Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

التسليم داخل البطين للمستقلبات الميكروبية المشتقة من الأمعاء في الفئران التي تتحرك بحرية

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63972
Automatic Translation
*1,2, *2, 1,2
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Physiology, College of Medicine, National Cheng Kung University
* These authors contributed equally

Summary

المستقلبات الميكروبية المشتقة من الأمعاء لها تأثيرات متعددة الأوجه تؤدي إلى سلوك معقد في الحيوانات. نحن نهدف إلى توفير طريقة خطوة بخطوة لتحديد آثار المستقلبات الميكروبية المشتقة من الأمعاء في الدماغ عن طريق التسليم داخل البطين عبر قنية دليلية.

Abstract

تم التحقيق على نطاق واسع في تأثير ميكروبات الأمعاء ومستقلباتها على فسيولوجيا المضيف وسلوكه على نطاق واسع في هذا العقد. كشفت العديد من الدراسات أن المستقلبات المشتقة من ميكروبات الأمعاء تعدل الوظائف الفسيولوجية بوساطة الدماغ من خلال مسارات معقدة بين الأمعاء والدماغ في المضيف. الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFAs) هي المستقلبات الرئيسية المشتقة من البكتيريا التي يتم إنتاجها أثناء تخمير الألياف الغذائية بواسطة ميكروبيوم الأمعاء. يمكن أن تعمل SCFAs المفرزة من الأمعاء في مواقع متعددة في المحيط ، مما يؤثر على الاستجابات المناعية والغدد الصماء والعصبية بسبب التوزيع الواسع لمستقبلات SCFAs. لذلك ، من الصعب التمييز بين الآثار المركزية والطرفية ل SCFAs من خلال الإدارة الفموية وداخل الصفاق ل SCFAs. تقدم هذه الورقة طريقة قائمة على الفيديو لاستجواب الدور الوظيفي ل SCFAs في الدماغ عبر قنية إرشادية في الفئران التي تتحرك بحرية. يمكن تعديل كمية ونوع SCFAs في الدماغ عن طريق التحكم في حجم التسريب ومعدله. يمكن أن توفر هذه الطريقة للعلماء طريقة لتقدير دور المستقلبات المشتقة من الأمعاء في الدماغ.

Introduction

يأوي الجهاز الهضمي البشري كائنات دقيقة متنوعة تؤثر على المضيف1،2،3. يمكن لبكتيريا الأمعاء هذه إفراز مستقلبات مشتقة من الأمعاء أثناء استخدامها للمكونات الغذائية التي يستهلكها المضيف 4,5. ومن المثير للاهتمام ، يمكن نقل مستقلبات الأمعاء غير المستقلب في المحيط إلى أعضاء أخرى عبر الدورة الدموية6. تجدر الإشارة إلى أن هذه المستقلبات المفرزة يمكن أن تكون بمثابة وسطاء لمحور الأمعاء والدماغ ، والذي يعرف بأنه الاتصال ثنائي الاتجاه بين الجهاز العصبي المركزي والأمعاء7. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن المستقلبات المشتقة من الأمعاء يمكن أن تعدل السلوك المعقد والعاطفة في الحيوانات8،9،10،11.

الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFAs) هي المستقلبات الرئيسية التي تنتجها ميكروبات الأمعاء أثناء تخمير الألياف الغذائية والكربوهيدرات غير القابلة للهضم6. الأسيتات والبروبيونات والزبدات هي SCFAs الأكثر وفرة في الأمعاء12. SCFAs بمثابة مصدر الطاقة للخلايا في الجهاز الهضمي. يمكن نقل SCFAs غير المستقلب في الأمعاء إلى الدماغ من خلال الوريد البابي ، وبالتالي تعديل الدماغ والسلوك 6,12. وقد أشارت الدراسات السابقة إلى أن SCFAs قد تلعب دورا حاسما في الاضطرابات العصبية والنفسية 6,12. على سبيل المثال ، الحقن داخل الصفاق من الزباديات في الفئران BTBR T + Itpr3tf / J (BTBR) ، وهو نموذج حيواني لاضطراب طيف التوحد (ASD) ، أنقذ عجزهم الاجتماعي13. أظهرت الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية التي تتلقى الميكروبات من الأشخاص المصابين بالاكتئاب زيادة في السلوكيات الشبيهة بالقلق و SCFAs البرازية14. سريريا ، لوحظت تغيرات في مستويات SCFAs البرازية في الأشخاص الذين يعانون من ASD مقارنة بالضوابط النامية عادة15,16. الأشخاص الذين يعانون من الاكتئاب لديهم مستويات SCFAs أقل في البراز من الأشخاص الأصحاء17,18. اقترحت هذه الدراسات أن SCFAs يمكن أن تغير السلوك في الحيوانات والبشر من خلال طرق مختلفة.

تمارس المستقلبات الميكروبية تأثيرات متنوعة على مواقع متعددة في الجسم ، مما يؤثر على فسيولوجيا المضيف والسلوكيات 4,19 ، بما في ذلك الجهاز الهضمي والعصب المبهم والعصب الودي. من الصعب تحديد الدور الدقيق للمستقلبات المشتقة من الأمعاء في الدماغ عند إدارة المستقلبات عبر الطرق الطرفية. تقدم هذه الورقة بروتوكولا قائما على الفيديو للتحقيق في آثار المستقلبات المشتقة من الأمعاء في دماغ فأر يتحرك بحرية (الشكل 1). أظهرنا أنه يمكن إعطاء SCFAs بشكل حاد من خلال قنية الدليل أثناء الاختبارات السلوكية. يمكن تعديل نوع وحجم ومعدل ضخ المستقلبات اعتمادا على الغرض. يمكن تعديل موقع القنية لاستكشاف تأثير مستقلبات الأمعاء في منطقة معينة من الدماغ. نحن نهدف إلى تزويد العلماء بطريقة لاستكشاف التأثير المحتمل للمستقلبات الميكروبية المشتقة من الأمعاء على الدماغ والسلوك.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية ورعاية الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات بجامعة تشنغ كونغ الوطنية (NCKU).

1. التحضير لحيوان التجارب

  1. احصل على الفئران الذكور C57BL / 6JNarl من النوع البري من 6 إلى 8 أسابيع من بائع.
  2. قم بإيواء الفئران في قفص فأر قياسي مع تشاو الماوس القياسي والماء المعقم ad libitum.
    ملاحظة: ظروف السكن لمركز حيوانات المختبر في NCKU هي 22 ± درجة حرارة 1 درجة مئوية ، و 55٪ ± رطوبة 10٪ ، ودورة ضوء / ظلام 13 ساعة / 11 ساعة.

2. الجراحة المجسمة

  1. إعداد وتعقيم الأداة المجسمة والأدوات الجراحية والمواد ذات الصلة.
    ملاحظة: يجب تعقيم جميع العناصر التي ستتصل مباشرة بموقع الجراحة لتجنب العدوى.
  2. تخدير الماوس عن طريق وضعه في قفص زجاجي شبكي مع 1٪ -5٪ أيسوفلوران في الأكسجين.
    ملاحظة: راقب الماوس عن كثب لضمان الحفاظ على معدل التنفس عند حوالي نفس واحد في الثانية.
  3. أخرج الماوس من غرفة التخدير. حلق الموقع الجراحي (رأس الماوس) باستخدام أداة تشذيب الحيوانات الأليفة. ضع الماوس على الإطار المجسمة عن طريق تثبيت قواطع الماوس على شريط القواطع في حامل القواطع المجسمة. تغطية الأنف مع قناع مخروط الأنف.
  4. تخدير الفأر مع 1٪ -2.5٪ isoflurane في الأكسجين طوال الجراحة المجسمة. تقييم الإحساس بألم الماوس عبر منعكس قرصة إصبع القدم وضمان معدل تنفس ثابت قبل شق الموقع الجراحي.
  5. ضع وسادة تدفئة (37.0 درجة مئوية) أسفل الماوس على الإطار المجسمة للحفاظ على درجة حرارة الجسم أثناء الجراحة. بدلا من ذلك ، حافظ على درجة الحرارة الأساسية بمساعدة مسبار حراري مستقيمي يربط بين جهاز الدفء المبرمج ووسادة التدفئة.
  6. قم بإزالة الفراء المشذب على الرأس باستخدام شريط لاصق. حقن الفأر مع كيتوبروفين مسكن (5 ملغ / كغ) تحت الجلد لتخفيف الألم. ضع مرهم العين لتجنب جفاف العينين.
  7. أدخل شريط الأذن المدبب في قناة الأذن لإصلاح الرأس.
  8. توسيط الرأس عن طريق ضبط مقياس شريط الأذن.
  9. شد مشبك الأنف على حامل القواطع لتجنب الحركة الرأسية. اضغط على الرأس برفق للتحقق من أن الرأس ثابت وتجنب أن يصبح الرأس فضفاضا أثناء الجراحة اللاحقة.
  10. قم بتطهير فروة الرأس بثلاث مقشرات متناوبة من الكلورهيكسيدين باستخدام قطعة قطن. ابدأ كل مقشر من الوسط نحو الجانب الخارجي (من المنطقة المركزية الأكثر تطهيرا إلى المنطقة الأقل تطهيرا).
    ملاحظة: يمكن أن يساعد استخدام المقشرات من الوسط إلى الخارج العلماء على تقليل العدوى والتلوث من الفراء. المنطقة الخارجية قريبة من منطقة الرأس غير المحلوقة ، والتي لا تزال تحتوي على كمية كبيرة من الفراء وليس من السهل تطهيرها جيدا.
  11. شق فروة الرأس بطريقة أمامية / خلفية (<1 سم) باستخدام شفرة جراحية. افتح الشق وامسح الجمجمة بقطعة قطن تمسك بها ملقط تشريح مجهري.
    ملاحظة: يجب تعقيم ملقط التشريح المجهري والشفرة الجراحية ومسحات القطن عن طريق التعقيم قبل الجراحة. أثناء العملية الجراحية ، قم بتعقيم جميع المعدات الجراحية باستخدام معقم خرز زجاجي (150 درجة مئوية) لمدة 5 ثوان على الأقل قبل وبعد كل. قم بإعداد كوب معقم لحمل الشفرة الجراحية والملقط أثناء العملية الجراحية وبين الحيوانات.
  12. تحديد بريغما ولامدا على الجمجمة. استخدم Bregma كمرجع لتحديد موقع المنطقة محل الاهتمام.
    1. اختياري: قم بتركيب المثقاب المجسمة على حامل المثقاب المجسم، واستخدم طرف المثقاب للإشارة إلى Bregma كمرجع. قم بتعقيم المثقاب المجسمة باستخدام معقم الخرز الزجاجي (150 درجة مئوية) لمدة 5 ثوان على الأقل.
  13. معايرة ومحاذاة المستوى الأفقي للجمجمة المسطحة في المستويات اليسرى / اليمنى والأمامية / الخلفية بواسطة Bregma / Lambda.
    ملاحظة: إذا لم يكن في مستوى أفقي صحيح، فأعد تركيب الماوس على الجهاز المجسم.

3. التجارية دليل مخصص زرع قنية

  1. تحديد وتسمية موضع البطين الجانبي الأيمن، استنادا إلى الإحداثيات المجسمة: المسافة إلى بريغما، الأمامية/الخلفية (A/P): 0.26 مم، الإنسية/الجانبية (M/L): -1.0 مم، الظهرية/البطنية (D/V): -2.0 مم20.
    ملاحظة: يمكن تعديل الإحداثيات استنادا إلى المنطقة محل الاهتمام. استندت إحداثيات البطين الجانبي إلى الفئران البالغة C57BL/6J التي يتراوح وزنها بين 26 و30 جم. إذا تم استخدام الفئران الأصغر سنا ، فراجع المناقشة.
  2. حفر حفرة (قطرها = 1.5 مم) من خلال الجمجمة في الموقع المسمى باستخدام مثقاب مجسمة لزرع قنية دليل تجاري.
  3. حفر اثنين إلى أربعة ثقوب أخرى (قطرها = 1.5 ملم) على الجمجمة باستخدام مثقاب مجسمة لتركيب مسامير الفولاذ المقاوم للصدأ.
    ملاحظة: قم بتعقيم المثقاب المجسمة باستخدام معقم خرز زجاجي (150 درجة مئوية) لمدة 5 ثوان على الأقل قبل وبعد كل.
  4. امسح قصاصات العظام وأوقف النزيف باستخدام قطعة قطن.
  5. امسح الجمجمة باستخدام ليدوكائين (1 ملغم / كغم) باستخدام قطعة قطن للحصول على تأثيرات مخدرة موضعية ومضادة للحكة ومسكنة للألم. إذا لم يتوقف النزيف بعد الحفر ، ضع قطعة قطن بلطف على الحفرة للإرقاء.
  6. قم بتركيب اثنين إلى أربعة مسامير غير قابلة للصدأ على الثقوب لتوفير مراسي لأكريليك الأسنان.
  7. ضع قنية الدليل التجاري على حامل القنية المجسمة وقم بتطهيرها باستخدام معقم الخرز الزجاجي (150 درجة مئوية).
    ملاحظة: تم تخصيص قنية الدليل التجاري والدمية التجارية والحاقن التجاري (الشكل 2A) وفقا للمواصفات الموضحة في جدول المواد.
  8. حرك حامل القنية المجسمة إلى الفتحة المحفورة للبطين الجانبي وأدخل قنية التوجيه التجاري ببطء في الحفرة حتى العمق المطلوب (2.5 مم).
    ملاحظة: يمكن تعريف الإحداثيات الظهرية/البطنية عن طريق تعيين طرف قنية الدليل التجاري كمرجع عندما يتم إدخال الطرف بالكاد في الحفرة.
  9. ضع 10 ميكرولتر من لاصق n-butyl cyanoacrylate (غراء لاصق للأنسجة) لإصلاح قنية الدليل التجاري في الحفرة المحفورة وانتظر لمدة 3-4 دقائق. حرر قنية الدليل التجاري بلطف من حامل القنية المجسمة وانقل الحامل بعيدا.
  10. ضع أكريليك الأسنان على فروة الرأس المحفورة لإصلاح قنية الدليل التجاري وانتظر لمدة 5 دقائق على الأقل. زرع الدمية التجارية في قنية الدليل التجاري لتجنب انسداد القنية بالدم أو سوائل الجسم (الشكل 2B).
  11. حرر شريط الأذن من قناة الأذن وأزل الماوس من الإطار المجسم.
  12. ضع الماوس في قفص جديد مع وسادة تدفئة تحته للتعافي من التخدير وراقب باستمرار حتى يستيقظ الماوس تماما.
    ملاحظة: لا تترك الحيوان دون مراقبة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء الصارم. يجب ألا يعود الحيوان الذي خضع لعملية جراحية إلى صحبة الحيوانات الأخرى حتى يتعافى تماما.
  13. أعد الماوس إلى مسكن واحد أو سكن جماعي ، اعتمادا على بروتوكول IACUC المؤسسي والتصميم التجريبي. بالنسبة للإسكان الجماعي ، تأكد من وجود عدد أقل من الفئران في قفص لتقليل الإصابات غير المرغوب فيها أو انفصال الكانيولا.
  14. قم بإعطاء الإيبوبروفين (0.2 مجم / مل) في مياه الشرب لمدة 3 أيام على الأقل للرعاية بعد العملية الجراحية ، وراقب مرتين في اليوم علامات الألم والضيق لمدة 3 أيام على الأقل.
    1. أثناء الرعاية بعد العملية الجراحية ، ضع مرهم روكسيثروميسين حول الجلد لمنع الالتهاب والعدوى في الفئران.
    2. استمر في مراقبة حالة الحيوان وإعطاء حقن داخل الصفاق في الوقت المناسب من 5٪ من الجلوكوز و / أو 0.9٪ كلوريد الصوديوم لتوفير طاقة كافية.
    3. إذا تدهورت حالة الألم أو الضيق أو العدوى بشكل مطرد ، فقم بالقتل الرحيم للفأر عن طريق استنشاق CO2 .
  15. انتظر لمدة 1 أسبوع بعد العملية حتى يكون الماوس جاهزا للتسليم داخل البطين من SCFAs والاختبارات السلوكية.

4. إعداد SCFAs

  1. قم بإذابة خلات الصوديوم وبوتيرات الصوديوم وبروبيونات الصوديوم في السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي (ACSF) (انظر جدول المواد).
  2. تأكد من إذابة المواد الكيميائية بالكامل ، ثم اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 ، وقم بتصفية خليط SCFAs من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر للتعقيم.

5. إعداد نظام التسريب للتوصيل داخل البطين من SCFAs أثناء الاختبار السلوكي

  1. قم بتركيب كاميرا سقف لتسجيل السلوك. قم بتوصيل الكاميرا بجهاز كمبيوتر للتحكم في برنامج تسجيل الفيديو (الشكل 3).
  2. املأ حقنة 10 ميكرولتر بالماء المقطر.
    ملاحظة: تجنب فقاعات الهواء في حقنة الميكرولتر.
  3. قم بتوصيل مضخة الحقن المجهري بوحدة التحكم في الحقن المجهري.
  4. قم بتركيب حقنة الميكرولتر على مضخة الحقن المجهري. لتثبيت المحقنة ، اضغط على الزر لتخفيف المشبك وتثبيت المحقنة على الموضع المقابل. أغلق المشبك وقم بتشديد المسمار الذي يحتفظ بالمكبس على مضخة الحقن المجهري (الشكل 4A).
  5. أدخل الحاقن التجاري في أنبوب البولي إيثيلين (الشكل 2A).
  6. قم بتعليق أنبوب البولي إيثيلين على كاميرا السقف فوق ساحة الاختبار.
  7. املأ أنبوب البولي إيثيلين بالماء المقطر باستخدام حقنة الأنسولين. قم بتوصيل حقنة الميكرولتر بأنبوب البولي إيثيلين المعلق.
    ملاحظة: تأكد من أن أنبوب البولي إيثيلين طويل بما يكفي للسماح للماوس بالتحرك بحرية في جميع أنحاء ساحة الاختبار.

6. إعدادات النظام من وحدة تحكم الحقن المجهري

  1. قم بتشغيل وحدة التحكم في الحقن المجهري واضغط على عرض جميع القنوات للوصول إلى شاشة الأوامر (الشكل 4C). اضغط على التكوين واضبط مستوى الصوت المستهدف على 9800 نانولتر مع معدل التسليم إلى 100 نانولتر/ثانية. قم ببث 9800 نانولتر من الماء المقطر من أنبوب البولي إيثيلين المتصل بحقنة الميكرولتر (اضغط على الاتجاه للتبديل إلى وضع Infuse واضغط على RUN) (انظر المربعات الحمراء في شاشة الأوامر في الشكل 4C).
  2. اضغط على التكوين واضبط مستوى الصوت المستهدف على 3000 نانولتر مع معدل التسليم إلى 100 نانولتر/ثانية. اسحب 3000 نانولتر من الزيت المعدني (اضغط على الاتجاه للتبديل إلى وضع السحب واضغط على RUN) (انظر المربعات الحمراء في شاشة الأوامر في الشكل 4C).
    ملاحظة: يجب ملاحظة فصل واضح بين الزيت والماء على أنبوب البولي إيثيلين.
  3. قم بتفكيك أنبوب البولي إيثيلين من إبرة حقنة الميكرولتر. بصق 3000 نانولتر من الماء المقطر من إبرة حقنة ميكرولتر (اضغط على الاتجاه للتبديل إلى وضع Infuse واضغط على RUN).
  4. أدخل حقنة الميكرولتر مرة أخرى في أنبوب البولي إيثيلين. اضغط على التكوين واضبط مستوى الصوت المستهدف على 9500 نانولتر مع معدل التسليم إلى 100 نانولتر/ثانية. سحب 9500 نانولتر من SCFAs (اضغط على الاتجاه للتبديل إلى وضع السحب واضغط على RUN). قم بتسمية مرحلة SCFAs النفطية للتحقق مما إذا كان قد تم غرس SCFAs بنجاح.
  5. اضغط على التكوين واضبط هدف مستوى الصوت المطلوب بمعدل التسليم على 7 nL / s. اضغط على الاتجاه للتبديل إلى وضع Infuse (انظر المربعات الحمراء في شاشة الأوامر في الشكل 4C).
    ملاحظة: تحديد وحدة التخزين استنادا إلى وقت التسريب. على سبيل المثال ، إذا كان وقت التسريب هو 3 دقائق لمعدل التسليم البالغ 7 nL / s ، فإن الحجم المستهدف = 1,260 nL.
  6. اضغط على RUN لبث حقنة الميكرولتر إلى الأمام حتى يخرج السائل في الطرف الأمامي من الحاقن التجاري قبل إدخال الحاقن في القنية لحقن SCFAs.

7. ضخ SCFAs في البطين الجانبي من خلال قنية الدليل التجاري في الفأر المتحرك بحرية

  1. تخدير الماوس عن طريق وضعه في قفص زجاجي شبكي مع 1٪ -5٪ أيسوفلوران في الأكسجين.
    ملاحظة: راقب الماوس عن كثب لضمان الحفاظ على معدل التنفس عند حوالي نفس واحد في الثانية.
  2. قشر الماوس وأدخل الحاقن التجاري في قنية الدليل التجاري (الشكل 4B).
    ملاحظة: إذا كانت قنية الدليل التجاري متصلة بالدم أو سائل الجسم، فقم بفكها بلطف باستخدام ملاقط.
  3. اسمح للفأر بالتعافي من التخدير لمدة 15 دقيقة في قفص قبل الاختبار السلوكي.
  4. لاختبار الحركة الأساسي ، ضع الماوس في قفص جديد واسمح له بالاستكشاف بحرية لمدة 35 دقيقة. قم ببث SCFAs باستخدام معدل تسليم يبلغ 7 nL / s لحجم مستهدف يبلغ 2100 nL في أول 5 دقائق (اضغط على الاتجاه إلى وضع Infuse واضغط على RUN).
    ملاحظة: يمكن تحليل الحركة في قفص الرواية باستخدام برنامج تتبع الفيديو لسلوك الحيوان21,22.
  5. تخدير الماوس (تكرار الخطوة 7.1) وإزالة الحاقن التجاري من قنية الدليل التجاري.
    ملاحظة: يمكن حقن الماوس بشكل متكرر بعناصر تحكم / مستقلبات مختلفة بعد إعطاء المدة الزمنية المناسبة لغسل الحقن السابق. طالما أن القنية مثبتة على رأس الفأر ، يمكن اختبار الماوس بشكل متكرر باستخدام مستقلبات مختلفة.

8. استعادة نظام الحقن المجهري

  1. قم بتفكيك أنبوب البولي إيثيلين من حقنة الميكرولتر.
  2. حقن الهواء في الأنبوب باستخدام حقنة الأنسولين للتخلص من الماء المقطر في أنبوب البولي إيثيلين. إفراغ حقنة ميكرولتر.
  3. اضغط على Reset Pos على شاشة التكوين لفتح شاشة تعريف إيقاف المحاقن (الشكل 4C).
  4. اضغط على مفتاح سحب حتى يصدر صوت صفير لإعادة ضبط مضخة الحقن المجهري على الموضع المسحوب بالكامل (الشكل 4C).
  5. ارجع إلى شاشة الأوامر وقم بإيقاف تشغيل وحدة التحكم في الحقن المجهري إذا كانت هناك علامة ** END REACHED** على هذه الشاشة (الشكل 4C).

9. اختياري: التحقق من صحة الحقن داخل البطين عن طريق التتبع العصبي

  1. غرس 2100 نانولتر من المقتفي العصبي بمعدل تسليم 7 نانولتر / ثانية للتحقق من موقع التسريب.
    ملاحظة: اترك الحاقن في قنية التوجيه لمدة 5 دقائق لمنع التدفق العكسي.
  2. تخدير الفأر عن طريق جرعة زائدة من الايزوفلوران (5 ٪) بعد 30 دقيقة من ضخ المقتفي العصبي.
  3. تحقق من معدل التنفس ومنعكس قرصة الذيل / المخلب في الماوس المخدر.
    ملاحظة: يجب ألا تستجيب الفئران قبل الخطوة التالية.
  4. قم بعمل شق 4-5 سم عبر الجلد والعضلات وجدار البطن أسفل القفص الصدري.
  5. حرك الكبد قليلا بعيدا عن الحجاب الحاجز بعناية.
  6. شق الحجاب الحاجز لفضح قلب الماوس.
  7. قم باختراق الماوس عبر القلب مع محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وبارافورمالديهايد بارد بنسبة 4٪ في PBS.
  8. قطع رأس الفأر وتشريح الدماغ بعناية باستخدام ملقط تشريح مجهري ومقص تشريح مجهري لإخراج الدماغ كله23. ضع عينات الدماغ في بارافورمالدهيد 4٪ بارد في PBS لمدة 3-4 أيام واغسلها 3 × 5 دقائق باستخدام PBS.
  9. قطع الدماغ إلى قسمين في حامل شريحة دماغ الفأر في الجزء الثامن من حامل شريحة دماغ الفأر (1 مم / مقطع) من الاتجاه الأمامي إلى الخلفي. ضع الدماغ في قالب التضمين وقم بتضمين عينات الدماغ في أغاروز منخفض الانصهار (4٪ في PBS).
  10. قم بلصق الدماغ المضمن في الأغاروز على مرحلة الاهتزاز باستخدام الغراء الفائق. قسم الدماغ بشكل كورانيكي إلى شرائح دماغية 50 ميكرومتر باستخدام الاهتزاز.
  11. احتضان شرائح الدماغ في الجسم المضاد الذي يستهدف المقتفي العصبي المخفف في المخزن المؤقت المانع (تخفيف 1: 1000) بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يحتوي المخزن المؤقت المانع على 10٪ من مصل الحصان و 0.1٪ Triton X-100 و 0.02٪ من أزيد الصوديوم.
  12. اغسل الشرائح 3 × 5 دقائق باستخدام PBST (PBS مع 0.1٪ triton X-100).
  13. احتضان شرائح الدماغ في الجسم المضاد الثانوي المترافق مع صبغة التألق المخفف في المخزن المؤقت المانع (تخفيف 1:500) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  14. اغسل الشرائح 3 × 5 دقائق باستخدام PBS.
  15. قم بتركيب شرائح الدماغ على الشريحة باستخدام وسط تركيب يحتوي على 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
  16. قم بتغطية الشريحة بغطاء مجهري.
  17. ضع طلاء الأظافر على حافة الانزلاق لتجنب تسرب وسط التركيب.
  18. بعد الحضانة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء ، قم بتصوير إشارة التألق في موقع التسريب باستخدام مجهر التألق.

10. اختياري: ضخ المستقلبات من خلال قنية دليل الفولاذ المقاوم للصدأ مخصصة في البطين الجانبي في الفئران

  1. اتبع أقسام البروتوكول 1-8 واستبدل قنية الدليل التجاري بقنية دليل من الفولاذ المقاوم للصدأ لبث المواد الكيميائية من خلال حاقن الفولاذ المقاوم للصدأ في الماوس.
    ملاحظة: يتم توضيح إيجابيات وسلبيات مختلف القنيبات التجارية والفولاذ المقاوم للصدأ في قسم المناقشة.
  2. قم بإجراء البروتوكول الجراحي بنفس الطريقة الموضحة في قسمي البروتوكول 2 و 3 ، باستثناء تذكر استبدال قنية الدليل التجاري بقنية دليل من الفولاذ المقاوم للصدأ (الشكل 5B).
    ملاحظة: تم تخصيص قنية دليل الفولاذ المقاوم للصدأ ، وهمية الفولاذ المقاوم للصدأ ، وحاقن الفولاذ المقاوم للصدأ (الشكل 5A) مع المواصفات الموضحة في جدول المواد. أدخل قنية التوجيه المخصصة من الفولاذ المقاوم للصدأ في الحفرة حتى العمق المطلوب (2.0 مم).
  3. قم ببث SCFAs عبر قنية دليل الفولاذ المقاوم للصدأ باستخدام نظام الحقن المجهري الذي يتكون من وحدة التحكم في الحقن المجهري ومضخة الحقن المجهري (الشكل 4B) (نفس أقسام البروتوكول 4-7). بالنسبة لدمية الفولاذ المقاوم للصدأ لقنية دليل الفولاذ المقاوم للصدأ ، قم بثني جانب واحد من حاقن الفولاذ المقاوم للصدأ بلطف حتى يصبح طرف الجانب الآخر أطول بمقدار 1 مم من قنية التوجيه المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ.
  4. غرس 2100 نانولتر من المقتفي العصبي من خلال قنية دليل الفولاذ المقاوم للصدأ في البطين الجانبي في الفئران (نفس قسم البروتوكول 9).
  5. اجمع العينة لمدة 30 دقيقة بعد ضخ التتبع العصبي (مثل قسم البروتوكول 9).
  6. قم بإجراء الحصول على الصور في شرائح الدماغ المشبعة بالمقتفي العصبي (مثل قسم البروتوكول 9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم غرس الفأر مع SCFAs 1 بعد أسبوع من الشفاء من زرع قنية الدليل لتقييم النشاط الحركي في قفص جديد. تم وضع الفأر في قفص جديد وغرسه مع 2100 نانولتر من SCFAs أو ACSF في أول 5 دقائق (معدل تسليم 7 nL / s) في الدماغ من خلال قنية الدليل التجاري المزروعة في البطين الجانبي للدماغ. تم تسجيل النشاط الحركي في قفص جديد لمدة 30 دقيقة إضافية بعد التسريب. لم يلاحظ أي فرق في النشاط الحركي في القفص الجديد بين ضخ SCFAs و ACSF (الشكل 6) (n = 2 فئران لكل مجموعة ؛ يتم عرض البيانات كمتوسط ± s.e.m. وتحليلها بواسطة ANOVA ثنائي الاتجاه).

للتحقق من دقة زرع قنية الدليل في مناطق الدماغ ، تم غرس متتبع عصبي فلورسنت في الفئران عبر قنية الدليل بنفس الحجم ومعدل التسليم مثل SCFAs (2100 nL في 5 دقائق ؛ 7 nL / s). تم جمع الأدمغة لعلم الأنسجة بعد 30 دقيقة. تم الكشف عن صبغة الفلورسنت في البطين الجانبي والمناطق المحيطة به من دماغ الفأر (الشكل 7A). تم زرع قنية دليل من الفولاذ المقاوم للصدأ في البطين الجانبي للدماغ لضخ المقتفي العصبي في ظل نفس الظروف. على غرار قنية التوجيه ، أظهرت النتائج أنه تم اكتشاف إشارة صبغة الفلورسنت في البطين الجانبي والمناطق المحيطة بدماغ الفأر حتى بعد التسريب من خلال قنية دليل الفولاذ المقاوم للصدأ (الشكل 7B).

Figure 1
الشكل 1: إجراء التسريب البطيني في الفئران التي تتحرك بحرية. مخطط التدفق للتوصيل داخل البطين للمستقلبات الميكروبية المشتقة من الأمعاء في الفئران التي تتحرك بحرية. اختصار: SCFAs = الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: زرع قنية الدليل التجاري في الفئران . (أ) الصورة التمثيلية لقنية الدليل التجاري والدمية والحاقن. (ب) الصورة التمثيلية لقنية الدليل التجاري والدمية المزروعة في دماغ الفئران عن طريق التثبيت بأكريليك الأسنان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: جهاز التسريب البطيني لاختبار السلوك. الرسم البياني لنظام الحقن المجهري ونظام تسجيل الفيديو والجهاز السلوكي. اختصار: SCFAs = الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: نظام الحقن المجهري. (أ) تركيب حقنة الميكرولتر باستخدام مضخة الحقن المجهري. (ب) إدخال الحاقن التجاري المتصل بأنبوب البولي إيثيلين في قنية التوجيه التجاري (C) شاشة اللمس لوحدة التحكم في الحقن المجهري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: زرع قنية دليل الفولاذ المقاوم للصدأ في البطين الجانبي للفئران . (أ) الصورة التمثيلية لقنية دليل الفولاذ المقاوم للصدأ ، دمية ، وحاقن. (ب) الصورة التمثيلية لقنية دليل الفولاذ المقاوم للصدأ ودمية مزروعة في دماغ الفئران عن طريق التثبيت مع الاكريليك الأسنان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: النشاط الحركي للفئران المشبعة ب SCFAs في القفص الجديد. (أ) مخطط زمني لزرع قنية التوجيه وحركة القفص الجديدة عند ضخ ACSF أو SCFAs. (ب) مخطط زمني لوضع حقنة التسريب ، ونافذة التسريب (الظل الأزرق) ، واختبار سلوك القفص الجديد. (ج) المسافة الإجمالية التي تحركها الفئران المشبعة ب ACSF و SCFAs في قفص جديد لمدة 35 دقيقة. يشار إلى النافذة الزمنية للتسريب بظل أزرق (0-5 دقائق). (د) صور تمثيلية لمسارات الفئران المشبعة ب ACSF و SCFAs في قفص جديد. n = 2 فئران لكل مجموعة. البيانات المعروضة كمتوسط ± s.e.m. وتحليلها بواسطة ANOVA ثنائي الاتجاه. ns: ليست مهمة. الاختصارات: SCFAs = الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة. ACSF = السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: علم الأنسجة من صبغة الفلورسنت المشبعة بالدماغ. التسريب من خلال قنية التوجيه المخصصة (A) التجارية و (B) المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ المزروعة في البطين الجانبي (LV) للفئران. أشرطة المقياس = 1 مم (يسار) و 500 ميكرومتر (يمين). الأزرق: تلطيخ DAPI. أخضر: وسم الذهب المضاد للفلورسنت. الاختصارات: LV = البطين الجانبي; AC = الوصاية الأمامية; CPu = بوتامين مذنب; LS = الحاجز الجانبي; MS = الحاجز الإنسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ارتبطت المستقلبات المشتقة من الأمعاء بأمراض بوساطة الدماغ دون آلية دقيقة للغاية ، ويرجع ذلك جزئيا إلى مواقع ارتباطها المتعددة في الجسم6،12،24. أشارت التقارير السابقة إلى أن SCFAs يمكن أن تكون بمثابة روابط للمستقبلات المرتبطة بالبروتين G ، والمنظمين اللاجينيين ، ومصادر لإنتاج الطاقة في مواقع متعددة في الجسم 6,12. لتجاوز العوامل المربكة التي تنشأ من المحيط (مثل الخلايا المناعية والهرمونات والجهاز العصبي اللاإرادي) ، تم تطوير طريقة من خلال اعتماد الحقن داخل البطين من SCFAs في الدماغ من خلال قنية دليل في الفئران التي تتحرك بحرية. بالإضافة إلى ذلك ، تم التحقق من صحة مواقع القصب والتسريب لاستكشاف مناطق الدماغ التي يحتمل أن تتأثر ب SCFAs. إجمالا ، تقدم هذه الورقة طريقة دقيقة ودقيقة ومعتمدة لتوصيل المستقلبات المشتقة من الأمعاء إلى الدماغ لإجراء أبحاث محور الأمعاء والدماغ.

تم تأسيس توصيل الأدوية والمواد الكيميائية داخل البطين من خلال قنية إرشادية إلى الحيوانات 25،26،27،28،29 لمختلف اختبارات المخدرات 29 ، ونمذجة الأمراض 26،28 ، والتصميم المحدد للاختبارات السلوكية 27 . الأهم من ذلك ، قدمت العديد من الدراسات مستقلبات ميكروبية الأمعاء إلى الدماغ من خلال الحقن داخل البطين واختبرت آثارها على الوظائف الفسيولوجية 30،31،32،33. يوفر هذا البروتوكول سمة إضافية في إدارة مستقلبات الأمعاء بطريقة حادة للدماغ في الوقت الفعلي ، مما يسمح للعلماء بفهم الآثار الديناميكية لمستقلبات الأمعاء على الدماغ والسلوك.

معدل التسليم لضخ الأيض أمر بالغ الأهمية لمحاكاة تدفق السائل الدماغي الشوكي في البطينين الدماغيين. أشارت إحدى الدراسات إلى أن معدل إنتاج السائل الدماغي الشوكي في الفئران هو 5.3 nL / s34. للتحكم في معدل تدفق SCFAs بشكل طبيعي في الفئران التي تتحرك بحرية ، قمنا بتقييم معدل التدفق لنظام الحقن المجهري هذا (الشكل 3 والشكل 4). يمكن غرس SCFAs بسلاسة دون مقاومة كبيرة حتى عندما تم استخدام أنبوب البولي إيثيلين الذي يبلغ طوله 350 سم لبث SCFAs في ماوس يتحرك بحرية. مع ملء الماء المقطر والزيوت المعدنية لتقليل مقاومة السائل في أنبوب البولي إيثيلين (انظر قسمي البروتوكول 5 و 6) ، يمكن خفض معدل التدفق إلى 7 nL / s من 100 nL / s. لم يؤد غرس SCFAs أو ACSF بمعدل تدفق 7 nL / s إلى أي سلوك غير طبيعي للفئران.

كمية وجرعة من المستقلبات المشتقة من الأمعاء للحقن داخل البطين أمر بالغ الأهمية. لا يزال من الصعب إجراء تحليل شامل للمستويات المطلقة من المستقلبات المشتقة من الأمعاء في مناطق الدماغ المختلفة. على سبيل المثال ، أظهرت دراسات قليلة جدا اكتشاف المستويات الفسيولوجية ل SCFAs في الدماغ35,36. أظهرت إحدى الدراسات أن تركيزات الأسيتات والبروبيونات والبوتيرات في أدمغة الفئران تبلغ حوالي 1640.6-3281.2 ميكروغرام / غرام ، و 288.18-384.24 ميكروغرام / غرام ، و 44.036-66.054 ميكروغرام / غرام ، على التوالي36. ومع ذلك ، أبلغت دراسة أخرى عن انخفاض مستويات SCFAs في الدماغ (خلات 128.1 ميكروغرام / غرام ، بروبيونات 0.3883 ميكروغرام / غرام ، و butyrate 0.1640 ميكروغرام / غرام)35. وكانت كميات الأسيتات والبروبيونات والزبدات المغروسة المعتمدة في هذا البروتوكول 5.81385 ميكروغرام/غرام، و4.62378 ميكروغرام/غرام، و2.6124 ميكروغرام/غرام، على التوالي. لذلك ، فإن تركيزات SCFAs المشبعة في هذا البروتوكول قابلة للمقارنة مع التركيزات الفسيولوجية. ومع ذلك ، لا يمكننا استبعاد احتمال أن تركيزات SCFAs قد تختلف في مناطق الدماغ المتميزة. أظهرت العديد من الدراسات أن توصيل البروبيونات إلى البطين الدماغي عن طريق الحقن داخل البطين (4 ميكرولتر من 0.26 م من حمض البروبيونيك في دقيقة واحدة ؛ حوالي 249.756 ميكروغرام / غرام) أضعف السلوك الاجتماعي والإدراك في الفئران30,31. كانت الجرعة ومعدل تدفق البروبيونات المشبعة مرتفعة نسبيا ، كما ورد في الفئران35 والجرذان37. لذلك ، فإن التقدم في تحليل الأيض والتنميط الأيضي في الدماغ والأطراف سيساعد الباحثين على فهم التغيرات الديناميكية المكانية والزمانية في الأيضات المشتقة من الأمعاء بشكل أفضل.

تم تقديم نوعين من القنية الإرشادية في هذا البروتوكول للحقن داخل البطين في الفئران - قنية دليل تجارية وقنية دليل من الفولاذ المقاوم للصدأ. تم تصميم قنية الدليل التجاري والدمية بشكل جيد للزرع. ليس من السهل على الفئران إزالة الدمية المخصصة بسبب الغطاء. على العكس من ذلك ، يمكن إزالة دمية الفولاذ المقاوم للصدأ بسهولة من قنية دليل الفولاذ المقاوم للصدأ من قبل الفئران خلال فترة الانتعاش لمدة 1 أسبوع ، مما تسبب في تخثر الدم / السائل الدماغي الشوكي في الكانيولا. ومع ذلك ، فإن القنية المخصصة التجارية هي 64 ملغ ، ودمية هذه القنية هي 86 ملغ. وبالتالي ، فإن الوزن الإجمالي للقنية التجارية المخصصة والدمية هو 150 ملغ. في المقابل ، فإن قنية دليل الفولاذ المقاوم للصدأ المخصصة هي 18.3 ملغ ، ودمية هذه القنية هي 8.5 ملغ. وبالتالي ، فإن الوزن الإجمالي لقنية دليل الفولاذ المقاوم للصدأ المخصصة هو 26.8 ملغ. من الناحية النظرية ، فإن الوزن المنخفض لمجموعة قنية دليل الفولاذ المقاوم للصدأ من شأنه أن يقلل من تأثير القنية على حركة الحيوان والدماغ. علاوة على ذلك ، فإن تكلفة قنية الدليل التجاري أعلى من قنية دليل الفولاذ المقاوم للصدأ والحاقن. وبالتالي ، نوصي بقنية دليل الفولاذ المقاوم للصدأ للباحثين عديمي الخبرة الذين يجرون جراحة مجسمة في الفئران.

يمكن انسداد القنية المزروعة عن طريق الدم والسائل الدماغي الشوكي بسبب تلف الدماغ. يمكن أن يحدث هذا الانسداد للقنية بشكل متكرر في قنية الفولاذ المقاوم للصدأ على القنية التجارية. يمكن ربط الدمية لتشديد القنية التجارية بشكل آمن (الشكل 2A) ولكن ليس لقنية الفولاذ المقاوم للصدأ (الشكل 5A). لذلك ، فإن ضمان إرفاق الدمية خلال فترة الاسترداد من شأنه أن يقلل من انسداد الكانيولا. يجب إدخال دمية جديدة إذا حدث انفصال أثناء الانتعاش لمدة 1 أسبوع. علاوة على ذلك ، يجب إدخال حاقن معقم يمكن التخلص منه عدة مرات لفك انسداد القنية قبل تركيب الحاقن الذي يربط أنبوب البولي إيثيلين.

سيؤثر اختيار أدوية التخدير بشكل كبير على الجراحة واختبار السلوك. هنا ، تم اختيار إيسوفلوران مخدر الاستنشاق على التخدير بالحقن لأن وقت الشفاء أقصر وهو أقل ضررا على الحيوانات لأسباب إنسانية. ومع ذلك ، يمكن أن تختلف جرعة استنشاق الأيزوفلوران اعتمادا على حالة الفأر ووزن الجسم. لذلك ، يجب ملاحظة حالة التخدير عن كثب أثناء العملية الجراحية بأكملها ، وتعديل مبخر الأيزوفلوران وفقا لذلك. يجب أن يكون معدل التنفس الأمثل نفسا واحدا في الثانية خلال جميع الإجراءات. علاوة على ذلك ، يجب توصيل علبة مرشح الغاز المملوءة بالكربون المنشط بغرفة التخدير وقناع مخروط الأنف لإفراغ تلوث غاز الأيزوفلوران والعادم في منطقة التشغيل. هذا سوف يحمي الجراح من التأثير السام للأيزوفلوران.

أظهرت النتائج التمثيلية أن تسريب SCFAs لم ينتج عنه أي تأثير دراماتيكي على الحركة في قفص جديد. قد يكون هذا بسبب استخدام عدد صغير من الحيوانات للحصول على هذه النتيجة (الشكل 6). علاوة على ذلك ، قمنا فقط بغرس SCFAs لأول 5 دقائق من اختبار سلوك حركة القفص الجديد ولكن ليس الاختبار بأكمله لأن معظم السلوك تم اختباره في غضون فترة زمنية قصيرة (5-15 دقيقة). يجب تعديل النافذة الزمنية للمستقلبات الميكروبية المشتقة من الأمعاء بناء على فرضية المحققين.

يعد وقت التخدير واستعادة الوعي من التخدير أمرا بالغ الأهمية للاختبارات السلوكية. هنا ، تم تخدير الفئران لفترة وجيزة لزرع الحاقن وضخ SCFAs ، وتم إجراء اختبار السلوك بعد 15 دقيقة. تم تحديد وقت التعافي بعد توقف التخدير بالاستنشاق بناء على دراسة سابقة38. ضمنت دراسة تجريبية أن الفئران كانت نشطة وتتحرك بحرية وليست غير مريحة بعد 15 دقيقة من التخدير. قدمنا خطوة التخدير لتركيب الحاقن للأسباب التالية. أولا ، مقياس الحاقن هو 33 جم ؛ من الصعب جدا إدخال مثل هذا الحاقن الحساس في القنية عندما يتحرك الحيوان بنشاط. بالإضافة إلى ذلك ، قد يؤدي تقشر الفئران الواعية إلى الضغط على الفئران39 ، مما يربك النتائج السلوكية. ثانيا ، يتم انسداد القنية في بعض الأحيان بسبب تخثر الدم / السائل الدماغي الشوكي. إن فتح القنية بلطف قبل تركيب الحاقن سيكون مثاليا لضخ الأيض. بناء على هذين السببين ، يوصى بتخدير الفئران لفترة وجيزة لتركيب الحاقن. يمكن للمحققين الانتظار لفترة أطول (30 دقيقة) إذا كان هناك أي قلق بشأن تعافي الحيوان من تخدير الاستنشاق. علاوة على ذلك ، يمكن إعداد مجموعة منفصلة من حاقن التسريب تربط أنبوب البولي إيثيلين لتسريع التجارب.

يحتوي هذا البروتوكول على العديد من القيود. أولا ، إن زرع قنية التوجيه وأنبوب البولي إيثيلين المتصل من شأنه أن يحد من المنطقة الجراحية لزرع الألياف البصرية للقياس الضوئي البصري والألياف في نفس الإحداثي أو المنطقة المحيطة أو حتى نفس نصف الكرة المخية. سيكون من الصعب أكثر زرع عدسة التنظير المجهري على رأس الفأر جنبا إلى جنب مع قنية التوجيه المزروعة. ثانيا ، قد يؤدي زرع قنية الدليل إلى توليد وزن كبير على رأس الفأر. الوزن الإجمالي لمجموعة قنية مخصصة هو 26.8-150 ملغ ، والمسمار هو ~ 48 ملغ ، والأكريليك الأسنان المثبت هو 450-500 ملغ. قد تقيد مجموعة التثبيت بأكملها حركات الفئران. ومع ذلك ، فقد زرعت الدراسات الحديثة منظارا صغيرا لمراقبة إشارات الكالسيوم في الفئران التي تتحرك بحرية40,41. يتراوح وزن المنظار الصغير من 1.6 جم إلى 4.5 جم ، باستثناء البراغي وأكريليك الأسنان. لذلك ، يمكن اعتبار وزن قنية الدليل مقبولا نسبيا لاختبار سلوك الماوس. ثالثا ، يبلغ طول أنبوب البولي إيثيلين المتصل بالتسريب حوالي 350 سم ، مما قد يحد من حركة الفئران أثناء اختبار السلوك. ولمعالجة هذا القلق، قد تكون هناك حاجة إلى اختبار مسبق للحركة في اختبار مفتوح المجال لتقييم تأثير أنبوب البولي إيثيلين المتصل على وظيفة محرك الماوس. رابعا ، قد ينتج عن أكريل الأسنان تأثير سام للأعصاب على الفئران. ومع ذلك ، يلزم إرفاق قنية الدليل برأس الماوس خلال فترة الاختبار. لتقليل التأثير العصبي المحتمل لأكريل الأسنان على الفئران ، يجب أن يكون المشغلون على دراية باستخدام أكريل الأسنان. يتم تطبيق أكريل الأسنان بشكل أفضل عندما يتم تصلب خليط أكريل الأسنان (مسحوق وسائل) قليلا للحد من تغلغل سائل أكريل الأسنان في الدماغ.

ترتبط الميكروبات ومستقلباتها بوظيفة السلوك في مراحل تطور متميزة. على الرغم من أن هذا البروتوكول يعتمد على الفئران البالغة C57BL/6 التي تتراوح أوزان جسمها من 26 جم إلى 30 جم ، إلا أنه يمكن تطبيقه أيضا على الفئران من مختلف الأعمار والأحجام. وقد اعتمدت الدراسات السابقة الجراحة المجسمة في الفئران الصغيرة42،43،44،45. ومع ذلك ، قد تختلف إحداثيات مناطق الدماغ اعتمادا على حجم وعمر الفئران. نوصي بالرجوع إلى الأطلس المقابل للعمر أو المورد عبر الإنترنت (http://mouse.brain-map.org/static/atlas). علاوة على ذلك ، يجب التحقق من صحة الإحداثيات عن طريق حقن صبغة التربان الزرقاء أو الفلورية في الفئران الصغيرة ، وبالتالي تحسين الطريقة قبل تنفيذها على الفئران التجريبية. يتم تخصيص جميع القنيبات الإرشادية المستخدمة في هذا البروتوكول ويمكن تعديلها بعد التحقق من صحة الإحداثيات لأحجام مختلفة من الفئران.

سيكون هذا البروتوكول متوافقا مع معظم اختبارات سلوك القوارض مع ساحة مفتوحة أعلى الجهاز دون الكثير من التعديل. يمكن إجراء اختبارات سلوك القوارض باستخدام أسلاك أنبوب البولي إيثيلين أعلى رأس الماوس دون أي عائق ، بما في ذلك اختبار المجال المفتوح ، متاهة زائد / صفر مرتفعة ، اختبار التنحي ، التفاعل الاجتماعي المباشر ، النطق بالموجات فوق الصوتية للبالغين ، اختبار السباحة القسري ، تعليق الذيل ، متاهة الماء ، متاهة T أو Y ، التعرف على الأشياء الجديدة ، دفن الرخام ، اختبار الاستمالة الذاتية ، عبور الشعاع ، اختبار القطب ، والتعرض للإجهاد لتجنب المياه. ستحتاج الاختبارات التي تستخدم غرف أو أنابيب مغلقة إلى التعديل للسماح لأنبوب البولي إيثيلين بالتحرك بحرية مع الفئران ، مثل الاختبار الاجتماعي المكون من ثلاث غرف ، والصندوق المظلم الفاتح ، وتكييف الخوف ، وتفضيل السكروز ، وإجهاد التقييد ، واختبار الدهشة ، وتثبيط نبض النبض. نقترح الاختبار المسبق وتقدير الطول اللازم لأنبوب البولي إيثيلين على الفئران قبل الاختبار.

وقد ثبت أن مستقلبات ميكروبات الأمعاء تؤثر على سلوكيات المضيف 8,46,47,48,49. يمكن للعلماء اعتماد هذه الطريقة للتحقيق مباشرة في الآثار الزمانية والمكانية للمستقلبات المشتقة من ميكروبات الأمعاء على الدماغ والسلوكيات في الفئران. على سبيل المثال ، تم زيادة المستقلب الميكروبي 4-إيثيل فينيل كبريتات (4EPS) في نماذج الفئران قبل السريرية من ASD والأشخاص الذين يعانون من ASD46,48,49. أدى حقن 4EPS واستعمار البكتيريا المنتجة ل 4EPS إلى زيادة السلوك الشبيه بالقلق وضعف نضج الخلايا قليلة التغصن في النواة شبه البطينية للمهاد (PVT) في الفئران46,48. سيكون من الرائع تقييم التأثير المباشر ل 4EPS على PVT للفئران أثناء اختبار السلوك الشبيه بالقلق. ومع ذلك ، فإن التركيز المطلق ل 4EPS في PVT لا يزال غير معروف. لذلك ، قد يكون اختبار استجابة الجرعة أمرا بالغ الأهمية لتحديد المستويات المناسبة من 4EPS في PVT. يمكن اعتماد مفهوم مماثل لآثار المستقلبات الميكروبية الأخرى على الدماغ والسلوك.

تعد التقنيات العصبية القائمة على الدوائر ، مثل علم الوراثة البصرية ، وعلم الوراثة الكيميائية ، وتصوير الكالسيوم في الجسم الحي ، طرقا حاسمة تسمح للعلماء بفهم الدائرة العصبية في التحكم في السلوك50،51،52. محور الأمعاء والدماغ هو اتصال معقد بالغ الأهمية لميكروبات الأمعاء ومستقلباتها للتوسط في سلوك المضيف. استخدم عدد متزايد من الدراسات التقنيات العصبية القائمة على الدوائر لفهم الحديث المتبادل المثير للاهتمام بين الأمعاء والدماغ33،53،54،55،56،57،58،59. سيوفر هذا البروتوكول طريقة بديلة لفهم التحكم القائم على منطقة الدماغ في السلوك الناجم عن مستقلبات الأمعاء. إن الجمع بين هذا البروتوكول والتقنيات العصبية القائمة على الدائرة سيسمح للباحثين باكتساب نظرة ثاقبة على التحكم القائم على الدائرة في السلوك ونشاط الدماغ الذي تساهم به مستقلبات الأمعاء.

في الختام ، فإن مفهوم محور الأمعاء والدماغ مقبول بشكل جيد في المجتمع العلمي ويعزز إمكانية مشاركة المستقلبات المشتقة من الأمعاء في الاضطرابات العصبية والنفسية11،13،60،61،62،63،64،65 . لاستجواب كيف وما هي المستقلبات المشتقة من الأمعاء التي تؤثر على الدماغ وسلوك الفئران ، ستكون هناك حاجة إلى منهجية شاملة وقائمة على الفسيولوجية في هذا المجال. توفر هذه المقالة بروتوكولا خطوة بخطوة لتوصيل المستقلبات المشتقة من الأمعاء إلى الدماغ مباشرة ، والأهم من ذلك ، في فأر يتحرك بحرية. يمكن تكييف هذا التصميم بشكل أكبر للتحقيق في الآثار الخاصة بالمنطقة عن طريق توصيل المستقلبات المشتقة من الأمعاء إلى مناطق مختلفة من الدماغ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح فيما يتعلق بهذا العمل.

Acknowledgments

نحن نقدر موظفي مركز المختبر في جامعة تشنغ كونغ الوطنية (NCKU) لرعاية الحيوانات. تم دعم هذا العمل من خلال المنحة الدراسية المقدمة من صندوق البروفيسور كون ين هوانغ للتعليم التابع لمؤسسة تشنغ - هسينغ الطبية إلى C.-W.L. ؛ الأموال من وزارة العلوم والتكنولوجيا (MOST) في تايوان: (البحوث الجامعية MOST 109-2813-C-006-095-B) إلى T.-H.Y. ؛ (معظم 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) إلى W.-L.W.; ومشروع براعم التعليم العالي ، وزارة التربية والتعليم إلى مقر التقدم الجامعي في NCKU إلى W.-L.W.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41 Pfizer n/a
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit ThermoFisher Scientific A-21206
Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal) Millipore AB153-I
Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μm, PES, Sterile NEST 121921LA01
CaCl2  Sigma-Aldrich C1016 ACSF: 0.14 g/L
Chlorhexidine scrub 2% Phoenix NDC 57319-611-09
Chlorhexidine solution Phoenix NDC 57319-599-09
Commercial dummy RWD Life Science 62004 Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm
Commercial guide cannul RWD Life Science 62104 Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm 
Commercial injector RWD Life Science 62204 Single_OD 0.21 mm-33G/ Mates with M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 ACSF: 0.61 g/L
Dental acrylic HYGENIC n/a
Fixing screws RWD Life Science 62521
Fluoroshield mounting medium with DAPI Abcam AB104139
Horse serum ThermoFisher Scientific 16050130
Insulin syringes BBraun XG-LBB-9151133S-1BX 1 mL
Isoflurane  Panion & BF biotech DG-4900-250D
KCl  Sigma-Aldrich P3911 ACSF: 0.19 g/L
Ketoprofen  Swiss Pharmaceutical n/a
Lidocaine  AstraZeneca n/a
Low melting point agarose Invitrogen 16520
MgCl2  Sigma-Aldrich M8266 ACSF: 0.19 g/L
Microscope cover slips MARIENFELD 101242
Microscope slides ThermoFisher Scientific 4951PLUS-001E
Mineral oil light, white NF Macron Fine Chemicals MA-6358-04
NaCl  Sigma-Aldrich S9888 ACSF: 7.46 g/L
NaH2PO4  Sigma-Aldrich S8282 ACSF: 0.18 g/L
NaHCO3  Sigma-Aldrich S5761 ACSF: 1.76 g/L
n-butyl cyanoacrylate adhesive (tissue adhesive glue) 3M 1469SB 3M Vetbond
Neural tracer  Santa Cruz SC-358883 FluoroGold
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Polyethylene tube RWD Life Science 62329 OD 1.50, I.D 0.50 mm and OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (eye) Ointment Dechra  12920060
Sodium acetate  Sigma-Aldrich S2889 SCFAs: 13.5 mM
Sodium azide  Sigma-Aldrich S2002
Sodium butyrate  Sigma-Aldrich B5887 SCFAs: 8 mM
Sodium propionate  Sigma-Aldrich P1880 SCFAs: 5.18 mM
Stainless guide cannula Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.63 mm; Local vendor
Stainless injector Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.3 mm; dummy is made from injector; local vendor
Superglue Krazy Glue KG94548R
Triton X-100 Merck 1.08603.1000
Equipment
Cannula holder RWD Life Science B485-68217
Ceiling camera FOSCAM R2
Digital stereotaxic instruments Stoelting 51730D
Dissecting microscope INNOVIEW SEM-HT/TW
Glass Bead Sterilizer RWD Life Science RS1501
Heating pad Stoelting 53800M
Leica microscope  Leica DM2500
Micro Dissecting Forceps ROBOZ RS-5136 Serrated, Slight Curve; Extra Delicate; 0.5mm Tip Width; 4" Length 
Micro Dissecting Scissors ROBOZ RS-5918 4.5" Angled Sharp
Microinjection controller World Precision Instruments (WPI) MICRO2T SMARTouch Controller
Microinjection syringe pump World Precision Instruments (WPI) UMP3T-1 UltraMicroPump3  
Microliter syringe Hamilton 80014 10 µL
Optical Fiber Cold Light with double Fiber Step LGY-150 Local vendor
Pet trimmer WAHL 09962-2018
Vaporiser for Isoflurane Step AS-01 Local vendor
Vibratome Leica VT1000S
Software
Animal behavior video tracking software Noldus EthoVision Version: 15.0.1416
Leica Application Suite X software Leica LASX Version: 3.7.2.22383

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lynch, J. B., Hsiao, E. Y. Microbiomes as sources of emergent host phenotypes. Science. 365 (6460), 1405-1409 (2019).
  2. Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome-gut-brain axis in health and disease. Gastroenterology Clinics of North America. 46 (1), 77-89 (2017).
  3. Sharon, G., Sampson, T. R., Geschwind, D. H., Mazmanian, S. K. The central nervous system and the gut microbiome. Cell. 167 (4), 915-932 (2016).
  4. Krautkramer, K. A., Fan, J., Backhed, F. Gut microbial metabolites as multi-kingdom intermediates. Nature Reviews: Microbiology. 19 (2), 77-94 (2021).
  5. Lavelle, A., Sokol, H. Gut microbiota-derived metabolites as key actors in inflammatory bowel disease. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. 17 (4), 223-237 (2020).
  6. Dalile, B., Van Oudenhove, L., Vervliet, B., Verbeke, K. The role of short-chain fatty acids in microbiota-gut-brain communication. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. 16 (8), 461-478 (2019).
  7. Morais, L. H., Schreiber, H. L. T., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews: Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
  8. Sharon, G., et al. Human gut microbiota from autism spectrum disorder promote behavioral symptoms in mice. Cell. 177 (6), 1600-1618 (2019).
  9. St Laurent, R., O'Brien, L. M., Ahmad, S. T. Sodium butyrate improves locomotor impairment and early mortality in a rotenone-induced Drosophila model of Parkinson's disease. Neuroscience. 246, 382-390 (2013).
  10. Govindarajan, N., Agis-Balboa, R. C., Walter, J., Sananbenesi, F., Fischer, A. Sodium butyrate improves memory function in an Alzheimer's disease mouse model when administered at an advanced stage of disease progression. Journal of Alzheimer's Disease. 26 (1), 187-197 (2011).
  11. Needham, B. D., et al. A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice. Nature. 602 (7898), 647-653 (2022).
  12. Silva, Y. P., Bernardi, A., Frozza, R. L. The role of short-chain fatty acids from gut microbiota in gut-brain communication. Frontiers in Endocrinology. 11, 25 (2020).
  13. Kratsman, N., Getselter, D., Elliott, E. Sodium butyrate attenuates social behavior deficits and modifies the transcription of inhibitory/excitatory genes in the frontal cortex of an autism model. Neuropharmacology. 102, 136-145 (2016).
  14. Kelly, J. R., et al. Transferring the blues: Depression-associated gut microbiota induces neurobehavioural changes in the rat. Journal of Psychiatric Research. 82, 109-118 (2016).
  15. Wang, L., et al. Elevated fecal short chain fatty acid and ammonia concentrations in children with autism spectrum disorder. Digestive Diseases and Sciences. 57 (8), 2096-2102 (2012).
  16. Adams, J. B., Johansen, L. J., Powell, L. D., Quig, D., Rubin, R. A. Gastrointestinal flora and gastrointestinal status in children with autism--comparisons to typical children and correlation with autism severity. BMC Gastroenterology. 11, 22 (2011).
  17. Skonieczna-Zydecka, K., et al. Faecal short chain fatty acids profile is changed in Polish depressive women. Nutrients. 10 (12), 1939 (2018).
  18. Szczesniak, O., Hestad, K. A., Hanssen, J. F., Rudi, K. Isovaleric acid in stool correlates with human depression. Nutritional Neuroscience. 19 (7), 279-283 (2016).
  19. Martin, A. M., Sun, E. W., Rogers, G. B., Keating, D. J. The influence of the gut microbiome on host metabolism through the regulation of gut hormone release. Frontiers in Physiology. 10, 428 (2019).
  20. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. Paxinos and Franklin's The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2013).
  21. York, J. M., Blevins, N. A., McNeil, L. K., Freund, G. G. Mouse short- and long-term locomotor activity analyzed by video tracking software. Journal of Visualized Experiments. (76), e50252 (2013).
  22. Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice. Journal of Visualized Experiments. (164), e61023 (2020).
  23. Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments. (168), e61941 (2021).
  24. Needham, B. D., Kaddurah-Daouk, R., Mazmanian, S. K. Gut microbial molecules in behavioural and neurodegenerative conditions. Nature Reviews: Neuroscience. 21 (12), 717-731 (2020).
  25. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880 (2008).
  26. Xiaoguang, W., et al. Establishment of a valuable mimic of Alzheimer's disease in rat animal model by intracerebroventricular injection of composited amyloid beta protein. Journal of Visualized Experiments. (137), e56157 (2018).
  27. Venniro, M., Shaham, Y. An operant social self-administration and choice model in rats. Nature Protocols. 15 (4), 1542-1559 (2020).
  28. Ucal, M., et al. Rat model of widespread cerebral cortical demyelination induced by an intracerebral injection of pro-inflammatory cytokines. Journal of Visualized Experiments. (175), e57879 (2021).
  29. Oberrauch, S., et al. Intraventricular drug delivery and sampling for pharmacokinetics and pharmacodynamics study. Journal of Visualized Experiments. (181), e63540 (2022).
  30. Shultz, S. R., et al. Intracerebroventricular injections of the enteric bacterial metabolic product propionic acid impair cognition and sensorimotor ability in the Long-Evans rat: further development of a rodent model of autism. Behavioural Brain Research. 200 (1), 33-41 (2009).
  31. Shultz, S. R., et al. Intracerebroventricular injection of propionic acid, an enteric metabolite implicated in autism, induces social abnormalities that do not differ between seizure-prone (FAST) and seizure-resistant (SLOW) rats. Behavioural Brain Research. 278, 542-548 (2015).
  32. Perry, R. J., et al. Acetate mediates a microbiome-brain-beta-cell axis to promote metabolic syndrome. Nature. 534 (7606), 213-217 (2016).
  33. Muller, P. A., et al. Microbiota modulate sympathetic neurons via a gut-brain circuit. Nature. 583 (7816), 441-446 (2020).
  34. Pardridge, W. M. CSF, blood-brain barrier, and brain drug delivery. Expert Opinion on Drug Delivery. 13 (7), 963-975 (2016).
  35. Wu, J. -T., et al. Oral short-chain fatty acids administration regulates innate anxiety in adult microbiome-depleted mice. Neuropharmacology. , (2022).
  36. Lee, J., et al. Gut microbiota-derived short-chain fatty acids promote poststroke recovery in aged mice. Circulation Research. 127 (4), 453-465 (2020).
  37. Chiu, C., et al. Temporal course of cerebrospinal fluid dynamics and amyloid accumulation in the aging rat brain from three to thirty months. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 3 (2012).
  38. Schuler, B., Rettich, A., Vogel, J., Gassmann, M., Arras, M. Optimized surgical techniques and postoperative care improve survival rates and permit accurate telemetric recording in exercising mice. BMC Veterinary Research. 5, 28 (2009).
  39. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
  40. Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
  41. de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
  42. Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).
  43. Wolter, J. M., et al. Cas9 gene therapy for Angelman syndrome traps Ube3a-ATS long non-coding RNA. Nature. 587 (7833), 281-284 (2020).
  44. Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses for combinatorial cell-subclass-specific labeling. Neuron. 109 (9), 1449-1464 (2021).
  45. Xie, M., et al. TREM2 interacts with TDP-43 and mediates microglial neuroprotection against TDP-43-related neurodegeneration. Nature Neuroscience. 25 (1), 26-38 (2022).
  46. Hsiao, E. Y., et al. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell. 155 (7), 1451-1463 (2013).
  47. Bermudez-Martin, P., et al. The microbial metabolite p-Cresol induces autistic-like behaviors in mice by remodeling the gut microbiota. Microbiome. 9 (1), 157 (2021).
  48. Needham, B. D., et al. A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice. Nature. 602 (7898), 647-653 (2022).
  49. Stewart Campbell, A., et al. Safety and target engagement of an oral small-molecule sequestrant in adolescents with autism spectrum disorder: an open-label phase 1b/2a trial. Nature Medicine. 28 (3), 528-534 (2022).
  50. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  51. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  52. Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
  53. Kaelberer, M. M., et al. A gut-brain neural circuit for nutrient sensory transduction. Science. 361 (6408), (2018).
  54. Needham, B. D., Tang, W., Wu, W. L. Searching for the gut microbial contributing factors to social behavior in rodent models of autism spectrum disorder. Developmental Neurobiology. 78 (5), 474-499 (2018).
  55. Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).
  56. Chu, C., et al. The microbiota regulate neuronal function and fear extinction learning. Nature. 574 (7779), 543-548 (2019).
  57. Wu, W. L., et al. Microbiota regulate social behaviour via stress response neurons in the brain. Nature. 595 (7867), 409-414 (2021).
  58. Buchanan, K. L., et al. The preference for sugar over sweetener depends on a gut sensor cell. Nature Neuroscience. 25 (2), 191-200 (2022).
  59. Han, W., et al. A neural circuit for gut-induced reward. Cell. 175 (3), 665-678 (2018).
  60. Yamawaki, Y., et al. Antidepressant-like effect of sodium butyrate (HDAC inhibitor) and its molecular mechanism of action in the rat hippocampus. World Journal of Biological Psychiatry. 13 (6), 458-467 (2012).
  61. Ho, L., et al. Protective roles of intestinal microbiota derived short chain fatty acids in Alzheimer's disease-type beta-amyloid neuropathological mechanisms. Expert Review of Neurotherapeutics. 18 (1), 83-90 (2018).
  62. Liu, J., et al. Anti-neuroinflammatory effect of short-chain fatty acid acetate against Alzheimer's disease via upregulating GPR41 and inhibiting ERK/JNK/NF-kappaB. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (27), 7152-7161 (2020).
  63. van de Wouw, M., et al. Short-chain fatty acids: microbial metabolites that alleviate stress-induced brain-gut axis alterations. Jounal of Physiology. 596 (20), 4923-4944 (2018).
  64. Olson, C. A., et al. The gut microbiota mediates the anti-seizure effects of the ketogenic diet. Cell. 173 (7), 1728-1741 (2018).
  65. Stewart Campbell, A., et al. Safety and target engagement of an oral small-molecule sequestrant in adolescents with autism spectrum disorder: an open-label phase 1b/2a trial. Nature Medicine. 28 (3), 528-534 (2022).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 184 ،
التسليم داخل البطين للمستقلبات الميكروبية المشتقة من الأمعاء في الفئران التي تتحرك بحرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liou, C. W., Yao, T. H., Wu, W. L.… More

Liou, C. W., Yao, T. H., Wu, W. L. Intracerebroventricular Delivery of Gut-Derived Microbial Metabolites in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (184), e63972, doi:10.3791/63972 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter