Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Intracerebroventrikulär leverans av tarm-härledda mikrobiella metaboliter i fritt rörliga möss

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63972
Automatic Translation
*1,2, *2, 1,2
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Physiology, College of Medicine, National Cheng Kung University
* These authors contributed equally

Summary

Gut-härledda mikrobiella metaboliter har mångfacetterade effekter som leder till komplext beteende hos djur. Vi strävar efter att tillhandahålla en steg-för-steg-metod för att avgränsa effekterna av tarm-härledda mikrobiella metaboliter i hjärnan via intracerebroventrikulär leverans via en guidekanyl.

Abstract

Effekten av tarmmikrobiota och deras metaboliter på värdens fysiologi och beteende har undersökts omfattande under detta decennium. Många studier har visat att tarmmikrobiota-härledda metaboliter modulerar hjärnmedierade fysiologiska funktioner genom invecklade tarm-hjärnvägar i värden. Kortkedjiga fettsyror (SCFA) är de viktigaste bakteriebaserade metaboliterna som produceras under kostfiberjäsning av tarmmikrobiomet. Utsöndrade SCFA från tarmen kan verka på flera platser i periferin, vilket påverkar immun-, endokrina och neurala svar på grund av den stora fördelningen av SCFA-receptorer. Därför är det utmanande att skilja de centrala och perifera effekterna av SCFA genom oral och intraperitoneal administrering av SCFA. Denna artikel presenterar en videobaserad metod för att förhöra SCFA: s funktionella roll i hjärnan via en guidekanyl i fritt rörliga möss. Mängden och typen av SCFA i hjärnan kan justeras genom att kontrollera infusionsvolymen och hastigheten. Denna metod kan ge forskare ett sätt att uppskatta rollen av gut-derived metaboliter i hjärnan.

Introduction

Den mänskliga mag-tarmkanalen har olika mikroorganismer som påverkar värden 1,2,3. Dessa tarmbakterier kan utsöndra gut-härledda metaboliter under deras utnyttjande av kostkomponenter som konsumeras av värden 4,5. Intressant nog kan tarmmetaboliterna som inte metaboliseras i periferin transporteras till andra organ via cirkulation6. Observera att dessa utsöndrade metaboliter kan fungera som mediatorer för tarm-hjärnaxeln, definierad som den dubbelriktade kommunikationen mellan centrala nervsystemet och tarmen7. Tidigare studier har visat att tarmbaserade metaboliter kan modulera komplext beteende och känslor hos djur 8,9,10,11.

Kortkedjiga fettsyror (SCFA) är de viktigaste metaboliterna som produceras av tarmmikrobiota under jäsning av kostfiber och svårsmälta kolhydrater6. Acetat, propionat och butyrat är de vanligaste SCFA i tarmen12. SCFA fungerar som energikälla för celler i mag-tarmkanalen. Ometaboliserade SCFA i tarmen kan transporteras till hjärnan genom portalvenen, vilket modulerar hjärnan och beteendet 6,12. Tidigare studier har föreslagit att SCFA kan spela en kritisk roll vid neuropsykiatriska störningar 6,12. Till exempel räddade intraperitoneal injektion av butyrat i BTBR T + Itpr3tf / J (BTBR) -möss, en djurmodell av autismspektrumstörning (ASD), deras sociala underskott13. Antibiotikabehandlade råttor som fick mikrobiota från depressiva personer visade en ökning av ångestliknande beteenden och fekala SCFA14. Kliniskt observerades förändringar i fekala SCFA-nivåer hos personer med ASD jämfört med typiskt utvecklande kontroller15,16. Personer med depression har lägre fekala SCFA-nivåer än friska försökspersoner17,18. Dessa studier föreslog att SCFA kan förändra beteende hos djur och människor genom olika vägar.

Mikrobiella metaboliter utövar olika effekter på flera platser i kroppen, vilket påverkar värdens fysiologi och beteenden 4,19, inklusive mag-tarmkanalen, vagusnerven och sympatisk nerv. Det är svårt att fastställa den exakta rollen av gut-härledda metaboliter i hjärnan när administrera metaboliterna via perifera vägar. Detta dokument presenterar ett videobaserat protokoll för att undersöka effekterna av tarm-härledda metaboliter i hjärnan hos en fritt rörlig mus (figur 1). Vi visade att SCFA kunde ges akut genom guidekanylen under beteendetester. Metaboliternas typ, volym och infusionshastighet kan modifieras beroende på syftet. Platsen för kanylisering kan justeras för att utforska effekterna av tarmmetaboliter i en specifik hjärnregion. Vi strävar efter att ge forskare en metod för att utforska den potentiella effekten av tarm-härledda mikrobiella metaboliter på hjärnan och beteendet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experimentella protokoll och djurens vård godkändes av National Cheng Kung University (NCKU) Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Förberedelse för försöksdjuret

  1. Skaffa 6-8 veckor gamla vildtyp C57BL / 6JNarl hanmöss från en leverantör.
  2. Inhys mössen i en vanlig musbur med vanlig muschow och steriliserat vatten ad libitum.
    OBS: Husförhållandena för Laboratory Animal Center of NCKU är 22 ± 1 ° C temperatur, 55% ± 10% luftfuktighet och en 13 h / 11 h ljus / mörk cykel.

2. Stereotaxisk kirurgi

  1. Förbered och sterilisera det stereotaxiska instrumentet, kirurgiska instrument och relaterade föremål.
    OBS: Alla föremål som direkt kommer i kontakt med operationsområdet bör steriliseras för att undvika infektion.
  2. Bedöva musen genom att placera den i plexiglasburen med 1%-5% isofluran i syre.
    OBS: Observera musen noga för att säkerställa att andningsfrekvensen hålls på cirka ett andetag per sekund.
  3. Ta musen ur anestesikammaren. Raka operationsplatsen (mushuvudet) med en husdjurstrimmer. Placera musen på den stereotaxiska ramen genom att fästa musens framtänder på snittstången i den stereotaxiska framtändhållaren. Täck näsan med näskonmasken.
  4. Bedöva musen med 1%-2,5% isofluran i syre under hela stereotaxiska operationen. Utvärdera musens nociception via tåklämreflexen och säkerställ en konstant andningsfrekvens innan du skär in operationsområdet.
  5. Placera en värmedyna (37,0 °C) under musen på den stereotaxiska ramen för att bibehålla kroppstemperaturen under operationen. Alternativt kan du behålla kärntemperaturen med hjälp av en rektal termisk sond som förbinder den programmerade värmaren och värmedynan.
  6. Ta bort den trimmade pälsen på huvudet med tejp. Injicera musen med smärtstillande ketoprofen (5 mg/kg) subkutant för att lindra smärta. Applicera ögonsalva för att undvika torra ögon.
  7. Sätt in den spetsiga öronstången i hörselgången för att fixera huvudet.
  8. Centrera huvudet genom att justera öronstångens skala.
  9. Dra åt näsklämman på snitthållaren för att undvika vertikal rörelse. Tryck försiktigt på huvudet för att kontrollera att huvudet är fixerat och undvik att huvudet lossnar under efterföljande operation.
  10. Desinficera hårbotten med tre alternerande skrubbar av klorhexidin med en bomullspinne. Börja varje skrubba från mitten mot utsidan (från det mest desinficerade centrala området till det minst desinficerade området).
    OBS: Användningen av scrubs från mitten till utsidan kan hjälpa forskare att minimera infektion och förorening från pälsen. Ytterområdet ligger nära det orakade huvudområdet, som fortfarande har en stor mängd päls och inte är lätt att desinficera noggrant.
  11. Skär hårbotten på ett främre/bakre sätt (<1 cm) med ett kirurgiskt blad. Öppna snittet och torka av skallen med en bomullspinne som hålls av mikrodissekerande pincett.
    OBS: De mikrodissekerande pincetterna, kirurgiska bladet och bomullspinnarna måste steriliseras genom autoklavering före operationen. Under den kirurgiska processen, sterilisera all kirurgisk utrustning med hjälp av en glaspärlsterilisator (150 ° C) i minst 5 s före och efter varje djur. Förbered en steriliserad bägare för att hålla det kirurgiska bladet och pincetten under den kirurgiska processen och mellan djur.
  12. Identifiera Bregma och Lambda på skallen. Använd Bregma som referens för att hitta den intressanta regionen.
    1. Valfritt: Montera den stereotaxiska borren på den stereotaxiska borrhållaren och använd borrspetsen för att peka Bregma som referens. Sterilisera den stereotaxiska borren med hjälp av glaspärlsterilisatorn (150 °C) i minst 5 s.
  13. Kalibrera och rikta in det plana skallens horisontella plan i vänster / höger och främre / bakre plan av Bregma / Lambda.
    OBS: Om det inte är i ett korrekt horisontellt plan, montera musen på det stereotaxiska instrumentet igen.

3. Kommersiell anpassad guide kanylimplantation

  1. Identifiera och märk positionen för höger lateral ventrikel, baserat på de stereotaxiska koordinaterna: Avstånd till Bregma, främre / bakre (A / P): 0,26 mm, medial / lateral (M / L): -1,0 mm, dorsal / ventral (D / V): -2,0 mm 20.
    OBS: Koordinaterna kan ändras baserat på intresseområdet. Koordinaterna för lateralkammaren baserades på vuxna C57BL/6J-möss med ett viktintervall på 26-30 g. Om yngre möss används, se diskussionen.
  2. Borra ett hål (diameter = 1,5 mm) genom skallen på den märkta platsen med hjälp av en stereotaxisk borr för implantation av en kommersiell styrkanyl.
  3. Borra ytterligare två till fyra hål (diameter = 1,5 mm) på skallen med en stereotaxisk borr för montering av skruvar av rostfritt stål.
    OBS: Sterilisera den stereotaxiska borren med en glassträngsterilisator (150 °C) i minst 5 s före och efter varje djur.
  4. Torka av benresterna och sluta blöda med en bomullspinne.
  5. Torka av skallen med lidokain (1 mg/kg) med en bomullspinne för lokalbedövningsmedel, antipruritiska och smärtlindrande effekter. Om blödningen inte slutar efter borrning, placera försiktigt en bomullspinne på hålet för hemostas.
  6. Montera två till fyra rostfria skruvar på hålen för att ge ankare för tandakryl.
  7. Placera den kommersiella guidekanylen på stereotaxisk kanylhållare och desinficera med glaspärlsterilisatorn (150 °C).
    OBS: Den kommersiella guidekanylen, den kommersiella dummyn och den kommersiella injektorn (figur 2A) anpassades med specifikationerna som visas i materialförteckningen.
  8. Flytta den stereotaxiska kanylhållaren till hålet som borrats för sidokammaren och sätt långsamt in den kommersiella styrkanylen i hålet tills önskat djup (2,5 mm).
    OBS: Den dorsala / ventrala koordinaten kan definieras genom att ställa in spetsen på den kommersiella styrkanylen som referens när spetsen knappt sätts in i hålet.
  9. Applicera 10 μL n-butylcyanoakrylatlim (vävnadslimlim) för att fixera den kommersiella styrkanylen i det borrade hålet och vänta i 3-4 minuter. Släpp den kommersiella guidekanylen försiktigt från den stereotaxiska kanylhållaren och flytta hållaren bort.
  10. Applicera tandakryl på den snittade hårbotten för att fixa den kommersiella styrkanylen och vänta i minst 5 minuter. Implantera den kommersiella provdockan i den kommersiella guidekanylen för att undvika att kanyl täpps till av blod eller kroppsvätska (figur 2B).
  11. Släpp öronstången från hörselgången och ta bort musen från den stereotaxiska ramen.
  12. Placera musen i en ny bur med en värmedyna under för återhämtning från anestesi och observera kontinuerligt tills musen vaknar helt.
    OBS: Lämna inte djuret utan uppsikt förrän det har återfått tillräckligt medvetande för att upprätthålla sternal recumbency. Ett djur som har genomgått operation bör inte återvända till sällskap med andra djur tills det är helt återställt.
  13. Återställ musen till ett enda hölje eller grupphus, beroende på det institutionella IACUC-protokollet och den experimentella designen. För gruppboende, se till att färre möss är inrymda i en bur för att minimera oönskade skador eller avlägsnande av kanylen.
  14. Administrera Ibuprofen (0,2 mg/ml) i dricksvattnet i minst 3 dagar för postoperativ vård och övervaka två gånger om dagen för tecken på smärta och ångest i minst 3 dagar.
    1. Under postoperativ vård, applicera roxitromycinsalva runt huden för att förhindra inflammation och infektion hos mössen.
    2. Fortsätt övervaka djurets tillstånd och ge en snabb intraperitoneal injektion av 5% glukos och / eller 0,9% natriumklorid för att ge tillräckligt med energi.
    3. Om tillståndet av smärta, nöd eller infektion stadigt försämras, avliva musen genom CO 2-inandning.
  15. Vänta i 1 vecka efter operationen för att musen ska vara redo för intracerebroventrikulär leverans av SCFA och beteendetestning.

4. Förberedelse av vetenskapliga kommittén för hälso- och konsumentfrågor

  1. Lös upp natriumacetat, natriumbutyrat och natriumpropionat i konstgjord cerebrospinalvätska (ACSF) (se materialförteckningen).
  2. Se till att kemikalierna är helt upplösta, justera sedan pH-värdet till 7,4 och filtrera SCFA-blandningen genom ett 0,22 μm-filter för sterilisering.

5. Ställ in infusionssystemet för intracerebroventrikulär leverans av SCFA under beteendetestning

  1. Montera en takkamera för att spela in beteendet. Anslut kameran till en dator för att styra videoinspelningsprogrammet (bild 3).
  2. Fyll en 10 μl spruta med destillerat vatten.
    OBS: Undvik luftbubblor i mikrolitersprutan.
  3. Anslut en mikroinjektionspump med mikroinjektionsregulatorn.
  4. Montera mikrolitersprutan på mikroinjektionspumpen. För att installera sprutan, tryck på knappen för att lossa klämman och montera sprutan på motsvarande läge. Stäng klämman och dra åt kolvfästesskruven på mikroinjektionspumpen (figur 4A).
  5. För in den kommersiella injektorn i polyetenröret (figur 2A).
  6. Häng polyetenröret på takkameran ovanför testarenan.
  7. Fyll polyetenröret med destillerat vatten med en insulinspruta. Anslut mikrolitersprutan till det hängande polyetenröret.
    OBS: Se till att polyetenröret är tillräckligt långt för att musen ska kunna röra sig fritt över hela testarenan.

6. Systeminställningar för mikroinjektionsregulatorn

  1. Slå på mikroinjektionskontrollen och tryck på Visa alla kanaler för att komma åt kommandoskärmen (bild 4C). Tryck på Konfiguration och ställ in Volymmål till 9 800 nL med Leveranshastighet till 100 nL/s. Infusera 9 800 nL destillerat vatten från polyetenröret som är anslutet till mikrolitersprutan (tryck på Riktning för att växla till infuserläge och tryck på RUN) (se röda rutor på kommandoskärmen i figur 4C).
  2. Tryck på Konfiguration och ställ in Volymmål på 3 000 nL med Leveranshastighet till 100 nL/s. Dra upp 3 000 nL mineralolja (tryck på Riktning för att växla till uttagsläge och tryck på RUN) (se röda rutor på kommandoskärmen i figur 4C).
    OBS: En klar olje-vattenfasseparation bör observeras på polyetenröret.
  3. Demontera polyetenröret från mikrolitersprutnålen. Spotta ut 3 000 nL destillerat vatten från mikrolitersprutan (tryck på Riktning för att växla till Infuse-läget och tryck på RUN).
  4. Sätt tillbaka mikrolitersprutan i polyetenröret. Tryck på Konfiguration och ställ in Volymmål på 9 500 nL med Leveranshastighet till 100 nL/s. Ta ut 9 500 nL SCFAs (tryck på Direction för att växla till uttagsläget och tryck på RUN). Märk olje-SCFAs-fasen för att verifiera om SCFA:erna har infunderats.
  5. Tryck på Konfiguration och ställ in önskat volymmål med leveranshastighet till 7 nL/s. Tryck på Riktning för att växla till inloppsläge (se röda rutor på kommandoskärmen i bild 4C).
    OBS: Bestäm volymen baserat på infusionstiden. Till exempel, om infusionstiden är 3 min för leveranshastigheten 7 nL/s, är målvolymen = 1 260 nL.
  6. Tryck på RUN för att infusera mikrolitersprutan framåt tills vätskan kommer ut i den främre änden av den kommersiella injektorn innan du sätter in injektorn i kanylen för SCFA-injektion.

7. Infusion av SCFA i lateral ventrikel genom den kommersiella styrkanylen i fritt rörlig mus

  1. Bedöva musen genom att placera den i plexiglasburen med 1%-5% isofluran i syre.
    OBS: Observera musen noga för att säkerställa att andningsfrekvensen hålls på cirka ett andetag per sekund.
  2. Skrubba musen och sätt in den kommersiella injektorn i den kommersiella styrkanylen (figur 4B).
    OBS: Om den kommersiella guidekanylen är ansluten av blod eller kroppsvätska, rensa den försiktigt med pincett.
  3. Låt musen återhämta sig från anestesi i 15 minuter i en bur före beteendetestning.
  4. För det grundläggande rörelsetestet, placera musen i en ny bur och låt den fritt utforska i 35 minuter. Infusera SCFA med en leveranshastighet på 7 nL /s för en målvolym på 2 100 nL under de första 5 minuterna (tryck på Riktning till Infuse-läget och tryck på RUN).
    OBS: Rörelsen i den nya buren kan analyseras med hjälp av videospårningsprogram för djurbeteende21,22.
  5. Bedöva musen (upprepa steg 7.1) och ta bort den kommersiella injektorn från den kommersiella guidekanylen.
    OBS: Musen kan injiceras upprepade gånger med olika kontroller/metaboliter efter att ha gett lämplig tid för att tvätta bort den föregående injektionen. Så länge kanylen är fixerad på mushuvudet kan musen testas upprepade gånger med olika metaboliter.

8. Återställande av mikroinjektionssystemet

  1. Demontera polyetenröret från mikrolitersprutan.
  2. Injicera luft i röret med insulinsprutan för att kasta det destillerade vattnet i polyetenröret. Töm mikrolitersprutan.
  3. Tryck på Återställ Pos på skärmen Konfiguration för att öppna skärmen Definition av sprutstopp (bild 4C).
  4. Tryck på Dra ut tills ett pipande ljud uppstår för att återställa mikroinjektionspumpen till det helt uttagna läget (figur 4C).
  5. Gå tillbaka till kommandoskärmen och stäng av mikroinjektionskontrollen om det finns ett **END REACHED** -tecken på den här skärmen (bild 4C).

9. Valfritt: Validering av intracerebroventrikulär injektion med neuralt spårämne

  1. Infusera 2 100 nL av det neurala spårämnet med en leveranshastighet på 7 nL/s för att verifiera infusionsstället.
    OBS: Låt injektorn stå i styrkanylen i 5 minuter för att förhindra återflöde.
  2. Bedöva musen genom en överdos av isofluran (5%) 30 min efter infusion av neural tracer.
  3. Kontrollera andningsfrekvensen och svans-/tassklämreflexen i den sövda musen.
    OBS: Möss måste inte svara innan nästa steg.
  4. Gör ett snitt på 4-5 cm genom huden, muskeln och bukväggen under bröstkorgen.
  5. Flytta levern försiktigt bort från membranet.
  6. Skär membranet för att exponera musens hjärta.
  7. Genomsyra musen genom hjärtat med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och iskall 4% paraformaldehyd i PBS.
  8. Halshugg musen och dissekera hjärnan försiktigt med mikrodissekerande tång och mikrodissekerande sax för att ta ut hela hjärnan23. Placera hjärnproverna i iskall 4% paraformaldehyd i PBS i 3-4 dagar och tvätta dem 3 x 5 min med PBS.
  9. Skär hjärnan i två delar i musens hjärnskivhållare vid det åttonde snittet av musens hjärnskivhållare (1 mm/sektion) från främre till bakre riktningen. Placera hjärnan i inbäddningsformen och bädda in hjärnproverna i agaros med låg smältpunkt (4% i PBS).
  10. Limma hjärnan inbäddad i agaros på vibratomstadiet med superlim. Dela upp hjärnan i 50 μm hjärnskivor med vibratomet.
  11. Inkubera hjärnskivorna i antikroppen som riktar sig mot det neurala spårämnet utspätt i blockerande buffert (1:1 000 utspädning) över natten vid rumstemperatur.
    OBS: Blockeringsbufferten innehöll 10% hästserum, 0,1% Triton X-100 och 0,02% natriumazid.
  12. Tvätta skivorna 3 x 5 min med PBST (PBS med 0,1% triton X-100).
  13. Inkubera hjärnskivorna i fluorescensfärgkonjugerad sekundär antikropp utspädd i blockerande buffert (1:500 utspädning) i 2 timmar vid rumstemperatur.
  14. Tvätta skivorna 3 x 5 min med PBS.
  15. Montera hjärnskivorna på bilden med ett monteringsmedium som innehåller 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI).
  16. Täck bilden med ett mikroskopskydd.
  17. Applicera nagellack på glidkanten för att undvika läckage av monteringsmediet.
  18. Efter inkubation över natten vid rumstemperatur, skyddad från ljus, avbilda fluorescenssignalen på infusionsstället med hjälp av ett fluorescensmikroskop.

10. Valfritt: Infusion av metaboliter genom en anpassad styrkanyl i rostfritt stål i lateral ventrikel hos möss

  1. Följ protokollavsnitten 1-8 och byt ut den kommersiella styrkanylen med en styrkanyl i rostfritt stål för att införa kemikalier genom en injektor i rostfritt stål i musen.
    OBS: För- och nackdelarna med de olika kommersiella och rostfria kanylerna utvecklas i diskussionsavsnittet.
  2. Utför det kirurgiska protokollet på samma sätt som beskrivs i protokollavsnitten 2 och 3, förutom att komma ihåg att ersätta den kommersiella styrkanylen med en styrkanyl i rostfritt stål (figur 5B).
    OBS: Styrkanylen i rostfritt stål, provdocka i rostfritt stål och injektor i rostfritt stål (figur 5A) anpassades med specifikationerna som visas i materialförteckningen. Sätt in den anpassade styrkanylen i rostfritt stål i hålet tills önskat djup (2,0 mm).
  3. Infusera SCFA via styrkanylen i rostfritt stål med hjälp av mikroinjektionssystemet som består av mikroinjektionsregulatorn och mikroinjektionspumpen (figur 4B) (samma som protokollavsnitten 4-7). För provdockan i rostfritt stål på styrkanylen i rostfritt stål, böj försiktigt ena sidan av injektorn av rostfritt stål tills spetsen på den andra sidan är 1 mm längre än styrkanylen i rostfritt stål.
  4. Infusera 2,100 nL av neuralspåraren genom styrkanylen i rostfritt stål i lateral ventrikel hos möss (samma som protokollavsnitt 9).
  5. Samla provet i 30 minuter efter infusion med neurala spårämnen (samma som protokollavsnitt 9).
  6. Utför bildförvärv i neurala spårämnesinfunderade hjärnsegment (samma som protokollavsnitt 9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Musen infunderades med SCFA 1 vecka efter återhämtning från styrkanylimplantationen för att utvärdera rörelseaktivitet i en ny bur. Musen placerades i en ny bur och infunderades med 2 100 nL SCFA eller ACSF under de första 5 minuterna (leveranshastighet på 7 nL/s) i hjärnan genom den kommersiella styrkanylen implanterad i hjärnans laterala kammare. Den lokomotoriska aktiviteten i en ny bur registrerades i ytterligare 30 minuter efter infusion. Ingen skillnad observerades i den lokomotoriska aktiviteten i den nya buren mellan infusion av SCFA och ACSF (figur 6) (n = 2 möss per grupp; data visas som medelvärde ± s.e.m. och analyseras med tvåvägs ANOVA).

För att validera noggrannheten i implantationen av styrkanylen i hjärnregionerna infunderades ett fluorescerande neuralt spårämne i mössen via styrkanylen med samma volym och leveranshastighet som SCFA (2,100 nL på 5 min; 7 nL / s). Hjärnorna samlades in för histologi 30 min senare. Det fluorescerande färgämnet detekterades i lateral ventrikel och de omgivande regionerna i mushjärnan (figur 7A). En styrkanyl av rostfritt stål implanterades i hjärnans laterala ventrikel för infusion av neuralt spårämne under samma förhållanden. I likhet med styrkanylen visade resultaten att en fluorescerande färgsignal detekterades i lateralkammaren och de omgivande regionerna i mushjärnan även efter infusion genom styrkanylen i rostfritt stål (figur 7B).

Figure 1
Figur 1: Förfarandet för intracerebroventrikulär infusion hos fritt rörliga möss. Flödesschemat för intracerebroventrikulär leverans av tarm-härledda mikrobiella metaboliter i fritt rörliga möss. Förkortning: SCFA = kortkedjiga fettsyror. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Implantation av den kommersiella styrkanylen i möss . (A) Den representativa bilden av kommersiell guidekanyl, dummy och injektor. (B) Den representativa bilden av kommersiell guidekanyl och dummy implanterad i hjärnan hos möss genom fixering med dental akryl. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Intracerebroventrikulär infusionsrigg för beteendetestning. Diagrammet över mikroinjektionssystem, videoinspelningssystem och beteendeapparat. Förkortning: SCFA = kortkedjiga fettsyror. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Mikroinjektionssystemet . (A) Installation av mikrolitersprutan med hjälp av en mikroinjektionspump. (B) Införandet av den kommersiella injektorn ansluten med polyetenrör i den kommersiella styrkanylen (C) Mikroinjektionsregulatorns pekskärm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Implantation av styrkanyl av rostfritt stål i musens laterala ventrikel. (A) Den representativa bilden av styrkanyl, dummy och injektor av rostfritt stål. (B) Den representativa bilden av styrkanyl och provdocka av rostfritt stål som implanterats i hjärnan hos möss genom fixering med dental akryl. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Rörelseaktivitet hos SCFA-infunderade möss i den nya buren. (A) Tidslinjeschema för guidekanylimplantation och ny burrörelse vid infusion av ACSF eller SCFA. (B) Schema för tidslinje för placering av infusionsspruta, infusionsfönster (blå skugga) och den nya burbeteendetestningen. (C) Total sträcka som flyttas av ACSF- och SCFAs-infunderade möss i en ny bur i 35 minuter. Tidsfönstret för infusion indikeras med blå skugga (0-5 min). (D) Representativa bilder av banor för ACSF- och SCFA-infunderade möss i en ny bur. n = 2 möss per grupp. Data som visas som medelvärde ± s.e.m. och analyseras med tvåvägs ANOVA. NS: Inte signifikant. Förkortningar: SCFA = kortkedjiga fettsyror; ACSF = konstgjord cerebrospinalvätska. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: Histologin för hjärninfunderat fluorescerande färgämne. Infusion genom den anpassade (A) kommersiella och (B) rostfria styrkanylen implanterad i lateral ventrikel (LV) hos möss. Skalstänger = 1 mm (vänster) och 500 μm (höger). Blå: DAPI-färgning; Grön: Anti-fluorescerande guldmärkning. Förkortningar: LV = lateral ventrikel; AC = främre kommissur; CPu = caudat putamen; LS = lateral septum; MS = medial septum. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Gut-härledda metaboliter har associerats med hjärnmedierade sjukdomar utan mycket exakt mekanism, delvis på grund av deras flera bindningsställen i kroppen 6,12,24. Tidigare rapporter indikerade att SCFA kunde fungera som ligander för G-proteinkopplade receptorer, epigenetiska regulatorer och källor för energiproduktion på flera platser i kroppen 6,12. För att kringgå de förvirrande faktorer som härrör från periferin (såsom immunceller, hormoner och autonoma nervsystemet) utvecklades en metod genom att anta intracerebroventrikulär injektion av SCFA i hjärnan genom en guidekanyl hos fritt rörliga möss. Dessutom validerades kanyliserings- och infusionsställena för att utforska de hjärnområden som potentiellt påverkas av SCFA. Sammantaget presenterar detta papper en exakt, noggrann och validerad metod för att leverera tarm-härledda metaboliter till hjärnan för tarm-hjärnaxelforskning.

Den intracerebroventrikulära leveransen av läkemedel och kemikalier genom en guidekanyl till djur har varit väletablerad 25,26,27,28,29 för olika drogtester 29, sjukdomsmodellering 26,28 och specifik design av beteendetester 27 . Viktigast av allt, flera studier har levererat tarmmikrobiella metaboliter in i hjärnan genom intracerebroventrikulär injektion och testat deras effekter på fysiologiska funktioner30,31,32,33. Detta protokoll ger ett tilläggsattribut vid administrering av tarmmetaboliter på ett akut sätt till hjärnan i realtid, vilket skulle göra det möjligt för forskare att förstå de dynamiska effekterna av tarmmetaboliter på hjärnan och beteendet.

Leveranshastigheten för metabolitinfusionen är avgörande för att simulera flödet av cerebrospinalvätska i hjärnventriklarna. En studie indikerade att produktionshastigheten för cerebrospinalvätska hos möss är 5,3 nL/s34. För att kontrollera flödeshastigheten för SCFA naturligt i fritt rörliga möss har vi utvärderat flödeshastigheten för detta mikroinjektionssystem (figur 3 och figur 4). SCFA kunde infunderas smidigt utan mycket motstånd även när det 350 cm långa polyetenröret användes för att införa SCFA i en fritt rörlig mus. Med påfyllning av destillerat vatten och mineralolja för att minska vätskemotståndet i polyetenröret (se protokollavsnitten 5 och 6) kan flödeshastigheten sänkas till 7 nL/s från 100 nL/s. Infusion av SCFA eller ACSF med en flödeshastighet på 7 nL/s resulterade inte i något onormalt beteende hos mössen.

Mängden och doseringen av gut-härledda metaboliter för intracerebroventrikulär injektion är kritiska. Det är fortfarande utmanande att omfattande analysera de absoluta nivåerna av gut-derived metaboliter i olika hjärnregioner. Till exempel har mycket få studier visat detektering av de fysiologiska nivåerna av SCFA i hjärnan35,36. En studie visade att koncentrationerna av acetat, propionat och butyrat i hjärnan hos möss är ungefär 1640,6-3281,2 μg / g, 288,18-384,24 μg / g respektive 44,036-66,054 μg / grespektive 36. En annan studie rapporterade dock lägre nivåer av SCFA i hjärnan (acetat 128,1 μg/g, propionat 0,3883 μg/g och butyrat 0,1640 μg/g)35. Mängderna infunderat acetat, propionat och butyrat som antogs i detta protokoll var 5,81385 μg/g, 4,62378 μg/g respektive 2,6124 μg/g. Därför är koncentrationerna av SCFA som infunderas i detta protokoll jämförbara med fysiologiska koncentrationer. Vi kunde dock inte utesluta möjligheten att koncentrationerna av SCFA kan variera i distinkta hjärnregioner. Flera studier visade att leveransen av propionat i hjärnkammaren genom intracerebroventrikulär injektion (4 μL 0,26 M propionsyra på 1 min; cirka 249,756 μg/g) försämrade socialt beteende och kognition hos råttor30,31. Doseringen och flödeshastigheten för det infunderade propionatet var relativt höga, vilket rapporterades hos möss35 ochråttor 37. Därför kommer framsteg inom metabolitanalys och metabolomisk profilering i hjärnan och periferin att hjälpa forskare att bättre förstå de rumsliga och tidsmässiga dynamiska förändringarna i tarm-härledda metaboliter.

Två typer av styrkanyler har presenterats i detta protokoll för intracerebroventrikulär injektion i möss - en kommersiell styrkanyl och en styrkanyl i rostfritt stål. Den kommersiella styrkanylen och dummy är väl utformade för implantation. Det är inte lätt för möss att ta bort den anpassade dummy på grund av locket. Tvärtom kan provdockan i rostfritt stål enkelt avlägsnas från styrkanylen i rostfritt stål av möss under 1 veckas återhämtning, vilket orsakar koagulering av blod / cerebrospinalvätska i kanylen. Den kommersiella anpassade kanylen är dock 64 mg och dummy för denna kanyl är 86 mg. Således är den totala vikten av den kommersiella anpassade kanylen och dummy 150 mg. Däremot är den anpassade styrkanylen i rostfritt stål 18,3 mg och dummy för denna kanyl är 8,5 mg. Således är den totala vikten av den anpassade styrkanylen i rostfritt stål 26,8 mg. Teoretiskt sett skulle den låga vikten av den rostfria styrkanyluppsättningen minimera kanylens inverkan på djurets rörelse och hjärnan. Dessutom är kostnaden för den kommersiella guidekanylen högre än styrkanylen och injektorn i rostfritt stål. Därför rekommenderar vi den rostfria stålsnoylen för oerfarna forskare som utför stereotaxisk kirurgi hos möss.

Den implanterade kanylen kan vara igensatt av blod och cerebrospinalvätska på grund av hjärnskador. Denna igensättning av kanylen kan förekomma oftare i rostfritt stålkanyl över den kommersiella kanylen. Provdockan kan gängas för att dra åt manylen ordentligt (figur 2A) men inte för kanylen i rostfritt stål (figur 5A). Att säkerställa fastsättning av provdockan under återhämtningsperioden skulle därför minimera igensättning av kanylen. En ny provdocka måste sättas in om lossning sker under 1 veckas återhämtning. Dessutom måste en engångssteriliserad injektor sättas in flera gånger för att rensa kanylen innan du monterar injektorn som förbinder polyetenröret.

Valet av bedövningsmedel kommer i hög grad att påverka operationen och beteendetestningen. Här valdes inhalationsbedövningsisofluran framför injicerade bedövningsmedel eftersom återhämtningstiden är kortare och det är mindre skadligt för djuren av humana skäl. Doseringen för inandning av isofluran kan dock varieras beroende på musens status och kroppsvikt. Därför måste anestesiens status observeras noggrant under hela det kirurgiska ingreppet, och isofluranförångaren justeras i enlighet därmed. Den optimerade andningsfrekvensen bör vara ett andetag per sekund under alla procedurer. Dessutom bör gasfilterbehållaren fylld med aktivt kol anslutas till anestesikammaren och noskonmasken för att tömma isofluran- och avgasföroreningarna i driftsområdet. Detta kommer att skydda kirurgen från den toxiska effekten av isofluran.

De representativa resultaten visade att infusionen av SCFA inte gav någon dramatisk effekt på rörelse i en ny bur. Detta kan bero på att ett litet antal djur användes för att få detta resultat (figur 6). Dessutom infunderade vi bara SCFA under de första 5 minuterna av det nya burrörelsebeteendetestet men inte hela testningen eftersom det mesta av beteendet testades inom ett kort tidsfönster (5-15 min). Tidsfönstret för de gut-härledda mikrobiella metaboliterna bör justeras baserat på prövarnas hypotes.

Tiden för anestesi och återfå medvetandet från anestesi är avgörande för beteendetester. Här bedövades mössen kort för injektorimplantation och SCFA-infusion, och beteendetestning utfördes efter 15 minuter. Tiden för att återhämta sig efter upphörandet av inhalationsanestesi bestämdes baserat på en tidigare studie38. En pilotstudie säkerställde att mössen var aktiva, fritt rörliga och inte obekväma 15 minuter efter anestesi. Vi introducerade anestesisteget för montering av injektorn av följande skäl. För det första är injektormätaren 33 G; Det är mycket utmanande att sätta in en sådan känslig injektor i kanylen när djuret rör sig aktivt. Dessutom kan scruffing av medvetna möss producera stress på mössen39, förvirrande beteendemässiga resultat. För det andra är kanylen ibland igensatt på grund av koagulering av blod / cerebrospinalvätska. Att rensa kanylen försiktigt innan du monterar injektorn skulle vara idealisk för metabolitinfusion. Baserat på dessa två skäl rekommenderas att kortfattat bedöva mössen för montering av injektorn. Utredare kan vänta längre (30 min) om det finns någon oro för djurets återhämtning från inhalationsanestesi. Dessutom kan en separat uppsättning infusionsinjektor som förbinder polyetenröret ställas in för att påskynda experimenten.

Detta protokoll har flera begränsningar. För det första skulle implantationen av styrkanylen och det anslutande polyetenröret begränsa det kirurgiska området för implantering av optiska fibrer för optogenetisk och fiberfotometri i samma koordinat, det omgivande området eller till och med samma hjärnhalva. Det blir ännu mer utmanande att implantera linsen för mikroendoskopi på mushuvudet tillsammans med den implanterade styrkanylen. För det andra kan implantationen av styrkanylen generera en signifikant vikt på mushuvudet. Den totala vikten av en anpassad kanyluppsättning är 26,8-150 mg, en skruv är ~ 48 mg och den monterade tandakrylen är 450-500 mg. Hela installationsuppsättningen kan begränsa mössens rörelser. Nya studier har dock implanterat ett miniskop för övervakning av kalciumsignaler hos fritt rörliga möss40,41. Miniskopets vikt varierar från 1,6 g till 4,5 g, exklusive skruvarna och dental akryl. Därför kan vikten av styrkanylen anses vara relativt acceptabel för testning av musbeteende. För det tredje är anslutningspolyetenröret för infusionen ~ 350 cm långt, vilket kan begränsa mössens rörelse under beteendetestet. För att ta itu med detta problem kan förtestning av rörelse i ett öppet fälttest krävas för att utvärdera effekten av det anslutande polyetenröret på musmotorfunktionen. För det fjärde kan dental akryl ge en neurotoxisk effekt på mössen. Det är dock nödvändigt att fästa styrkanylen på mushuvudet under testperioden. För att minska den potentiella neurotoxiska effekten av tandakryl på möss måste operatörerna vara bekanta med användningen av tandakryl. Dental akryl appliceras bättre när tandakrylblandningen (pulver och vätska) stelnar något för att minska penetrationen av dental akrylvätska i hjärnan.

Mikrobiota och deras metaboliter är associerade med beteendefunktion vid distinkta utvecklingsmilstolpar. Även om detta protokoll är baserat på vuxna C57BL/6-möss med kroppsvikter från 26 g till 30 g, kan det också appliceras på möss i olika åldrar och storlekar. Tidigare studier har antagit stereotaxisk kirurgi hos unga möss42,43,44,45. Koordinaterna för hjärnregioner kan dock variera beroende på mössens storlek och ålder. Vi rekommenderar att du refererar till åldersmotsvarande atlas eller onlineresurs (http://mouse.brain-map.org/static/atlas). Dessutom måste koordinaterna valideras genom att injicera trypanblått eller fluorescensfärgämne i de unga slaktmössen, vilket optimerar metoden innan den körs på experimentmössen. Guidekanylerna som används i detta protokoll är alla anpassade och kan justeras efter validering av koordinaterna för olika storlekar av möss.

Detta protokoll kommer att vara kompatibelt med de flesta gnagares beteendetestning med en öppen arena ovanpå apparaten utan mycket modifiering. Gnagarebeteendetester kan utföras med en polyetenrörledning ovanpå mushuvudet utan hinder, inklusive öppet fälttest, förhöjd plus / noll labyrint, steg ner test, direkt social interaktion, ultraljud vokalisering för vuxna, tvångssimningstest, svansupphängning, vattenlabyrint, T eller Y labyrint, ny objektigenkänning, marmorbegravning, självvårdstest, strålkorsning, poltest och vattenundvikande stressexponering. Tester med slutna kamrar eller rör måste modifieras så att polyetenröret fritt kan röra sig tillsammans med mössen, såsom trekammars socialt test, ljus-mörk låda, rädsla konditionering, sackarospreferens, fasthållningsspänning, skrämseltest och prepulspulshämning. Vi föreslår att du förtestar och uppskattar längden som behövs för polyetenröret på slaktmössen före testning.

Tarmmikrobiella metaboliter har visat sig påverka värdbeteenden 8,46,47,48,49. Forskare kan anta denna metod för att direkt undersöka de tidsmässiga och rumsliga effekterna av tarmmikrobiota-härledda metaboliter på hjärnan och beteenden hos möss. Till exempel ökade den mikrobiella metaboliten 4-etylfenylsulfat (4EPS) i prekliniska musmodeller av ASD och personer med ASD46,48,49. Injektion av 4EPS och kolonisering av bakterierna som producerar 4EPS ökade ångestliknande beteende och försämrad oligodendrocytmognad i den paraventrikulära kärnan i thalamus (PVT) hos möss46,48. Det skulle vara fascinerande att utvärdera den direkta effekten av 4EPS på pvt hos möss under ångestliknande beteendetestning. Den absoluta koncentrationen av 4EPS i PVT är dock fortfarande okänd. Därför kan ett dos-responstest vara avgörande för att bestämma de adekvata nivåerna av 4EPS i PVT. Ett liknande koncept kan antas för effekterna av andra mikrobiella metaboliter på hjärnan och beteendet.

Kretsbaserade neuroteknologier, såsom optogenetik, kemogenetik och in vivo kalciumavbildning, är kritiska metoder som gör det möjligt för forskare att förstå den neurala kretsen i kontrollen av beteende50,51,52. Tarm-hjärnaxeln är en komplicerad anslutning som är avgörande för tarmmikroberna och deras metaboliter för att förmedla värdbeteende. Ett växande antal studier har använt kretsbaserad neuroteknik för att förstå den spännande överhörningen mellan tarmen och hjärnan 33,53,54,55,56,57,58,59. Detta protokoll kommer att ge ett alternativt sätt att förstå hjärnans regionbaserade kontroll av beteende som orsakas av tarmmetaboliter. Genom att kombinera detta protokoll med kretsbaserad neuroteknik kan forskare få insikt i den kretsbaserade kontrollen av beteende och hjärnaktivitet som tarmmetaboliter bidrar med.

Sammanfattningsvis är begreppet tarm-hjärnaxeln väl accepterat i det vetenskapliga samfundet och främjar möjligheten att involvera tarm-härledda metaboliter i neuropsykiatriska störningar 11,13,60,61,62,63,64,65 . För att undersöka hur och vilka tarmbaserade metaboliter som påverkar hjärnan och beteendet hos möss kommer en omfattande och fysiologiskt baserad metodik att behövas inom området. Den här artikeln ger ett steg-för-steg-protokoll för att leverera tarm-härledda metaboliter till hjärnan direkt, viktigast av allt, i en fritt rörlig mus. Denna design kan anpassas ytterligare för att undersöka de regionspecifika effekterna genom leverans av de gut-härledda metaboliterna till olika hjärnregioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter relaterade till detta arbete.

Acknowledgments

Vi erkänner laboratoriedjurcentrets personal vid National Cheng Kung University (NCKU) för att ta hand om djuren. Detta arbete stöddes av stipendiet från Prof. Kun-Yen Huang Education Fund of CHENG-HSING Medical Foundation till C.-W.L.; medel från ministeriet för vetenskap och teknik (MOST) i Taiwan: (Grundutbildning MOST 109-2813-C-006-095-B) till T.-H.Y.; (MEST 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) till W.-L.W.; och Higher Education Sprout Project, utbildningsministeriet till huvudkontoret för universitetsutveckling vid NCKU till W.-L.W.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41 Pfizer n/a
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit ThermoFisher Scientific A-21206
Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal) Millipore AB153-I
Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μm, PES, Sterile NEST 121921LA01
CaCl2  Sigma-Aldrich C1016 ACSF: 0.14 g/L
Chlorhexidine scrub 2% Phoenix NDC 57319-611-09
Chlorhexidine solution Phoenix NDC 57319-599-09
Commercial dummy RWD Life Science 62004 Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm
Commercial guide cannul RWD Life Science 62104 Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm 
Commercial injector RWD Life Science 62204 Single_OD 0.21 mm-33G/ Mates with M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 ACSF: 0.61 g/L
Dental acrylic HYGENIC n/a
Fixing screws RWD Life Science 62521
Fluoroshield mounting medium with DAPI Abcam AB104139
Horse serum ThermoFisher Scientific 16050130
Insulin syringes BBraun XG-LBB-9151133S-1BX 1 mL
Isoflurane  Panion & BF biotech DG-4900-250D
KCl  Sigma-Aldrich P3911 ACSF: 0.19 g/L
Ketoprofen  Swiss Pharmaceutical n/a
Lidocaine  AstraZeneca n/a
Low melting point agarose Invitrogen 16520
MgCl2  Sigma-Aldrich M8266 ACSF: 0.19 g/L
Microscope cover slips MARIENFELD 101242
Microscope slides ThermoFisher Scientific 4951PLUS-001E
Mineral oil light, white NF Macron Fine Chemicals MA-6358-04
NaCl  Sigma-Aldrich S9888 ACSF: 7.46 g/L
NaH2PO4  Sigma-Aldrich S8282 ACSF: 0.18 g/L
NaHCO3  Sigma-Aldrich S5761 ACSF: 1.76 g/L
n-butyl cyanoacrylate adhesive (tissue adhesive glue) 3M 1469SB 3M Vetbond
Neural tracer  Santa Cruz SC-358883 FluoroGold
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Polyethylene tube RWD Life Science 62329 OD 1.50, I.D 0.50 mm and OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (eye) Ointment Dechra  12920060
Sodium acetate  Sigma-Aldrich S2889 SCFAs: 13.5 mM
Sodium azide  Sigma-Aldrich S2002
Sodium butyrate  Sigma-Aldrich B5887 SCFAs: 8 mM
Sodium propionate  Sigma-Aldrich P1880 SCFAs: 5.18 mM
Stainless guide cannula Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.63 mm; Local vendor
Stainless injector Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.3 mm; dummy is made from injector; local vendor
Superglue Krazy Glue KG94548R
Triton X-100 Merck 1.08603.1000
Equipment
Cannula holder RWD Life Science B485-68217
Ceiling camera FOSCAM R2
Digital stereotaxic instruments Stoelting 51730D
Dissecting microscope INNOVIEW SEM-HT/TW
Glass Bead Sterilizer RWD Life Science RS1501
Heating pad Stoelting 53800M
Leica microscope  Leica DM2500
Micro Dissecting Forceps ROBOZ RS-5136 Serrated, Slight Curve; Extra Delicate; 0.5mm Tip Width; 4" Length 
Micro Dissecting Scissors ROBOZ RS-5918 4.5" Angled Sharp
Microinjection controller World Precision Instruments (WPI) MICRO2T SMARTouch Controller
Microinjection syringe pump World Precision Instruments (WPI) UMP3T-1 UltraMicroPump3  
Microliter syringe Hamilton 80014 10 µL
Optical Fiber Cold Light with double Fiber Step LGY-150 Local vendor
Pet trimmer WAHL 09962-2018
Vaporiser for Isoflurane Step AS-01 Local vendor
Vibratome Leica VT1000S
Software
Animal behavior video tracking software Noldus EthoVision Version: 15.0.1416
Leica Application Suite X software Leica LASX Version: 3.7.2.22383

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lynch, J. B., Hsiao, E. Y. Microbiomes as sources of emergent host phenotypes. Science. 365 (6460), 1405-1409 (2019).
  2. Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome-gut-brain axis in health and disease. Gastroenterology Clinics of North America. 46 (1), 77-89 (2017).
  3. Sharon, G., Sampson, T. R., Geschwind, D. H., Mazmanian, S. K. The central nervous system and the gut microbiome. Cell. 167 (4), 915-932 (2016).
  4. Krautkramer, K. A., Fan, J., Backhed, F. Gut microbial metabolites as multi-kingdom intermediates. Nature Reviews: Microbiology. 19 (2), 77-94 (2021).
  5. Lavelle, A., Sokol, H. Gut microbiota-derived metabolites as key actors in inflammatory bowel disease. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. 17 (4), 223-237 (2020).
  6. Dalile, B., Van Oudenhove, L., Vervliet, B., Verbeke, K. The role of short-chain fatty acids in microbiota-gut-brain communication. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. 16 (8), 461-478 (2019).
  7. Morais, L. H., Schreiber, H. L. T., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews: Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
  8. Sharon, G., et al. Human gut microbiota from autism spectrum disorder promote behavioral symptoms in mice. Cell. 177 (6), 1600-1618 (2019).
  9. St Laurent, R., O'Brien, L. M., Ahmad, S. T. Sodium butyrate improves locomotor impairment and early mortality in a rotenone-induced Drosophila model of Parkinson's disease. Neuroscience. 246, 382-390 (2013).
  10. Govindarajan, N., Agis-Balboa, R. C., Walter, J., Sananbenesi, F., Fischer, A. Sodium butyrate improves memory function in an Alzheimer's disease mouse model when administered at an advanced stage of disease progression. Journal of Alzheimer's Disease. 26 (1), 187-197 (2011).
  11. Needham, B. D., et al. A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice. Nature. 602 (7898), 647-653 (2022).
  12. Silva, Y. P., Bernardi, A., Frozza, R. L. The role of short-chain fatty acids from gut microbiota in gut-brain communication. Frontiers in Endocrinology. 11, 25 (2020).
  13. Kratsman, N., Getselter, D., Elliott, E. Sodium butyrate attenuates social behavior deficits and modifies the transcription of inhibitory/excitatory genes in the frontal cortex of an autism model. Neuropharmacology. 102, 136-145 (2016).
  14. Kelly, J. R., et al. Transferring the blues: Depression-associated gut microbiota induces neurobehavioural changes in the rat. Journal of Psychiatric Research. 82, 109-118 (2016).
  15. Wang, L., et al. Elevated fecal short chain fatty acid and ammonia concentrations in children with autism spectrum disorder. Digestive Diseases and Sciences. 57 (8), 2096-2102 (2012).
  16. Adams, J. B., Johansen, L. J., Powell, L. D., Quig, D., Rubin, R. A. Gastrointestinal flora and gastrointestinal status in children with autism--comparisons to typical children and correlation with autism severity. BMC Gastroenterology. 11, 22 (2011).
  17. Skonieczna-Zydecka, K., et al. Faecal short chain fatty acids profile is changed in Polish depressive women. Nutrients. 10 (12), 1939 (2018).
  18. Szczesniak, O., Hestad, K. A., Hanssen, J. F., Rudi, K. Isovaleric acid in stool correlates with human depression. Nutritional Neuroscience. 19 (7), 279-283 (2016).
  19. Martin, A. M., Sun, E. W., Rogers, G. B., Keating, D. J. The influence of the gut microbiome on host metabolism through the regulation of gut hormone release. Frontiers in Physiology. 10, 428 (2019).
  20. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. Paxinos and Franklin's The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2013).
  21. York, J. M., Blevins, N. A., McNeil, L. K., Freund, G. G. Mouse short- and long-term locomotor activity analyzed by video tracking software. Journal of Visualized Experiments. (76), e50252 (2013).
  22. Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice. Journal of Visualized Experiments. (164), e61023 (2020).
  23. Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments. (168), e61941 (2021).
  24. Needham, B. D., Kaddurah-Daouk, R., Mazmanian, S. K. Gut microbial molecules in behavioural and neurodegenerative conditions. Nature Reviews: Neuroscience. 21 (12), 717-731 (2020).
  25. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880 (2008).
  26. Xiaoguang, W., et al. Establishment of a valuable mimic of Alzheimer's disease in rat animal model by intracerebroventricular injection of composited amyloid beta protein. Journal of Visualized Experiments. (137), e56157 (2018).
  27. Venniro, M., Shaham, Y. An operant social self-administration and choice model in rats. Nature Protocols. 15 (4), 1542-1559 (2020).
  28. Ucal, M., et al. Rat model of widespread cerebral cortical demyelination induced by an intracerebral injection of pro-inflammatory cytokines. Journal of Visualized Experiments. (175), e57879 (2021).
  29. Oberrauch, S., et al. Intraventricular drug delivery and sampling for pharmacokinetics and pharmacodynamics study. Journal of Visualized Experiments. (181), e63540 (2022).
  30. Shultz, S. R., et al. Intracerebroventricular injections of the enteric bacterial metabolic product propionic acid impair cognition and sensorimotor ability in the Long-Evans rat: further development of a rodent model of autism. Behavioural Brain Research. 200 (1), 33-41 (2009).
  31. Shultz, S. R., et al. Intracerebroventricular injection of propionic acid, an enteric metabolite implicated in autism, induces social abnormalities that do not differ between seizure-prone (FAST) and seizure-resistant (SLOW) rats. Behavioural Brain Research. 278, 542-548 (2015).
  32. Perry, R. J., et al. Acetate mediates a microbiome-brain-beta-cell axis to promote metabolic syndrome. Nature. 534 (7606), 213-217 (2016).
  33. Muller, P. A., et al. Microbiota modulate sympathetic neurons via a gut-brain circuit. Nature. 583 (7816), 441-446 (2020).
  34. Pardridge, W. M. CSF, blood-brain barrier, and brain drug delivery. Expert Opinion on Drug Delivery. 13 (7), 963-975 (2016).
  35. Wu, J. -T., et al. Oral short-chain fatty acids administration regulates innate anxiety in adult microbiome-depleted mice. Neuropharmacology. , (2022).
  36. Lee, J., et al. Gut microbiota-derived short-chain fatty acids promote poststroke recovery in aged mice. Circulation Research. 127 (4), 453-465 (2020).
  37. Chiu, C., et al. Temporal course of cerebrospinal fluid dynamics and amyloid accumulation in the aging rat brain from three to thirty months. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 3 (2012).
  38. Schuler, B., Rettich, A., Vogel, J., Gassmann, M., Arras, M. Optimized surgical techniques and postoperative care improve survival rates and permit accurate telemetric recording in exercising mice. BMC Veterinary Research. 5, 28 (2009).
  39. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
  40. Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
  41. de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
  42. Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).
  43. Wolter, J. M., et al. Cas9 gene therapy for Angelman syndrome traps Ube3a-ATS long non-coding RNA. Nature. 587 (7833), 281-284 (2020).
  44. Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses for combinatorial cell-subclass-specific labeling. Neuron. 109 (9), 1449-1464 (2021).
  45. Xie, M., et al. TREM2 interacts with TDP-43 and mediates microglial neuroprotection against TDP-43-related neurodegeneration. Nature Neuroscience. 25 (1), 26-38 (2022).
  46. Hsiao, E. Y., et al. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell. 155 (7), 1451-1463 (2013).
  47. Bermudez-Martin, P., et al. The microbial metabolite p-Cresol induces autistic-like behaviors in mice by remodeling the gut microbiota. Microbiome. 9 (1), 157 (2021).
  48. Needham, B. D., et al. A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice. Nature. 602 (7898), 647-653 (2022).
  49. Stewart Campbell, A., et al. Safety and target engagement of an oral small-molecule sequestrant in adolescents with autism spectrum disorder: an open-label phase 1b/2a trial. Nature Medicine. 28 (3), 528-534 (2022).
  50. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  51. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  52. Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
  53. Kaelberer, M. M., et al. A gut-brain neural circuit for nutrient sensory transduction. Science. 361 (6408), (2018).
  54. Needham, B. D., Tang, W., Wu, W. L. Searching for the gut microbial contributing factors to social behavior in rodent models of autism spectrum disorder. Developmental Neurobiology. 78 (5), 474-499 (2018).
  55. Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).
  56. Chu, C., et al. The microbiota regulate neuronal function and fear extinction learning. Nature. 574 (7779), 543-548 (2019).
  57. Wu, W. L., et al. Microbiota regulate social behaviour via stress response neurons in the brain. Nature. 595 (7867), 409-414 (2021).
  58. Buchanan, K. L., et al. The preference for sugar over sweetener depends on a gut sensor cell. Nature Neuroscience. 25 (2), 191-200 (2022).
  59. Han, W., et al. A neural circuit for gut-induced reward. Cell. 175 (3), 665-678 (2018).
  60. Yamawaki, Y., et al. Antidepressant-like effect of sodium butyrate (HDAC inhibitor) and its molecular mechanism of action in the rat hippocampus. World Journal of Biological Psychiatry. 13 (6), 458-467 (2012).
  61. Ho, L., et al. Protective roles of intestinal microbiota derived short chain fatty acids in Alzheimer's disease-type beta-amyloid neuropathological mechanisms. Expert Review of Neurotherapeutics. 18 (1), 83-90 (2018).
  62. Liu, J., et al. Anti-neuroinflammatory effect of short-chain fatty acid acetate against Alzheimer's disease via upregulating GPR41 and inhibiting ERK/JNK/NF-kappaB. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (27), 7152-7161 (2020).
  63. van de Wouw, M., et al. Short-chain fatty acids: microbial metabolites that alleviate stress-induced brain-gut axis alterations. Jounal of Physiology. 596 (20), 4923-4944 (2018).
  64. Olson, C. A., et al. The gut microbiota mediates the anti-seizure effects of the ketogenic diet. Cell. 173 (7), 1728-1741 (2018).
  65. Stewart Campbell, A., et al. Safety and target engagement of an oral small-molecule sequestrant in adolescents with autism spectrum disorder: an open-label phase 1b/2a trial. Nature Medicine. 28 (3), 528-534 (2022).

Tags

Neurovetenskap utgåva 184
Intracerebroventrikulär leverans av tarm-härledda mikrobiella metaboliter i fritt rörliga möss
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liou, C. W., Yao, T. H., Wu, W. L.… More

Liou, C. W., Yao, T. H., Wu, W. L. Intracerebroventricular Delivery of Gut-Derived Microbial Metabolites in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (184), e63972, doi:10.3791/63972 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter