løsningsmidlet har tørket ut, støvsuges lipidfilmen i >2 timer ved romtemperatur for å fjerne eventuelle spor av kloroform igjen. Resuspend den uttørkede lipidblandingen i lipidrehydreringsbuffer for en endelig lipidkonsentrasjon på 4 mM.
    11. Inkuber i 5-10 minutter for å tillate rehydrering av lipidene. Vortex lipidoppløsningen i ca. 30 s for å danne MLVer.
    12. Lag 0,5-1 ml aliquots av MLVene i 1,5 ml mikrosentrifugerør. Kast rørene i flytende nitrogen, forsegl med en gjennomsiktig film og oppbevar ved -20 °C (i opptil 6 uker).
      MERK: Lipidlagerkonsentrasjoner er valgt for å tillate tilstrekkelig store volumer som tillater pålitelig pipettering ved bruk av Hamilton-sprøytene. Hvis volumene som er nødvendige for å lage bestanden er for store til å oppløse det tørkede lipidpulveret, gjør du flere fortynninger av bestanden for å sikre reproduserbar blanding av forskjellige lipider.
  10. Fremstilling av små unilamellære vesikler (SUVer)
    1. Ta ut en aliquot av MLV-er fra -20 °C-lagringen og tine den ved romtemperatur. Flash fryser vesiklene ved å stikke mikrosentrifugerøret i flytende nitrogen i 15-30 s og legg det umiddelbart i et vannbad sett ved 45 °C til oppløsningen har tint helt (1-2 min). Gjenta fryse-tine-syklusen ovenfor 10x-15x til løsningen ser mindre uklar ut.
      NOTAT: Still temperaturen på vannbadet høyere enn overgangstemperaturen til lipidblandingen som tines for å tillate jevn lipidblanding.
    2. Likevekt en sprøytebasert miniekstruder utstyrt med en 80 nm porestørrelse polykarbonatfiltermembran med SUV-rehydreringsbuffer. Forsikre deg om at det ikke er lekkasje eller bobler i systemet. Mens ekstruderingsmetoden gir monodisperse SUVer med minimal lipidskade, kan lipidblandinger med negativ ladning holde seg til polykarbonatmembranen.
    3. Pass forsiktig den tinte lipidløsningen gjennom den pre-likevektede ekstruderen fra den ene siden til den andre og deretter tilbake. Gjenta syklusen 5x-10x til lipidoppløsningen blir synlig klar, noe som indikerer dannelsen av SUVer med ~ 100 nm diameter.
    4. Sentrifuger den ekstruderte suspensjonen (eller tip-sonikere løsningen; se merknad nedenfor) ved 15.000 x g i 60 minutter ved 4 ° C for å pelletere ned lipidrester. Samle de øverste 80% av løsningen uten å forstyrre pelleten og uten å lage bobler. Overfør supernatanten som inneholder SUV-ene til et nytt mikrosentrifugerør og oppbevar på is i opptil 6 dager.
      MERK: Et alternativ til sentrifugering er tip sonikering utført som følger. Slå på en mikrotip sonicator og angi følgende innstillinger: Amplitude = 30% av maksimum, PÅ tid = 10 s, AV-tid = 60 s. Rengjør spissen av mikrosonikeren med avionisert vann etterfulgt av 2 N NaOH, kloroform og igjen avionisert vann. Dypp sonikerspissen i hver av disse løsningene og sonikere i 1-2 sykluser ved hjelp av innstillingene ovenfor. Dypp den rene spissen i frysetint vesikkelløsning og soniker i 3-6 sykluser på is til løsningen blir klar.
    5. Etter sentrifugering, sjekk for tegn på høy lipidnedbrytning eller en mislykket lipidekstrudering som dannelse av en tynn hvitaktig film og / eller en tydelig synlig pellet. I disse tilfellene må du ikke fortsette og gjenta SUV-forberedelsestrinnene igjen.
      MERK: Holdbarheten til SUVer kan variere for forskjellige lipidblandinger. SUVer laget av DOPC: DGS-NTA-Ni2+ er stabile i opptil 6 dager i forbindelse med disse eksperimentene. Tips for å løse vanlige problemer finnes i tabell 2.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk som viser arbeidsflyten fra fremstilling av multilamellære vesikler og små unilamellære vesikler til dannelse av støttede lipid-dobbeltlag. Laget med Biorender. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

2. Rekonstituering av membranbundne aktinnettverk

  1. Fremstilling av prøvekamre
    1. Ta 3-5 rektangulære glassdeksler og legg dem i en Coplin-krukke. Slå på badet sonikator og sett temperaturen til 65 ° C. Fyll Coplin-krukken med 2% rengjøringsløsning for å senke dekslene helt ned og legg den i sonikatoren i 30 minutter i full pulsmodus.
    2. Bruk stump PTFE-belagt tang for å fjerne dekslene en etter en fra krukken. Skyll dem grundig med destillert vann og legg dem i en annen Coplin-krukke fylt med 2 N NaOH.
    3. Sonikere dekslene i 20 minutter i full pulsmodus. Fjern dekslene en etter en, skyll grundig med destillert vann, og legg i en annen Coplin-krukke fylt med destillert vann.
      MERK: Eventuelt, soniker dekslene i destillert vann i 20 minutter og skyll dem deretter igjen med destillert vann.
    4. Umiddelbart før du starter eksperimentet, ta krukken som inneholder dekslene i en kjemisk hette utstyrt med en N2 gassforsyning.
    5. Optimaliser lufttrykket til N2-gasstrømmen ved prøving og feiling, slik at det er akkurat nok til å forskyve vann fra dekkflaten uten å bryte den. Juster strømmen av N2-gass parallelt med dekselslipplanet for å redusere muligheten for å bryte dekselet.
    6. Bruk hansker og tang for å fjerne dekslene en etter en fra krukken for å tørke dem under N2-strømmen . Tørk begge sidene av hvert deksel og legg dem på et rent plastgitter med et deksel. Plasser esken med dekslene i en tørkemaskin for å unngå kontakt med støvpartikler i luften.
      MERK: N 2-tørkede deksler kan lagres i en tørkemaskin hvor de kan forbli hydrofile i opptil2 dager. Denne strategien kan være nyttig når det kreves mange dobbeltlag for eksperimentet, eller hvis eksperimentet tar lengre tid enn 8 timer.
    7. Ta autoklaverte PCR-rør og kutt ut lokkene og nedre koniske halvdeler med et skarpt kirurgisk blad. Ta de sylindriske halvkuttede rørene en etter en, påfør UV-herdbart lim på den glatte kanten av hvert kuttrør, og legg det omvendt på et nyrenset deksel slik at felgen sitter flatt på dekselet.
    8. Ikke flytt sylinderen sideveis når den er plassert på dekselet for å sikre at limet ikke søler til kammerets sentrale rom. Rektangulære deksler kan komfortabelt romme opptil tre reaksjonskamre, og de runde har plass til bare ett i midten (figur 1).
    9. Sett de kammerbærende dekslene inne i en UV-ozonrenser med O2-tilførsel og vakuum (eller bruk UV-belysning). Slå på UV-lyset og lys i 3-5 minutter for å la limet polymerisere. Utfør lengre belysning (10-15 min) for å forbedre hydrofiliteten til dekselglasset og dermed kvaliteten på lipid-dobbeltlaget.
    10. Oppbevar de tørre UV-opplyste prøvekamrene i opptil 8 timer inne i små plastbokser (for eksempel tomme rektangulære dekselbokser) innpakket i gjennomsiktig film for å redusere kontakt med støvpartikler i luften.
      MERK: En jevn strøm av O2 i nærvær av UV-lys danner ozon- og oksygenradikaler som kan fjerne organiske urenheter fra overflaten av dekselet. Et vakuum vil forhindre lekkasje av giftig ozon som dannes under prosessen.
    11. Ta ut dekslene og test kamrene for lekkasje ved å fylle dem opp med destillert vann. Hvert kammer kan holde opptil ~ 150 μL prøve. Kast de lekkende kamrene.
      MERK: Et annet flott og trygt rengjøringsalternativ er plasmarenseren. Tids- og strøminnstillingene avhenger av modellen, men sørg for ikke å overbehandle glassglassene med plasma, da dette vil føre til en reduksjon av lipidmobiliteten. Overflatebehandlingen kan påvirke mobiliteten til lipider27, som det er observert ved langvarig behandling med rengjøringsmiddelet (>45 min) eller NaOH (>30 min).
  2. Fremstilling av støttede lipid dobbeltlag
    1. Vask hvert kammer med SLB-formasjonsbuffer (eller 1x PBS) for å fjerne overflateforurensninger, og la 100 μL buffer være på slutten. Merk nivået på bufferen ved 100 μL med en permanent markør for å reproduserbart spore endringer i volumet.
    2. Tilsett 2 μL 0,1 M CaCl2 i kammeret. Dette forbedrer adsorpsjonen av vesiklene til glassoverflaten, og forbedrer tolagsformasjonen i neste trinn. Tilsett 8 μL av SUV-løsningen (fra trinn 1.10.) i hvert kammer og inkuber i 15 minutter ved 25 °C.
      MERK: Volumet av SUV-blandingen som skal legges til, kan estimeres ved å beregne det totale antallet lipider (med et gjennomsnittlig areal på 0,72 nm2) som er nødvendig for å fullstendig dekke det eksponerte hydrofile området av brønnen med to lipidlag.
    3. Vask av de ubundne vesiklene med aktinmotilitetsbuffer (1x KMEH). Fjern først 50 μL av SLB-formasjonsbufferen, og la bare 50 μL være i prøvekammeret. For det andre, legg til 100 μL 1x KMEH til kammeret. Bland forsiktig og fjern deretter 100 μL av bufferen uten å berøre bunnen.
      MERK: Det er viktig å være forsiktig mens du vasker. Forsikre deg om at pipettespissen ikke berører bunnen av kammeret. Hold pipetten tilbøyelig til å lede strømmen av buffer til kammerets vegg og ikke direkte på dobbeltlaget, da en direkte strøm kan forstyrre dobbeltlaget. Vær forsiktig så du ikke introduserer noen luftbobler mens du pipetterer, da luft kan nå lipid-dobbeltlaget og forårsake defekter i det.
    4. Gjenta vasken 10x ved å tilsette 100 μL 1x KMEH og fjerne 100 μL.
    5. Tilsett 10 μL 1 mg / ml β-kasein til dobbeltlaget, bland forsiktig og inkuber i 5-10 minutter. β-kasein blokkerer regionene på dekselet der dobbeltlaget ikke har dannet seg. Vask av β-kasein 3x med 1x KMEH som beskrevet i trinn 2.2.3. og bringe buffernivået tilbake til 100 μL-merket.
  3. Tilsetning av membran-aktin linker
    1. Under β-kaseininkubasjonen (trinn 2.2.5.), ta ut en aliquot av membran-aktin linkerprotein fra -80 ° C, tine den raskt ved 37 ° C, og hold den deretter på is. Fortynn aliquot med proteinfortynningsbuffer til en konsentrasjon på 1 μM.
    2. Tilsett linkerproteinet ved en definert sluttkonsentrasjon (typisk 5-20 nM) og bland forsiktig. For å sikre en rask utjevning av proteinet i kammeret, tilsett volumer som er større enn 20 μL ved å forblande linkerproteinet med 1x KMEH.
    3. Inkuber i 40 minutter ved romtemperatur. Vask 3x med 1x KMEH-buffer for å fjerne det ubundne HMS-proteinet (som i trinn 2.2.3.). Ta buffernivået i hvert kammer tilbake til 100 μL-merket. Prøven er nå klar for avbildning.
  4. Kvalitetsvurdering av lipid dobbeltlaget
    MERK: Dette er et valgfritt trinn som ikke må utføres hver gang. Vi anbefaler at denne vurderingen utføres hver gang ferske SUV-er er laget av frosne MLV-lagre.
    1. Slå på mikroskopet, eksitasjonslaserne og deteksjonskameraene. Forsikre deg om at laseren er justert, målet er rengjort, og programvaren er klar til å skaffe bilder.
    2. Sett olje på 100x-målet, monter prøven på mikroskopstadiet, og fokuser målet på dobbeltlaget. Forsikre deg om at laserposisjonen er slik at den gjennomgår total intern refleksjon på prøven. Bruk en 488 nm eksitasjonslaser for å kontrollere fluorescensintensitetsfordelingen til dobbeltlagsbundet 10xHis-YFP-EzrinABD.
      MERK: Dobbeltlag av god kvalitet viser en storstilt, jevn fordeling av fluorescensintensitet. Dårlige dobbeltlag viser intense og flekkete fluorescerende flekker.
    3. For å bestemme integriteten til dobbeltlaget, utfør en FRAP-analyse.
      1. Velg et område av interesse på dobbeltlaget og ta opp noen bilder av synsfeltet ved hjelp av bildeforhold som gir et signal/støy-forhold på 5:1 eller høyere. Sett opptaket på pause og lukk feltmembranen til TIRF-mikroskopet for å fokusere en konsentrert laserstråle på et lite sirkulært område av dobbeltlaget for å bleke fluoroforene lokalt.
      2. Slå på laseren til maksimal effekt for å fotobleke det lille området i 3-10 s, og slå deretter av laseren. Åpne feltmembranen på nytt til sin opprinnelige radius, juster bildetilstanden tilbake til (pre-bleach) innstillinger, og fortsett umiddelbart for å registrere gjenoppretting av fluorescerende signal i synsfeltet.
    4. Sjekk om dobbeltlaget er flytende. Gode dobbeltlag med normal lateral diffusjon kommer seg raskt, mens dårlige dobbeltlag restituerer seg sakte eller ikke restituerer seg i det hele tatt (figur 3). Hvis dobbeltlaget ikke gjenopprettes, sjekk feilsøkingsdelen og start på nytt. Lagre bildene som 16-biters TIFF-filer. For en kvantitativ estimering av diffusjonskoeffisienten, sjekk trinn 3. under.
  5. Polymerisering av fluorescerende aktin
    MERK: For å spare tid, start polymerisering av aktin under inkubasjonstiden for HMS-proteinbindingen til dobbeltlaget (trinn 2.3.) eller under kvalitetsvurderingen av dobbeltlaget (trinn 2.4.).
    1. Bland umerket og fluorescerende merket G-aktin i et 10: 1 molforhold og fyll det opp med G-Buffer slik at konsentrasjonen av G-aktin er 20 μM. Konsentrasjonen der aktin til slutt polymeriseres vil være 1/4 av denne verdien. Tilsett 1/10 av 10x ME buffer til blandingen for en 1x løsning og inkuber i 2 min. Dette trinnet erstatter Ca 2+ ioner bundet til G-aktin med Mg2+ ioner. Forsikre deg om at det endelige volumet er i multipler på 10 μL.
    2. Tilsett ønsket mengde capping protein som følger. Tine et hetteglass med kappeproteinkraft raskt ved 37 °C og hold det deretter på is. Fortynn med G-buffer slik at konsentrasjonen av kappeprotein nå er to ganger den ønskede endelige konsentrasjonen i polymerisasjonsblandingen. Tilsett et likt volum av den fortynnede kapslingsproteinoppløsningen til aktinblandingen fra trinn 2.5.1.
    3. Til slutt legger du til et likt volum frisk 2x målbuffer til reaksjonsblandingen. Det endelige volumet av oppløsningen skal være fire ganger volumet av aktinblandingen på slutten av trinn 2.5.2. Sørg for at den endelige konsentrasjonen av KMEH er 1x, av ATP er 1 mM, av BSA er 1 mg / ml, og av G-aktin er 5 μM.
      Inkuber i mørket ved 25 °C i 45-60 minutter for å la polymerisering skje.
      MERK: Dette kalles målbufferstrategien, der ett volum Mg 2+ G-aktin (trinn 2.5.1.) blandes med ett volum av kapslingsproteinblanding (trinn 2.5.2.) og to volumer2x målbuffer (trinn 2.5.3.). Dette gjør det lettere å skalere opp eller ned mengden aktin og å endre den relative konsentrasjonen av capping protein (eller annen aktinmodulator; Figur 4).
  6. Tilsetning av fluorescerende aktinfilamenter
    1. Klipp noen 200 μL spisser med et skarpt blad eller saks for å gjøre dem stumpe enden. Pipetter forsiktig ut det nødvendige volumet av 5 μM polymerisert aktin (fra trinn 2.5.3.) med en butt pipettespiss (for å forhindre skjæring av aktinfilamenter) og legg den til et rent autoklaveret PCR-rør.
    2. Tilsett 1x KMEH i røret for å lage volumet >20 μL og bland forsiktig for å unngå skjæring av F-aktin. Fjern et likt volum av bufferen fra det monterte prøvekammeret.
    3. Tilsett den polymeriserte aktinoppløsningen i kammeret og pipetter forsiktig opp og ned 3x uten å berøre dobbeltlaget nederst. Dette gjør at aktinfilamentene kan fordeles jevnt på dobbeltlaget. Monter prøven på TIRF-mikroskopet (se trinn 2.4.1. og trinn 2.4.2.).
    4. Man kan registrere prosessen med F-aktinbinding til dobbeltlaget. Inkuber i 20-30 min. Ta opp noen bilder fra forskjellige synsfelt etter at F-actin i tillegg har nådd en stabil tilstand. Observer endring i den romlige organisasjonen av 10xHis-YFP-EzrinABD før (homogen) og etter aktinorganisasjon.
      MERK: HYE er jevnt fordelt over lipid dobbeltlaget i fravær av aktin. Ved tilsetning av aktinfilamenter samlokaliseres HYE med F-aktin. Omfanget av colocalization avhenger av aktinbindende affinitet av linkerproteinet; jo sterkere affinitet, jo høyere colocalization og langsommere lateral mobilitet av linkerproteinet (figur 5).
  7. Tilsetning av myosin II
    1. Etter 30 minutter med aktinkubasjon, monter prøven tilbake på mikroskopet (hvis den var umontert). Kontroller signalet i linkerprotein- og F-aktinkanalene. Juster bildeforholdene om nødvendig.
    2. Velg en god region med jevnt linkerproteinsignal og jevnt spredte aktinfilamenter og ingen artefakter for lang tidsforløpsopptak. Ta opp 10-15 bilder ved 0,1-0,2 Hz før myosin tilsetning og pause opptaket. Pipetter ut det nødvendige volumet av resirkulert muskelmyosin-II fra hetteglasset med en butt pipettespiss (for å forhindre skjæring av myosinfilamenter) og tilsett et rent autoklaveret PCR-rør.
    3. Tilsett umiddelbart 1x KMEH i røret for å gjøre volumet >20 μL og bland forsiktig. Man kan også legge til ATP, ATP-regenererende blanding, fotostabiliserende midler, etc. i løpet av dette trinnet. Fjern forsiktig et likt volum av bufferen fra det monterte prøvekammeret uten å forstyrre det.
    4. Tilsett myosinoppløsningen forsiktig i prøvekammeret. Ikke pipetter opp og ned, da det vil forstyrre de overflatebundne filamenter. Gjenoppta umiddelbart time-lapse-registreringen og observer systemet når det utvikler seg fra pre-myosin-tilstanden til ATP-drevet kontraktil acto-myosin-strømmer og asterdannelse til en ATP-utarmet fastkjørt tilstand (se representative resultater).
    5. Ta bakgrunnsbilder for alle kanalene ved hjelp av et buffereksempel. Lagre alle bildene som 16-biters .tiff filer. Se tabell 2 for tips for å løse vanlige problemer.

Figure 3
Figur 3: Kvalitetsvurdering av dobbeltlagene med rask FRAP-analyse. Støttede lipid dobbeltlag (SLBer) fremstilt fra DOPC og Ni-NTA lipider (98: 2 mol%) er belagt med HYE (10xHis-YFP-merket membran-aktin linker). Etter at det ubundne proteinet er vasket ut, avbildes det fluorescerende dobbeltlaget under et TIRF-mikroskop. En liten region på dobbeltlaget er fotobleket med høy laserkraft, og gjenvinning av fluorescens registreres. (A) Et godt dobbeltlag gjenoppretter alltid raskt, med en forventet diffusjonskoeffisient på 1-1,5 μm2 / s for lipidsammensetningen som brukes i dette tilfellet. (B) Dårlige dobbeltlag gjenoppretter veldig sakte eller gjenoppretter ikke i det hele tatt. (C) Representative bilder av dårlige dobbeltlag: (C-i) et dobbeltlag med hull, (C-ii) et dobbeltlag med store, immobile lipidplaster og (C-iii) et dobbeltlag med små, immobile prikker. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Skjematisk som viser hvordan man polymeriserer aktin ved hjelp av målbuffermetoden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Romlig organisering av HYE ved binding til F-aktin. TIRF øyeblikksbilder som viser romlig organisering av HYE før og etter tilsetning av aktinfilamenter (merket med Atto-635 maleimid). HYE-organisasjonen er homogen før tilsetning av F-aktin og blir colocalized og coaligned langs aktinfilamenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

3. Analyse av data

  1. Bruk Fiji-programvaren (https://imagej.net) til å trekke bakgrunnen fra linkerproteinbildene (fra trinn 2.4.). Mål gjennomsnittsintensitetsverdiene fra det blekede stedet og et referanseområde.
  2. Normaliser tidssporene fra det blekede stedet og referanseområdet til intensiteten av deres respektive intensitetsverdier før blekemiddel. Del hvert tidspunkt i de normaliserte blekede regionverdiene med de respektive tidspunktene i det normaliserte referanseområdets tidssporing. Korriger det resulterende normaliserte tidssporet for bakgrunn og for eventuelle systematiske svingninger i intensitet under oppkjøpet (global fotobleking, z-drift, etc.).
    1. Bruk en tilpasningsfri, manuell metode28 for å estimere diffusjonskoeffisienten til de tolags bundet proteinene. Kort fortalt kan halvtiden for gjenopprettingsprofilen, τ1/2, beregnes ved å se på tidspunktet da den normaliserte gjenopprettingsprofilen når halvparten av sin stabile tilstand:
      Equation 1
      Her er F 0 middelintensiteten i det blekede området i den første rammen etter fotobleking, og F∞ er den langsiktige steady state-verdien for gjenvinning av dobbeltlaget.
    2. Beregn den effektive blekemiddelradiusen, re, en parameter som korrigerer for diffusjon under fotobleking, fra en linjeskanning av postblekemiddelpunktprofilen29. Halvbredden på halvparten av denne linjeskanningen som går gjennom midten av blekemiddelpunktet, r 1/2, relaterer seg til re som følger:
      Equation 2
      τ1/2 beregnet i trinn 2.8.3., r e beregnet i trinn 2.8.4., og den opprinnelig innstilte blekemiddelradiusen, rn, brukes til å beregne diffusjonskoeffisienten (D) ved hjelp av følgende formel:
      Equation 3
  3. Bildeanalyse av aktomyosinastere
    1. Bruk Fiji til å trekke bakgrunnen fra alle de innspilte bildene i alle kanalene. Korriger bildene for ujevn belysning eller interferensmønster ved hjelp av flatfeltkorreksjon.
      MERK: Man kan bruke fargede plastglass, som er gode flate prøver for å gjøre slike korreksjoner. For linkerprotein- og aktinfilamenter på et plane dobbeltlag kan man også bruke gjennomsnittlig projeksjon av flere pre-myosinbilder for å lage kanalspesifikke belysningskorreksjonskart.
      1. For HYE-kanalen, vist her, ta en gjennomsnittlig intensitetsprojeksjon av flere HYE-bilder (registrert fra forskjellige regioner av lipid-dobbeltlaget før myosin-tilsetning). Bruk et passende Gauss-filter (σ = 50 piksler til 80 piksler) på den gjennomsnittlige projeksjonen (fra pre-myosinbilder eller en hvilken som helst standard flat prøve).
      2. Konverter det filtrerte bildet til et 32-biters bilde. Del opp alle bildepunktverdiene med gjennomsnittet av hele bildet. Dette vil gi et normalisert korreksjonskart for HYE-kanalen. Del alle bildene i HYE-kanalen med dette kartet for flatfeltkorreksjon. Lag korreksjonskart for andre kanaler ved hjelp av samme strategi.
    2. Riktig for fotobleking ved hjelp av en eksponentiell eller enkel forholdsmetode (avhengig av intensitetsforfallprofilen) på Fiji.
      1. For å korrigere for temporal x-y feiljustering (translasjonsbevegelse), slå sammen alle fotoblekemiddelkorrigerte kanaler til en enkelt Hyperstack. Bruk Hyperstack-Reg-plugin på Fiji, bruk en stiv kropps- eller oversettelsestransformasjon.
      2. Til slutt deler du den justerte Hyperstack i individuelle kanaler og lagrer dem separat som 16-biters TIFF-stabler for videre analyse.

Representative Results

For representasjon, her vises en typisk postblekemiddelprofil fra 1. bilde etter fotobleking (bilde ved t = 0 s i figur 3A) og dens passform til følgende funksjon28 (se figur 6A):

Equation 4

Verdien av r e (23,94 μm) beregnet ved tilpasningen til denne kurven er svært lik re beregnet i trinn 2.8.4. (23,24 μm). Her er K en blekemiddeldybdeparameter som kan estimeres direkte fra F0 (beskrevet i trinn 2.8.4.). Tilsvarende viser figur 6B gjenopprettingsprofilen og dens tilpasning til følgende funksjon28:

Equation 5

Vi finner at den tilpassede verdien av diffusjonskoeffisienten er 1,34 μm 2/s, en verdi som er nært med verdien av 1,39 μm 2/s som beregnes med formelen i trinn2.8.4. Her står MF for den mobile fraksjonen av lipid-dobbeltlaget som representerer brøkdelen av den blekede populasjonen som gjenoppretter tilbake. Mobiliteten til lipidforankrede molekyler avhenger selvfølgelig av lipidsammensetningen og dens fysiske tilstand (væske- eller gelfase). For våre eksperimenter med DOPC-baserte lipidmembraner bør mobiliteten være >1 μm2/s, og den mobile fraksjonen bør ikke være mindre enn 0,9 for å indikere et godt lipid-dobbeltlag. Vi anbefaler bruk av den manuelle monteringsfrie metoden for en rask test av dobbeltlagets kvalitet og mobilitet. Monteringsmetoden kan være nyttig når du automatiserer analysen for mange FRAP-kurver. Videre, hvis man ønsker å utføre et mer sofistikert FRAP-eksperiment for systematisk å karakterisere diffusjon i systemet, anbefaler vi leseren til denne anmeldelsen fra Lorén et al.30 for mer detaljer om monteringsmodeller og potensielle fallgruver i eksperimentell design.

Figure 6
Figur 6: Kvantifisering av diffusjonskoeffisienten til lipid dobbeltlag. (A) Linjeprofil for det første bildet etter fotobleking (t = 0 s i figur 3A) og dets tilpasning til ligning 4 for å beregne den effektive blekemiddelradiusen. (B) Gjenvinningsprofilen til det blekede området og dets passform til ligning 5 for å beregne diffusjonskoeffisienten og mobilfraksjonen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Et typisk resultat av eksperimentene beskrevet ovenfor som viser dynamisk montering og organisering av et acto-myosin-nettverk koblet på et støttet lipid-dobbeltlag avbildet ved TIRF-mikroskopi, er avbildet i figur 7 og supplerende video S1.

Figur 7 viser en bildemontasje av linkerproteinet, F-aktin og myosin-II.

Figure 7
Figur 7: Kontraktile aktomyosinstrømmer driver lokal klynge av membran-aktinlinkerproteinet HYE. TIRF øyeblikksbilder av HYE (YFP-merket), aktinfilamenter (merket med Atto-635 maleimid) og myosin II-filamenter (merket med Atto-565 maleimid) ved tilsetning av myosin II til en SLB som inneholder HYE og F-aktin. Tiden er angitt på toppen: 0 min er umiddelbart før fluorescerende myofilamenter begynte å vises i TIRF-feltet. HYE og F-aktin fordeles homogent over lipid-dobbeltlaget før myosintilsetning (0 min). Myosinaktivitet induserer kontraktile aktomyosinstrømmer, som kommer inn i asterlignende strukturer ved steady state (15 min), og driver lokal klynge av den koblede membrankomponenten (HYE). Den nederste raden er en sammenslåing av aktin (gul) og myosin II (magenta) bilder som viser organiseringen av aktin og myosin på forskjellige tidspunkter. Bildene som ble brukt til å lage disse montasjene ble korrigert på Fiji for bakgrunnssignal, ujevne intensitetsmønstre og translasjonsbevegelse. Skala bar = 10 μm. Hvis du vil ha mer informasjon, kan du se Tilleggsvideo S1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Buffer Navn Komposisjon
Lipid rehydrering buffer 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 % sukrose, pH 7,5
SLB-formasjonsbuffer 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 5-6
SLB-lagringsbuffer 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,2
Protein fortynning buffer 20 mM HEPES, 100 mM KCl, 1mM TCEP eller DTT, pH 7,2
1X ME eller Actin ion-exchange buffer 50 mM MgCl2, 0,2 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7,2 (oppbevares ved 4 °C)
1X KMEH eller Actin polymerisasjonsbuffer 50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 50 mM HEPES, pH 7,2
100 mM ATP-lager 100 mM ATP dinatriumsalt, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 2 mM EGTA, pH 7,5 (oppbevares ved -20 °C)
2x Buffer for mål 2x KMEH, 2 mg/ml BSA, 2 mM ATP, 5 mM TCEP (lagret ved 4 °C)
G-buffer 2 mM Tris, 0,1 mM CaCl2, 0,2 mM ATP, 0,5 mM TCEP, 0,04 % NaN3, pH 8 (oppbevares ved 4 °C)
Myosin II buffer 500 mM KCl, 1 mM EDTA, 10-20 mM Hepes, pH 7,0
Gelfiltreringskromatografibuffer 50 mM Tris-HCl, 150-300 mM NaCl, 5 mM TCEP, 0,1% Tween-20, pH 7,5
Capping protein Lagringsbuffer 10 mM Tris · Cl, 50 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7,5, 20% glyserol

Tabell 1: Liste over buffersammensetninger som brukes i denne protokollen.

Vanlige problemer og feilsøking Problem Årsak Mulige løsninger
1 Lipid dobbeltlag viser ingen diffusjon Den mest sannsynlige årsaken til dette problemet er skittent dekselglass som kan skje når rengjøringsløsningen er eldre eller oppvarmingen ikke fant sted under sonikering av badet. Disse dobbeltlagene har et "vesikulært" utseende fordi de sprengte vesiklene holder seg til dekselet, men smelter ikke sammen med hverandre. Bruk av MLVer eldre enn 6 uker eller SUVer eldre enn 6 dager, eller legge til lave mengder SUVer kan også føre til vesikulært dobbeltlagsdannelse. Bruk fersk rengjøringsmiddel. Forsikre deg om at ovnen er slått på og at temperaturen er mellom 45-65 °C. Bruk ferske lipidblandinger. (Ved hjelp av en fluorescerende lipidsonde versus en fluorescerende proteinsonde kan noen ganger manifestere seg annerledes. For eksempel, hvis dobbeltlaget har subdiffraksjonsdefekter og overflatepassiveringstrinnet hoppes over (eller ikke fungerer), vil lipidsonden vise en jevn intensitetsfordeling, men den fluorescerende proteinsonden kan vise lyse fluorescerende flekker.)
2 Lipid dobbeltlag har lyse flekker Lang inkubasjon av SUVer for tolagsdannelse kan skape et lipid dobbeltlag som generelt diffuserer, men med sporadiske lyse flekker. Disse patchene kan være flerlags dobbeltlag som kan tiltrekke seg store mengder fluorescerende sonde. 15-20 min inkubasjon med SUVer er nok. Forsikre deg om at sonden ikke aggregerer: Et raskt hardt spinn av linkerproteinet (300 x g i 15 minutter ved 4 °C) kan fjerne aggregatene
3 Lipid dobbeltlag har mørke hull Dette skjer når dobbeltlaget er laget av gamle SUVer og avbildet i lengre timer (> 4 timer etter dannelse), eller pH i løsningen endres drastisk på grunn av langvarig avbildning (f.eks. I høy ATP-tilstand og i nærvær av visse oksygenrensere), eller når overflaten er overpassivert med beta-kasein (tilsetter for mye beta-kasein i mer enn 10-15 minutter og eller ikke vasker den ut). Bruk ferske lipider. Reduser bildefrekvensen eller den effektive laserbelysningstiden. Bruk buffere med høyere bufferkapasitet.
4 Lipid dobbeltlag viser langsom diffusjon Lipid dobbeltlag med høy prosentandel kolesterol, lange mettede lipider eller ladede lipider diffunderer langsommere. I slike tilfeller må du forberede prøven ved høy temperatur. Man kan også bruke en enkel, testet lipidsammensetning som en kontroll sammen med komplekse og uprøvde lipidsammensetninger. Pass på at glasset er rent.
5 Aktin polymeriserer ikke Målbufferen er gammel, G-aktinlageret er for gammelt, gammelt og nytt G-aktin ble sampolymerisert. Forsikre deg om at Ca 2+ er erstattet av Mg2+ før polymerisering (ved bruk av ME-buffer). Bruk fersk ATP-Mg2+ lager. Bruk nyresirkulert G-aktin. Pass på at konsentrasjonen av F-aktin (i form av G-aktin) tilsatt dobbeltlaget er høyere enn 0,2 μM. For lavere konsentrasjoner, bruk phalloidinstabilisert F-aktin.
6 Aktin binder seg ikke til dobbeltlaget Membran-aktin linker er ikke tilsatt eller tilsatt ved svært lav konsentrasjon - dette kan utledes fra fluorescens av linkerproteinet. Hvis fluorescensen er anstendig, har membran-aktin-linkeren mistet aktinbindingskapasiteten. Også, hvis linkerproteinet ikke er spesifikt bundet til glassoverflaten (når dobbeltlaget er dårlig), kan det ikke rekruttere actinfilamenter. Forsikre deg om at dobbeltlaget diffunderer. Bruk fersk linkerprotein
7 Fluorescerende F-aktinsignal er svakt Forholdet mellom merket og mørkt aktin er for lavt. Enten er det merkede aktin eller umerket aktin for gammelt, og de er ikke kopolymeriserende med hverandre. Resirkuler aktin igjen, og prøv ploymeriseringen på nytt med nyresirkulert aktin. Photodamage kan ødelegge eller depolymerisere F-aktin; Hvis mulig, bruk røde eller langt røde fargestoffer for aktin (og myosin).
8 Myosin viser ikke kontraktilitet Det kan observeres at etter å ha tilsatt ATP til det myosininfunderte systemet, er det ingen kontraktilitet av acto-myosin. Sjekk om myosinkonsentrasjonen eller renhetsnivået er bra. Bruk nyresirkulert myosin (bruk innen 6 uker etter resirkulering). Tilsetning av fersk ATP til myosinblandingen kan hjelpe. Avgassing av buffere og bruk av oksygenrensere etc. kan redusere fotoskade på motorene.  Ytterligere informasjon finnes i protokollene til Plastino og medarbeidere eller Stam og medarbeidere om samme metodesamling.
9 Coverglass er ikke hydrofilt Coverglass rengjøres ikke ordentlig. Rent hydrofilllisk dekselglass er avgjørende for lipid dobbeltlagsdannelsen. En nyttig, visuell avlesning av hydrofiliteten til dekselglasset etter rengjøringsprotokollen er å observere fukting av glasset med vann. Tilsett et lite volum vann til et flattliggende deksel. Vannet vil forbli i form av en rund dråpe hvis dekselet ikke rengjøres ordentlig. Imidlertid vil det samme volumet av vann spre seg ut og danne et tynt lag på et behandlet hydrofilt dekselglass. Denne fukteoppførselen til vannet på glassoverflaten på dekselet kan brukes til å fastslå om rengjøringstrinnene med rengjøringsløsningen / NaOH har fungert.

Tabell 2: Feilsøkingsveiledning som oppsummerer vanlige problemer og tilhørende løsninger.

Supplerende video S1: Kontraktile aktomyosinstrømmer driver lokal klynge av membran-aktin linkerproteinet HYE. TIRF timelapse av HYE (YFP-merket), aktinfilamenter (merket med Atto-635 maleimid) og myosin II-filamenter (merket med Atto-565 maleimid) ved tillegg av myosin II til en SLB som inneholder HYE og F-aktin. Tiden er angitt på toppen: 0 min er umiddelbart før fluorescerende myofilamenter begynte å vises i TIRF-feltet. Skala bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Denne protokollen presenterer en allsidig plattform og et utgangspunkt for designeksperimenter for å studere membran-cortex-grensesnittet til celler. Kritiske trinn er utarbeidelse av rene glassglass, bruk av ferske lipider for effektiv SUV-dannelse (begge påvirker kvaliteten på SLB-er), og bruk av nyresirkulerte myosin II-proteiner for dynamisk aktinfilamentreorganisering. Ved avbildning av dynamikk over lang tid er det svært viktig å inkorporere et oksygenrensesystem (f.eks. protokatechuinsyre og protokatechuat 3 4-dioksygenase 5,31).

Den åpne kammerdesignen tillater sekvensiell tilsetning av komponenter til et eksisterende system uten å indusere lipidstrømmer. Dette kan være en viktig fordel i forhold til vanlige tilnærminger med lukket kammer eller arbeid ved bruk av innkapslede proteiner i liposomer36. Motstridende effekter som proteinindusert membrandeformasjon kan ikke studeres med glassadsorberte lipid dobbeltlag.

Lipid dobbeltlagene kan dannes med et bredt spekter av lipidsammensetninger. Det begynner med adsorpsjon av lipidblærene til den hydrofile glassoverflaten, etterfulgt av enten spontan vesikkelbrudd på grunn av overflate-vesikkel og direkte vesikkel-vesikkel-interaksjoner eller de adsorberte vesiklene som når en kritisk dekning, hvoretter en liten brøkdel av vesiklene brister, danner aktive kanter, noe som til slutt fører til dobbeltlagsformasjonen32 . Foruten glass kan forskjellige substrater brukes til å danne støttede lipid-dobbeltlag, for eksempel glimmer (f.eks. For atomkraftmikroskopi), myke substrater (f.eks. Poly-di-metyl-siloksan), polymerputer33,34,35, som spenner mellom hull i elektronmikroskopigitter 14. Dråpegrensesnitt dobbeltlag er en annen interessant metode for å lage stabile, frittstående lipid dobbeltlag36. Inkluderingen av acto-myosin-nettverk i vesikler eller emulsjoner er en meget kraftig metode for å studere dette minimale systemet i en cellelignende geometri 37,38, og som er beskrevet i detalj andre steder39.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av AXA forskningsfond og Warwick-Wellcome Quantitative Biomedicine Programme (Wellcome ISSF, RMRCB0058) for DVK, NCBS-TIFR for AB og ST, og Wellcome-DBT Margdarshi fellowship (IA/M/15/1/502018) for SM. DVK vil også takke Biophysical Society for å muliggjøre det virtuelle nettverksarrangementet "Challenges in understanding multi-component cytoskeletal networks from the molecular to the meso-scale", som bidro til opprettelsen av denne protokollsamlingen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2 dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- (lissamine rhodamine B sulfonyl) Avanti Polar Lipids 810158 16:0 RhoPE
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3- [(N-(5-amino-1 carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl] (nickel salt) Avanti Polar Lipids 790404 DGS-NTA-Ni2+
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850375 DOPC
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850355 DPPC
Amber glass vials ThermoFisher B7990-2A
ATP disodium salt Sigma Aldrich A26209
Attofluor cell chamber ThermoFisher A7816
Bath sonicator GT Sonic 1860QTS
beta-casein Sigma Aldrich C6905
CaCl2 ThermoFisher 12135
chloroform Sigma Aldrich 650471 alternatively from Electron Microscopy Sciences, 50980296
Cover slips, #1, 25 mm diameter, Gold Seal Harvard Apparatus 64-0705B
Cover slips, #1, 40x22 mm, Gold Seal ThermoFisher 48404-031
EDTA ThermoFisher G12635
EGTA Himedia MB130
Gas tight glass syringes, with removebla needle, blunt, volumes 10 µL, 100 µL, 500 µL Hammilton 1700 series
Hellmanex III Hellma Analytics Z805939 cleaning solution
HEPES Himedia RM380
KaH2PO4 ThermoFisher G13405
KCl ThermoFisher G13305
KOH ThermoFisher G26708
Lipid extruder Avanti Polar Lipids 61000-1EA
MgCl2 ThermoFisher G15535
Microtip sonicator Sonics VC750 3 mm Tip diameter
Na2CO3 ThermoFisher G15955
NaCl Himedia GRM853
NaH2PO4 ThermoFisher G15825
NaOH ThermoFisher G27815
Nikon Ti Eclipse TIRF microscope Nikon With a TIRF unit connected through a polarization-conserving optical fibre to an Agilent monolithic laser combiner MLC400 with multiple laser lines with a 100X, 1.45 NA Nikon Oil Objective with two 512 x 512-pixel EMCCD cameras (Photometrics Evolve 512) with a 100X, 1.45 NA Nikon Oil Objective with two 512 x 512-pixel EMCCD cameras (Photometrics Evolve 512)
NOA88 Norland Products 8801
PTFE Coated Tweezer Style #2A Structure Probe 0S2AT-XD
Refrigerated microcentrifuge Eppendorf 5424R
Sucrose ThermoFisher G15925
UV-illuminator Novascan PSD PRO-UV needs vacuum and O2 supply

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Köster, D. V., Mayor, S. Cortical actin and the plasma membrane: Inextricably intertwined. Current Opinion in Cell Biology. 38, 81-89 (2016).
  2. Rao, M., Mayor, S. Active organization of membrane constituents in living cells. Current Opinion in Cell Biology. 29, 126-132 (2014).
  3. Honigmann, A., et al. A lipid bound actin meshwork organizes liquid phase separation in model membranes. eLife. 3, 01671 (2014).
  4. Das, A., et al. Stratification relieves constraints from steric hindrance in the generation of compact actomyosin asters at the membrane cortex. Science Advances. 6 (11), (2020).
  5. Köster, D. V., et al. Actomyosin dynamics drive local membrane component organization in an in vitro active composite layer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (12), 1645-1654 (2016).
  6. Vogel, S. K., Heinemann, F., Chwastek, G., Schwille, P. The design of MACs (minimal actin cortices). Cytoskeleton. 70 (11), 706-717 (2013).
  7. Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. Reconstitution of contractile actomyosin arrays. Methods in Enzymology. 540, 265-282 (2014).
  8. Mosby, L. S., et al. Myosin II filament dynamics in actin networks revealed with interferometric scattering microscopy. Biophysical Journal. 118 (8), 1946-1957 (2020).
  9. Seara, D. S., et al. Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin. Nature Communications. 9 (1), 4948 (2018).
  10. Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7, 12615 (2016).
  11. Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments. eLife. 2, 00116 (2013).
  12. Ditlev, J. A., et al. A composition-dependent molecular clutch between T cell signaling condensates and actin. eLife. 8, 42695 (2019).
  13. Banjade, S., Rosen, M. K. Phase transitions of multivalent proteins can promote clustering of membrane receptors. eLife. 3, 04123 (2014).
  14. Heinemann, F., Vogel, S. K., Schwille, P. Lateral membrane diffusion modulated by a minimal actin cortex. Biophysical Journal. 104 (7), 1465-1475 (2013).
  15. Vogel, S. K., Greiss, F., Khmelinskaia, A., Schwille, P. Control of lipid domain organization by a biomimetic contractile actomyosin cortex. eLife. 6, 24350 (2017).
  16. Block, S. Brownian motion at lipid membranes: A comparison of hydrodynamic models describing and experiments quantifying diffusion within lipid bilayers. Biomolecules. 8 (2), 30 (2018).
  17. JoVE, JoVE. JoVE Methods Collection. In vitro reconstitution of cytoskeleton networks for biomaterials, biophysics and active matter research. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2022).
  18. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Purification of muscle actin. Methods in Enzymology. 85, 164-181 (1982).
  19. Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
  20. Pollard, T. D. Myosin purification and characterization. Methods in Cell Biology. 24, 331-371 (1982).
  21. JoVE Science Education Database. Separating protein with SDS-PAGE. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2022).
  22. Bieling, P., et al. WH2 and proline-rich domains of WASP-family proteins collaborate to accelerate actin filament elongation. The EMBO Journal. 37 (1), 102-121 (2018).
  23. Shrivastava, R., Köster, D., Kalme, S., Mayor, S., Neerathilingam, M. Tailor-made ezrin actin binding domain to probe its interaction with actin in-vitro. PLoS One. 10 (4), 0123428 (2015).
  24. Nye, J. A., Groves, J. T. Kinetic control of histidine-tagged protein surface density on supported lipid bilayers. Langmuir. 24 (8), 4145-4149 (2008).
  25. Honigmann, A., et al. Scanning STED-FCS reveals spatiotemporal heterogeneity of lipid interaction in the plasma membrane of living cells. Nature Communications. 5, 5412 (2014).
  26. Selden, N. S., et al. Chemically programmed cell adhesion with membrane-anchored oligonucleotides. Journal of the American Chemical Society. 134 (2), 765-768 (2012).
  27. Seu, K. J., et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).
  28. Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K., DiBenedetto, E. Simplified equation to extract diffusion coefficients from confocal FRAP data. Traffic. 13 (12), 1589-1600 (2012).
  29. Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K. A novel computational framework for D(t) from Fluorescence Recovery after Photobleaching data reveals various anomalous diffusion types in live cell membranes. Traffic. 20 (11), 867-880 (2019).
  30. Lorén, N., et al. Fluorescence recovery after photobleaching in material and life sciences: Putting theory into practice. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (3), 323-387 (2015).
  31. Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (7), 1-7 (2013).
  32. Andrecka, J., Spillane, K. M., Ortega-Arroyo, J., Kukura, P. Direct observation and control of Supported lipid bilayer formation with interferometric scattering microscopy. ACS Nano. 7 (12), 10662-10670 (2013).
  33. Lin, W. -C., et al. Supported membrane formation, characterization, functionalization, and patterning for application in biological science and technology. Current Protocols in Chemical Biology. 2 (4), 235-269 (2010).
  34. Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view. Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).
  35. Sapuri-Butti, A. R., Butti, R. C., Parikh, A. N. Characterization of supported membranes on topographically patterned polymeric elastomers and their applications to microcontact printing. Langmuir. 23 (25), 12645-12654 (2007).
  36. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  37. Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. iScience. 25 (5), 104236 (2022).
  38. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments. (177), e63332 (2021).
  39. Murrell, M., Chen, S., Sun, Z. G. In vitro reconstitution of actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments. , (2022).

Tags

Biologi utgave 185
Rekonstituering av membranbundet minimal aktin cortices på støttede lipid dobbeltlag
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Köster, D. V., Bhat, A.,… More

Köster, D. V., Bhat, A., Talluri, S., Mayor, S. Reconstitution of Membrane-Tethered Minimal Actin Cortices on Supported Lipid Bilayers. J. Vis. Exp. (185), e63968, doi:10.3791/63968 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter