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Neuroscience

Entrega intracerebroventricular de metabolitos microbianos derivados del intestino en ratones que se mueven libremente

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63972
Automatic Translation
*1,2, *2, 1,2
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Physiology, College of Medicine, National Cheng Kung University
* These authors contributed equally

Summary

Los metabolitos microbianos derivados del intestino tienen efectos multifacéticos que conducen a un comportamiento complejo en los animales. Nuestro objetivo es proporcionar un método paso a paso para delinear los efectos de los metabolitos microbianos derivados del intestino en el cerebro a través de la administración intracerebroventricular a través de una cánula guía.

Abstract

El impacto de la microbiota intestinal y sus metabolitos en la fisiología y el comportamiento del huésped ha sido ampliamente investigado en esta década. Numerosos estudios han revelado que los metabolitos derivados de la microbiota intestinal modulan las funciones fisiológicas mediadas por el cerebro a través de intrincadas vías intestino-cerebro en el huésped. Los ácidos grasos de cadena corta (AGCC) son los principales metabolitos derivados de bacterias producidos durante la fermentación de la fibra dietética por el microbioma intestinal. Los AGCC secretados desde el intestino pueden actuar en múltiples sitios en la periferia, afectando las respuestas inmunes, endocrinas y neuronales debido a la vasta distribución de los receptores de AGCC. Por lo tanto, es difícil diferenciar los efectos centrales y periféricos de los AGCC a través de la administración oral e intraperitoneal de AGCC. Este documento presenta un método basado en video para interrogar el papel funcional de los AGCC en el cerebro a través de una cánula guía en ratones que se mueven libremente. La cantidad y el tipo de AGCC en el cerebro se pueden ajustar controlando el volumen y la velocidad de infusión. Este método puede proporcionar a los científicos una forma de apreciar el papel de los metabolitos derivados del intestino en el cerebro.

Introduction

El tracto gastrointestinal humano alberga diversos microorganismos que impactan al huésped 1,2,3. Estas bacterias intestinales pueden secretar metabolitos derivados del intestino durante la utilización de los componentes dietéticos consumidos por el huésped 4,5. Curiosamente, los metabolitos intestinales no metabolizados en la periferia pueden ser transportados a otros órganos a través de la circulación6. Cabe destacar que estos metabolitos secretados pueden servir como mediadores para el eje intestino-cerebro, definido como la comunicación bidireccional entre el sistema nervioso central y el intestino7. Estudios previos han demostrado que los metabolitos derivados del intestino pueden modular el comportamiento complejo y la emoción en animales 8,9,10,11.

Los ácidos grasos de cadena corta (AGCC) son los principales metabolitos producidos por la microbiota intestinal durante la fermentación de la fibra dietética y los carbohidratos no digeribles6. El acetato, el propionato y el butirato son los AGCC más abundantes en el intestino12. Los AGCC sirven como fuente de energía para las células en el tracto gastrointestinal. Los AGCC no metabolizados en el intestino pueden ser transportados al cerebro a través de la vena porta, modulando así el cerebro y el comportamiento 6,12. Estudios previos han sugerido que los AGCC podrían desempeñar un papel crítico en los trastornos neuropsiquiátricos 6,12. Por ejemplo, la inyección intraperitoneal de butirato en ratones BTBR T+ Itpr3tf/J (BTBR), un modelo animal de trastorno del espectro autista (TEA), rescató sus déficits sociales13. Las ratas tratadas con antibióticos que recibieron microbiota de sujetos depresivos mostraron un aumento en los comportamientos similares a la ansiedad y los AGCC fecales14. Clínicamente, se observaron alteraciones en los niveles de AGCC fecales en personas con TEA en comparación con los controles de desarrollo típico15,16. Las personas con depresión tienen niveles más bajos de AGCC fecales que los sujetos sanos17,18. Estos estudios sugirieron que los AGCC pueden alterar el comportamiento en animales y humanos a través de varias rutas.

Los metabolitos microbianos ejercen diversos efectos en múltiples sitios del cuerpo, afectando la fisiología y los comportamientos del huésped 4,19, incluyendo el tracto gastrointestinal, el nervio vago y el nervio simpático. Es difícil determinar el papel preciso de los metabolitos derivados del intestino en el cerebro cuando se administran los metabolitos a través de rutas periféricas. Este artículo presenta un protocolo basado en video para investigar los efectos de los metabolitos derivados del intestino en el cerebro de un ratón que se mueve libremente (Figura 1). Demostramos que los AGCC podían administrarse de forma aguda a través de la cánula guía durante las pruebas de comportamiento. El tipo, el volumen y la velocidad de infusión de los metabolitos pueden modificarse dependiendo del propósito. El sitio de canulización se puede ajustar para explorar el impacto de los metabolitos intestinales en una región específica del cerebro. Nuestro objetivo es proporcionar a los científicos un método para explorar el impacto potencial de los metabolitos microbianos derivados del intestino en el cerebro y el comportamiento.

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Protocol

Todos los protocolos experimentales y el cuidado de los animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Nacional Cheng Kung (NCKU).

1. Preparación para el animal de experimentación

  1. Obtenga ratones machos C57BL / 6JNarl de tipo salvaje de 6-8 semanas de edad de un proveedor.
  2. Aloje a los ratones en una jaula de ratón estándar con comida de ratón estándar y agua esterilizada ad libitum.
    NOTA: Las condiciones de alojamiento para el Centro de Animales de Laboratorio de NCKU son 22 ± 1 ° C de temperatura, 55% ± 10% de humedad y un ciclo de luz / oscuridad de 13 h / 11 h.

2. Cirugía estereotáxica

  1. Preparar y esterilizar el instrumento estereotáxico, los instrumentos quirúrgicos y los artículos relacionados.
    NOTA: Todos los artículos que entrarán en contacto directo con el sitio quirúrgico deben esterilizarse para evitar infecciones.
  2. Anestesiar al ratón colocándolo en la jaula de plexiglás con 1% -5% de isoflurano en oxígeno.
    NOTA: Observe de cerca al ratón para asegurarse de que la frecuencia respiratoria se mantenga en alrededor de una respiración por segundo.
  3. Saque al ratón de la cámara de anestesia. Afeite el sitio quirúrgico (cabeza de ratón) con un recortador de mascotas. Coloque el ratón en el marco estereotáxico fijando los incisivos del ratón en la barra incisiva del soporte del incisivo estereotáxico. Cubra la nariz con la máscara de nariz.
  4. Anestesiar al ratón con isoflurano al 1%-2,5% en oxígeno durante toda la cirugía estereotáxica. Evalúe la nocicepción del ratón a través del reflejo de pellizco del dedo del pie y asegure una frecuencia respiratoria constante antes de incidir el sitio quirúrgico.
  5. Coloque una almohadilla térmica (37.0 °C) debajo del mouse en el marco estereotáxico para mantener la temperatura corporal durante la cirugía. Alternativamente, mantenga la temperatura central con la ayuda de una sonda térmica rectal que conecte el calentador programado y la almohadilla térmica.
  6. Retire el pelaje recortado de la cabeza con cinta adhesiva. Inyecte al ratón con analgésico Ketoprofeno (5 mg/kg) por vía subcutánea para aliviar el dolor. Aplique ungüento para los ojos para evitar los ojos secos.
  7. Inserte la barra del oído puntiaguda en el canal auditivo para fijar la cabeza.
  8. Centra la cabeza ajustando la escala de la barra auditiva.
  9. Apriete la abrazadera nasal en el soporte del incisivo para evitar el movimiento vertical. Presione la cabeza suavemente para verificar que la cabeza esté fija y evitar que la cabeza se afloje durante la cirugía posterior.
  10. Desinfecte el cuero cabelludo con tres exfoliantes alternos de clorhexidina con un hisopo de algodón. Comience cada exfoliante desde el medio hacia el lado exterior (desde el área central más desinfectada hasta el área menos desinfectada).
    NOTA: El uso de exfoliantes desde el centro hasta el exterior podría ayudar a los científicos a minimizar la infección y la contaminación del pelaje. El área exterior está cerca de la región de la cabeza sin afeitar, que todavía tiene una gran cantidad de pelaje y no es fácil de desinfectar a fondo.
  11. Incise el cuero cabelludo de manera anterior/posterior (<1 cm) con una cuchilla quirúrgica. Abra la incisión y limpie el cráneo con un hisopo de algodón sostenido por pinzas de microdisección.
    NOTA: Las pinzas de microdisección, la cuchilla quirúrgica y los hisopos de algodón deben esterilizarse en autoclave antes de la cirugía. Durante el proceso quirúrgico, esterilizar todo el equipo quirúrgico con un esterilizador de perlas de vidrio (150 °C) durante al menos 5 s antes y después de cada animal. Prepare un vaso de precipitados esterilizado para sostener la cuchilla quirúrgica y los fórceps durante el proceso quirúrgico y entre animales.
  12. Identifica el Bregma y la Lambda en el cráneo. Utilice el Bregma como referencia para localizar la región de interés.
    1. Opcional: Monte el taladro estereotáxico en el soporte del taladro estereotáxico y utilice la punta del taladro para apuntar Bregma como referencia. Esterilizar el taladro estereotáxico con el esterilizador de perlas de vidrio (150 °C) durante al menos 5 s.
  13. Calibrar y alinear el plano horizontal del cráneo en los planos izquierdo/derecho y anterior/posterior mediante Bregma/Lambda.
    NOTA: Si no está en un plano horizontal correcto, vuelva a montar el ratón en el instrumento estereotáxico.

3. Implantación de cánula de guía personalizada comercial

  1. Identificar y etiquetar la posición del ventrículo lateral derecho, basándose en las coordenadas estereotáxicas: Distancia a Bregma, anterior/posterior (A/P): 0,26 mm, medial/lateral (M/L): -1,0 mm, dorsal/ventral (D/V): -2,0 mm20.
    NOTA: Las coordenadas se pueden modificar en función de la región de interés. Las coordenadas para el ventrículo lateral se basaron en ratones adultos C57BL / 6J con un rango de peso de 26-30 g. Si se utilizan ratones más jóvenes, consulte la discusión.
  2. Perfore un agujero (diámetro = 1,5 mm) a través del cráneo en el sitio marcado utilizando un taladro estereotáxico para la implantación de una cánula de guía comercial.
  3. Perfore de dos a cuatro agujeros más (diámetro = 1,5 mm) en el cráneo utilizando un taladro estereotáxico para el montaje de tornillos de acero inoxidable.
    NOTA: Esterilizar el taladro estereotáxico utilizando un esterilizador de perlas de vidrio (150 °C) durante al menos 5 s antes y después de cada animal.
  4. Limpie los restos de hueso y deje de sangrar con un hisopo de algodón.
  5. Limpie el cráneo con lidocaína (1 mg/kg) usando un hisopo de algodón para obtener anestésicos locales, antipruriginosos y efectos analgésicos. Si el sangrado no se detiene después de la perforación, coloque suavemente un hisopo de algodón en el orificio para la hemostasia.
  6. Monte de dos a cuatro tornillos inoxidables en los orificios para proporcionar anclajes para acrílico dental.
  7. Coloque la cánula de guía comercial en el soporte de la cánula estereotáxica y desinfecte con el esterilizador de perlas de vidrio (150 °C).
    NOTA: La cánula de la guía comercial, el maniquí comercial y el inyector comercial (Figura 2A) se personalizaron con las especificaciones que se muestran en la Tabla de materiales.
  8. Mueva el soporte de la cánula estereotáxica al orificio perforado para el ventrículo lateral e inserte lentamente la cánula de guía comercial en el orificio hasta la profundidad deseada (2,5 mm).
    NOTA: La coordenada dorsal/ventral se puede definir estableciendo la punta de la cánula guía comercial como referencia cuando la punta apenas se inserta en el agujero.
  9. Aplique 10 μL de adhesivo de cianoacrilato de n-butilo (pegamento adhesivo tisular) para fijar la cánula de guía comercial en el orificio perforado y espere 3-4 min. Suelte suavemente la cánula de guía comercial del soporte de la cánula estereotáxica y aleje el soporte.
  10. Aplique el acrílico dental al cuero cabelludo inciso para fijar la cánula de la guía comercial y espere al menos 5 minutos. Implante el maniquí comercial en la cánula de guía comercial para evitar que la cánula se obstruya por sangre o fluido corporal (Figura 2B).
  11. Suelte la barra auditiva del canal auditivo y retire el ratón del marco estereotáxico.
  12. Coloque el ratón en una jaula nueva con una almohadilla térmica debajo para recuperarse de la anestesia y observe continuamente hasta que el ratón se despierte por completo.
    NOTA: No deje al animal desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Un animal que se ha sometido a cirugía no debe regresar a la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.
  13. Devolver el ratón a una sola vivienda o a una vivienda colectiva, dependiendo del protocolo institucional IACUC y del diseño experimental. Para el alojamiento grupal, asegúrese de que menos ratones estén alojados en una jaula para minimizar las lesiones no deseadas o el desprendimiento de la cánula.
  14. Administre ibuprofeno (0.2 mg/ml) en el agua potable durante al menos 3 días para el cuidado postoperatorio, y controle dos veces al día para detectar signos de dolor y angustia durante al menos 3 días.
    1. Durante el cuidado postoperatorio, aplique ungüento de roxitromicina alrededor de la piel para prevenir la inflamación y la infección en los ratones.
    2. Mantenga el monitoreo del estado del animal y administre una inyección intraperitoneal oportuna de glucosa al 5% y / o cloruro de sodio al 0.9% para proporcionar suficiente energía.
    3. Si el estado de dolor, angustia o infección se deteriora constantemente, eutanasia al ratón por inhalación deCO2 .
  15. Espere 1 semana después de la operación para que el ratón esté listo para la administración intracerebroventricular de AGCC y las pruebas de comportamiento.

4. Preparación de los CCPA

  1. Disuelva el acetato de sodio, el butirato de sodio y el propionato de sodio en el líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) (consulte la Tabla de materiales).
  2. Asegúrese de que los productos químicos estén completamente disueltos, luego ajuste el pH a 7.4 y filtre la mezcla de AGCC a través de un filtro de 0.22 μm para la esterilización.

5. Configurar el sistema de infusión para la administración intracerebroventricular de AGCC durante las pruebas de comportamiento

  1. Monte una cámara de techo para grabar el comportamiento. Conecte la cámara con un ordenador para controlar el software de grabación de vídeo (figura 3).
  2. Llene una jeringa de 10 μL con agua destilada.
    NOTA: Evite las burbujas de aire en la jeringa de microlitros.
  3. Conecte una bomba de microinyección con el controlador de microinyección.
  4. Monte la jeringa de microlitro en la bomba de microinyección. Para instalar la jeringa, pulse el botón para aflojar la pinza e instale la jeringa en la posición correspondiente. Cierre la abrazadera y apriete el tornillo de retención del émbolo de la bomba de microinyección (Figura 4A).
  5. Inserte el inyector comercial en el tubo de polietileno (Figura 2A).
  6. Cuelgue el tubo de polietileno en la cámara del techo sobre la arena de prueba.
  7. Llene el tubo de polietileno con agua destilada usando una jeringa de insulina. Conecte la jeringa de microlitro al tubo de polietileno colgante.
    NOTA: Asegúrese de que el tubo de polietileno sea lo suficientemente largo como para permitir que el ratón se mueva libremente por el campo de pruebas.

6. Configuración del sistema del controlador de microinyección

  1. Encienda el controlador de microinyección y pulse Mostrar todos los canales para acceder a la pantalla de comandos (Figura 4C). Pulse Configuración y establezca Objetivo de volumen en 9.800 nL con Velocidad de entrega en 100 nL/s. Infunda 9.800 nL de agua destilada del tubo de polietileno conectado a la jeringa de microlitro (pulse Dirección para cambiar al modo Infundir y pulse RUN) (consulte los cuadrados rojos en la pantalla Comando de la figura 4C).
  2. Pulse Configuración y establezca Objetivo de volumen en 3.000 nL con Velocidad de entrega en 100 nL/s. Extraiga 3.000 nL de aceite mineral (pulse Dirección para cambiar al modo Retirar y pulse EJECUTAR) (consulte los cuadrados rojos en la pantalla Comando de la figura 4C).
    NOTA: Se debe observar una clara separación de la fase aceite-agua en el tubo de polietileno.
  3. Desmonte el tubo de polietileno de la aguja de la jeringa de microlitros. Escupa 3.000 nL de agua destilada de la aguja de la jeringa de microlitros (presione la dirección para cambiar al modo de infusión y presione RUN).
  4. Vuelva a insertar la jeringa de microlitro en el tubo de polietileno. Pulse Configuración y establezca Objetivo de volumen en 9.500 nL con Velocidad de entrega en 100 nL/s. Extraiga 9.500 nL de SCFA (pulse Dirección para cambiar al modo de retirada y pulse EJECUTAR). Etiquete la fase aceite-SCFA para validar si los SCFA se infunden con éxito.
  5. Pulse Configuración y establezca el objetivo de volumen deseado con velocidad de entrega en 7 nL/s. Pulse Dirección para cambiar al modo Infundir (consulte los cuadrados rojos en la pantalla Comando de la Figura 4C).
    NOTA: Determine el volumen en función del tiempo de infusión. Por ejemplo, si el tiempo de perfusión es de 3 min para la velocidad de entrega de 7 nL/s, volumen objetivo = 1.260 nL.
  6. Presione RUN para infundir la jeringa de microlitros hacia adelante hasta que el líquido salga por el extremo frontal del inyector comercial antes de insertar el inyector en la cánula para la inyección de SCFA.

7. Infusión de AGCC en ventrículo lateral a través de la cánula guía comercial en ratón que se mueve libremente

  1. Anestesiar al ratón colocándolo en la jaula de plexiglás con 1% -5% de isoflurano en oxígeno.
    NOTA: Observe de cerca al ratón para asegurarse de que la frecuencia respiratoria se mantenga en alrededor de una respiración por segundo.
  2. Frote el ratón e inserte el inyector comercial en la cánula de guía comercial (Figura 4B).
    NOTA: Si la cánula de la guía comercial está tapada por sangre o fluido corporal, destapa suavemente con pinzas.
  3. Permita que el ratón se recupere de la anestesia durante 15 minutos en una jaula antes de las pruebas de comportamiento.
  4. Para la prueba básica de locomoción, coloque al ratón en una jaula novedosa y déjelo explorar libremente durante 35 minutos. Infundir SCFA utilizando una velocidad de entrega de 7 nL/s para un volumen objetivo de 2.100 nL en los primeros 5 minutos (presione la dirección al modo de infusión y presione RUN).
    NOTA: La locomoción en la nueva jaula se puede analizar utilizando el software de seguimiento de video del comportamiento animal21,22.
  5. Anestesiar el ratón (repitiendo el paso 7.1) y retirar el inyector comercial de la cánula de guía comercial.
    NOTA: El ratón puede ser inyectado repetidamente con diferentes controles/metabolitos después de dar el tiempo adecuado para lavar la inyección anterior. Mientras la cánula esté fijada en la cabeza del ratón, el ratón se puede probar repetidamente con diferentes metabolitos.

8. Restauración del sistema de microinyección

  1. Desmonte el tubo de polietileno de la jeringa de microlitros.
  2. Inyecte aire en el tubo usando la jeringa de insulina para desechar el agua destilada en el tubo de polietileno. Vacíe la jeringa de microlitros.
  3. Pulse Reset Pos (Restablecer punto de partida) en la pantalla Configuration (Configuración para abrir la pantalla Syringe Stop Definition) (Figura 4C).
  4. Pulse Retirar hasta que se produzca un pitido para restablecer la bomba de microinyección a la posición completamente retirada (Figura 4C).
  5. Vuelva a la pantalla Comando y apague el controlador de microinyección si hay un signo ** END REACH** en esta pantalla (Figura 4C).

9. Opcional: Validación de la inyección intracerebroventricular por trazador neural

  1. Infundir 2.100 nL del trazador neural con la velocidad de administración de 7 nL/s para verificar el sitio de infusión.
    NOTA: Deje el inyector en la cánula de guía durante 5 minutos para evitar el reflujo.
  2. Anestesiar al ratón mediante una sobredosis de isoflurano (5%) 30 min después de la infusión del marcador neural.
  3. Compruebe la frecuencia respiratoria y el reflejo de pellizco de la cola / pata en el ratón anestesiado.
    NOTA: Los ratones no deben responder antes del siguiente paso.
  4. Haga una incisión de 4 a 5 cm a través de la piel, el músculo y la pared abdominal debajo de la caja torácica.
  5. Aleje ligeramente el hígado del diafragma con cuidado.
  6. Incide el diafragma para exponer el corazón del ratón.
  7. Perfundir el ratón a través del corazón con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y paraformaldehído helado al 4% en PBS.
  8. Decapitar al ratón y diseccionar el cerebro cuidadosamente con pinzas de microdisección y tijeras de microdisección para extraer todo el cerebro23. Coloque las muestras de cerebro en paraformaldehído al 4% helado en PBS durante 3-4 días y lávelas 3 x 5 min con PBS.
  9. Corte el cerebro en dos partes en el soporte de corte de cerebro de ratón en el octavo corte del soporte de corte de cerebro de ratón (1 mm / sección) de la dirección anterior a posterior. Coloque el cerebro en el molde de incrustación e incruste las muestras de cerebro en agarosa de bajo punto de fusión (4% en PBS).
  10. Pegue el cerebro incrustado en agarosa en el escenario del vibratomo usando superglue. Secciona el cerebro coronalmente en cortes de cerebro de 50 μm usando el vibratomo.
  11. Incubar las rodajas de cerebro en el anticuerpo dirigido al trazador neural diluido en tampón de bloqueo (dilución 1:1.000) durante la noche a temperatura ambiente.
    NOTA: El tampón de bloqueo contenía 10% de suero de caballo, 0.1% de Triton X-100 y 0.02% de azida de sodio.
  12. Lave las rodajas 3 x 5 min con PBST (PBS con tritón X-100 al 0,1%).
  13. Incubar las rodajas de cerebro en anticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente diluido en tampón de bloqueo (dilución 1:500) durante 2 h a temperatura ambiente.
  14. Lave las rodajas 3 x 5 min con PBS.
  15. Monte las rebanadas de cerebro en el portaobjetos con un medio de montaje que contenga 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).
  16. Cubra el portaobjetos con un cubreobjetos de microscopio.
  17. Aplique esmalte de uñas en el borde deslizante para evitar fugas del medio de montaje.
  18. Después de la incubación nocturna a temperatura ambiente, protegida de la luz, obtenga una imagen de la señal de fluorescencia en el sitio de infusión con un microscopio de fluorescencia.

10. Opcional: Infusión de metabolitos a través de una cánula guía de acero inoxidable personalizada en el ventrículo lateral en ratones

  1. Siga las secciones del protocolo 1-8 y reemplace la cánula de guía comercial con una cánula de guía de acero inoxidable para infundir productos químicos a través de un inyector de acero inoxidable en el ratón.
    NOTA: Los pros y los contras de las diferentes cánulas comerciales y de acero inoxidable se elaboran en la sección de discusión.
  2. Realice el protocolo quirúrgico de la misma manera que se describe en las secciones 2 y 3 del protocolo, excepto que recuerde reemplazar la cánula guía comercial por una cánula guía de acero inoxidable (Figura 5B).
    NOTA: La cánula guía de acero inoxidable, el maniquí de acero inoxidable y el inyector de acero inoxidable (Figura 5A) se personalizaron con las especificaciones que se muestran en la Tabla de materiales. Inserte la cánula guía de acero inoxidable personalizada en el orificio hasta la profundidad deseada (2,0 mm).
  3. Infundir SCFA a través de la cánula de guía de acero inoxidable utilizando el sistema de microinyección que consiste en el controlador de microinyección y la bomba de microinyección (Figura 4B) (igual que las secciones 4-7 del protocolo). Para el maniquí de acero inoxidable de la cánula de guía de acero inoxidable, doble un lado del inyector de acero inoxidable suavemente hasta que la punta del otro lado sea 1 mm más larga que la cánula de guía de acero inoxidable.
  4. Infundir 2.100 nL del trazador neural a través de la cánula guía de acero inoxidable en el ventrículo lateral en ratones (igual que la sección 9 del protocolo).
  5. Recoja la muestra durante 30 minutos después de la infusión del marcador neural (igual que la sección 9 del protocolo).
  6. Realice la adquisición de imágenes en los cortes de cerebro infundidos con trazador neural (igual que la sección 9 del protocolo).

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Representative Results

El ratón fue infundido con AGCC 1 semana después de la recuperación de la implantación de la cánula guía para evaluar la actividad locomotora en una nueva jaula. El ratón se colocó en una jaula novedosa y se infundió con 2.100 nL de AGCC o ACSF en los primeros 5 minutos (tasa de entrega de 7 nL / s) en el cerebro a través de la cánula de guía comercial implantada en el ventrículo lateral del cerebro. La actividad locomotora en una nueva jaula se registró durante 30 minutos adicionales después de la infusión. No se observaron diferencias en la actividad locomotora en la nueva jaula entre la infusión de AGCC y ACSF (Figura 6) (n = 2 ratones por grupo; los datos se muestran como media ± s.e.m. y se analizan mediante ANOVA bidireccional).

Para validar la precisión de la implantación de la cánula guía en las regiones del cerebro, se infundió un trazador neural fluorescente en los ratones a través de la cánula guía al mismo volumen y velocidad de entrega que los AGCC (2.100 nL en 5 min; 7 nL / s). Los cerebros se recolectaron para histología 30 minutos después. El tinte fluorescente se detectó en el ventrículo lateral y las regiones circundantes del cerebro del ratón (Figura 7A). Se implantó una cánula guía de acero inoxidable en el ventrículo lateral del cerebro para la infusión de trazador neural en las mismas condiciones. Similar a la cánula guía, los resultados mostraron que se detectó una señal de colorante fluorescente en el ventrículo lateral y las regiones circundantes del cerebro del ratón incluso después de la infusión a través de la cánula guía de acero inoxidable (Figura 7B).

Figure 1
Figura 1: El procedimiento para la infusión intracerebroventricular en ratones en movimiento libre. El diagrama de flujo para la administración intracerebroventricular de metabolitos microbianos derivados del intestino en ratones que se mueven libremente. Abreviatura: SCFAs = ácidos grasos de cadena corta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Implantación de la cánula guía comercial en ratones. (A) La imagen representativa de la cánula guía comercial, el maniquí y el inyector. (B) La imagen representativa de la cánula guía comercial y el maniquí implantado en el cerebro de ratones por fijación con acrílico dental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: El equipo de infusión intracerebroventricular para pruebas de comportamiento. El diagrama del sistema de microinyección, el sistema de grabación de video y el aparato de comportamiento. Abreviatura: SCFAs = ácidos grasos de cadena corta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: El sistema de microinyección. (A) La instalación de la jeringa de microlitro utilizando una bomba de microinyección. (B) La inserción del inyector comercial conectado con tubo de polietileno en la cánula de guía comercial (C) La pantalla táctil del controlador de microinyección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Implantación de cánula guía de acero inoxidable en el ventrículo lateral de ratones. (A) La imagen representativa de la cánula guía de acero inoxidable, maniquí e inyector. (B) La imagen representativa de la cánula guía de acero inoxidable y el maniquí implantado en el cerebro de ratones mediante fijación con acrílico dental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Actividad locomotora de ratones infundidos con AGCC en la nueva jaula. (A) Esquema cronológico de la implantación de cánulas guía y la locomoción de la nueva jaula tras la infusión de ACSF o SCFAs. (B) Esquema de línea de tiempo para la colocación de la jeringa de infusión, la ventana de infusión (sombra azul) y la nueva prueba de comportamiento de la jaula. (C) Distancia total movida por ratones infundidos con ACSF y SCFA en una jaula novedosa durante 35 minutos. La ventana de tiempo para la perfusión se indica con sombra azul (0-5 min). (D) Imágenes representativas de trayectorias para ratones infundidos con ACSF y SCFA en una jaula nueva. n = 2 ratones por grupo. Los datos mostrados como media ± s.e.m. y analizados por ANOVA bidireccional. NS: No significativo. Abreviaturas: AGCC = ácidos grasos de cadena corta; ACSF = líquido cefalorraquídeo artificial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: La histología del colorante fluorescente con infusión cerebral. Infusión a través de la cánula guía personalizada (A) comercial y (B) de acero inoxidable implantada en el ventrículo lateral (VI) de ratones. Barras de escala = 1 mm (izquierda) y 500 μm (derecha). Azul: tinción DAPI; Verde: Etiquetado de oro antifluorescente. Abreviaturas: VI = ventrículo lateral; CA = comisariado anterior; CPu = putamen caudado; LS = tabique lateral; SM = tabique medial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los metabolitos derivados del intestino se han asociado con enfermedades mediadas por el cerebro sin mucho mecanismo preciso, en parte debido a sus múltiples sitios de unión en el cuerpo 6,12,24. Informes anteriores indicaron que los AGCC podrían servir como ligandos para receptores acoplados a proteínas G, reguladores epigenéticos y fuentes de producción de energía en múltiples sitios del cuerpo 6,12. Para evitar los factores de confusión que se originan en la periferia (como las células inmunes, las hormonas y el sistema nervioso autónomo), se desarrolló un método mediante la adopción de la inyección intracerebroventricular de AGCC en el cerebro a través de una cánula guía en ratones que se mueven libremente. Además, los sitios de canulización e infusión se validaron para explorar las áreas cerebrales potencialmente afectadas por los AGCC. En conjunto, este documento presenta un método preciso, meticuloso y validado para administrar metabolitos derivados del intestino en el cerebro para la investigación del eje intestino-cerebro.

La administración intracerebroventricular de fármacos y productos químicos a través de una cánula guía en animales ha sido bien establecida 25,26,27,28,29 para diversas pruebas de drogas29, modelado de enfermedades26,28 y diseño específico de pruebas de comportamiento 27 . Lo más importante es que varios estudios han entregado metabolitos microbianos intestinales en el cerebro a través de la inyección intracerebroventricular y han probado sus efectos sobre las funciones fisiológicas30,31,32,33. Este protocolo proporciona un atributo adicional en la administración de metabolitos intestinales de manera aguda al cerebro en tiempo real, lo que permitiría a los científicos comprender los efectos dinámicos de los metabolitos intestinales en el cerebro y el comportamiento.

La velocidad de administración para la infusión de metabolitos es crucial para simular el flujo de líquido cefalorraquídeo en los ventrículos cerebrales. Un estudio indicó que la tasa de producción de líquido cefalorraquídeo en ratones es de 5,3 nL/s34. Para controlar el caudal de los AGCC de forma natural en ratones que se mueven libremente, hemos evaluado el caudal de este sistema de microinyección (Figura 3 y Figura 4). Los AGCC podían infundirse suavemente sin mucha resistencia, incluso cuando se utilizaba el tubo de polietileno de 350 cm de largo para infundir AGCC en un ratón que se movía libremente. Con el llenado de agua destilada y aceite mineral para disminuir la resistencia al líquido en el tubo de polietileno (consulte las secciones 5 y 6 del protocolo), el caudal podría reducirse a 7 nL / s desde 100 nL / s. La infusión de los AGCC o ACSF a un caudal de 7 nL/s no dio lugar a ningún comportamiento anormal de los ratones.

La cantidad y la dosis de metabolitos derivados del intestino para la inyección intracerebroventricular son críticas. Sigue siendo difícil analizar exhaustivamente los niveles absolutos de metabolitos derivados del intestino en varias regiones del cerebro. Por ejemplo, muy pocos estudios han demostrado la detección de los niveles fisiológicos de AGCC en el cerebro35,36. Un estudio mostró que las concentraciones de acetato, propionato y butirato en los cerebros de ratones son aproximadamente 1640.6-3281.2 μg / g, 288.18-384.24 μg / g y 44.036-66.054 μg / g, respectivamente36. Sin embargo, otro estudio reportó niveles más bajos de AGCC en el cerebro (acetato 128,1 μg/g, propionato 0,3883 μg/g y butirato 0,1640 μg/g)35. Las cantidades de acetato infundido, propionato y butirato adoptadas en este protocolo fueron 5,81385 μg/g, 4,62378 μg/g y 2,6124 μg/g, respectivamente. Por lo tanto, las concentraciones de los AGCC infundidos en este protocolo son comparables a las concentraciones fisiológicas. Sin embargo, no fue posible excluir la posibilidad de que las concentraciones de AGCC puedan variar en distintas regiones cerebrales. Varios estudios mostraron que la administración de propionato en el ventrículo cerebral por inyección intracerebroventricular (4 μL de ácido propiónico 0,26 M en 1 min; aproximadamente 249,756 μg/g) deterioró el comportamiento social y la cognición en ratas30,31. La dosis y la tasa de flujo del propionato infundido fueron relativamente altas, como se informó en ratones35 y ratas37. Por lo tanto, los avances en el análisis de metabolitos y el perfil metabolómico en el cerebro y la periferia ayudarán a los investigadores a comprender mejor los cambios dinámicos espaciales y temporales en los metabolitos derivados del intestino.

En este protocolo se han presentado dos tipos de cánulas guía para inyección intracerebroventricular en ratones: una cánula guía comercial y una cánula guía de acero inoxidable. La cánula y el maniquí de la guía comercial están bien diseñados para la implantación. No es fácil para los ratones quitar el maniquí personalizado debido a la tapa. Por el contrario, el maniquí de acero inoxidable puede ser fácilmente retirado de la cánula guía de acero inoxidable por ratones durante la recuperación de 1 semana, causando la coagulación de la sangre / líquido cefalorraquídeo en la cánula. Sin embargo, la cánula personalizada comercial es de 64 mg, y el maniquí para esta cánula es de 86 mg. Por lo tanto, el peso total de la cánula y el maniquí personalizados comerciales es de 150 mg. En contraste, la cánula guía de acero inoxidable personalizada es de 18.3 mg, y el maniquí para esta cánula es de 8.5 mg. Por lo tanto, el peso total de la cánula guía de acero inoxidable personalizada es de 26,8 mg. Teóricamente, el bajo peso del conjunto de cánulas guía de acero inoxidable minimizaría el impacto de la cánula en el movimiento del animal y el cerebro. Además, el costo de la cánula de guía comercial es más alto que la cánula de guía de acero inoxidable y el inyector. Por lo tanto, recomendamos la cánula guía de acero inoxidable para investigadores sin experiencia que realizan cirugía estereotáxica en ratones.

La cánula implantada puede ser obstruida por la sangre y el líquido cefalorraquídeo debido al daño cerebral. Esta obstrucción de la cánula podría ocurrir con mayor frecuencia en la cánula de acero inoxidable sobre la cánula comercial. El maniquí se puede roscar para apretar la cánula comercial de forma segura (Figura 2A), pero no para la cánula de acero inoxidable (Figura 5A). Por lo tanto, asegurar la fijación del maniquí durante el período de recuperación minimizaría la obstrucción de la cánula. Se debe insertar un nuevo maniquí si se produce un desprendimiento durante la recuperación de 1 semana. Además, se debe insertar varias veces un inyector esterilizado desechable para destapar la cánula antes de montar el inyector que conecta el tubo de polietileno.

La elección de los fármacos anestésicos influirá en gran medida en la cirugía y las pruebas de comportamiento. Aquí, se eligió el anestésico inhalatorio isoflurano sobre los anestésicos inyectados porque el tiempo de recuperación es más corto y es menos dañino para los animales por razones humanitarias. Sin embargo, la dosis para la inhalación de isoflurano puede variar dependiendo del estado del ratón y el peso corporal. Por lo tanto, el estado de la anestesia debe observarse de cerca durante todo el procedimiento quirúrgico, y el vaporizador de isoflurano debe ajustarse en consecuencia. La frecuencia respiratoria optimizada debe ser de una respiración por segundo durante todos los procedimientos. Además, el recipiente del filtro de gas lleno de carbón activado debe conectarse a la cámara de anestesia y la máscara de nariz para anular la contaminación por isoflurano y gases de escape en el área de operación. Esto protegerá al cirujano del efecto tóxico del isoflurano.

Los resultados representativos demostraron que la infusión de AGCC no produjo ningún efecto dramático sobre la locomoción en una jaula nueva. Esto podría deberse a que se utilizó un pequeño número de animales para obtener este resultado (Figura 6). Además, solo infundimos los SCFA durante los primeros 5 minutos de la nueva prueba de comportamiento de locomoción en jaula, pero no toda la prueba porque la mayor parte del comportamiento se probó en un corto período de tiempo (5-15 min). La ventana de tiempo para los metabolitos microbianos derivados del intestino debe ajustarse en función de la hipótesis de los investigadores.

El tiempo para la anestesia y la recuperación de la conciencia de la anestesia son críticos para las pruebas de comportamiento. Aquí, los ratones fueron anestesiados brevemente para la implantación del inyector y la infusión de AGCC, y las pruebas de comportamiento se realizaron después de 15 minutos. El tiempo de recuperación después del cese de la anestesia por inhalación fue determinado con base en un estudio previo38. Un estudio piloto aseguró que los ratones estuvieran activos, se movieran libremente y no se sintieran incómodos 15 minutos después de la anestesia. Introdujimos el paso de anestesia para el montaje del inyector por las siguientes razones. Primero, el medidor del inyector es 33 G; Es muy difícil insertar un inyector tan delicado en la cánula cuando el animal se está moviendo activamente. Además, el desaliñamiento de ratones conscientes puede producir estrés en los ratones39, confundiendo los resultados de comportamiento. En segundo lugar, la cánula se obstruye ocasionalmente debido a la coagulación de la sangre / líquido cefalorraquídeo. Destapar la cánula suavemente antes de montar el inyector sería ideal para la infusión de metabolitos. Sobre la base de estas dos razones, se recomienda anestesiar brevemente a los ratones para montar el inyector. Los investigadores pueden esperar más tiempo (30 minutos) si hay alguna preocupación sobre la recuperación del animal de la anestesia por inhalación. Además, se puede configurar un conjunto separado de inyector de infusión que conecta el tubo de polietileno para acelerar los experimentos.

Este protocolo tiene varias limitaciones. Primero, la implantación de la cánula guía y el tubo de polietileno de conexión limitaría el área quirúrgica para implantar fibras ópticas para fotometría optogenética y de fibra en la misma coordenada, el área circundante o incluso el mismo hemisferio del cerebro. Será aún más difícil implantar la lente para microendoscopia en la cabeza del ratón junto con la cánula guía implantada. En segundo lugar, la implantación de la cánula guía puede generar un peso significativo en la cabeza del ratón. El peso total de un juego de cánula personalizado es de 26.8-150 mg, un tornillo es ~ 48 mg y el acrílico dental montado es de 450-500 mg. Todo el conjunto de instalación puede restringir los movimientos de los ratones. Sin embargo, estudios recientes han implantado un miniscopio para monitorear las señales de calcio en ratones que se mueven libremente40,41. El peso del miniscopio varía de 1,6 g a 4,5 g, excluyendo los tornillos y el acrílico dental. Por lo tanto, el peso de la cánula guía puede considerarse relativamente aceptable para las pruebas de comportamiento del ratón. En tercer lugar, el tubo de polietileno de conexión para la infusión mide ~ 350 cm de largo, lo que puede limitar el movimiento de los ratones durante la prueba de comportamiento. Para abordar esta preocupación, es posible que se requiera una prueba previa de locomoción en una prueba de campo abierto para evaluar el impacto del tubo de polietileno de conexión en la función del motor del ratón. En cuarto lugar, el acrílico dental puede producir un efecto neurotóxico en los ratones. Sin embargo, es necesario conectar la cánula de guía a la cabeza del ratón durante el período de prueba. Para disminuir el posible efecto neurotóxico del acrílico dental en ratones, los operadores deben estar familiarizados con el uso del acrílico dental. El acrílico dental se aplica mejor cuando la mezcla de acrílico dental (polvo y líquido) se solidifica ligeramente para reducir la penetración del líquido de acrílico dental en el cerebro.

La microbiota y sus metabolitos están asociados con la función conductual en distintos hitos del desarrollo. Aunque este protocolo se basa en ratones adultos C57BL/6 con pesos corporales que van desde 26 g a 30 g, también se puede aplicar a ratones de diferentes edades y tamaños. Estudios previos han adoptado la cirugía estereotáxica en ratones jóvenes42,43,44,45. Sin embargo, las coordenadas de las regiones del cerebro pueden variar dependiendo del tamaño y la edad de los ratones. Recomendamos hacer referencia al atlas correspondiente a la edad o al recurso en línea (http://mouse.brain-map.org/static/atlas). Además, las coordenadas deben validarse inyectando azul de tripano o colorante fluorescente en los ratones jóvenes de sacrificio, optimizando así el método antes de ejecutarlo en los ratones experimentales. Las cánulas de guía utilizadas en este protocolo están todas personalizadas y se pueden ajustar después de validar las coordenadas para diferentes tamaños de ratones.

Este protocolo será compatible con la mayoría de las pruebas de comportamiento de roedores con una arena abierta en la parte superior del aparato sin mucha modificación. Las pruebas de comportamiento de roedores se pueden realizar con un cableado de tubo de polietileno en la parte superior de la cabeza del ratón sin ningún obstáculo, incluida la prueba de campo abierto, el laberinto elevado más / cero, la prueba de reducción, la interacción social directa, la vocalización ultrasónica del adulto, la prueba de natación forzada, la suspensión de la cola, el laberinto de agua, el laberinto en T o Y, el reconocimiento de objetos novedosos, el entierro de mármol, la prueba de autoaseo, el cruce de vigas, prueba de poste y exposición al estrés para evitar el agua. Las pruebas que utilizan cámaras o tubos cerrados deberán modificarse para permitir que el tubo de polietileno se mueva libremente junto con los ratones, como la prueba social de tres cámaras, la caja clara-oscura, el condicionamiento del miedo, la preferencia de sacarosa, el estrés de restricción, la prueba de sobresalto y la inhibición del pulso previo al pulso. Sugerimos probar previamente y estimar la longitud necesaria para el tubo de polietileno en los ratones de sacrificio antes de la prueba.

Se ha demostrado que los metabolitos microbianos intestinales afectan el comportamiento del huésped 8,46,47,48,49. Los científicos pueden adoptar este método para investigar directamente los efectos temporales y espaciales de los metabolitos derivados de la microbiota intestinal en el cerebro y los comportamientos en ratones. Por ejemplo, el metabolito microbiano 4-etilfenil sulfato (4EPS) se incrementó en modelos preclínicos de ratón de TEA y personas con TEA46,48,49. La inyección de 4EPS y la colonización de las bacterias productoras de 4EPS aumentaron el comportamiento similar a la ansiedad y alteraron la maduración de los oligodendrocitos en el núcleo paraventricular del tálamo (PVT) en ratones46,48. Sería fascinante evaluar el efecto directo de 4EPS en el PVT de ratones durante las pruebas de comportamiento similar a la ansiedad. Sin embargo, la concentración absoluta de 4EPS en el PVT es aún desconocida. Por lo tanto, una prueba de dosis-respuesta podría ser crítica para determinar los niveles adecuados de 4EPS en la PVT. Se puede adoptar un concepto similar para los efectos de otros metabolitos microbianos en el cerebro y el comportamiento.

Las neurotecnologías basadas en circuitos, como la optogenética, la quimiogenética y las imágenes de calcio in vivo, son métodos críticos que permiten a los científicos comprender el circuito neuronal en el control del comportamiento50,51,52. El eje intestino-cerebro es una conexión complicada crítica para que los microbios intestinales y sus metabolitos medien el comportamiento del huésped. Un número creciente de estudios han empleado neurotecnologías basadas en circuitos para comprender la intrigante diafonía entre el intestino y el cerebro 33,53,54,55,56,57,58,59. Este protocolo proporcionará una forma alternativa de comprender el control basado en la región cerebral del comportamiento causado por los metabolitos intestinales. La combinación de este protocolo con neurotecnologías basadas en circuitos permitirá a los investigadores obtener información sobre el control basado en circuitos del comportamiento y la actividad cerebral aportados por los metabolitos intestinales.

En conclusión, el concepto de eje intestino-cerebro es bien aceptado en la comunidad científica y promueve la posibilidad de la participación de metabolitos derivados del intestino en trastornos neuropsiquiátricos 11,13,60,61,62,63,64,65 . Para interrogar cómo y qué metabolitos derivados del intestino afectan el cerebro y el comportamiento de los ratones, se necesitará una metodología integral y basada en la fisiología en el campo. Este artículo proporciona un protocolo paso a paso para administrar metabolitos derivados del intestino directamente en el cerebro, lo más importante, en un ratón que se mueve libremente. Este diseño se puede adaptar aún más para investigar los efectos específicos de la región mediante la entrega de los metabolitos derivados del intestino en varias regiones del cerebro.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses relacionados con este trabajo.

Acknowledgments

Reconocemos al personal del Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad Nacional Cheng Kung (NCKU) por cuidar a los animales. Este trabajo fue apoyado por la beca del Fondo de Educación Prof. Kun-Yen Huang de la Fundación Médica CHENG-HSING a C.-W.L.; los fondos del Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST) en Taiwán: (Investigación de pregrado MOST 109-2813-C-006-095-B) a T.-H.Y.; (MOST 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) a W.-L.W.; y el Proyecto Brote de Educación Superior, Ministerio de Educación a la Sede de Avance Universitario en NCKU a W.-L.W.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41 Pfizer n/a
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit ThermoFisher Scientific A-21206
Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal) Millipore AB153-I
Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μm, PES, Sterile NEST 121921LA01
CaCl2  Sigma-Aldrich C1016 ACSF: 0.14 g/L
Chlorhexidine scrub 2% Phoenix NDC 57319-611-09
Chlorhexidine solution Phoenix NDC 57319-599-09
Commercial dummy RWD Life Science 62004 Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm
Commercial guide cannul RWD Life Science 62104 Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm 
Commercial injector RWD Life Science 62204 Single_OD 0.21 mm-33G/ Mates with M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 ACSF: 0.61 g/L
Dental acrylic HYGENIC n/a
Fixing screws RWD Life Science 62521
Fluoroshield mounting medium with DAPI Abcam AB104139
Horse serum ThermoFisher Scientific 16050130
Insulin syringes BBraun XG-LBB-9151133S-1BX 1 mL
Isoflurane  Panion & BF biotech DG-4900-250D
KCl  Sigma-Aldrich P3911 ACSF: 0.19 g/L
Ketoprofen  Swiss Pharmaceutical n/a
Lidocaine  AstraZeneca n/a
Low melting point agarose Invitrogen 16520
MgCl2  Sigma-Aldrich M8266 ACSF: 0.19 g/L
Microscope cover slips MARIENFELD 101242
Microscope slides ThermoFisher Scientific 4951PLUS-001E
Mineral oil light, white NF Macron Fine Chemicals MA-6358-04
NaCl  Sigma-Aldrich S9888 ACSF: 7.46 g/L
NaH2PO4  Sigma-Aldrich S8282 ACSF: 0.18 g/L
NaHCO3  Sigma-Aldrich S5761 ACSF: 1.76 g/L
n-butyl cyanoacrylate adhesive (tissue adhesive glue) 3M 1469SB 3M Vetbond
Neural tracer  Santa Cruz SC-358883 FluoroGold
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Polyethylene tube RWD Life Science 62329 OD 1.50, I.D 0.50 mm and OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (eye) Ointment Dechra  12920060
Sodium acetate  Sigma-Aldrich S2889 SCFAs: 13.5 mM
Sodium azide  Sigma-Aldrich S2002
Sodium butyrate  Sigma-Aldrich B5887 SCFAs: 8 mM
Sodium propionate  Sigma-Aldrich P1880 SCFAs: 5.18 mM
Stainless guide cannula Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.63 mm; Local vendor
Stainless injector Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.3 mm; dummy is made from injector; local vendor
Superglue Krazy Glue KG94548R
Triton X-100 Merck 1.08603.1000
Equipment
Cannula holder RWD Life Science B485-68217
Ceiling camera FOSCAM R2
Digital stereotaxic instruments Stoelting 51730D
Dissecting microscope INNOVIEW SEM-HT/TW
Glass Bead Sterilizer RWD Life Science RS1501
Heating pad Stoelting 53800M
Leica microscope  Leica DM2500
Micro Dissecting Forceps ROBOZ RS-5136 Serrated, Slight Curve; Extra Delicate; 0.5mm Tip Width; 4" Length 
Micro Dissecting Scissors ROBOZ RS-5918 4.5" Angled Sharp
Microinjection controller World Precision Instruments (WPI) MICRO2T SMARTouch Controller
Microinjection syringe pump World Precision Instruments (WPI) UMP3T-1 UltraMicroPump3  
Microliter syringe Hamilton 80014 10 µL
Optical Fiber Cold Light with double Fiber Step LGY-150 Local vendor
Pet trimmer WAHL 09962-2018
Vaporiser for Isoflurane Step AS-01 Local vendor
Vibratome Leica VT1000S
Software
Animal behavior video tracking software Noldus EthoVision Version: 15.0.1416
Leica Application Suite X software Leica LASX Version: 3.7.2.22383

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Neurociencia Número 184
Entrega intracerebroventricular de metabolitos microbianos derivados del intestino en ratones que se mueven libremente
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Liou, C. W., Yao, T. H., Wu, W. L.… More

Liou, C. W., Yao, T. H., Wu, W. L. Intracerebroventricular Delivery of Gut-Derived Microbial Metabolites in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (184), e63972, doi:10.3791/63972 (2022).

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