Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Intracerebroventriculaire toediening van van de darm afgeleide microbiële metabolieten in vrij bewegende muizen

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63972
Automatic Translation
*1,2, *2, 1,2
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Physiology, College of Medicine, National Cheng Kung University
* These authors contributed equally

Summary

Van de darm afgeleide microbiële metabolieten hebben veelzijdige effecten die leiden tot complex gedrag bij dieren. We streven ernaar om een stapsgewijze methode te bieden om de effecten van van de darm afgeleide microbiële metabolieten in de hersenen af te bakenen via intracerebroventriculaire toediening via een gidscanule.

Abstract

De impact van darmmicrobiota en hun metabolieten op de fysiologie en het gedrag van de gastheer is in dit decennium uitgebreid onderzocht. Talrijke studies hebben aangetoond dat van darmmicrobiota afgeleide metabolieten hersengemedieerde fysiologische functies moduleren via ingewikkelde darm-hersenroutes in de gastheer. Korte keten vetzuren (SCFA's) zijn de belangrijkste van bacteriën afgeleide metabolieten die worden geproduceerd tijdens de fermentatie van voedingsvezels door het darmmicrobioom. Uitgescheiden SCFA's uit de darm kunnen op meerdere plaatsen in de periferie werken en de immuun-, endocriene en neurale reacties beïnvloeden vanwege de enorme distributie van SCFA-receptoren. Daarom is het een uitdaging om de centrale en perifere effecten van SCFA's te differentiëren door orale en intraperitoneale toediening van SCFA's. Dit artikel presenteert een op video gebaseerde methode om de functionele rol van SCFA's in de hersenen te ondervragen via een gidscanule bij vrij bewegende muizen. De hoeveelheid en het type SCFA's in de hersenen kunnen worden aangepast door het infusievolume en de snelheid te regelen. Deze methode kan wetenschappers een manier bieden om de rol van darm-afgeleide metabolieten in de hersenen te waarderen.

Introduction

Het menselijke maagdarmkanaal herbergt diverse micro-organismen die de gastheerbeïnvloeden 1,2,3. Deze darmbacteriën kunnen darm-afgeleide metabolieten afscheiden tijdens hun gebruik van voedingscomponenten die door de gastheer worden geconsumeerd 4,5. Interessant is dat de darmmetabolieten die niet in de periferie worden gemetaboliseerd, via circulatie naar andere organen kunnen worden getransporteerd6. Van belang is dat deze uitgescheiden metabolieten kunnen dienen als mediatoren voor de darm-hersenas, gedefinieerd als de bidirectionele communicatie tussen het centrale zenuwstelsel en de darm7. Eerdere studies hebben aangetoond dat van de darm afgeleide metabolieten complex gedrag en emotie bij dieren kunnen moduleren 8,9,10,11.

Korte keten vetzuren (SCFA's) zijn de belangrijkste metabolieten geproduceerd door darmmicrobiota tijdens de fermentatie van voedingsvezels en onverteerbare koolhydraten6. Acetaat, propionaat en butyraat zijn de meest voorkomende SCFA's in de darm12. SCFA's dienen als de energiebron voor cellen in het maagdarmkanaal. Niet-gemetaboliseerde SCFA's in de darm kunnen via de poortader naar de hersenen worden getransporteerd, waardoor hersenen en gedrag worden gemoduleerd 6,12. Eerdere studies hebben gesuggereerd dat SCFA's een cruciale rol kunnen spelen bij neuropsychiatrischeaandoeningen 6,12. Bijvoorbeeld, intraperitoneale injectie van butyraat in BTBR T + Itpr3tf / J (BTBR) muizen, een diermodel van autismespectrumstoornis (ASS), redde hun sociale tekorten13. Met antibiotica behandelde ratten die microbiota kregen van depressieve proefpersonen vertoonden een toename van angstachtig gedrag en fecale SCFA's14. Klinisch werden veranderingen in fecale SCFA's waargenomen bij mensen met ASS in vergelijking met typisch ontwikkelende controles15,16. Mensen met een depressie hebben lagere fecale SCFA's dan gezonde proefpersonen 17,18. Deze studies suggereerden dat SCFA's het gedrag bij dieren en mensen via verschillende routes kunnen veranderen.

Microbiële metabolieten oefenen verschillende effecten uit op meerdere plaatsen in het lichaam, met invloed op de fysiologie en het gedrag van de gastheer 4,19, waaronder het maagdarmkanaal, de nervus vagus en de sympathische zenuw. Het is moeilijk om de precieze rol van darm-afgeleide metabolieten in de hersenen te bepalen bij het toedienen van de metabolieten via perifere routes. Dit artikel presenteert een op video gebaseerd protocol om de effecten van darm-afgeleide metabolieten in de hersenen van een vrij bewegende muis te onderzoeken (figuur 1). We toonden aan dat SCFA's acuut konden worden gegeven via de gidscanule tijdens gedragstests. Het type, het volume en de infusiesnelheid van metabolieten kunnen worden gewijzigd afhankelijk van het doel. De plaats van cannulisatie kan worden aangepast om de impact van darmmetabolieten in een specifiek hersengebied te onderzoeken. We willen wetenschappers een methode bieden om de potentiële impact van van de darm afgeleide microbiële metabolieten op de hersenen en het gedrag te onderzoeken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimentele protocollen en de verzorging van de dieren werden goedgekeurd door de National Cheng Kung University (NCKU) Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Voorbereiding op het proefdier

  1. Verkrijg 6-8 weken oude wild-type C57BL / 6JNarl mannelijke muizen van een leverancier.
  2. Huis de muizen in een standaard muizenkooi met standaard muizen chow en gesteriliseerd water ad libitum.
    OPMERKING: De huisvestingsomstandigheden voor het Proefdiercentrum van NCKU zijn 22 ± 1 °C temperatuur, 55% ± 10% luchtvochtigheid en een 13 h/11 h licht/donker cyclus.

2. Stereotaxische chirurgie

  1. Bereid en steriliseer het stereotaxische instrument, chirurgische instrumenten en gerelateerde items.
    OPMERKING: Alle items die rechtstreeks contact maken met de chirurgische site moeten worden gesteriliseerd om infectie te voorkomen.
  2. Verdoof de muis door hem in de plexiglas kooi te plaatsen met 1%-5% isofluraan in zuurstof.
    OPMERKING: Observeer de muis nauwlettend om ervoor te zorgen dat de ademhalingsfrequentie op ongeveer één ademhaling per seconde wordt gehandhaafd.
  3. Haal de muis uit de anesthesiekamer. Scheer de chirurgische site (muizenkop) met een trimmer voor huisdieren. Plaats de muis op het stereotaxische frame door de snijtanden van de muis op de snijbalk in de stereotaxische snijtandhouder te bevestigen. Bedek de neus met het neuskegelmasker.
  4. Verdoof de muis met 1% -2,5% isofluraan in zuurstof gedurende de stereotaxische operatie. Evalueer de nociceptie van de muis via de teenknijpreflex en zorg voor een constante ademhaling voordat de operatieplaats wordt ingesneden.
  5. Plaats een verwarmingskussen (37,0 °C) onder de muis op het stereotaxische frame om de lichaamstemperatuur tijdens de operatie te handhaven. U kunt ook de kerntemperatuur handhaven met behulp van een rectale thermische sonde die de geprogrammeerde warmer en het verwarmingskussen verbindt.
  6. Verwijder de getrimde vacht op het hoofd met plakband. Injecteer de muis subcutaan met pijnstillend Ketoprofen (5 mg/kg) om de pijn te verlichten. Breng oogzalf aan om droge ogen te voorkomen.
  7. Steek de puntige oorbalk in de gehoorgang om het hoofd te bevestigen.
  8. Centreer het hoofd door de schaal van de oorstang aan te passen.
  9. Draai de neusklem op de snijtandhouder vast om verticale beweging te voorkomen. Druk zachtjes op het hoofd om te controleren of het hoofd is gefixeerd en voorkom dat het hoofd losraakt tijdens de volgende operatie.
  10. Desinfecteer de hoofdhuid met drie afwisselende scrubs van chloorhexidine met behulp van een wattenstaafje. Start elke scrub van het midden naar de buitenkant (van het meest gedesinfecteerde centrale gebied naar het minst gedesinfecteerde gebied).
    OPMERKING: Het gebruik van scrubs van het midden naar de buitenkant kan wetenschappers helpen infectie en besmetting van de vacht te minimaliseren. Het buitengebied ligt dicht bij het ongeschoren hoofdgebied, dat nog steeds een grote hoeveelheid vacht heeft en niet gemakkelijk grondig te desinfecteren is.
  11. Snijd de hoofdhuid op een voorste/achterste manier (<1 cm) met behulp van een chirurgisch mesje. Open de incisie en veeg de schedel af met een wattenstaafje dat wordt vastgehouden door een microdissecterende tang.
    OPMERKING: De microdissecterende tang, het chirurgische mes en het wattenstaafje moeten vóór de operatie worden gesteriliseerd door autoclaveren. Steriliseer tijdens het chirurgische proces alle chirurgische apparatuur met behulp van een glazen kraalsterilisator (150 °C) gedurende ten minste 5 s voor en na elk dier. Bereid een gesteriliseerd bekerglas voor om het chirurgische mes en de tang vast te houden tijdens het chirurgische proces en tussen dieren.
  12. Identificeer de Bregma en Lambda op de schedel. Gebruik de Bregma als referentie om de regio van belang te lokaliseren.
    1. Optioneel: Monteer de stereotaxische boormachine op de stereotaxische boorhouder en gebruik de punt van de boor om Bregma als referentie aan te wijzen. Steriliseer de stereotaxische boor met behulp van de glazen kraalsterilisator (150 °C) gedurende ten minste 5 s.
  13. Kalibreer en lijn het horizontale vlak van de platte schedel in linker/rechter en voorste/achterste vlakken van Bregma/Lambda.
    OPMERKING: Als u zich niet in een correct horizontaal vlak bevindt, koppelt u de muis opnieuw op het stereotaxische instrument.

3. Commerciële op maat gemaakte gids canule implantatie

  1. Identificeer en label de positie van de rechter laterale ventrikel, op basis van de stereotaxische coördinaten: Afstand tot Bregma, voorste/achterste (A/P): 0,26 mm, mediaal/lateraal (M/L): -1,0 mm, dorsaal/ventraal (D/V): -2,0 mm20.
    OPMERKING: De coördinaten kunnen worden gewijzigd op basis van de regio van belang. De coördinaten voor de laterale ventrikel waren gebaseerd op volwassen C57BL/6J muizen met een gewichtsbereik van 26-30 g. Als jongere muizen worden gebruikt, raadpleeg dan de discussie.
  2. Boor een gat (diameter = 1,5 mm) door de schedel op de gelabelde plaats met behulp van een stereotaxische boor voor de implantatie van een commerciële geleidecanule.
  3. Boor nog twee tot vier gaten (diameter = 1,5 mm) op de schedel met behulp van een stereotaxische boor voor de montage van roestvrijstalen schroeven.
    OPMERKING: Steriliseer de stereotaxische boor met behulp van een glazen kraalsterilisator (150 °C) gedurende ten minste 5 s voor en na elk dier.
  4. Veeg de botresten af en stop het bloeden met een wattenstaafje.
  5. Veeg de schedel af met Lidocaïne (1 mg / kg) met een wattenstaafje voor lokale anesthetische, antipruritische en pijnstillende effecten. Als het bloeden niet stopt na het boren, plaats dan voorzichtig een wattenstaafje op het gat voor hemostase.
  6. Monteer twee tot vier roestvrijstalen schroeven op de gaten om ankers te bieden voor tandheelkundig acrylaat.
  7. Plaats de commerciële geleidecanule op de stereotaxische canulehouder en desinfecteer met de glazen kraalsterilisator (150 °C).
    OPMERKING: De commerciële gidscanule, commerciële dummy en commerciële injector (figuur 2A) zijn aangepast met de specificaties in de materiaaltabel.
  8. Verplaats de stereotaxische canulehouder naar het gat dat is geboord voor de laterale ventrikel en steek de commerciële geleidecanule langzaam in het gat tot de gewenste diepte (2,5 mm).
    OPMERKING: De dorsale/ventrale coördinaat kan worden gedefinieerd door de punt van de commerciële geleidecanule als referentie in te stellen wanneer de punt nauwelijks in het gat wordt gestoken.
  9. Breng 10 μL n-butylcyanoacrylaatlijm (weefsellijmlijm) aan om de commerciële geleidecanule in het geboorde gat te bevestigen en wacht 3-4 minuten. Laat de commerciële geleidecanule voorzichtig los van de stereotaxische canulehouder en beweeg de houder weg.
  10. Breng het tandheelkundige acrylaat aan op de ingesneden hoofdhuid om de commerciële gidscanule te fixeren en wacht minstens 5 minuten. Implanteer de commerciële dummy in de commerciële gidscanule om canuleverstopping door bloed of lichaamsvocht te voorkomen (figuur 2B).
  11. Laat de oorstang los van de gehoorgang en verwijder de muis uit het stereotaxische frame.
  12. Plaats de muis in een nieuwe kooi met een verwarmingskussen eronder voor herstel van de anesthesie en observeer continu totdat de muis volledig ontwaakt.
    OPMERKING: Laat het dier niet onbeheerd achter totdat het weer voldoende bewustzijn heeft gekregen om de strengale lighouding te behouden. Een dier dat een operatie heeft ondergaan, mag niet terugkeren naar het gezelschap van andere dieren totdat het volledig is hersteld.
  13. Breng de muis terug naar één behuizing of groepshuisvesting, afhankelijk van het institutionele IACUC-protocol en het experimentele ontwerp. Zorg er voor groepshuisvesting voor dat er minder muizen in een kooi worden gehuisvest om ongewenste verwondingen of het loslaten van de canule te minimaliseren.
  14. Dien Ibuprofen (0,2 mg /ml) toe in het drinkwater gedurende ten minste 3 dagen voor postoperatieve zorg en controleer tweemaal daags op tekenen van pijn en angst gedurende ten minste 3 dagen.
    1. Breng tijdens postoperatieve zorg roxitromycinezalf rond de huid aan om ontsteking en infectie bij de muizen te voorkomen.
    2. Blijf de toestand van het dier controleren en geef tijdig een intraperitoneale injectie van 5% glucose en/of 0,9% natriumchloride om voldoende energie te leveren.
    3. Als de toestand van pijn, angst of infectie gestaag verslechtert, euthanaseer de muis dan door CO 2-inademing.
  15. Wacht 1 week na de operatie totdat de muis klaar is voor de intracerebroventriculaire levering van SCFA's en gedragstests.

4. Voorbereiding van SCFA's

  1. Los het natriumacetaat, natriumbutyraat en natriumpropionaat op in kunstmatige hersenvocht (ACSF) (zie de tabel met materialen).
  2. Zorg ervoor dat de chemicaliën volledig zijn opgelost, pas vervolgens de pH aan op 7,4 en filter het SCFAs-mengsel door een filter van 0,22 μm voor sterilisatie.

5. Het infuussysteem instellen voor intracerebroventriculaire toediening van SCFA's tijdens gedragstests

  1. Monteer een plafondcamera om het gedrag vast te leggen. Sluit de camera aan op een computer om de video-opnamesoftware te bedienen (figuur 3).
  2. Vul een spuit van 10 μL met gedestilleerd water.
    OPMERKING: Vermijd luchtbellen in de microliterspuit.
  3. Sluit een micro-injectiepomp aan op de microinjectieregelaar.
  4. Monteer de microliterspuit op de micro-injectiepomp. Om de spuit te installeren, drukt u op de knop om de klem los te maken en installeert u de spuit op de overeenkomstige positie. Sluit de klem en draai de zuigerbevestigingsschroef op de micro-injectiepomp vast (figuur 4A).
  5. Steek de commerciële injector in de polyethyleenbuis (figuur 2A).
  6. Hang de polyethyleenbuis aan de plafondcamera boven de testarena.
  7. Vul de polyethyleenbuis met gedestilleerd water met behulp van een insulinespuit. Sluit de microliterspuit aan op de hangende polyethyleenbuis.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de polyethyleenbuis lang genoeg is om de muis vrij door de testarena te laten bewegen.

6. Systeeminstellingen van de micro-injectiecontroller

  1. Schakel de micro-injectiecontroller in en druk op Alle kanalen weergeven om toegang te krijgen tot het opdrachtscherm (afbeelding 4C). Druk op Configuratie en stel volumedoel in op 9.800 nL met leveringssnelheid op 100 nL/s. Injecteer 9.800 ml gedestilleerd water uit de polyethyleenbuis die is aangesloten op de microliterspuit (druk op Direction om over te schakelen naar de infuse-modus en druk op RUN) (zie rode vierkantjes in het opdrachtscherm van figuur 4C).
  2. Druk op Configuratie en stel volumedoel in op 3.000 nL met leveringssnelheid op 100 nL/s. Trek 3.000 nL minerale olie op (druk op Direction om over te schakelen naar de modus Terugtrekken en druk op RUN) (zie rode vierkanten in het opdrachtscherm van figuur 4C).
    OPMERKING: Een duidelijke olie-water fasescheiding moet in acht worden genomen op de polyethyleenbuis.
  3. Demonteer de polyethyleenbuis van de naald van de microliterspuit. Spuug 3.000 ml gedestilleerd water uit de naald van de microliterspuit (druk op Direction om over te schakelen naar de Infuse-modus en druk op RUN).
  4. Steek de microliterspuit terug in de polyethyleenbuis. Druk op Configuratie en stel volumedoel in op 9.500 nL met delivery rate op 100 nL/s. Neem 9.500 nL SCFA's op (druk op Direction om over te schakelen naar de modus Terugtrekken en druk op RUN). Label de olie-SCFA's fase om te valideren of de SCFA's met succes zijn geïnfundeerd.
  5. Druk op Configuratie en stel het gewenste volumedoel met leveringssnelheid in op 7 nL/s. Druk op Direction om over te schakelen naar de infuse-modus (zie rode vierkantjes in het opdrachtscherm van Figuur 4C).
    OPMERKING: Bepaal het volume op basis van de infusietijd. Als de infusietijd bijvoorbeeld 3 minuten is voor de toedieningssnelheid van 7 nL/s, is het streefvolume = 1.260 nL.
  6. Druk op RUN om de microliterspuit naar voren te laten trekken totdat de vloeistof aan de voorkant van de commerciële injector naar buiten komt voordat u de injector in de canule inbrengt voor scfa-injectie.

7. Infusie van SCFA's in de laterale ventrikel via de commerciële gidscanule in vrij bewegende muis

  1. Verdoof de muis door hem in de plexiglas kooi te plaatsen met 1%-5% isofluraan in zuurstof.
    OPMERKING: Observeer de muis nauwlettend om ervoor te zorgen dat de ademhalingsfrequentie op ongeveer één ademhaling per seconde wordt gehandhaafd.
  2. Krabbel de muis en steek de commerciële injector in de commerciële geleidecanule (figuur 4B).
    OPMERKING: Als de commerciële gidscanule is aangesloten op bloed of lichaamsvloeistof, ontstop deze dan voorzichtig met een pincet.
  3. Laat de muis gedurende 15 minuten herstellen van de anesthesie in een kooi voorafgaand aan gedragstests.
  4. Voor de basisbewegingstest plaatst u de muis in een nieuwe kooi en laat u hem 35 minuten vrij verkennen. Infundeer SCFA's met een leveringssnelheid van 7 nL/s voor een doelvolume van 2.100 nL in de eerste 5 minuten (druk op Direction to the Infuse mode en druk op RUN).
    OPMERKING: De voortbeweging in de nieuwe kooi kan worden geanalyseerd met behulp van videotrackingsoftware voor diergedrag21,22.
  5. Verdoof de muis (herhaal stap 7.1) en verwijder de commerciële injector uit de commerciële geleidecanule.
    OPMERKING: De muis kan herhaaldelijk worden geïnjecteerd met verschillende controles/metabolieten nadat de juiste tijd is gegeven om de vorige injectie uit te spoelen. Zolang de canule op de muiskop is bevestigd, kan de muis herhaaldelijk worden getest met verschillende metabolieten.

8. Herstel van het micro-injectiesysteem

  1. Demonteer de polyethyleenbuis van de microliterspuit.
  2. Injecteer lucht in de buis met behulp van de insulinespuit om het gedestilleerde water in de polyethyleenbuis weg te gooien. Leeg de microliterspuit.
  3. Druk op Reset Pos op het scherm Configuratie om het scherm Spuitstopdefinitie te openen (Figuur 4C).
  4. Druk op Terugtrekken totdat er een piepend geluid optreedt om de micro-injectiepomp terug te zetten naar de volledig teruggetrokken positie (figuur 4C).
  5. Ga terug naar het opdrachtscherm en schakel de micro-injectiecontroller uit als er een **END REACHED**- teken op dit scherm staat (figuur 4C).

9. Optioneel: Validatie van intracerebroventriculaire injectie door neurale tracer

  1. Infundeer 2.100 nL van de neurale tracer met de toedieningssnelheid van 7 nL/s om de infusieplaats te verifiëren.
    OPMERKING: Laat de injector 5 minuten in de geleidecanule zitten om terugstroming te voorkomen.
  2. Verdoof de muis door een overdosis isofluraan (5%) 30 minuten na de infusie van neurale tracer.
  3. Controleer de ademhalingsfrequentie en de staart/poot knijpreflex bij de verdoofde muis.
    OPMERKING: Muizen moeten niet reageren voor de volgende stap.
  4. Maak een incisie van 4-5 cm door de huid, spier en buikwand onder de ribbenkast.
  5. Beweeg de lever voorzichtig weg van het diafragma.
  6. Snijd het diafragma in om het hart van de muis bloot te leggen.
  7. Perfuseer de muis door het hart met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en ijskoude 4% paraformaldehyde in PBS.
  8. Onthoofd de muis en ontleed de hersenen zorgvuldig met een microdissecterende tang en een microdissecterende schaar om het hele brein eruit te halen23. Plaats de hersenmonsters in ijskoude 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 3-4 dagen en was ze 3 x 5 minuten met PBS.
  9. Snijd de hersenen in twee delen in de hersenschijfhouder van de muis bij de achtste snede van de hersenschijfhouder van de muis (1 mm / sectie) van de voorste naar de achterste richting. Plaats de hersenen in de insluitvorm en integreer de hersenmonsters in laagsmeltpunt agarose (4% in PBS).
  10. Lijm de hersenen ingebed in agarose op het stadium van het vibratoom met behulp van secondelijm. Sectie van de hersenen coronaal in 50 μm hersenplakken met behulp van het vibratoom.
  11. Incubeer de hersenschijfjes in het antilichaam gericht op de neurale tracer verdund in blokkerende buffer (1:1.000 verdunning) 's nachts bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: De blokkerende buffer bevatte 10% paardenserum, 0,1% Triton X-100 en 0,02% natriumazide.
  12. Was de plakjes 3 x 5 min met PBST (PBS met 0,1% triton X-100).
  13. Incubeer de hersenschijfjes in fluorescentiekleurstof geconjugeerd secundair antilichaam verdund in blokkerende buffer (1:500 verdunning) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
  14. Was de plakjes 3 x 5 min met PBS.
  15. Monteer de hersenschijfjes op de dia met een montagemedium dat 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) bevat.
  16. Bedek de dia met een microscoop coverslip.
  17. Breng nagellak aan op de schuifrand om lekkage van het montagemedium te voorkomen.
  18. Na nachtelijke incubatie bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht, brengt u het fluorescentiesignaal op de infusieplaats in beeld met behulp van een fluorescentiemicroscoop.

10. Optioneel: Infusie van metabolieten via een aangepaste roestvrijstalen geleidecanule in de laterale ventrikel bij muizen

  1. Volg protocol secties 1-8 en vervang de commerciële gidscanule door een roestvrijstalen geleidecanule om chemicaliën door een roestvrijstalen injector in de muis te injecteren.
    OPMERKING: De voor- en nadelen van de verschillende commerciële en roestvrijstalen canules worden uitgewerkt in de discussiesectie.
  2. Voer het chirurgische protocol uit op dezelfde manier als beschreven in protocolsecties 2 en 3, behalve dat u de commerciële geleidecanule moet vervangen door een roestvrijstalen geleidecanule (figuur 5B).
    OPMERKING: De roestvrijstalen geleidecanule, de roestvrijstalen dummy en de roestvrijstalen injector (figuur 5A) zijn aangepast aan de specificaties in de materiaaltabel. Steek de aangepaste roestvrijstalen geleidecanule in het gat tot de gewenste diepte (2,0 mm).
  3. Infundeer SCFA's via de roestvrijstalen geleidecanule met behulp van het microinjectiesysteem dat bestaat uit de micro-injectieregelaar en de micro-injectiepomp (figuur 4B) (hetzelfde als protocolsecties 4-7). Voor de roestvrijstalen dummy van de roestvrijstalen geleidecanule buigt u de ene kant van de roestvrijstalen injector voorzichtig totdat de punt van de andere kant 1 mm langer is dan de roestvrijstalen geleidecanule.
  4. Injecteer 2.100 nL van de neurale tracer door de roestvrijstalen geleidecanule in de laterale ventrikel bij muizen (hetzelfde als protocolsectie 9).
  5. Verzamel het monster gedurende 30 minuten na de infusie van neurale tracers (hetzelfde als protocolparagraaf 9).
  6. Voer beeldacquisitie uit in de neurale tracer geïnfundeerde hersensegmenten (hetzelfde als protocolsectie 9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De muis werd 1 week na herstel van de implantatie van de gidscanule toegediend met SCFA's om de locomotorische activiteit in een nieuwe kooi te evalueren. De muis werd in een nieuwe kooi geplaatst en toegediend met 2.100 nL SCFA's of ACSF in de eerste 5 minuten (afgiftesnelheid van 7 nL / s) in de hersenen via de commerciële gidscanule geïmplanteerd in de laterale ventrikel van de hersenen. De locomotorische activiteit in een nieuwe kooi werd geregistreerd gedurende nog eens 30 minuten na infusie. Er werd geen verschil waargenomen in de locomotorische activiteit in de nieuwe kooi tussen infusie van SCFA's en ACSF (figuur 6) (n = 2 muizen per groep; gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± s.e.m. en geanalyseerd door tweeweg ANOVA).

Om de nauwkeurigheid van de implantatie van de gidscanule in de hersengebieden te valideren, werd een fluorescerende neurale tracer via de gidscanule in de muizen geïnfundeerd met hetzelfde volume en dezelfde toedieningssnelheid als de SCFA's (2.100 nL in 5 min; 7 nL / s). De hersenen werden 30 minuten later verzameld voor histologie. De fluorescerende kleurstof werd gedetecteerd in de laterale ventrikel en de omliggende gebieden van de muizenhersenen (figuur 7A). Een roestvrijstalen geleidecanule werd geïmplanteerd in de laterale ventrikel van de hersenen voor de infusie van neurale tracer onder dezelfde omstandigheden. Net als bij de gidscanule toonden de resultaten aan dat een fluorescerend kleurstofsignaal werd gedetecteerd in de laterale ventrikel en de omliggende gebieden van de muizenhersenen, zelfs na infusie door de roestvrijstalen geleidecanule (figuur 7B).

Figure 1
Figuur 1: De procedure voor intracerebroventriculaire infusie bij vrij bewegende muizen. Het stroomschema voor de intracerebroventriculaire toediening van darm-afgeleide microbiële metabolieten in vrij bewegende muizen. Afkorting: SCFA's = vetzuren met een korte keten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Implantatie van de commerciële gidscanule bij muizen. (A) Het representatieve beeld van commerciële gidscanule, dummy en injector. (B) Het representatieve beeld van commerciële gidscanule en dummy geïmplanteerd in de hersenen van muizen door fixatie met tandheelkundig acrylaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: De intracerebroventriculaire infusieinstallatie voor gedragstesten. Het diagram van micro-injectiesysteem, video-opnamesysteem en gedragsapparaat. Afkorting: SCFA's = vetzuren met een korte keten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Het micro-injectiesysteem. (A) De installatie van de microliterspuit met behulp van een micro-injectiepomp. (B) Het inbrengen van de commerciële injector verbonden met polyethyleenbuis in de commerciële geleidecanule (C) Het aanraakscherm van de micro-injectiecontroller. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Implantatie van roestvrijstalen geleidecanule in de laterale ventrikel van muizen. (A) Het representatieve beeld van roestvrijstalen geleidecanule, dummy en injector. (B) Het representatieve beeld van roestvrijstalen geleidecanule en dummy geïmplanteerd in de hersenen van muizen door fixatie met tandheelkundig acrylaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Locomotorische activiteit van scfa's-geïnfundeerde muizen in de nieuwe kooi. (A) Tijdlijnschema van gidscanule-implantatie en nieuwe kooibeweging bij ACSF- of SCFA's-infusie. (B) Tijdlijnschema voor plaatsing van infuusspuit, infusievenster (blauwe schaduw) en de nieuwe kooigedragstests. (C) Totale afstand verplaatst door ACSF- en SCFA's-geïnfundeerde muizen in een nieuwe kooi gedurende 35 minuten. Het tijdvenster voor infusie wordt aangegeven met blauwe schaduw (0-5 min). (D) Representatieve beelden van trajecten voor ACSF- en SCFA's-geïnfundeerde muizen in een nieuwe kooi. n = 2 muizen per groep. Gegevens die als gemiddelde worden weergegeven, ± s.e.m. en geanalyseerd door tweerichtings-ANOVA. ns: niet significant. Afkortingen: SCFA's = vetzuren met een korte keten; ACSF = kunstmatig hersenvocht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: De histologie van met de hersenen doordrenkte fluorescerende kleurstof. Infusie via de aangepaste (A) commerciële en (B) roestvrijstalen geleidecanule geïmplanteerd in de laterale ventrikel (LV) van muizen. Schaalbalken = 1 mm (links) en 500 μm (rechts). Blauw: DAPI-kleuring; Groen: Anti-Fluorescerend Goud labeling. Afkortingen: LV = laterale ventrikel; AC = anterieure commissure; CPu = caudate putamen; LS = lateraal septum; MS = mediaal septum. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Van de darm afgeleide metabolieten zijn in verband gebracht met hersengemedieerde ziekten zonder veel nauwkeurig mechanisme, gedeeltelijk vanwege hun meerdere bindingsplaatsen in het lichaam 6,12,24. Eerdere rapporten gaven aan dat SCFA's kunnen dienen als liganden voor G-eiwitgekoppelde receptoren, epigenetische regulatoren en bronnen voor energieproductie op meerdere locaties in het lichaam 6,12. Om de verstorende factoren die afkomstig zijn uit de periferie (zoals immuuncellen, hormonen en het autonome zenuwstelsel) te omzeilen, werd een methode ontwikkeld door intracerebroventriculaire injectie van SCFA's in de hersenen aan te nemen via een gidscanule bij vrij bewegende muizen. Bovendien werden de cannulisatie- en infusieplaatsen gevalideerd om de hersengebieden te verkennen die mogelijk worden beïnvloed door SCFA's. Al met al presenteert dit artikel een nauwkeurige, nauwgezette en gevalideerde methode om darm-afgeleide metabolieten in de hersenen af te leveren voor darm-hersenasonderzoek.

De intracerebroventriculaire toediening van geneesmiddelen en chemicaliën via een gidscanule bij dieren is goed vastgesteld 25,26,27,28,29 voor verschillende drugstests29, ziektemodellering26,28 en specifiek ontwerp van gedragstests27 . Het belangrijkste is dat verschillende studies darmmicrobiële metabolieten in de hersenen hebben afgeleverd via intracerebroventriculaire injectie en hun effecten op fysiologische functies hebben getest 30,31,32,33. Dit protocol biedt een add-on attribuut bij het toedienen van darmmetabolieten op een acute manier aan de hersenen in realtime, waardoor wetenschappers de dynamische effecten van darmmetabolieten op de hersenen en het gedrag kunnen begrijpen.

De toedieningssnelheid voor de metabolietinfusie is cruciaal om de stroom van hersenvocht in de hersenventrikels te simuleren. Eén studie gaf aan dat de productiesnelheid van hersenvocht bij muizen 5,3 nL / s34 is. Om de stroomsnelheid van SCFA's op natuurlijke wijze in vrij bewegende muizen te regelen, hebben we het debiet voor dit micro-injectiesysteem geëvalueerd (figuur 3 en figuur 4). De SCFA's konden soepel worden toegediend zonder veel weerstand, zelfs wanneer de 350 cm lange polyethyleenbuis werd gebruikt om SCFA's in een vrij bewegende muis te injecteren. Met het vullen van gedestilleerd water en minerale olie om de vloeistofweerstand in de polyethyleenbuis te verminderen (zie protocolparagrafen 5 en 6), kan het debiet worden verlaagd van 100 nL/s naar 7 nL/s. Het infunderen van de SCFA's of ACSF met een stroomsnelheid van 7 nL/s resulteerde niet in abnormaal gedrag van de muizen.

De hoeveelheid en dosering van darm-afgeleide metabolieten voor intracerebroventriculaire injectie zijn van cruciaal belang. Het blijft een uitdaging om de absolute niveaus van van de darm afgeleide metabolieten in verschillende hersengebieden uitgebreid te analyseren. Er zijn bijvoorbeeld maar heel weinig studies die de detectie van de fysiologische niveaus van SCFA's in de hersenen hebben aangetoond35,36. Een studie toonde aan dat de concentraties van acetaat, propionaat en butyraat in de hersenen van muizen ongeveer 1640,6-3281,2 μg / g, 288,18-384,24 μg / g en 44,036-66,054 μg / g, respectievelijk36. Een andere studie rapporteerde echter lagere niveaus van SCFA's in de hersenen (acetaat 128,1 μg / g, propionaat 0,3883 μg / g en butyraat 0,1640 μg / g)35. De hoeveelheden geïnfundeerd acetaat, propionaat en butyraat die in dit protocol werden aangenomen, waren respectievelijk 5,81385 μg / g, 4,62378 μg / g en 2,6124 μg / g. Daarom zijn de concentraties van de SCFA's die in dit protocol worden geïnfundeerd vergelijkbaar met fysiologische concentraties. We konden echter niet uitsluiten dat de concentraties van SCFA's in verschillende hersengebieden kunnen variëren. Verschillende studies toonden aan dat de toediening van propionaat in de hersenkamer door intracerebroventriculaire injectie (4 μL van 0,26 M propionzuur in 1 min; ongeveer 249,756 μg / g) het sociale gedrag en de cognitie bij ratten verminderde30,31. De dosering en stroomsnelheid van het geïnfundeerde propionaat waren relatief hoog, zoals gemeld bij muizen35 en ratten37. Daarom zal vooruitgang in metabolietanalyse en metabolomische profilering in de hersenen en de periferie onderzoekers helpen de ruimtelijke en temporele dynamische veranderingen in darm-afgeleide metabolieten beter te begrijpen.

In dit protocol zijn twee soorten gidscanules gepresenteerd voor intracerebroventriculaire injectie bij muizen - een commerciële gidscanule en een roestvrijstalen gidscanule. De commerciële gidscanule en dummy zijn goed ontworpen voor implantatie. Het is niet eenvoudig voor muizen om de aangepaste dummy te verwijderen vanwege de dop. Integendeel, de roestvrijstalen dummy kan gemakkelijk door muizen uit de roestvrijstalen geleidecanule worden verwijderd tijdens het herstel van 1 week, waardoor de stolling van bloed / hersenvocht in de canule ontstaat. De commerciële aangepaste canule is echter 64 mg en de dummy voor deze canule is 86 mg. Het totale gewicht van de commerciële aangepaste canule en dummy is dus 150 mg. Daarentegen is de aangepaste roestvrijstalen gidscanule 18,3 mg en de dummy voor deze canule is 8,5 mg. Het totale gewicht van de aangepaste roestvrijstalen geleidecanule is dus 26,8 mg. Theoretisch zou het lage gewicht van de roestvrijstalen geleidecanuleset de impact van de canule op de beweging van het dier en de hersenen minimaliseren. Bovendien zijn de kosten van de commerciële geleidecanule hoger dan de roestvrijstalen geleidecanule en injector. Daarom raden we de roestvrijstalen gidscanule aan voor onervaren onderzoekers die stereotaxische chirurgie bij muizen uitvoeren.

De geïmplanteerde canule kan verstopt raken door bloed en hersenvocht als gevolg van hersenbeschadiging. Deze verstopping van de canule zou vaker kunnen voorkomen in de roestvrijstalen canule dan in de commerciële canule. De dummy kan worden geregen om de commerciële canule stevig aan te spannen (figuur 2A), maar niet voor de roestvrijstalen canule (figuur 5A). Daarom zou het verzekeren van de bevestiging van de dummy tijdens de herstelperiode de verstopping van de canule minimaliseren. Een nieuwe dummy moet worden ingebracht als onthechting optreedt tijdens het herstel van 1 week. Bovendien moet een gesteriliseerde wegwerpinjector meerdere keren worden ingebracht om de canule te ontstoppen voordat de injector wordt gemonteerd die de polyethyleenbuis verbindt.

De keuze van anesthetica zal de operatie en gedragstesten sterk beïnvloeden. Hier werd het inhalatie-anestheticum isofluraan verkozen boven geïnjecteerde anesthetica omdat de hersteltijd korter is en het om humane redenen minder schadelijk is voor de dieren. De dosering voor isofluraaninhalatie kan echter worden gevarieerd, afhankelijk van de status en het lichaamsgewicht van de muis. Daarom moet de status van de anesthesie nauwlettend in de gaten worden gehouden tijdens de gehele chirurgische procedure en moet de isofluraanverdamper dienovereenkomstig worden aangepast. De geoptimaliseerde ademhalingsfrequentie moet tijdens alle procedures één ademhaling per seconde zijn. Bovendien moet de gasfilterbus gevuld met actieve kool worden aangesloten op de anesthesiekamer en het neuskegelmasker om de isofluraan- en uitlaatgasvervuiling in het operatiegebied te legen. Dit beschermt de chirurg tegen het toxische effect van isofluraan.

De representatieve resultaten toonden aan dat SCFAs-infusie geen dramatisch effect had op de voortbeweging in een nieuwe kooi. Dit kan zijn omdat een klein aantal dieren is gebruikt om dit resultaat te verkrijgen (figuur 6). Bovendien hebben we de SCFA's alleen toegediend voor de eerste 5 minuten van de nieuwe kooibewegingsgedragstest, maar niet de hele test omdat het meeste gedrag binnen een kort tijdsbestek (5-15 min) werd getest. Het tijdvenster voor de van de darm afgeleide microbiële metabolieten moet worden aangepast op basis van de hypothese van de onderzoekers.

De tijd voor anesthesie en het herwinnen van bewustzijn van anesthesie zijn van cruciaal belang voor gedragstests. Hier werden de muizen kort verdoofd voor de injectorimplantatie en SCFA-infusie en werden gedragstests uitgevoerd na 15 minuten. De tijd om te herstellen na het staken van de anesthesie bij inhalatie werd bepaald op basis van een eerdere studie38. Een pilotstudie zorgde ervoor dat de muizen actief waren, vrij bewogen en zich niet ongemakkelijk voelden 15 minuten na anesthesie. We hebben de anesthesiestap voor de montage van de injector om de volgende redenen geïntroduceerd. Ten eerste is de injectormeter 33 G; het is een hele uitdaging om zo'n delicate injector in de canule te steken wanneer het dier actief beweegt. Bovendien kan het krabben van bewuste muizen stress veroorzaken bij de muizen39, waardoor de gedragsuitkomsten worden verstoord. Ten tweede is de canule af en toe verstopt door de stolling van het bloed/hersenvocht. Het voorzichtig ontstoppen van de canule voordat de injector wordt gemonteerd, zou ideaal zijn voor metabolietinfusie. Op basis van deze twee redenen wordt aanbevolen om de muizen kort te verdoven voor het monteren van de injector. Onderzoekers kunnen langer wachten (30 minuten) als er enige bezorgdheid is over het herstel van het dier van de inhalatie-anesthesie. Bovendien kan een aparte set infusie-injectoren die de polyethyleenbuis verbindt, worden opgezet om de experimenten te versnellen.

Dit protocol heeft verschillende beperkingen. Ten eerste zou de implantatie van de gidscanule en de verbindende polyethyleenbuis het chirurgische gebied voor het implanteren van optische vezels voor optogenetische en vezelfotometrie in dezelfde coördinaat, het omliggende gebied of zelfs dezelfde hersenhelft beperken. Het zal nog uitdagender zijn om de lens voor micro-endoscopie op het muizenhoofd te implanteren, samen met de geïmplanteerde geleidecanule. Ten tweede kan de implantatie van de geleidecanule een aanzienlijk gewicht op het muizenhoofd genereren. Het totale gewicht van een aangepaste canuleset is 26,8-150 mg, een schroef is ~ 48 mg en het gemonteerde tandheelkundige acrylaat is 450-500 mg. De hele installatieset kan de bewegingen van de muizen beperken. Recente studies hebben echter een miniscoop geïmplanteerd voor het monitoren van calciumsignalen bij vrij bewegende muizen40,41. Het gewicht van de miniscoop varieert van 1,6 g tot 4,5 g, exclusief de schroeven en tandheelkundig acrylaat. Daarom kan het gewicht van de geleidecanule als relatief acceptabel worden beschouwd voor het testen van het gedrag van muizen. Ten derde is de verbindende polyethyleenbuis voor de infusie ~ 350 cm lang, wat de beweging van muizen tijdens de gedragstest kan beperken. Om dit probleem aan te pakken, kan pretesting op voortbeweging in een open-veldtest nodig zijn om de impact van de verbindende polyethyleenbuis op de motorfunctie van de muis te evalueren. Ten vierde kan tandheelkundig acryl een neurotoxisch effect op de muizen veroorzaken. Het is echter vereist om de geleidecanule tijdens de testperiode aan de muiskop te bevestigen. Om het potentiële neurotoxische effect van tandheelkundig acryl op muizen te verminderen, moeten de operators bekend zijn met het gebruik van tandheelkundig acryl. Tandheelkundig acryl wordt beter toegepast wanneer het tandheelkundige acrylmengsel (poeder en vloeistof) enigszins is gestold om de penetratie van tandheelkundige acrylvloeistof in de hersenen te verminderen.

Microbiota en hun metabolieten zijn geassocieerd met gedragsfunctie bij verschillende ontwikkelingsmijlpalen. Hoewel dit protocol is gebaseerd op volwassen C57BL/6-muizen met een lichaamsgewicht variërend van 26 g tot 30 g, kan het ook worden toegepast op muizen van verschillende leeftijden en maten. Eerdere studies hebben stereotaxische chirurgie aangenomen bij jonge muizen 42,43,44,45. De coördinaten voor hersengebieden kunnen echter variëren, afhankelijk van de grootte en leeftijd van muizen. We raden u aan te verwijzen naar de leeftijdsafhankelijke atlas of online bron (http://mouse.brain-map.org/static/atlas). Bovendien moeten de coördinaten worden gevalideerd door trypanblauwe of fluorescentiekleurstof in de jonge ruimingsmuizen te injecteren, waardoor de methode wordt geoptimaliseerd voordat deze op de experimentele muizen wordt uitgevoerd. De gidscanules die in dit protocol worden gebruikt, zijn allemaal aangepast en kunnen worden aangepast na het valideren van de coördinaten voor verschillende groottes van muizen.

Dit protocol zal compatibel zijn met de meeste gedragstests voor knaagdieren met een open arena bovenop het apparaat zonder veel aanpassingen. Knaagdiergedragstests kunnen worden uitgevoerd met een polyethyleenbuisbedrading bovenop de muiskop zonder enig obstakel, inclusief open veldtest, verhoogd plus / nul doolhof, step-down test, directe sociale interactie, ultrasone vocalisatie van volwassenen, geforceerde zwemtest, staartophanging, waterdoolhof, T- of Y-doolhof, nieuwe objectherkenning, marmerbegraven, zelfverzorgingstest, straaloversteek, pooltest en blootstelling aan stress door watervermijding. Tests met behulp van gesloten kamers of buizen moeten worden aangepast om de polyethyleenbuis vrij mee te laten bewegen met de muizen, zoals een sociale test met drie kamers, een licht-donkerbox, angstconditionering, sucrosevoorkeur, terughoudendheidsstress, schriktest en prepulse-pulsremming. We stellen voor om de lengte die nodig is voor de polyethyleenbuis op de ruimingsmuizen vooraf te testen en te schatten voordat ze worden getest.

Van microbiële metabolieten in de darm is aangetoond dat ze het gedrag van de gastheer beïnvloeden 8,46,47,48,49. Wetenschappers kunnen deze methode gebruiken om de temporele en ruimtelijke effecten van van darmmicrobiota afgeleide metabolieten op de hersenen en het gedrag bij muizen direct te onderzoeken. De microbiële metaboliet 4-ethylfenylsulfaat (4EPS) was bijvoorbeeld verhoogd in preklinische muismodellen van ASS en mensen met ASS 46,48,49. Injectie van 4EPS en kolonisatie van de bacteriën die 4EPS produceren, verhoogden angstachtig gedrag en verminderde oligodendrocytenrijping in de paraventriculaire kern van de thalamus (PVT) bij muizen46,48. Het zou fascinerend zijn om het directe effect van 4EPS op de PVT van muizen te evalueren tijdens angstachtige gedragstests. De absolute concentratie van 4EPS in de PVT is echter nog onbekend. Daarom kan een dosis-responstest van cruciaal belang zijn om de adequate niveaus van 4EPS in de PVT te bepalen. Een soortgelijk concept kan worden aangenomen voor de effecten van andere microbiële metabolieten op de hersenen en het gedrag.

Circuitgebaseerde neurotechnologieën, zoals optogenetica, chemogenetica en in vivo calciumbeeldvorming, zijn kritieke methoden waarmee wetenschappers het neurale circuit in de controle van gedrag kunnen begrijpen 50,51,52. De darm-hersenas is een gecompliceerde verbinding die cruciaal is voor de darmmicroben en hun metabolieten om het gedrag van de gastheer te bemiddelen. Een groeiend aantal studies heeft circuitgebaseerde neurotechnologieën gebruikt om de intrigerende kruisverwijzing tussen de darm en de hersenen te begrijpen 33,53,54,55,56,57,58,59. Dit protocol biedt een alternatieve manier om de op hersengebieden gebaseerde controle van gedrag veroorzaakt door darmmetabolieten te begrijpen. Door dit protocol te combineren met circuitgebaseerde neurotechnologieën kunnen onderzoekers inzicht krijgen in de circuitgebaseerde controle van gedrag en hersenactiviteit die wordt bijgedragen door darmmetabolieten.

Kortom, het concept van de darm-hersenas is goed geaccepteerd in de wetenschappelijke gemeenschap en bevordert de mogelijkheid van de betrokkenheid van darm-afgeleide metabolieten bij neuropsychiatrischeaandoeningen 11,13,60,61,62,63,64,65 . Om te onderzoeken hoe en welke van de darm afgeleide metabolieten de hersenen en het gedrag van muizen beïnvloeden, is een uitgebreide en fysiologische methodologie nodig in het veld. Dit artikel biedt een stapsgewijs protocol om darm-afgeleide metabolieten rechtstreeks in de hersenen af te leveren, vooral in een vrij bewegende muis. Dit ontwerp kan verder worden aangepast om de regiospecifieke effecten te onderzoeken door toediening van de van de darm afgeleide metabolieten in verschillende hersengebieden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten met betrekking tot dit werk.

Acknowledgments

We erkennen het personeel van het Laboratory Animal Center van de National Cheng Kung University (NCKU) voor de zorg voor de dieren. Dit werk werd ondersteund door de beurs van Prof. Kun-Yen Huang Education Fund van CHENG-HSING Medical Foundation aan C.-W.L.; de fondsen van het Ministerie van Wetenschap en Technologie (MOST) in Taiwan: (Undergraduate Research MOST 109-2813-C-006-095-B) aan T.-H.Y.; (MOST 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) naar W.-L.W.; en het Higher Education Sprout Project, Ministerie van Onderwijs aan het hoofdkantoor van University Advancement bij NCKU naar W.-L.W.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41 Pfizer n/a
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit ThermoFisher Scientific A-21206
Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal) Millipore AB153-I
Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μm, PES, Sterile NEST 121921LA01
CaCl2  Sigma-Aldrich C1016 ACSF: 0.14 g/L
Chlorhexidine scrub 2% Phoenix NDC 57319-611-09
Chlorhexidine solution Phoenix NDC 57319-599-09
Commercial dummy RWD Life Science 62004 Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm
Commercial guide cannul RWD Life Science 62104 Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm 
Commercial injector RWD Life Science 62204 Single_OD 0.21 mm-33G/ Mates with M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 ACSF: 0.61 g/L
Dental acrylic HYGENIC n/a
Fixing screws RWD Life Science 62521
Fluoroshield mounting medium with DAPI Abcam AB104139
Horse serum ThermoFisher Scientific 16050130
Insulin syringes BBraun XG-LBB-9151133S-1BX 1 mL
Isoflurane  Panion & BF biotech DG-4900-250D
KCl  Sigma-Aldrich P3911 ACSF: 0.19 g/L
Ketoprofen  Swiss Pharmaceutical n/a
Lidocaine  AstraZeneca n/a
Low melting point agarose Invitrogen 16520
MgCl2  Sigma-Aldrich M8266 ACSF: 0.19 g/L
Microscope cover slips MARIENFELD 101242
Microscope slides ThermoFisher Scientific 4951PLUS-001E
Mineral oil light, white NF Macron Fine Chemicals MA-6358-04
NaCl  Sigma-Aldrich S9888 ACSF: 7.46 g/L
NaH2PO4  Sigma-Aldrich S8282 ACSF: 0.18 g/L
NaHCO3  Sigma-Aldrich S5761 ACSF: 1.76 g/L
n-butyl cyanoacrylate adhesive (tissue adhesive glue) 3M 1469SB 3M Vetbond
Neural tracer  Santa Cruz SC-358883 FluoroGold
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Polyethylene tube RWD Life Science 62329 OD 1.50, I.D 0.50 mm and OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (eye) Ointment Dechra  12920060
Sodium acetate  Sigma-Aldrich S2889 SCFAs: 13.5 mM
Sodium azide  Sigma-Aldrich S2002
Sodium butyrate  Sigma-Aldrich B5887 SCFAs: 8 mM
Sodium propionate  Sigma-Aldrich P1880 SCFAs: 5.18 mM
Stainless guide cannula Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.63 mm; Local vendor
Stainless injector Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.3 mm; dummy is made from injector; local vendor
Superglue Krazy Glue KG94548R
Triton X-100 Merck 1.08603.1000
Equipment
Cannula holder RWD Life Science B485-68217
Ceiling camera FOSCAM R2
Digital stereotaxic instruments Stoelting 51730D
Dissecting microscope INNOVIEW SEM-HT/TW
Glass Bead Sterilizer RWD Life Science RS1501
Heating pad Stoelting 53800M
Leica microscope  Leica DM2500
Micro Dissecting Forceps ROBOZ RS-5136 Serrated, Slight Curve; Extra Delicate; 0.5mm Tip Width; 4" Length 
Micro Dissecting Scissors ROBOZ RS-5918 4.5" Angled Sharp
Microinjection controller World Precision Instruments (WPI) MICRO2T SMARTouch Controller
Microinjection syringe pump World Precision Instruments (WPI) UMP3T-1 UltraMicroPump3  
Microliter syringe Hamilton 80014 10 µL
Optical Fiber Cold Light with double Fiber Step LGY-150 Local vendor
Pet trimmer WAHL 09962-2018
Vaporiser for Isoflurane Step AS-01 Local vendor
Vibratome Leica VT1000S
Software
Animal behavior video tracking software Noldus EthoVision Version: 15.0.1416
Leica Application Suite X software Leica LASX Version: 3.7.2.22383

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lynch, J. B., Hsiao, E. Y. Microbiomes as sources of emergent host phenotypes. Science. 365 (6460), 1405-1409 (2019).
  2. Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome-gut-brain axis in health and disease. Gastroenterology Clinics of North America. 46 (1), 77-89 (2017).
  3. Sharon, G., Sampson, T. R., Geschwind, D. H., Mazmanian, S. K. The central nervous system and the gut microbiome. Cell. 167 (4), 915-932 (2016).
  4. Krautkramer, K. A., Fan, J., Backhed, F. Gut microbial metabolites as multi-kingdom intermediates. Nature Reviews: Microbiology. 19 (2), 77-94 (2021).
  5. Lavelle, A., Sokol, H. Gut microbiota-derived metabolites as key actors in inflammatory bowel disease. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. 17 (4), 223-237 (2020).
  6. Dalile, B., Van Oudenhove, L., Vervliet, B., Verbeke, K. The role of short-chain fatty acids in microbiota-gut-brain communication. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. 16 (8), 461-478 (2019).
  7. Morais, L. H., Schreiber, H. L. T., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews: Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
  8. Sharon, G., et al. Human gut microbiota from autism spectrum disorder promote behavioral symptoms in mice. Cell. 177 (6), 1600-1618 (2019).
  9. St Laurent, R., O'Brien, L. M., Ahmad, S. T. Sodium butyrate improves locomotor impairment and early mortality in a rotenone-induced Drosophila model of Parkinson's disease. Neuroscience. 246, 382-390 (2013).
  10. Govindarajan, N., Agis-Balboa, R. C., Walter, J., Sananbenesi, F., Fischer, A. Sodium butyrate improves memory function in an Alzheimer's disease mouse model when administered at an advanced stage of disease progression. Journal of Alzheimer's Disease. 26 (1), 187-197 (2011).
  11. Needham, B. D., et al. A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice. Nature. 602 (7898), 647-653 (2022).
  12. Silva, Y. P., Bernardi, A., Frozza, R. L. The role of short-chain fatty acids from gut microbiota in gut-brain communication. Frontiers in Endocrinology. 11, 25 (2020).
  13. Kratsman, N., Getselter, D., Elliott, E. Sodium butyrate attenuates social behavior deficits and modifies the transcription of inhibitory/excitatory genes in the frontal cortex of an autism model. Neuropharmacology. 102, 136-145 (2016).
  14. Kelly, J. R., et al. Transferring the blues: Depression-associated gut microbiota induces neurobehavioural changes in the rat. Journal of Psychiatric Research. 82, 109-118 (2016).
  15. Wang, L., et al. Elevated fecal short chain fatty acid and ammonia concentrations in children with autism spectrum disorder. Digestive Diseases and Sciences. 57 (8), 2096-2102 (2012).
  16. Adams, J. B., Johansen, L. J., Powell, L. D., Quig, D., Rubin, R. A. Gastrointestinal flora and gastrointestinal status in children with autism--comparisons to typical children and correlation with autism severity. BMC Gastroenterology. 11, 22 (2011).
  17. Skonieczna-Zydecka, K., et al. Faecal short chain fatty acids profile is changed in Polish depressive women. Nutrients. 10 (12), 1939 (2018).
  18. Szczesniak, O., Hestad, K. A., Hanssen, J. F., Rudi, K. Isovaleric acid in stool correlates with human depression. Nutritional Neuroscience. 19 (7), 279-283 (2016).
  19. Martin, A. M., Sun, E. W., Rogers, G. B., Keating, D. J. The influence of the gut microbiome on host metabolism through the regulation of gut hormone release. Frontiers in Physiology. 10, 428 (2019).
  20. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. Paxinos and Franklin's The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2013).
  21. York, J. M., Blevins, N. A., McNeil, L. K., Freund, G. G. Mouse short- and long-term locomotor activity analyzed by video tracking software. Journal of Visualized Experiments. (76), e50252 (2013).
  22. Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice. Journal of Visualized Experiments. (164), e61023 (2020).
  23. Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments. (168), e61941 (2021).
  24. Needham, B. D., Kaddurah-Daouk, R., Mazmanian, S. K. Gut microbial molecules in behavioural and neurodegenerative conditions. Nature Reviews: Neuroscience. 21 (12), 717-731 (2020).
  25. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880 (2008).
  26. Xiaoguang, W., et al. Establishment of a valuable mimic of Alzheimer's disease in rat animal model by intracerebroventricular injection of composited amyloid beta protein. Journal of Visualized Experiments. (137), e56157 (2018).
  27. Venniro, M., Shaham, Y. An operant social self-administration and choice model in rats. Nature Protocols. 15 (4), 1542-1559 (2020).
  28. Ucal, M., et al. Rat model of widespread cerebral cortical demyelination induced by an intracerebral injection of pro-inflammatory cytokines. Journal of Visualized Experiments. (175), e57879 (2021).
  29. Oberrauch, S., et al. Intraventricular drug delivery and sampling for pharmacokinetics and pharmacodynamics study. Journal of Visualized Experiments. (181), e63540 (2022).
  30. Shultz, S. R., et al. Intracerebroventricular injections of the enteric bacterial metabolic product propionic acid impair cognition and sensorimotor ability in the Long-Evans rat: further development of a rodent model of autism. Behavioural Brain Research. 200 (1), 33-41 (2009).
  31. Shultz, S. R., et al. Intracerebroventricular injection of propionic acid, an enteric metabolite implicated in autism, induces social abnormalities that do not differ between seizure-prone (FAST) and seizure-resistant (SLOW) rats. Behavioural Brain Research. 278, 542-548 (2015).
  32. Perry, R. J., et al. Acetate mediates a microbiome-brain-beta-cell axis to promote metabolic syndrome. Nature. 534 (7606), 213-217 (2016).
  33. Muller, P. A., et al. Microbiota modulate sympathetic neurons via a gut-brain circuit. Nature. 583 (7816), 441-446 (2020).
  34. Pardridge, W. M. CSF, blood-brain barrier, and brain drug delivery. Expert Opinion on Drug Delivery. 13 (7), 963-975 (2016).
  35. Wu, J. -T., et al. Oral short-chain fatty acids administration regulates innate anxiety in adult microbiome-depleted mice. Neuropharmacology. , (2022).
  36. Lee, J., et al. Gut microbiota-derived short-chain fatty acids promote poststroke recovery in aged mice. Circulation Research. 127 (4), 453-465 (2020).
  37. Chiu, C., et al. Temporal course of cerebrospinal fluid dynamics and amyloid accumulation in the aging rat brain from three to thirty months. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 3 (2012).
  38. Schuler, B., Rettich, A., Vogel, J., Gassmann, M., Arras, M. Optimized surgical techniques and postoperative care improve survival rates and permit accurate telemetric recording in exercising mice. BMC Veterinary Research. 5, 28 (2009).
  39. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
  40. Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
  41. de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
  42. Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).
  43. Wolter, J. M., et al. Cas9 gene therapy for Angelman syndrome traps Ube3a-ATS long non-coding RNA. Nature. 587 (7833), 281-284 (2020).
  44. Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses for combinatorial cell-subclass-specific labeling. Neuron. 109 (9), 1449-1464 (2021).
  45. Xie, M., et al. TREM2 interacts with TDP-43 and mediates microglial neuroprotection against TDP-43-related neurodegeneration. Nature Neuroscience. 25 (1), 26-38 (2022).
  46. Hsiao, E. Y., et al. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell. 155 (7), 1451-1463 (2013).
  47. Bermudez-Martin, P., et al. The microbial metabolite p-Cresol induces autistic-like behaviors in mice by remodeling the gut microbiota. Microbiome. 9 (1), 157 (2021).
  48. Needham, B. D., et al. A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice. Nature. 602 (7898), 647-653 (2022).
  49. Stewart Campbell, A., et al. Safety and target engagement of an oral small-molecule sequestrant in adolescents with autism spectrum disorder: an open-label phase 1b/2a trial. Nature Medicine. 28 (3), 528-534 (2022).
  50. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  51. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  52. Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
  53. Kaelberer, M. M., et al. A gut-brain neural circuit for nutrient sensory transduction. Science. 361 (6408), (2018).
  54. Needham, B. D., Tang, W., Wu, W. L. Searching for the gut microbial contributing factors to social behavior in rodent models of autism spectrum disorder. Developmental Neurobiology. 78 (5), 474-499 (2018).
  55. Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).
  56. Chu, C., et al. The microbiota regulate neuronal function and fear extinction learning. Nature. 574 (7779), 543-548 (2019).
  57. Wu, W. L., et al. Microbiota regulate social behaviour via stress response neurons in the brain. Nature. 595 (7867), 409-414 (2021).
  58. Buchanan, K. L., et al. The preference for sugar over sweetener depends on a gut sensor cell. Nature Neuroscience. 25 (2), 191-200 (2022).
  59. Han, W., et al. A neural circuit for gut-induced reward. Cell. 175 (3), 665-678 (2018).
  60. Yamawaki, Y., et al. Antidepressant-like effect of sodium butyrate (HDAC inhibitor) and its molecular mechanism of action in the rat hippocampus. World Journal of Biological Psychiatry. 13 (6), 458-467 (2012).
  61. Ho, L., et al. Protective roles of intestinal microbiota derived short chain fatty acids in Alzheimer's disease-type beta-amyloid neuropathological mechanisms. Expert Review of Neurotherapeutics. 18 (1), 83-90 (2018).
  62. Liu, J., et al. Anti-neuroinflammatory effect of short-chain fatty acid acetate against Alzheimer's disease via upregulating GPR41 and inhibiting ERK/JNK/NF-kappaB. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (27), 7152-7161 (2020).
  63. van de Wouw, M., et al. Short-chain fatty acids: microbial metabolites that alleviate stress-induced brain-gut axis alterations. Jounal of Physiology. 596 (20), 4923-4944 (2018).
  64. Olson, C. A., et al. The gut microbiota mediates the anti-seizure effects of the ketogenic diet. Cell. 173 (7), 1728-1741 (2018).
  65. Stewart Campbell, A., et al. Safety and target engagement of an oral small-molecule sequestrant in adolescents with autism spectrum disorder: an open-label phase 1b/2a trial. Nature Medicine. 28 (3), 528-534 (2022).

Tags

Neurowetenschappen Nummer 184
Intracerebroventriculaire toediening van van de darm afgeleide microbiële metabolieten in vrij bewegende muizen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liou, C. W., Yao, T. H., Wu, W. L.… More

Liou, C. W., Yao, T. H., Wu, W. L. Intracerebroventricular Delivery of Gut-Derived Microbial Metabolites in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (184), e63972, doi:10.3791/63972 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter