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Neuroscience

Livraison intrarébroventriculaire de métabolites microbiens dérivés de l’intestin chez des souris en mouvement libre

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63972
Automatic Translation
*1,2, *2, 1,2
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Physiology, College of Medicine, National Cheng Kung University
* These authors contributed equally

Summary

Les métabolites microbiens dérivés de l’intestin ont des effets multiformes conduisant à un comportement complexe chez les animaux. Notre objectif est de fournir une méthode étape par étape pour délimiter les effets des métabolites microbiens dérivés de l’intestin dans le cerveau via une administration intrarébroventriculaire via une canule guide.

Abstract

L’impact du microbiote intestinal et de ses métabolites sur la physiologie et le comportement de l’hôte a été largement étudié au cours de cette décennie. De nombreuses études ont révélé que les métabolites dérivés du microbiote intestinal modulent les fonctions physiologiques à médiation cérébrale par des voies complexes intestin-cerveau chez l’hôte. Les acides gras à chaîne courte (AGCC) sont les principaux métabolites dérivés de bactéries produits lors de la fermentation des fibres alimentaires par le microbiome intestinal. Les AGCC sécrétés par l’intestin peuvent agir sur plusieurs sites à la périphérie, affectant les réponses immunitaires, endocriniennes et neuronales en raison de la vaste distribution des récepteurs des AGCC. Par conséquent, il est difficile de différencier les effets centraux et périphériques des AGCC par administration orale et intrapéritonéale d’AGCC. Cet article présente une méthode vidéo pour interroger le rôle fonctionnel des AGCC dans le cerveau via une canule guide chez des souris en mouvement libre. La quantité et le type d’AGCC dans le cerveau peuvent être ajustés en contrôlant le volume et le débit de perfusion. Cette méthode peut fournir aux scientifiques un moyen d’apprécier le rôle des métabolites dérivés de l’intestin dans le cerveau.

Introduction

Le tractus gastro-intestinal humain abrite divers micro-organismes ayant un impact sur l’hôte 1,2,3. Ces bactéries intestinales peuvent sécréter des métabolites dérivés de l’intestin lors de leur utilisation des composants alimentaires consommés par l’hôte 4,5. Fait intéressant, les métabolites intestinaux non métabolisés à la périphérie peuvent être transportés vers d’autres organes par la circulation6. Il convient de noter que ces métabolites sécrétés peuvent servir de médiateurs pour l’axe intestin-cerveau, défini comme la communication bidirectionnelle entre le système nerveux central et l’intestin7. Des études antérieures ont montré que les métabolites dérivés de l’intestin peuvent moduler le comportement complexe et les émotions chez les animaux 8,9,10,11.

Les acides gras à chaîne courte (AGCC) sont les principaux métabolites produits par le microbiote intestinal lors de la fermentation des fibres alimentaires et des glucides non digestibles6. L’acétate, le propionate et le butyrate sont les AGCC les plus abondants dans l’intestin12. Les AGCC servent de source d’énergie pour les cellules du tractus gastro-intestinal. Les AGCC non métabolisés dans l’intestin peuvent être transportés vers le cerveau par la veine porte, modulant ainsi le cerveau et le comportement 6,12. Des études antérieures ont suggéré que les AGCC pourraient jouer un rôle essentiel dans les troubles neuropsychiatriques 6,12. Par exemple, l’injection intrapéritonéale de butyrate chez des souris BTBR T+ Itpr3tf/J (BTBR), un modèle animal de trouble du spectre autistique (TSA), a sauvé leurs déficits sociaux13. Les rats traités aux antibiotiques recevant le microbiote de sujets dépressifs ont montré une augmentation des comportements anxieux et des AGCC fécaux14. Sur le plan clinique, des altérations des taux d’AGCC fécaux ont été observées chez les personnes atteintes de TSA par rapport aux témoins en développement typique15,16. Les personnes souffrant de dépression ont des taux d’AGCC fécaux inférieurs à ceux des sujets sains17,18. Ces études suggèrent que les AGCC peuvent modifier le comportement des animaux et des humains par diverses voies.

Les métabolites microbiens exercent divers effets sur de multiples sites dans le corps, affectant la physiologie et les comportements de l’hôte 4,19, y compris le tractus gastro-intestinal, le nerf vague et le nerf sympathique. Il est difficile de déterminer le rôle précis des métabolites dérivés de l’intestin dans le cerveau lors de l’administration des métabolites par des voies périphériques. Cet article présente un protocole vidéo pour étudier les effets des métabolites dérivés de l’intestin dans le cerveau d’une souris en mouvement libre (Figure 1). Nous avons montré que les AGCC pouvaient être administrés de manière aiguë par la canule guide pendant les tests comportementaux. Le type, le volume et le débit de perfusion des métabolites peuvent être modifiés en fonction de l’objectif. Le site de canulation peut être ajusté pour explorer l’impact des métabolites intestinaux dans une région spécifique du cerveau. Notre objectif est de fournir aux scientifiques une méthode pour explorer l’impact potentiel des métabolites microbiens dérivés de l’intestin sur le cerveau et le comportement.

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Protocol

Tous les protocoles expérimentaux et les soins des animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université nationale Cheng Kung (NCKU).

1. Préparation pour l’animal d’expérimentation

  1. Procurez-vous des souris mâles C57BL/6JNarl de type sauvage âgées de 6 à 8 semaines auprès d’un fournisseur.
  2. Abritez les souris dans une cage à souris standard avec un chow de souris standard et de l’eau stérilisée ad libitum.
    REMARQUE: Les conditions de logement pour le Centre des animaux de laboratoire du NCKU sont une température de 22 ± 1 °C, une humidité de 55% ± 10% et un cycle lumière/obscurité de 13 h / 11 h.

2. Chirurgie stéréotaxique

  1. Préparez et stérilisez l’instrument stéréotaxique, les instruments chirurgicaux et les articles connexes.
    REMARQUE: Tous les articles qui entreront directement en contact avec le site chirurgical doivent être stérilisés pour éviter l’infection.
  2. Anesthésiez la souris en la plaçant dans la cage en plexiglas avec 1% -5% d’isoflurane dans l’oxygène.
    REMARQUE: Observez attentivement la souris pour vous assurer que la fréquence respiratoire est maintenue à environ une respiration par seconde.
  3. Sortez la souris de la chambre d’anesthésie. Rasez le site chirurgical (tête de souris) avec une tondeuse pour animaux de compagnie. Placez la souris sur le cadre stéréotaxique en fixant les incisives de la souris sur la barre d’incisive dans le support d’incisive stéréotaxique. Couvrez le nez avec le masque de nosecone.
  4. Anesthésiez la souris avec 1% -2,5% d’isoflurane dans l’oxygène tout au long de la chirurgie stéréotaxique. Évaluer la nociception de la souris via le réflexe de pincement des orteils et s’assurer d’un rythme respiratoire constant avant d’inciser le site chirurgical.
  5. Placez un coussin chauffant (37,0 °C) sous la souris sur le cadre stéréotaxique pour maintenir la température corporelle pendant la chirurgie. Alternativement, maintenez la température centrale à l’aide d’une sonde thermique rectale reliant le réchauffeur programmé et le coussin chauffant.
  6. Retirez la fourrure parée sur la tête à l’aide de ruban adhésif. Injectez à la souris un analgésique kétoprofène (5 mg/kg) par voie sous-cutanée pour soulager la douleur. Appliquez une pommade pour les yeux pour éviter les yeux secs.
  7. Insérez la barre d’oreille pointue dans le conduit auditif pour fixer la tête.
  8. Centrez la tête en ajustant l’échelle de la barre d’oreille.
  9. Serrez la pince nasale sur le support d’incisive pour éviter les mouvements verticaux. Appuyez doucement sur la tête pour vérifier que la tête est fixe et éviter que la tête ne se desserre lors de la chirurgie ultérieure.
  10. Désinfectez le cuir chevelu avec trois gommages alternés de chlorhexidine à l’aide d’un coton-tige. Commencez chaque gommage du milieu vers le côté extérieur (de la zone centrale la plus désinfectée à la zone la moins désinfectée).
    REMARQUE: L’utilisation de gommages du milieu vers l’extérieur pourrait aider les scientifiques à minimiser l’infection et la contamination de la fourrure. La zone extérieure est proche de la région de la tête non rasée, qui a encore une grande quantité de fourrure et n’est pas facile à désinfecter complètement.
  11. Inciser le cuir chevelu de manière antérieure/postérieure (<1 cm) à l’aide d’une lame chirurgicale. Ouvrez l’incision et essuyez le crâne avec un coton-tige maintenu par une pince à microdissection.
    REMARQUE: Les pinces à microdissection, la lame chirurgicale et les cotons-tiges doivent être stérilisés par autoclavage avant la chirurgie. Pendant le processus chirurgical, stériliser tout le matériel chirurgical à l’aide d’un stérilisateur à billes de verre (150 °C) pendant au moins 5 s avant et après chaque animal. Préparez un bécher stérilisé pour maintenir la lame chirurgicale et les forceps pendant le processus chirurgical et entre les animaux.
  12. Identifiez le Bregma et le Lambda sur le crâne. Utilisez le Bregma comme référence pour localiser la région d’intérêt.
    1. Facultatif : Montez la perceuse stéréotaxique sur le support de perceuse stéréotaxique et utilisez la pointe de la perceuse pour pointer Bregma comme référence. Stériliser la perceuse stéréotaxique à l’aide du stérilisateur à billes de verre (150 °C) pendant au moins 5 s.
  13. Calibrer et aligner le plan horizontal du crâne plat dans les plans gauche/droite et antérieur/postérieur par Bregma/Lambda.
    REMARQUE: Si ce n’est pas dans un plan horizontal correct, remontez la souris sur l’instrument stéréotaxique.

3. Implantation de canule de guidage commercial personnalisé

  1. Identifier et étiqueter la position du ventricule latéral droit, en fonction des coordonnées stéréotaxiques : Distance à Bregma, antérieur/postérieure (A/P) : 0,26 mm, médiale/latérale (M/L) : -1,0 mm, dorsale/ventrale (D/V) : -2,0 mm 20.
    REMARQUE: Les coordonnées peuvent être modifiées en fonction de la région d’intérêt. Les coordonnées du ventricule latéral étaient basées sur des souris adultes C57BL/6J pesant entre 26 et 30 g. Si des souris plus jeunes sont utilisées, reportez-vous à la discussion.
  2. Percer un trou (diamètre = 1,5 mm) à travers le crâne sur le site marqué à l’aide d’une perceuse stéréotaxique pour l’implantation d’une canule de guidage commerciale.
  3. Percez deux à quatre trous supplémentaires (diamètre = 1,5 mm) sur le crâne à l’aide d’une perceuse stéréotaxique pour le montage de vis en acier inoxydable.
    REMARQUE : Stériliser la perceuse stéréotaxique à l’aide d’un stérilisateur à billes de verre (150 °C) pendant au moins 5 s avant et après chaque animal.
  4. Essuyez les restes d’os et arrêtez de saigner avec un coton-tige.
  5. Essuyez le crâne avec de la lidocaïne (1 mg / kg) à l’aide d’un coton-tige pour des effets anesthésiques, antiprurigineux et analgésiques locaux. Si le saignement ne s’arrête pas après le forage, placez doucement un coton-tige sur le trou pour l’hémostase.
  6. Montez deux à quatre vis en acier inoxydable sur les trous pour fournir des ancrages pour l’acrylique dentaire.
  7. Placer la canule de guidage commercial sur le support de canule stéréotaxique et désinfecter avec le stérilisateur à billes de verre (150 °C).
    REMARQUE : La canule du guide commercial, le mannequin commercial et l’injecteur commercial (figure 2A) ont été personnalisés conformément aux spécifications indiquées dans le tableau des matériaux.
  8. Déplacez le porte-canule stéréotaxique vers le trou percé pour le ventricule latéral et insérez lentement la canule de guidage commerciale dans le trou jusqu’à la profondeur souhaitée (2,5 mm).
    NOTE: La coordonnée dorsale/ventrale peut être définie en définissant l’extrémité de la canule de guidage commerciale comme référence lorsque la pointe est à peine insérée dans le trou.
  9. Appliquez 10 μL d’adhésif cyanoacrylate de n-butyle (colle adhésive tissulaire) pour fixer la canule de guidage commerciale dans le trou percé et attendez 3-4 minutes. Retirez doucement la canule de guidage commercial du support de canule stéréotaxique et éloignez la douille.
  10. Appliquez l’acrylique dentaire sur le cuir chevelu incisé pour fixer la canule de guidage commercial et attendez au moins 5 min. Implanter le mannequin commercial dans la canule de guidage commercial pour éviter que la canule ne ne soit obstruée par le sang ou les liquides organiques (figure 2B).
  11. Libérez la barre auriculaire du conduit auditif et retirez la souris du cadre stéréotaxique.
  12. Placez la souris dans une nouvelle cage avec un coussin chauffant en dessous pour récupérer de l’anesthésie et observez continuellement jusqu’à ce que la souris se réveille complètement.
    REMARQUE : Ne laissez pas l’animal sans surveillance avant qu’il n’ait repris suffisamment conscience pour maintenir sa position couchée sternale. Un animal qui a subi une intervention chirurgicale ne doit pas retourner en compagnie d’autres animaux avant d’être complètement rétabli.
  13. Retournez la souris dans un logement simple ou un logement de groupe, selon le protocole IACUC institutionnel et le plan expérimental. Pour le logement de groupe, assurez-vous que moins de souris sont logées dans une cage afin de minimiser les blessures indésirables ou le détachement de la canule.
  14. Administrer de l’ibuprofène (0,2 mg/mL) dans l’eau potable pendant au moins 3 jours pour les soins postopératoires et surveiller deux fois par jour les signes de douleur et de détresse pendant au moins 3 jours.
    1. Pendant les soins postopératoires, appliquez une pommade à la roxithromycine autour de la peau pour prévenir l’inflammation et l’infection chez les souris.
    2. Continuez à surveiller l’état de l’animal et donnez une injection intrapéritonéale opportune de glucose à 5% et / ou de chlorure de sodium à 0,9% pour fournir suffisamment d’énergie.
    3. Si l’état de douleur, de détresse ou d’infection se détériore régulièrement, euthanasier la souris par inhalation de CO2 .
  15. Attendez 1 semaine après l’opération pour que la souris soit prête pour l’administration intra-rébroventriculaire des AGCC et des tests comportementaux.

4. Préparation des AGCC

  1. Dissoudre l’acétate de sodium, le butyrate de sodium et le propionate de sodium dans le liquide céphalorachidien artificiel (ACSF) (voir le tableau des matériaux).
  2. Assurez-vous que les produits chimiques sont complètement dissous, puis ajustez le pH à 7,4 et filtrez le mélange d’AGCC à travers un filtre de 0,22 μm pour la stérilisation.

5. Mettre en place le système de perfusion pour l’administration intra-rébroventriculaire d’AGCC pendant les tests comportementaux

  1. Montez une caméra de plafond pour enregistrer le comportement. Connectez la caméra à un ordinateur pour contrôler le logiciel d’enregistrement vidéo (Figure 3).
  2. Remplissez une seringue de 10 μL avec de l’eau distillée.
    REMARQUE: Évitez les bulles d’air dans la seringue de microlitre.
  3. Connectez une pompe de micro-injection au contrôleur de micro-injection.
  4. Montez la seringue de microlitre sur la pompe de micro-injection. Pour installer la seringue, appuyez sur le bouton pour desserrer la pince et installez la seringue dans la position correspondante. Fermez la pince et serrez la vis de fixation du piston de la pompe de micro-injection (Figure 4A).
  5. Insérez l’injecteur commercial dans le tube en polyéthylène (figure 2A).
  6. Accrochez le tube en polyéthylène à la caméra de plafond au-dessus de l’arène de test.
  7. Remplissez le tube en polyéthylène avec de l’eau distillée à l’aide d’une seringue à insuline. Connectez la seringue de microlitre au tube en polyéthylène suspendu.
    REMARQUE: Assurez-vous que le tube en polyéthylène est suffisamment long pour permettre à la souris de se déplacer librement dans l’arène de test.

6. Paramètres système du contrôleur de micro-injection

  1. Mettez le contrôleur de micro-injection sous tension et appuyez sur Display All Channels (Afficher tous les canaux) pour accéder à l’écran de commande (Figure 4C). Appuyez sur Configuration et définissez Volume Target sur 9 800 nL avec Delivery Rate sur 100 nL/s. Infuser 9 800 nL d’eau distillée à partir du tube en polyéthylène connecté à la seringue de microlitre (appuyez sur Direction pour passer en mode Infuse et appuyez sur RUN) (voir les carrés rouges dans l’écran de commande de la figure 4C).
  2. Appuyez sur Configuration et définissez Volume Target à 3 000 nL avec Delivery Rate à 100 nL/s. Prélever 3 000 nL d’huile minérale (appuyez sur Direction pour passer en mode Retrait et appuyez sur RUN) (voir les carrés rouges dans l’écran de commande de la figure 4C).
    NOTE: Une séparation claire de la phase huile-eau doit être observée sur le tube en polyéthylène.
  3. Démontez le tube en polyéthylène de l’aiguille de la seringue de microlitre. Crachez 3 000 nL d’eau distillée de l’aiguille de la seringue de microlitre (appuyez sur Direction pour passer en mode Infuse et appuyez sur RUN).
  4. Réinsérez la seringue de microlitre dans le tube en polyéthylène. Appuyez sur Configuration et définissez Volume Target sur 9 500 nL avec Delivery Rate sur 100 nL/s. Retirez 9 500 nL d’AGCC (appuyez sur Direction pour passer en mode Retrait et appuyez sur RUN). Étiqueter la phase huile-AGCC pour valider si les AGCC sont perfusés avec succès.
  5. Appuyez sur Configuration et définissez l’objectif de volume souhaité avec un taux de livraison à 7 nL/s. Appuyez sur Direction pour passer en mode Infuser (voir les carrés rouges dans l’écran de commande de la figure 4C).
    REMARQUE: Déterminez le volume en fonction du temps de perfusion. Par exemple, si le temps de perfusion est de 3 min pour un débit de 7 nL/s, volume cible = 1 260 nL.
  6. Appuyez sur RUN pour perfuser la seringue de microlitre vers l’avant jusqu’à ce que le liquide sorte à l’extrémité avant de l’injecteur commercial avant d’insérer l’injecteur dans la canule pour l’injection d’AGCC.

7. Perfusion d’AGCC dans le ventricule latéral à travers la canule guide commerciale chez une souris en mouvement libre

  1. Anesthésiez la souris en la plaçant dans la cage en plexiglas avec 1% -5% d’isoflurane dans l’oxygène.
    REMARQUE: Observez attentivement la souris pour vous assurer que la fréquence respiratoire est maintenue à environ une respiration par seconde.
  2. Frotter la souris et insérer l’injecteur commercial dans la canule de guidage commercial (Figure 4B).
    REMARQUE: Si la canule de guide commercial est bouchée, déboucher doucement avec une pince à épiler.
  3. Laissez la souris récupérer de l’anesthésie pendant 15 minutes dans une cage avant les tests comportementaux.
  4. Pour le test de locomotion de base, placez la souris dans une nouvelle cage et laissez-la explorer librement pendant 35 minutes. Infuser les AGCC en utilisant un débit de 7 nL /s pour un volume cible de 2 100 nL au cours des 5 premières minutes (appuyez sur Direction vers le mode Infuse et appuyez sur RUN).
    REMARQUE: La locomotion dans la nouvelle cage peut être analysée à l’aide d’un logiciel de suivi vidéo du comportement animal21,22.
  5. Anesthésiez la souris (répétez l’étape 7.1) et retirez l’injecteur commercial de la canule de guidage commercial.
    REMARQUE: La souris peut être injectée à plusieurs reprises avec différents témoins / métabolites après avoir donné le temps approprié pour laver l’injection précédente. Tant que la canule est fixée sur la tête de la souris, la souris peut être testée à plusieurs reprises avec différents métabolites.

8. Restauration du système de micro-injection

  1. Démontez le tube en polyéthylène de la seringue de microlitre.
  2. Injectez de l’air dans le tube à l’aide de la seringue à insuline pour éliminer l’eau distillée dans le tube en polyéthylène. Videz la seringue du microlitre.
  3. Appuyez sur Reset Pos (Réinitialiser le point de vente) sur l’écran Configuration (Configuration) pour ouvrir l’écran Serinke Stop Definition (Définition de l’arrêt de la seringue) (Figure 4C).
  4. Appuyez sur Retirer jusqu’à ce qu’un bip sonore se produise pour remettre la pompe de micro-injection en position complètement retirée (Figure 4C).
  5. Revenez à l’écran de commande et éteignez le contrôleur de micro-injection si un signe ** FIN ATTEINT** s’affiche sur cet écran (Figure 4C).

9. Facultatif : Validation de l’injection intra-rebroventriculaire par traceur neural

  1. Infuser 2 100 nL du traceur neural avec un débit de 7 nL/s pour vérifier le site de perfusion.
    REMARQUE: Laissez l’injecteur dans la canule de guidage pendant 5 minutes pour éviter le refoulement.
  2. Anesthésier la souris par un surdosage d’isoflurane (5%) 30 min après la perfusion du traceur neural.
  3. Vérifiez la fréquence respiratoire et le réflexe de pincement de la queue et de la patte chez la souris anesthésiée.
    REMARQUE: Les souris ne doivent pas répondre avant l’étape suivante.
  4. Faites une incision de 4 à 5 cm à travers la peau, les muscles et la paroi abdominale sous la cage thoracique.
  5. Éloignez légèrement le foie du diaphragme avec précaution.
  6. Inciser le diaphragme pour exposer le cœur de la souris.
  7. Perfuser la souris à travers le cœur avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et du paraformaldéhyde glacé à 4% dans du PBS.
  8. Décapitater la souris et disséquer soigneusement le cerveau avec des pinces à microdissection et des ciseaux à microdissection pour éliminer tout le cerveau23. Placez les échantillons de cerveau dans du paraformaldéhyde glacé à 4% dans du PBS pendant 3-4 jours et lavez-les 3 x 5 min avec du PBS.
  9. Couper le cerveau en deux parties dans le support de tranche de cerveau de souris à la huitième coupe du support de tranche de cerveau de souris (1 mm / section) de la direction antérieure à postérieure. Placez le cerveau dans le moule d’encastrement et incorporez les échantillons de cerveau dans l’agarose à bas point de fusion (4% dans PBS).
  10. Collez le cerveau incrusté dans l’agarose sur la scène du vibratome à l’aide de superglue. Couper le cerveau coronalement en tranches de cerveau de 50 μm à l’aide du vibratome.
  11. Incuber les tranches de cerveau dans l’anticorps ciblant le traceur neural dilué dans un tampon de blocage (dilution 1:1 000) pendant une nuit à température ambiante.
    REMARQUE: Le tampon de blocage contenait 10% de sérum de cheval, 0,1% de Triton X-100 et 0,02% d’azoture de sodium.
  12. Laver les tranches 3 x 5 min avec PBST (PBS avec 0,1% de triton X-100).
  13. Incuber les tranches de cerveau dans un anticorps secondaire conjugué à fluorescence dilué dans un tampon bloquant (dilution 1:500) pendant 2 h à température ambiante.
  14. Laver les tranches 3 x 5 min avec du PBS.
  15. Fixez les tranches de cerveau sur la lame avec un support de montage contenant du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI).
  16. Couvrez la lame avec une lame-couverture de microscope.
  17. Appliquez du vernis à ongles sur le bord de la glissière pour éviter les fuites du support de montage.
  18. Après une nuit d’incubation à température ambiante, à l’abri de la lumière, imager le signal de fluorescence dans le site de perfusion à l’aide d’un microscope à fluorescence.

10. Facultatif : Perfusion de métabolites à travers une canule guide en acier inoxydable personnalisée dans le ventricule latéral chez la souris

  1. Suivez les sections 1 à 8 du protocole et remplacez la canule de guidage commerciale par une canule de guidage en acier inoxydable pour infuser des produits chimiques à travers un injecteur en acier inoxydable dans la souris.
    NOTE: Les avantages et les inconvénients des différentes canules commerciales et en acier inoxydable sont développés dans la section de discussion.
  2. Exécuter le protocole chirurgical de la même manière que celle décrite dans les sections 2 et 3 du protocole, sauf n’oubliez pas de remplacer la canule de guidage commerciale par une canule de guidage en acier inoxydable (Figure 5B).
    REMARQUE : La canule de guidage en acier inoxydable, le mannequin en acier inoxydable et l’injecteur en acier inoxydable (figure 5A) ont été personnalisés conformément aux spécifications indiquées dans le tableau des matériaux. Insérez la canule de guidage en acier inoxydable personnalisée dans le trou jusqu’à la profondeur souhaitée (2,0 mm).
  3. Infuser les AGCC via la canule guide en acier inoxydable à l’aide du système de microinjection composé du contrôleur de microinjection et de la pompe de microinjection (figure 4B) (identique aux sections de protocole 4 à 7). Pour le mannequin en acier inoxydable de la canule guide en acier inoxydable, pliez doucement un côté de l’injecteur en acier inoxydable jusqu’à ce que la pointe de l’autre côté soit 1 mm plus longue que la canule de guidage en acier inoxydable.
  4. Infuser 2 100 nL du traceur neural à travers la canule guide en acier inoxydable dans le ventricule latéral chez la souris (identique à la section 9 du protocole).
  5. Prélever l’échantillon pendant 30 minutes après la perfusion du traceur neural (identique à la section 9 du protocole).
  6. Effectuez l’acquisition d’images dans les tranches de cerveau infusées du traceur neuronal (identique à la section 9 du protocole).

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Representative Results

La souris a reçu des AGCC 1 semaine après la récupération de l’implantation de la canule guide pour évaluer l’activité locomotrice dans une nouvelle cage. La souris a été placée dans une nouvelle cage et perfusée avec 2 100 nL d’AGCC ou d’ACSF dans les 5 premières minutes (taux d’administration de 7 nL/s) dans le cerveau par la canule guide commerciale implantée dans le ventricule latéral du cerveau. L’activité locomotrice dans une nouvelle cage a été enregistrée pendant 30 minutes supplémentaires après la perfusion. Aucune différence n’a été observée dans l’activité locomotrice dans la nouvelle cage entre la perfusion d’AGCC et l’ACSF (figure 6) (n = 2 souris par groupe; les données sont présentées sous forme de moyenne ± s.e.m. et analysées par ANOVA bidirectionnelle).

Pour valider la précision de l’implantation de la canule guide dans les régions du cerveau, un traceur neural fluorescent a été perfusé dans les souris via la canule guide au même volume et au même taux d’administration que les AGCC (2 100 nL en 5 min; 7 nL/s). Les cerveaux ont été prélevés pour l’histologie 30 minutes plus tard. Le colorant fluorescent a été détecté dans le ventricule latéral et les régions environnantes du cerveau de la souris (Figure 7A). Une canule guide en acier inoxydable a été implantée dans le ventricule latéral du cerveau pour la perfusion de traceur neural dans les mêmes conditions. Semblable à la canule guide, les résultats ont montré qu’un signal de colorant fluorescent a été détecté dans le ventricule latéral et les régions environnantes du cerveau de la souris, même après perfusion à travers la canule guide en acier inoxydable (Figure 7B).

Figure 1
Figure 1 : Procédure de perfusion intra-rébroventriculaire chez des souris en mouvement libre. L’organigramme pour l’administration intra-rébroventriculaire de métabolites microbiens dérivés de l’intestin chez des souris en mouvement libre. Abréviation : AGCC = acides gras à chaîne courte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Implantation de la canule guide commerciale chez la souris. (A) L’image représentative de la canule de guidage commerciale, du mannequin et de l’injecteur. (B) L’image représentative de la canule et du mannequin guides commerciaux implantés dans le cerveau de souris par fixation avec de l’acrylique dentaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : L’appareil de perfusion intra-rébroventriculaire pour les tests de comportement. Le diagramme du système de micro-injection, du système d’enregistrement vidéo et de l’appareil comportemental. Abréviation : AGCC = acides gras à chaîne courte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Le système de micro-injection. (A) L’installation de la seringue à microlitre à l’aide d’une pompe à micro-injection. (B) L’insertion de l’injecteur commercial relié à un tube en polyéthylène dans la canule de guidage commerciale (C) L’écran tactile du contrôleur de micro-injection. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Implantation d’une canule guide en acier inoxydable dans le ventricule latéral de souris. (A) Image représentative de la canule de guidage, du mannequin et de l’injecteur en acier inoxydable. (B) L’image représentative d’une canule guide et d’un mannequin en acier inoxydable implantés dans le cerveau de souris par fixation avec de l’acrylique dentaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Activité locomotrice de souris perfusées d’AGCC dans la nouvelle cage. (A) Schéma chronologique de l’implantation de la canule guide et de la locomotion de la nouvelle cage lors de la perfusion d’ACSF ou d’AGCC. (B) Schéma chronologique pour la mise en place de la seringue de perfusion, fenêtre de perfusion (ombre bleue) et nouveaux tests de comportement de la cage. (C) Distance totale parcourue par des souris infusées par ACSF et SCFA dans une nouvelle cage pendant 35 min. La fenêtre de temps pour la perfusion est indiquée avec une ombre bleue (0-5 min). (D) Images représentatives des trajectoires de souris infusées d’ACSF et d’AGCC dans une nouvelle cage. n = 2 souris par groupe. Données présentées comme moyennes ± s.e.m. et analysées par ANOVA bidirectionnelle. NS : Non significatif. Abréviations : AGCC = acides gras à chaîne courte; ACSF = liquide céphalorachidien artificiel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Histologie du colorant fluorescent infusé dans le cerveau. Perfusion à travers la canule de guidage personnalisée (A) commerciale et (B) en acier inoxydable implantée dans le ventricule latéral (VG) de souris. Barres d’échelle = 1 mm (à gauche) et 500 μm (à droite). Bleu : coloration DAPI ; Vert : Étiquetage Or Anti-Fluorescent. Abréviations : VG = ventricule latéral; AC = commissure antérieure; CPu = putamen caudé; LS = septum latéral; MS = septum médial. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Les métabolites dérivés de l’intestin ont été associés à des maladies à médiation cérébrale sans mécanisme très précis, en partie à cause de leurs multiples sites de liaison dans le corps 6,12,24. Des rapports antérieurs indiquaient que les AGCC pouvaient servir de ligands pour les récepteurs couplés aux protéines G, les régulateurs épigénétiques et les sources de production d’énergie à plusieurs endroits dans le corps 6,12. Pour contourner les facteurs de confusion provenant de la périphérie (tels que les cellules immunitaires, les hormones et le système nerveux autonome), une méthode a été développée en adoptant l’injection intra-rébroventriculaire d’AGCC dans le cerveau à travers une canule guide chez des souris en mouvement libre. De plus, les sites de canulation et de perfusion ont été validés pour explorer les zones cérébrales potentiellement touchées par les AGCC. Dans l’ensemble, cet article présente une méthode précise, méticuleuse et validée pour délivrer des métabolites dérivés de l’intestin dans le cerveau pour la recherche sur l’axe intestin-cerveau.

L’administration intra-rébroventriculaire de médicaments et de produits chimiques par une canule guide aux animaux a été bien établie 25,26,27,28,29 pour divers tests de dépistage de drogues29, la modélisation de la maladie 26,28 et la conception spécifique de tests comportementaux 27 . Plus important encore, plusieurs études ont introduit des métabolites microbiens intestinaux dans le cerveau par injection intra-rébroventriculaire et testé leurs effets sur les fonctions physiologiques30,31,32,33. Ce protocole fournit un attribut complémentaire dans l’administration de métabolites intestinaux de manière aiguë au cerveau en temps réel, ce qui permettrait aux scientifiques de comprendre les effets dynamiques des métabolites intestinaux sur le cerveau et le comportement.

Le débit de livraison pour la perfusion de métabolites est crucial pour simuler l’écoulement du liquide céphalorachidien dans les ventricules cérébraux. Une étude a indiqué que le taux de production de liquide céphalorachidien chez la souris est de 5,3 nL/s34. Pour contrôler naturellement le débit des AGCC chez les souris en mouvement libre, nous avons évalué le débit de ce système de micro-injection (Figure 3 et Figure 4). Les AGCC pouvaient être perfusés en douceur sans grande résistance, même lorsque le tube en polyéthylène de 350 cm de long était utilisé pour infuser des AGCC dans une souris en mouvement libre. Avec le remplissage d’eau distillée et d’huile minérale pour diminuer la résistance aux liquides dans le tube en polyéthylène (voir les sections 5 et 6 du protocole), le débit pourrait être abaissé de 100 nL/s à 7 nL/s. L’injection des AGCC ou de l’ACSF à un débit de 7 nL/s n’a entraîné aucun comportement anormal des souris.

La quantité et la posologie des métabolites dérivés de l’intestin pour l’injection intrarébroventriculaire sont critiques. Il reste difficile d’analyser de manière exhaustive les niveaux absolus de métabolites dérivés de l’intestin dans diverses régions du cerveau. Par exemple, très peu d’études ont montré la détection des niveaux physiologiques d’AGCC dans le cerveau35,36. Une étude a montré que les concentrations d’acétate, de propionate et de butyrate dans le cerveau des souris sont d’environ 1640,6-3281,2 μg / g, 288,18-384,24 μg / g et 44,036-66,054 μg / g, respectivement36. Cependant, une autre étude a rapporté des niveaux plus faibles d’AGCC dans le cerveau (acétate 128,1 μg/g, propionate 0,3883 μg/g et butyrate 0,1640 μg/g)35. Les quantités d’acétate, de propionate et de butyrate perfusés adoptées dans ce protocole étaient respectivement de 5,81385 μg/g, 4,62378 μg/g et 2,6124 μg/g. Par conséquent, les concentrations des AGCC perfusés dans ce protocole sont comparables aux concentrations physiologiques. Cependant, nous ne pouvions pas exclure la possibilité que les concentrations d’AGCC varient dans des régions cérébrales distinctes. Plusieurs études ont montré que l’administration de propionate dans le ventricule cérébral par injection intra-rébroventriculaire (4 μL d’acide propionique 0,26 M en 1 min; environ 249,756 μg/g) altérait le comportement social et la cognition chez le rat30,31. La dose et le débit du propionate infusé étaient relativement élevés, comme indiqué chez les souris35 et les rats37. Par conséquent, les progrès de l’analyse des métabolites et du profilage métabolomique dans le cerveau et la périphérie aideront les chercheurs à mieux comprendre les changements dynamiques spatiaux et temporels dans les métabolites dérivés de l’intestin.

Deux types de canules guides ont été présentés dans ce protocole pour l’injection intrarébroventriculaire chez la souris : une canule de guide commerciale et une canule de guidage en acier inoxydable. La canule et le mannequin de guidage commercial sont bien conçus pour l’implantation. Il n’est pas facile pour les souris de retirer le mannequin personnalisé en raison du capuchon. Au contraire, le mannequin en acier inoxydable peut être facilement retiré de la canule guide en acier inoxydable par les souris pendant la récupération de 1 semaine, provoquant la coagulation du sang / liquide céphalo-rachidien dans la canule. Cependant, la canule commerciale personnalisée est de 64 mg, et le mannequin pour cette canule est de 86 mg. Ainsi, le poids total de la canule et du mannequin personnalisés commerciaux est de 150 mg. En revanche, la canule guide en acier inoxydable personnalisée est de 18,3 mg et le mannequin de cette canule est de 8,5 mg. Ainsi, le poids total de la canule de guidage en acier inoxydable personnalisée est de 26,8 mg. Théoriquement, le faible poids de la canule guide en acier inoxydable minimiserait l’impact de la canule sur le mouvement de l’animal et le cerveau. De plus, le coût de la canule de guidage commerciale est plus élevé que celui de la canule de guidage et de l’injecteur en acier inoxydable. Par conséquent, nous recommandons la canule guide en acier inoxydable pour les chercheurs inexpérimentés effectuant une chirurgie stéréotaxique chez la souris.

La canule implantée peut être obstruée par le sang et le liquide céphalorachidien en raison de lésions cérébrales. Ce colmatage de la canule pourrait se produire plus fréquemment dans la canule en acier inoxydable sur la canule commerciale. Le mannequin peut être fileté pour serrer solidement la canule commerciale (figure 2A), mais pas pour la canule en acier inoxydable (figure 5A). Par conséquent, assurer la fixation du mannequin pendant la période de récupération minimiserait le colmatage de la canule. Un nouveau mannequin doit être inséré si le détachement se produit pendant la récupération de 1 semaine. De plus, un injecteur stérilisé jetable doit être inséré plusieurs fois pour déboucher la canule avant de monter l’injecteur reliant le tube en polyéthylène.

Le choix des médicaments anesthésiques influencera fortement la chirurgie et les tests de comportement. Ici, l’isoflurane anesthésique par inhalation a été choisi plutôt que les anesthésiques injectés parce que le temps de récupération est plus court et qu’il est moins nocif pour les animaux pour des raisons humaines. Cependant, la posologie pour l’inhalation d’isoflurane peut varier en fonction de l’état de la souris et de son poids corporel. Par conséquent, l’état de l’anesthésie doit être observé de près pendant toute la procédure chirurgicale et le vaporisateur d’isoflurane doit être ajusté en conséquence. La fréquence respiratoire optimisée devrait être d’une respiration par seconde pendant toutes les procédures. De plus, la cartouche du filtre à gaz remplie de charbon actif doit être connectée à la chambre d’anesthésie et au masque nosecone pour éliminer la pollution par l’isoflurane et les gaz d’échappement dans la zone d’opération. Cela protégera le chirurgien de l’effet toxique de l’isoflurane.

Les résultats représentatifs ont démontré que la perfusion d’AGCC n’a pas produit d’effet spectaculaire sur la locomotion dans une nouvelle cage. Cela pourrait être dû au fait qu’un petit nombre d’animaux a été utilisé pour obtenir ce résultat (figure 6). De plus, nous n’avons perfusé les AGCC que pendant les 5 premières minutes du nouveau test de comportement de locomotion en cage, mais pas pendant tout le test, car la plupart des comportements ont été testés dans un court laps de temps (5-15 min). La fenêtre temporelle pour les métabolites microbiens dérivés de l’intestin doit être ajustée en fonction de l’hypothèse des chercheurs.

Le temps consacré à l’anesthésie et à la reprise de conscience de l’anesthésie est essentiel pour les tests comportementaux. Ici, les souris ont été anesthésiées brièvement pour l’implantation de l’injecteur et la perfusion d’AGCC, et des tests de comportement ont été effectués après 15 minutes. Le temps de récupération après l’arrêt de l’anesthésie par inhalation a été déterminé sur la base d’une étude antérieure38. Une étude pilote a permis de s’assurer que les souris étaient actives, se déplaçaient librement et n’étaient pas mal à l’aise 15 minutes après l’anesthésie. Nous avons introduit l’étape d’anesthésie pour le montage de l’injecteur pour les raisons suivantes. Tout d’abord, la jauge de l’injecteur est de 33 G; Il est très difficile d’insérer un injecteur aussi délicat dans la canule lorsque l’animal se déplace activement. En outre, le débraillage des souris conscientes peut produire un stress sur les souris39, confondant les résultats comportementaux. Deuxièmement, la canule est parfois obstruée en raison de la coagulation du sang / liquide céphalorachidien. Déboucher doucement la canule avant de monter l’injecteur serait idéal pour la perfusion de métabolites. Sur la base de ces deux raisons, il est recommandé d’anesthésier brièvement les souris pour monter l’injecteur. Les enquêteurs peuvent attendre plus longtemps (30 minutes) s’ils ont des inquiétudes quant au rétablissement de l’animal après l’anesthésie par inhalation. De plus, un ensemble séparé d’injecteur de perfusion reliant le tube en polyéthylène peut être mis en place pour accélérer les expériences.

Ce protocole comporte plusieurs limites. Tout d’abord, l’implantation de la canule guide et du tube en polyéthylène de connexion limiterait la zone chirurgicale pour l’implantation de fibres optiques pour la photométrie optogénétique et fibreuse dans la même coordonnée, la zone environnante, ou même le même hémisphère du cerveau. Il sera encore plus difficile d’implanter la lentille pour la microendoscopie sur la tête de souris avec la canule de guidage implantée. Deuxièmement, l’implantation de la canule guide peut générer un poids important sur la tête de la souris. Le poids total d’un ensemble de canules personnalisé est de 26,8 à 150 mg, une vis est de ~ 48 mg et l’acrylique dentaire monté est de 450 à 500 mg. L’ensemble du kit d’installation peut restreindre les mouvements des souris. Cependant, des études récentes ont implanté un miniscope pour surveiller les signaux de calcium chez les souris en mouvement libre40,41. Le poids du miniscope varie de 1,6 g à 4,5 g, sans compter les vis et l’acrylique dentaire. Par conséquent, le poids de la canule guide peut être considéré comme relativement acceptable pour les tests de comportement de la souris. Troisièmement, le tube en polyéthylène de connexion pour la perfusion mesure ~350 cm de long, ce qui peut limiter le mouvement des souris pendant le test de comportement. Pour répondre à cette préoccupation, un test préalable de locomotion dans un essai en plein champ peut être nécessaire pour évaluer l’impact du tube de polyéthylène de connexion sur la fonction motrice de la souris. Quatrièmement, l’acrylique dentaire peut produire un effet neurotoxique sur les souris. Cependant, il est nécessaire de fixer la canule de guidage à la tête de la souris pendant la période d’essai. Pour diminuer l’effet neurotoxique potentiel de l’acrylique dentaire sur les souris, les opérateurs doivent être familiers avec l’utilisation de l’acrylique dentaire. L’acryl dentaire est mieux appliqué lorsque le mélange d’acryl dentaire (poudre et liquide) est légèrement solidifié pour réduire la pénétration du liquide acrylique dentaire dans le cerveau.

Le microbiote et ses métabolites sont associés à une fonction comportementale à des étapes de développement distinctes. Bien que ce protocole soit basé sur des souris adultes C57BL / 6 avec des poids corporels allant de 26 g à 30 g, il peut également être appliqué à des souris d’âges et de tailles différents. Des études antérieures ont adopté la chirurgie stéréotaxique chez les jeunes souris42,43,44,45. Cependant, les coordonnées des régions du cerveau peuvent varier en fonction de la taille et de l’âge des souris. Nous vous recommandons de faire référence à l’atlas correspondant à l’âge ou à la ressource en ligne (http://mouse.brain-map.org/static/atlas). De plus, les coordonnées doivent être validées en injectant du bleu de trypan ou un colorant de fluorescence dans les jeunes souris de réforme, optimisant ainsi la méthode avant de l’exécuter sur les souris expérimentales. Les canules guides utilisées dans ce protocole sont toutes personnalisées et peuvent être ajustées après validation des coordonnées pour différentes tailles de souris.

Ce protocole sera compatible avec la plupart des tests de comportement des rongeurs avec une arène ouverte au-dessus de l’appareil sans trop de modification. Les tests de comportement des rongeurs peuvent être effectués avec un câblage de tube en polyéthylène sur le dessus de la tête de souris sans aucun obstacle, y compris le test en plein champ, le labyrinthe élevé plus/zéro, le test de descente, l’interaction sociale directe, la vocalisation par ultrasons adultes, le test de nage forcée, la suspension de la queue, le labyrinthe aquatique, le labyrinthe T ou Y, la reconnaissance de nouveaux objets, l’enfouissement du marbre, le test d’auto-toilettage, le franchissement de faisceau, test de poteau et exposition au stress d’évitement de l’eau. Les tests utilisant des chambres ou des tubes fermés devront être modifiés pour permettre au tube en polyéthylène de se déplacer librement avec les souris, tels que le test social à trois chambres, la boîte clair-obscurité, le conditionnement de la peur, la préférence saccharose, le stress de contention, le test de sursaut et l’inhibition du pouls prépulsatif. Nous suggérons de faire un test préalable et d’estimer la longueur nécessaire pour le tube en polyéthylène sur les souris de réforme avant de tester.

Il a été démontré que les métabolites microbiens intestinaux ont un impact sur les comportements de l’hôte 8,46,47,48,49. Les scientifiques peuvent adopter cette méthode pour étudier directement les effets temporels et spatiaux des métabolites dérivés du microbiote intestinal sur le cerveau et les comportements chez la souris. Par exemple, le métabolite microbien 4-éthylphénylsulfate (4EPS) a été augmenté dans des modèles murins précliniques de TSA et de personnes atteintes de TSA46,48,49. L’injection de 4EPS et la colonisation des bactéries produisant 4EPS ont augmenté le comportement anxieux et altéré la maturation des oligodendrocytes dans le noyau paraventriculaire du thalamus (PVT) chez la souris46,48. Il serait fascinant d’évaluer l’effet direct de 4EPS sur le PVT de souris lors de tests de comportement anxieux. Cependant, la concentration absolue de 4EPS dans le PVT est encore inconnue. Par conséquent, un essai dose-réponse pourrait être essentiel pour déterminer les niveaux adéquats de 4EPS dans le PVT. Un concept similaire peut être adopté pour les effets d’autres métabolites microbiens sur le cerveau et le comportement.

Les neurotechnologies basées sur les circuits, telles que l’optogénétique, la chimiogénétique et l’imagerie calcique in vivo, sont des méthodes essentielles permettant aux scientifiques de comprendre le circuit neuronal dans le contrôle du comportement50,51,52. L’axe intestin-cerveau est une connexion complexe essentielle pour que les microbes intestinaux et leurs métabolites interviennent dans le comportement de l’hôte. Un nombre croissant d’études ont utilisé des neurotechnologies basées sur des circuits pour comprendre la diaphonie intrigante entre l’intestin et le cerveau 33,53,54,55,56,57,58,59. Ce protocole fournira un moyen alternatif de comprendre le contrôle du comportement causé par les métabolites intestinaux basé sur la région du cerveau. La combinaison de ce protocole avec des neurotechnologies basées sur des circuits permettra aux chercheurs de mieux comprendre le contrôle du comportement et de l’activité cérébrale par circuit apporté par les métabolites intestinaux.

En conclusion, le concept de l’axe intestin-cerveau est bien accepté dans la communauté scientifique et favorise la possibilité de l’implication de métabolites dérivés de l’intestin dans les troubles neuropsychiatriques 11,13,60,61,62,63,64,65 . Pour interroger comment et quels métabolites dérivés de l’intestin ont un impact sur le cerveau et le comportement des souris, une méthodologie complète et physiologique sera nécessaire sur le terrain. Cet article fournit un protocole étape par étape pour délivrer des métabolites dérivés de l’intestin directement dans le cerveau, le plus important, dans une souris en mouvement libre. Cette conception peut être adaptée davantage pour étudier les effets spécifiques à la région en délivrant les métabolites dérivés de l’intestin dans diverses régions du cerveau.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts lié à ce travail.

Acknowledgments

Nous remercions le personnel du Centre des animaux de laboratoire de l’Université nationale Cheng Kung (NCKU) pour avoir pris soin des animaux. Ce travail a été soutenu par la bourse du Fonds d’éducation du professeur Kun-Yen Huang de la Fondation médicale CHENG-HSING à C.-W.L.; les fonds du Ministère de la science et de la technologie (MOST) à Taïwan : (Undergraduate Research MOST 109-2813-C-006-095-B) à T.-H.Y.; (MOST 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) à W.-L.W.; et le projet de germination de l’enseignement supérieur, du Ministère de l’éducation au siège de l’avancement universitaire à NCKU à W.-L.W.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41 Pfizer n/a
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit ThermoFisher Scientific A-21206
Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal) Millipore AB153-I
Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μm, PES, Sterile NEST 121921LA01
CaCl2  Sigma-Aldrich C1016 ACSF: 0.14 g/L
Chlorhexidine scrub 2% Phoenix NDC 57319-611-09
Chlorhexidine solution Phoenix NDC 57319-599-09
Commercial dummy RWD Life Science 62004 Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm
Commercial guide cannul RWD Life Science 62104 Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm 
Commercial injector RWD Life Science 62204 Single_OD 0.21 mm-33G/ Mates with M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 ACSF: 0.61 g/L
Dental acrylic HYGENIC n/a
Fixing screws RWD Life Science 62521
Fluoroshield mounting medium with DAPI Abcam AB104139
Horse serum ThermoFisher Scientific 16050130
Insulin syringes BBraun XG-LBB-9151133S-1BX 1 mL
Isoflurane  Panion & BF biotech DG-4900-250D
KCl  Sigma-Aldrich P3911 ACSF: 0.19 g/L
Ketoprofen  Swiss Pharmaceutical n/a
Lidocaine  AstraZeneca n/a
Low melting point agarose Invitrogen 16520
MgCl2  Sigma-Aldrich M8266 ACSF: 0.19 g/L
Microscope cover slips MARIENFELD 101242
Microscope slides ThermoFisher Scientific 4951PLUS-001E
Mineral oil light, white NF Macron Fine Chemicals MA-6358-04
NaCl  Sigma-Aldrich S9888 ACSF: 7.46 g/L
NaH2PO4  Sigma-Aldrich S8282 ACSF: 0.18 g/L
NaHCO3  Sigma-Aldrich S5761 ACSF: 1.76 g/L
n-butyl cyanoacrylate adhesive (tissue adhesive glue) 3M 1469SB 3M Vetbond
Neural tracer  Santa Cruz SC-358883 FluoroGold
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Polyethylene tube RWD Life Science 62329 OD 1.50, I.D 0.50 mm and OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (eye) Ointment Dechra  12920060
Sodium acetate  Sigma-Aldrich S2889 SCFAs: 13.5 mM
Sodium azide  Sigma-Aldrich S2002
Sodium butyrate  Sigma-Aldrich B5887 SCFAs: 8 mM
Sodium propionate  Sigma-Aldrich P1880 SCFAs: 5.18 mM
Stainless guide cannula Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.63 mm; Local vendor
Stainless injector Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.3 mm; dummy is made from injector; local vendor
Superglue Krazy Glue KG94548R
Triton X-100 Merck 1.08603.1000
Equipment
Cannula holder RWD Life Science B485-68217
Ceiling camera FOSCAM R2
Digital stereotaxic instruments Stoelting 51730D
Dissecting microscope INNOVIEW SEM-HT/TW
Glass Bead Sterilizer RWD Life Science RS1501
Heating pad Stoelting 53800M
Leica microscope  Leica DM2500
Micro Dissecting Forceps ROBOZ RS-5136 Serrated, Slight Curve; Extra Delicate; 0.5mm Tip Width; 4" Length 
Micro Dissecting Scissors ROBOZ RS-5918 4.5" Angled Sharp
Microinjection controller World Precision Instruments (WPI) MICRO2T SMARTouch Controller
Microinjection syringe pump World Precision Instruments (WPI) UMP3T-1 UltraMicroPump3  
Microliter syringe Hamilton 80014 10 µL
Optical Fiber Cold Light with double Fiber Step LGY-150 Local vendor
Pet trimmer WAHL 09962-2018
Vaporiser for Isoflurane Step AS-01 Local vendor
Vibratome Leica VT1000S
Software
Animal behavior video tracking software Noldus EthoVision Version: 15.0.1416
Leica Application Suite X software Leica LASX Version: 3.7.2.22383

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Neurosciences numéro 184
Livraison intrarébroventriculaire de métabolites microbiens dérivés de l’intestin chez des souris en mouvement libre
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Liou, C. W., Yao, T. H., Wu, W. L.… More

Liou, C. W., Yao, T. H., Wu, W. L. Intracerebroventricular Delivery of Gut-Derived Microbial Metabolites in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (184), e63972, doi:10.3791/63972 (2022).

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