Summary
نقدم هنا طريقة قائمة على قياس التدفق الخلوي للتصور والقياس الكمي للعلامات المتعددة المرتبطة بالشيخوخة في الخلايا المفردة.
Abstract
يمكن أن تحفز أدوية العلاج الكيميائي تلف الحمض النووي الذي لا يمكن إصلاحه في الخلايا السرطانية ، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج أو الشيخوخة المبكرة. على عكس موت الخلايا الماصة ، فإن الشيخوخة هي آلية مختلفة اختلافا جوهريا تقيد انتشار الخلايا السرطانية. كشفت عقود من الدراسات العلمية عن الآثار المرضية المعقدة للخلايا السرطانية الشائخة في الأورام والبيئات الدقيقة التي تعدل الخلايا السرطانية والخلايا اللحمية. تشير الأدلة الجديدة إلى أن الشيخوخة هي عامل تنبؤ قوي أثناء علاج السرطان ، وبالتالي فإن الكشف السريع والدقيق عن الخلايا الشائخة في عينات السرطان أمر ضروري. تقدم هذه الورقة طريقة لتصور واكتشاف الشيخوخة الناجمة عن العلاج (TIS) في الخلايا السرطانية. عولجت خطوط الخلايا اللمفاوية الكبيرة المنتشرة بالخلايا البائية (DLBCL) باستخدام المافوسفاميد (MAF) أو الدونوروبيسين (DN) وتم فحصها بحثا عن علامة الشيخوخة ، β-galactosidase المرتبط بالشيخوخة (SA-β-gal) ، وعلامة تخليق الحمض النووي 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) ، وعلامة تلف الحمض النووي gamma-H2AX (γH2AX). يمكن أن يساعد تصوير مقياس التدفق الخلوي في توليد صور أحادية الخلية عالية الدقة في فترة زمنية قصيرة لتصور العلامات الثلاثة في الخلايا السرطانية وتحديدها كميا في وقت واحد.
Introduction
يمكن لمجموعة متنوعة من المحفزات أن تؤدي إلى الشيخوخة الخلوية، مما يتسبب في دخول الخلايا في حالة من توقف دورة الخلية المستقرة. وتشمل هذه المحفزات تغييرات الإشارات الجوهرية أو الضغوط الخارجية. تشمل الإشارات الجوهرية تقصير التيلومير التدريجي ، والتغيرات في بنية التيلومير ، والتعديل اللاجيني ، واضطرابات البروتيوستاسيس ، وخلل الميتوكوندريا ، وتنشيط الجينات الورمية. تشمل الضغوط الخارجية إشارات تلف الالتهاب و / أو الأنسجة ، والإشعاع أو العلاج الكيميائي ، والحرمان الغذائي1،2،3،4. من بين الأنواع المتميزة من الشيخوخة ، فإن الأكثر شيوعا والمدروسة جيدا هي الشيخوخة التكرارية ، والشيخوخة التي يسببها الجين الورمي (OIS) ، والشيخوخة الناجمة عن الإشعاع ، والشيخوخة الناجمة عن العلاج (TIS). OIS هي استجابة خلوية حادة للأضرار السامة الجينية الناجمة عن الإجهاد التكراري الناتج عن تنشيط الجينات الورمية الشاذة ويمكن أن تمنع إلى حد ما التقدم المرضي من آفة ما قبل الورم إلى ورم كامل. يحدث TIS عندما يتم الضغط على الخلايا السرطانية بواسطة أدوية العلاج الكيميائي أو الإشعاع المؤين 5,6.
يعتبر الشيخوخة سيفا ذا حدين في علم الأمراض بسبب طبيعته الديناميكية للغاية. تم وصفه في البداية بأنه آلية مفيدة لقمع الورم لإزالة الخلايا التالفة من المجموعة المنتشرة للخلايا المنقسمة ، وحماية الوظيفة الطبيعية للأعضاء وتثبيط نمو الورم7،8،9. ومع ذلك ، فقد أشارت الأدلة الناشئة إلى جانب مظلم من الشيخوخة. تفرز الخلايا الشائخة السيتوكينات الالتهابية ، والمعروفة باسم النمط الظاهري الإفرازي المرتبط بالشيخوخة (SASP) ، مما يؤدي إلى التليف والأعضاء غير الوظيفية ويعزز بدء الورم وتقدمه10. علاوة على ذلك، تخضع الخلايا السرطانية الشائخة لإعادة برمجة الجينات والتعبير الجيني بالتوازي مع إعادة تشكيل الكروماتين وتنشيط استجابة مستمرة لتلف الحمض النووي (DDR)11،12، واكتساب خصائص جديدة للخلايا السرطانية الجذعية3. على الرغم من أن الأورام القادرة على الشيخوخة تستجيب بشكل أفضل للتدخل العلاجي مقارنة بالأورام غير القادرة على الشيخوخة13 ، إلا أن استمرار الخلايا الشائخة قد يؤدي إلى سوء التشخيص على المدى الطويل إذا لم يتم تحديدها والقضاء عليها بشكل فعال بواسطة الأدوية المحلل للسينوليك5. في كلتا الحالتين ، فإن الطريقة الموثوقة لتقييم الشيخوخة ذات أهمية سريرية كبيرة ، ليس فقط لتشخيص العلاج العلاجي ولكن أيضا لتطوير استراتيجيات جديدة تستهدف الخلايا الشائخة.
بغض النظر عن المحفزات المختلفة ، تظهر الخلايا الشائخة بعض السمات الشائعة ، بما في ذلك التشكل الموسع والمسطح ومتعدد النوى مع فجوات كبيرة ، ونوى موسعة بشكل كبير ، وتشكيل هيتيروكروماتين مرتبط بالشيخوخة H3K9me3 (SAHF) في النواة ، والتراكم المستمر لعلامات تلف الحمض النووي γH2AX البؤر ، وتنشيط p53-p21CIP1 و Rb-p16INK4a الآليات التنظيمية لدورة الخلية ، والقبض على دورة الخلية G1 المستقرة ، والحث الهائل ل SASP ، ونشاط β-galactosidase المرتبط بالشيخوخة (SA-β-gal)14. نظرا لعدم وجود علامة واحدة كافية لتحديد الشيخوخة ، فإن التلطيخ الأنزيمي لنشاط SA-β-gal ، والذي يعتبر المعيار الذهبي للكشف عن الشيخوخة ، عادة ما يتم دمجه مع تلطيخ كيميائي نسيجي مناعي ل H3K9me3 و Ki67 للكشف عن TIS15. ومع ذلك ، من الصعب تحديد SA-β-gal القائم على الكروموجينيك الكيميائي. هنا ، قمنا بدمج 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-D-galactopyranoside (C12FDG) للكشف عن SA-β-gal القائم على التألق (fSA-β-gal) مع تلطيخ الفلورسنت المناعي ل γH2AX و EdU-incorporated DNA لتحديد الخلايا الشائخة C12FDG + EdU-γH2AX + باستخدام نظام مقياس التدفق الخلوي المتقدم للتصوير ، والذي يجمع بين السرعة والحساسية والصور التفصيلية أحادية الخلية مع المعلومات المكانية التي لا يمكن توفيرها عن طريق قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري. تتيح هذه الطريقة التوليد السريع للصور عالية الدقة مما يسمح بتحديد مواقع إشارات الفلورسنت وتحديدها كميا داخل الخلايا ، مع ترخيص التحليل السريع لعينات متعددة من خلال بناء خطوط أنابيب قياسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. خطوط الخلايا DLBCL مع مافوسفاميد أو علاج دونوروبيسين للحث على الشيخوخة الخلوية
ملاحظة: يعمل البروتوكول أيضا مع الخلايا السرطانية الملتصقة. اعتمادا على حجم الخلية ، × البذور 1-2 10 5 خلايا في بئر واحد من صفيحة من 6 آبار وتحتضن اللوحة في حاضنة5 ٪ CO2 ، 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها قبل العلاج. خطوات البروتوكول هي نفسها بالنسبة لخلايا التعليق ولكن مع استثناءين. أولا ، يجب إزالة الخلايا من اللوحة بعد الخطوة 3.4. ثانيا ، يتم تنفيذ خطوات الغسيل دون الطرد المركزي قبل التربسين.
- عد خلايا DLBCL والبذور 1 × 10 6 خلايا / مل في 4 مل من الوسط لكل بئر في لوحة زراعة6 آبار. زراعة خلايا DLBCL في RPMI-1640 المتوسطة مع استكمال 10٪ مصل البقر الجنين (FBS) و 100 U / مل البنسلين / الستربتومايسين.
- أضف MAF (5 ميكروغرام / مل) أو DN (20 نانوغرام / مل) إلى مزرعة الخلايا وهز اللوحة بلطف للخلط.
ملاحظة: MAF و DN غير مستقرين. بعد الذوبان في DMSO ، يجب أن يكون محلول المخزون مذكورا وتخزينه عند -20 درجة مئوية. يجب تجنب دورات التجميد / الذوبان. - احتضان اللوحة في حاضنة 5٪ CO2 ، 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
- بعد حضانة لمدة 3 أيام ، اجمع خلايا DLBCL في أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 15 مل وتدور عند 100 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
- تخلص من السوبرناتانت ، وأعد تعليق كريات الخلايا مع 4 مل من الوسط الطازج ، وأضف المعلقات مرة أخرى إلى اللوحة المكونة من 6 آبار.
- زراعة لوحة الخلية في حاضنة 5٪ CO2 ، 37 درجة مئوية لمدة يومين آخرين قبل الحصاد للتحليل.
2. إعداد حلول للتلطيخ (الجدول 1)
3. بقع خلايا DLBCL مع علامات الشيخوخة المختلفة
ملاحظة: يتم إعداد عينات الخلايا الملطخة بعلامات فردية (أي المحيط الهادئ الأزرق EdU أو C12FDG أو Alexa Fluor 647-γH2AX) لإنشاء مصفوفة تعويض لتصحيح امتداد التألق أثناء القياس. وعلى الرغم من الاقتراح الشديد، يمكن تعليق هذه الخطوة عندما يكون هناك تداخل قابل للحذف (قيمة معامل التعويض ≤ 0.1) لأطياف الانبعاثات بين مختلف الفلوروفورات. ومع ذلك ، يجب على المستخدمين تحديد خطوات التعويض الموحدة عند استخدام أدوات مختلفة وألواح الفلورسنت.
- أضف محلول EdU 10 mM بنسبة 1: 1000 إلى مزرعة خلايا DLBCL المتولدة من الخطوة 1.6 (تركيز EdU النهائي هو 10 ميكرومتر). هز الطبق بلطف لخلطه واحتضانه في حاضنة 5٪ CO2 ، 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
- أخرج الصفيحة من الحاضنة وأضف محلول الكلوروكين 100 mM إلى تركيز نهائي قدره 75 ميكرومتر (انظر المناقشة). هز الطبق بلطف لتخلط وتحضن في حاضنة 5٪ CO2 ، 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- أخرج اللوحة من الحاضنة وأضف محلول 20 mM C 12 FDG عند 1: 1000 إلى تركيز C 12FDG النهائي البالغ 20ميكرومتر.
- أخرج اللوحة من الحاضنة وأضف محلول 100 mM 2-phenylethyl-β-D-thiogalactoside (PETG) في الساعة 1:50 لإيقاف تلطيخ fSA-β-gal (تركيز PETG النهائي 2 mM). قم بتدوير اللوحة بلطف للخلط.
- انقل الخلايا إلى أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 15 مل وتدور عند 100 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الفائقة واغسل الخلايا ب 4 مل من المياه المالحة العازلة بالفوسفات (PBS).
- كرر خطوة غسيل PBS. تخلص من supernatant وأعد تعليق كريات الخلايا في 500 ميكرولتر من محلول تثبيت بارافورمالديهايد بنسبة 4٪.
- بعد 10 دقائق من الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، جهاز طرد مركزي عند 250 × جم ، درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. تخلص من supernatant واغسل الخلايا ب 4 مل من PBS.
- كرر خطوة غسيل PBS. تخلص من السوبرناتانت ، وأعد تعليق بيليه الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لنفاذية الصابونين وانقل التعليق إلى أنبوب جديد 1.5 مل. بعد 10 دقائق من الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، جهاز طرد مركزي عند 250 × جم ، درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق كريات الخلايا في 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية (1:500 γH2AX من الأجسام المضادة في محلول حضانة الأجسام المضادة). احتضان في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها في الظلام.
- جهاز طرد مركزي للأنابيب عند 250 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. تخلص من السوبر ناتانت واغسله ب 100 ميكرولتر من محلول غسل الصابونين.
- كرر خطوة الغسيل مرتين إضافيتين. تخلص من السوبرناتانت وأعد تعليق كريات الخلايا في 500 ميكرولتر من كوكتيل الكشف عن EdU.
- احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام. جهاز طرد مركزي عند 250 × جم ، درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. تخلص من السوبر ناتانت واغسله ب 1 مل من محلول غسيل الصابونين.
- كرر خطوة الغسيل مرتين. تخلص من السوبرناتانت وأعد تعليق كريات الخلايا في 20-50 ميكرولتر من PBS. انتقل إلى القسم 4 لقياس العينة.
4. تصوير علامات الشيخوخة باستخدام نظام مقياس التدفق الخلوي للتصوير
- أفرغ زجاجة سائل النفايات. تحقق من مستويات الخرز السريع، والمعقم، والمنظف، ومزيل الفقاعات، والغمد، وكواشف الشطف (الماء منزوع الأيونات) لضمان وجود سوائل كافية قبل تشغيل الجهاز (انظر جدول المواد).
- قم بتشغيل الأداة وبرنامج التصوير (انظر واجهة البرنامج في الشكل 1A).
- انقر فوق الزر " بدء التشغيل" لتهيئة الموائع ومعايرة النظام.
ملاحظة: يستغرق هذا الإجراء حوالي 45 دقيقة. - اضبط التكبير على 40x ، واضبط سرعة الموائع على منخفضة ، وقم بتشغيل أشعة الليزر اللازمة في التجربة. قم بتشغيل ليزر 405 نانومتر و 488 نانومتر و 642 نانومتر لقياس أزرق EdU-pacific و C12FDG و Alexa Fluor 647-γH2AX (أو Alexa Fluor 647-Ki67) ، على التوالي. اضبط Ch6 للقناة المبعثرة ، و Ch1 و Ch9 ل brightfield.
- ابدأ بالعينة المتوقع أن يكون لها أعلى تألق لإعداد شدة الليزر. اقلب أنبوب العينة برفق لمزجه. افتح غطاء الأنبوب، وأدخل أنبوب العينة في الرصيف. انقر فوق تحميل للبدء.
- افتح مخططا مبعثرا وحدد المعالم Area_M01 Ratio_M01 Aspect للمحورين X وY، على التوالي. اضبط بوابة فوق نسبة العرض إلى الارتفاع تبلغ 0.5 لاستبعاد الثنائيات ومجاميع الخلايا أسفل الجانب الأيمن وعليه، ومجموعات خرزة السرعة على الجانب الأيسر (الشكل 1B).
- افتح مخطط رسم بياني وحدد ميزة التدرج RMS_M01_Ch01 للمحور X. اختر المجموعة المفردة واضبط البوابة للاختيار للخلايا المركزة (الشكل 1C).
ملاحظة: سيستخدم نظام التصوير تلقائيا حبات السرعة لضبط التركيز البؤري للتصوير. ومع ذلك ، يوصى باختيار النصف الأيمن من ذروة الرسم البياني للسكان الأكثر تركيزا. - افتح مخطط رسم بياني وحدد كثافة Raw Max Pixel للمحور X لكل قناة ألوان (Ch2 و7 و11). اضبط قوى الليزر (أي ليزر 488 نانومتر و 405 نانومتر و 642 نانومتر ل Ch2 و 7 و 11 ، على التوالي) ، بحيث يكون لكل فلوروكروم قيمة Raw Max Pixel بين 100 و 4000 لتجنب الإفراط في التشبع .
ملاحظة: بالنسبة لهذه التجربة، يكون إعداد طاقة الليزر 50 ميجاوات و200 ميجاوات و50 ميجاوات لليزر 488 نانومتر و405 نانومتر و642 نانومتر على التوالي. - اختر المجموعة المركزة لتسجيلها وانقر فوق اكتساب لقياس عينات DLBCL بإعدادات متسقة. عند تغيير العينات للقياس ، انقر فوق "رجوع" لاستعادة أنبوب العينة. اضغط على تحميل لتجاهل العينة.
- بعد قياس جميع العينات ، قم بإيقاف تشغيل الحقل الساطع وتشتت الليزر. قم بقياس عينات التحكم أحادية اللون لإنشاء مصفوفة تعويض.
- انقر فوق إيقاف التشغيل لإغلاق نظام التصوير.
- تحليل البيانات في برنامج تحليل الصور.
- استخدم أداة Spot Wizard الخاصة ببرنامج تحليل الصور لحساب بؤر γH2AX النووية وتحديدها تلقائيا في صور الخلايا الحية. حدد مجموعتين من الخلايا (واحدة ذات عدد نقاط مرتفع والأخرى ذات عدد نقاط منخفض) لتدريب معالج البقع على مزيد من التحليل التلقائي لعدد النقاط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم إنشاء مصفوفة تعويض باستخدام برنامج تحليل الصور عن طريق تحميل البيانات المسجلة لعينات التحكم أحادية اللون. كما هو موضح في الشكل التكميلي S1 ، تم الكشف عن امتداد ضوئي لا يكاد يذكر (قيمة المعامل ≥ 0.1) من EdU إلى C12FDG بقيمة معامل المحادثة المتقاطعة 0.248 ، في حين أن المحادثة المتقاطعة بين القنوات الأخرى لم تكن كبيرة. تمت معالجة أربعة خطوط خلايا DLBCL مختلفة باستخدام 5 ميكروغرام / مل MAF أو 20 نانوغرام / مل DN للحث على الشيخوخة الخلوية وتحليلها باستخدام إما تلطيخ SA-β-gal التقليدي أو طريقة التصوير لتدفق الخلايا.
دخلت أكثر من 70٪ من خلايا KARPAS422 و WSU-DLCL2 و OCI-LY1 في حالة الشيخوخة ، المشار إليها ب SA-β-gal الإيجابية ، في حين أن SU-DHL6 كان مقاوما تماما لتحريض الشيخوخة بواسطة MAF و DN (الشكل التكميلي S2A). والجدير بالذكر أن MAF و DN قد حفزا أيضا موت الخلايا في جميع خلايا DLBCL ، وإن لم يكن بشكل كبير (الشكل التكميلي S2B). باستخدام طريقة التصوير بالتدفق الخلوي ، أظهرت الصور أحادية الخلية ، والقياس الكمي القائم على قياس التدفق الخلوي زيادة في عدد السكان المسنين C 12 FDG + EdU-γH2AX + في KARPAS422 و WSU-DLCL2 و OCI-LY1 ولكن ليس في خلايا SU-DHL6 (الشكل 2A-D) ، والتي كانت متسقة مع نتائج تلطيخSA-β-gal التقليدية. ومع ذلك ، كانت النسبة المئوية للسكان المسنين C 12 FDG + EdU-γH2AX + أقل بكثير من طريقة تلطيخ SA-β-gal التقليدية (الشكل 2 والشكل التكميلي S2).
علاوة على ذلك ، أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي التصويري قابلية متنوعة للشيخوخة بين خطوط خلايا DLBCL المختلفة ، والتي لم يتم تمييزها بوضوح عن طريق تلطيخ SA-β-gal التقليدي. كانت النسبة المئوية لخلايا OCI-LY1 الشائخة C12FDG + EdU-γH2AX + (أي 43.2٪ و 31.9٪ مع MAF و DN ، على التوالي) ، أقل بكثير من تلك الموجودة في KARPAS422 (62.2٪ و 73.8٪ مع MAF و DN ، على التوالي) و WSU-DLCL2 (60٪ و 58.1٪ مع MAF و DN ، على التوالي) (الشكل 2). الأهم من ذلك ، أن التحليل القائم على التصوير قدم أعدادا أعلى بكثير من بؤر γH2AX في KARPAS422 و WSU-DLCL2 و OCI-LY1 ولكن ليس في خلايا SU-DHL6 (الشكل 3A ، B).
الشكل 1: واجهة برنامج التشغيل وإعداد الأداة. (أ) واجهة برنامج قياس التدفق الخلوي للتصوير. تحتوي لوحة صورة الخلية الحية (أعلى اليسار) على صور خلايا حية لجميع قنوات الصور ال 12 وأدوات ضبط الصورة (على سبيل المثال، التكبير/التصغير، وتحديد عدد الخلايا، وتغيير اللون، والقناع، وضبط خصائص الصورة). تحتوي منطقة تحليل قياس التدفق الخلوي (أسفل اليسار) على شريط أدوات لتحليل قياس التدفق الخلوي، مثل مخطط الرسم البياني، ومخطط التشتت، وبوابات المنطقة المختلفة، والتخطيط، وإحصاءات السكان. تحتوي لوحة التحكم (يمين) على قوائم للحصول على البيانات وحفظها، وإعداد الإضاءة، والتكبير، والتحكم في سرعة الموائع، والتركيز البؤري، والتمركز. (ب) اختيار السكان وحيدي الخلية. (ج) اختيار مجموعة الخلايا المركزة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تصور وقياس كمية الخلايا الشائخة على مستوى خلية واحدة. الصور التمثيلية (اللوحة اليسرى) وتحليل التدفق الخلوي للخلايا الشائخة C 12 FDG + EdU-γH2AX + (اللوحة اليمنى) من (A) KARPAS422 و (B) WSU-DLCL2 و (C) OCI-LY1 و (D) خلايا SU-DHL6 المعالجة ب 5 ميكروغرام / مل MAF أو 20 نانوغرام / مل DN لمدة 5 أيام وملطخة ب fSA-β-gal و EdU و γH2AX. تم استخدام الخلايا المعالجة ب DMSO كعنصر تحكم. الاختصارات: C12FDG = 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-Dgalactopyranoside; EdU = 5-ethynyl-2′-deoxyuridine; γH2AX = شكل مفسفرة من هيستون H2AX ؛ DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسيد; MAF = مافوسفاميد; DN = دونوروبيسين; fSA-β-gal = β-galactosidase المرتبط بالشيخوخة القائم على التألق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: القياس الكمي القائم على التصوير لبؤر γH2AX النووية في الخلايا الشائخة. (أ) صور تمثيلية لبؤر γH2AX في خلايا DLBCL (انظر نص الشكل 2 للحصول على تفاصيل العلاج والتلطيخ). (ب) التردد (يسار) والقياس الكمي (يمين) لأعداد بؤر γH2AX في خلايا DLBCL. الاختصارات: γH2AX = شكل مفسفرة من هيستون H2AX; DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسيد; MAF = مافوسفاميد; DN = دونوروبيسين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| حل | التعليقات | |
| حل EdU 10 mM في DMSO | يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية. | |
| حل 20 mM C12FDG في DMSO | يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية. | |
| محلول كلوروكين 100 مللي متر في الماء منزوع الأيونات | يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية. | |
| محلول PETG 100 mM في الماء منزوع الأيونات | يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية. | |
| حل التثبيت: 4٪ PFA (بارافورمالديهايد) في PBS | أعدت طازجة. تحذير: PFA ضار. يستخدم مع الاحتياطات المناسبة. | |
| المخزن المؤقت للنفاذية: 1٪ سابونين (ث / v) ، 3٪ BSA (ث / v) في PBS ، أعدت حديثا. | محضر طازج | |
| محلول حضانة الأجسام المضادة: 0.1٪ سابونين (ث / v) ، 3٪ BSA (ث / v) في PBS | محضر طازج | |
| محلول الغسيل: 0.1٪ سابونين (ث / v) ، 0.5٪ BSA (ث / v) في PBS | محضر طازج | |
| كوكتيل الكشف عن EdU: تمييع CuSO4 (100 ملليمتر) في الساعة 1:50 ، ومحلول أزيد أزرق المحيط الهادئ في الساعة 1:200 ، ومضاف مؤقت للتفاعل (200 مجم / مل) في 1:100 في PBS | محضر طازج | |
الجدول 1: حلول للتلطيخ.
الشكل التكميلي S1: مصفوفة التعويض من EdU-Pacific Blue و C12FDG-Fluorescein و AF647-γH2AX. الاختصارات: C12FDG = 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-Dgalactopyranoside; EdU = 5-ethynyl-2′-deoxyuridine; γH2AX = شكل مفسفرة من هيستون H2AX ؛ AF647 = أليكسا فلور 647. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S2: الشيخوخة الناجمة عن العلاج لخطوط خلايا DLBCL. (أ) تلطيخ SA-β-gal التقليدي (اللوحة اليسرى) والقياس الكمي (اللوحة اليمنى) لخطوط خلايا DLBCL المشار إليها المعالجة ب 5 ميكروغرام / مل MAF أو 20 نانوغرام / مل DN. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر. (B) النسبة المئوية لموت الخلايا التي تم تحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي (اللوحة اليسرى) والقياس الكمي (اللوحة اليمنى) لخطوط خلايا DLBCL كما في A. كانت الخلايا ملطخة بصبغة الأشباح الزرقاء في المحيط الهادئ في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. الاختصارات: DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسايد; MAF = مافوسفاميد; DN = دونوروبيسين; SA-β-gal = β-galactosidase المرتبط بالشيخوخة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S3: الصور التمثيلية وتحليل قياس التدفق الخلوي. (أ) الصور التمثيلية وتحليل التدفق الخلوي للخلايا الشائخة C 12 FDG + EdU-Ki67 + (B) من خلايا KARPAS422 و WSU-DLCL2 المعالجة ب MAF لمدة 5 أيام والملطخة ل fSA-β-gal و EdU و Ki67. تم استخدام الخلايا المعالجة ب DMSO كعنصر تحكم. الاختصارات: C12FDG = 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-Dgalactopyranoside; EdU = 5-ethynyl-2′-deoxyuridine; DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسيد; MAF = مافوسفاميد; DN = دونوروبيسين; fSA-β-gal = β-galactosidase المرتبط بالشيخوخة القائم على التألق. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
فحصت هذه الطريقة القدرة على دخول الشيخوخة لأربعة خطوط مختلفة من خلايا DLBCL عند العلاج الكيميائي ، مع التصوير الساطع المجال والقياس الكمي القائم على التدفق الخلوي. على مستوى الخلية الواحدة، نجحنا في اكتشاف المجموعات السكانية الشائخة الرئيسية C12FDG+EdU-Ki67+ في خلايا KARPAS422 وWSU-DLCL2 المعالجة، وبدرجة أقل في خلايا OCI-LY1، في حين أن خط خلايا SU-DHL6 كان مقاوما للعلاج. يمكن تفسير الفرق في القدرة على دخول الشيخوخة بين خطوط الخلايا من خلال عيوبها الجينومية المتميزة16,17. ومع ذلك ، فإن كثافة زراعة الخلايا غير المناسبة أو تركيز الدواء قد تؤثر أيضا على قابلية الشيخوخة للتحريض. يجب اختيار التخفيفات التسلسلية لكثافة الخلايا وتركيز الدواء بعناية لإجراء فحص أكثر شمولا. والجدير بالذكر أن هذه الطريقة كانت حساسة بما يكفي للكشف بدقة عن السكان المسنين الذين يحدثون بشكل طبيعي في خلايا DLBCL دون تحفيز إضافي للسمية الجينية (C12FDG + EdU-Ki67 + DMSO المجموعة المعالجة في الشكل 3).
يختلف مستوى نشاط β-galactosidase وإيقاع تخليق الحمض النووي بشكل كبير بين أنواع الخلايا المختلفة. وقت الحضانة المذكور (أي 3 ساعات ل EdU و 1 ساعة ل C12FDG) يكفي بشكل عام للتمييز بين التلطيخ الإيجابي والسلبي في المختبر. ومع ذلك ، في ظروف خاصة (على سبيل المثال ، الخلايا بطيئة النمو أو الخلايا ذات النشاط العالي للغاية β-galactosidase) ، قد يكون من الضروري إطالة وضع علامات EdU أو تقصير تلطيخ C12FDG لتحسين التمييز ، على التوالي. يقترح إجراء تجربة تجريبية مع وقت حضانة تسلسلي لتحسين الظروف التجريبية (على سبيل المثال ، زيادة 30 دقيقة أو 15 دقيقة انخفاض ل EdU أو C12FDG ، على التوالي). للتمييز بشكل أفضل بين الاختلافات في fSA-β-gal بين الخلايا المنتشرة ونظيراتها الشائخة ، يوصى بالحضانة المسبقة باستخدام الكلوروكين أو bafilomycin A1 لخفض النشاط الليزوزومي القاعدي عن طريق تحفيز قلوية الليزوسومات18,19. بالنسبة للخلايا ذات النشاط الليزوزومي المنخفض نسبيا ، يمكن حذف خطوة ما قبل الحضانة.
بنية غشاء الخلية السليمة ضرورية للكشف عن fSA-β-gal. في هذه الطريقة ، استخدمنا EdU بدلا من BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) لقياس تخليق الحمض النووي. بالمقارنة مع دمج BrdU ، يحتاج EdU إلى حالة تلطيخ خفيفة نسبيا ، والتي تحافظ على بنية الغشاء السليمة وتسمح بالتلطيخ المشترك مع fSA-β-gal. والجدير بالذكر أن الكشف بوساطة الأجسام المضادة للبروتينات داخل الخلايا أو النووية (على سبيل المثال ، γH2AX) الموصوفة هنا يحتاج أيضا إلى اختراق غشاء الخلية للسماح بدخول الأجسام المضادة. هنا ، تم استبدال الصابونين بالمنظف القوي Triton X-100 لتجنب إخماد إشارة fSA-β-gal.
العلاج الكيميائي لا يؤدي فقط إلى الشيخوخة ولكن أيضا موت الخلايا في خلايا DLBCL. قد يكون للخلايا الميتة تأثير لا يستهان به عند تحديد كمية السكان المسنين لأنها قد تؤدي إلى إيجابيات كاذبة أو سلبيات كاذبة أثناء التلطيخ. على الرغم من أن معظم حطام الخلايا وجثث الخلايا الميتة صغيرة الحجم سيتم استبعادها خلال خطوات الغسيل والطرد المركزي المتعددة ، إلا أن عدد الخلايا الميتة المتبقية قد لا يزال له تأثير لا يستهان به. يقترح تحسين تركيز الدواء لتجنب موت الخلايا بشكل جذري. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام تلطيخ صلاحية الخلايا (على سبيل المثال ، صبغة الأشباح) لتسهيل التمييز بين سكان الخلايا الميتة وتحديد عدد الشيخوخة بشكل أكثر صرامة.
نظام قياس التدفق الخلوي المتقدم للتصوير المستخدم في هذه الطريقة هو مقياس تدفق خلوي تصويري متعدد القنوات ، والذي يسمح بقياس القياسات القائمة على التدفق الخلوي وفحص الصور متعددة الألوان للخلايا المفردة بالتوازي. إنه يوفر حلا كميا سريعا وفعالا ودقيقا للكشف عن الشيخوخة ، وفي الوقت نفسه ، يولد دقة خلية واحدة وصورا متعددة الألوان مع معلومات مكانية لعلامات متعددة. ومع ذلك، لا تزال هناك بعض القيود. على سبيل المثال ، تكون دقة الصورة محدودة مقارنة بالمجهر المتطور ، مما يعوق تحليلا شاملا للتوطين تحت الخلوي عند تتبع البروتينات الموجودة في عضيات أصغر بخلاف النواة. بالمقارنة مع برامج التشغيل والتحليل المتطورة لمقياس التدفق الخلوي القياسي ، فإنه أقل ملاءمة وأقل كفاءة لإعداد أو تغيير استراتيجيات بوابات السكان. كما أن القياس الكمي والتحليل الإحصائي أكثر تعقيدا.
يتميز تلطيخ fSA-β-gal بمزايا كبيرة على SA-β-gal التقليدي للتلطيخ السريع والقياس الكمي غير المتحيز ولديه القدرة على التصنيف الفعال للخلايا الشائخة. تم تطبيق هذه التقنية بنجاح لفحص الخلايا الشائخة التي تعود إلى دورة انقسام الخلايا3،18،19،20. في هذه الطريقة ، اتخذنا خطوة أخرى إلى الأمام لدمج fSA-β-gal مع EdU و γH2AX لتحديد الخلايا الشائخة بشكل أكثر دقة وموثوقية. والجدير بالذكر أنه على الرغم من اختيار fSA-β-gal و EdU و γH2AX كعلامات مرتبطة بالشيخوخة في هذه الطريقة ، إلا أنه يمكن بسهولة تكييف علامات الشيخوخة الموثوقة الأخرى لتحل محل العلامات الثلاثة أو تضاف إليها. نظرا للاهتمام الكبير بالشيخوخة في الأوساط الأكاديمية ، تم تحديد العديد من العلامات الموثوقة المرتبطة بالشيخوخة ، مثل ارتفاع إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلي السيتوبلازمي (ROS) ، وعوامل SASP المفرزة ، وانخفاض تنظيم Ki67 ، وفقدان بروتين الغلاف النووي Lamin B1 ، وزيادة علامة heterochromatin H3K9me321,22. أظهر الشكل التكميلي S3 اكتشافا ناجحا للمجموعات السكانية الشائخة C12FDG + EdU-Ki67 في خلايا TIS KARPAS422 و WSU-DLCL2.
علاوة على ذلك ، هناك العديد من علامات سطح خلايا الشيخوخة المتاحة للاختبار باستخدام هذه الطريقة ، مثل ICAM-1 و NOTCH1 و NOTCH3 و DDP4 و CD36 و uPAR. لا يتطلب الكشف عن علامات سطح الخلية سوى وقت حضانة قصير للأجسام المضادة دون تثبيت الخلايا واختراقها ، مما سيؤدي إلى تقصير إجراء التلطيخ في سير عمل مدته 6 ساعات بالاشتراك مع fSA-β-gal و EdU ، أو حتى في تجربة 2 ساعة بالاشتراك مع fSA-β-gal فقط ، والأهم من ذلك ، أنه يسمح بتصوير الخلايا الحية. يمكن أن تكون الطريقة المعدلة بمثابة نهج سريع وموثوق ومجد في العيادة لتحديد خلايا الشيخوخة في الجسم الحي ، ليس فقط للتقييم التشخيصي والتنبؤي ولكن أيضا لدعم المزيد من التدخل السينوليتيكي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال منحة إلى يونغ يو من جامعة يوهانس كيبلر لينز (BERM16108001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613407 | |
| Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647) | Biolegend | 350509 | |
| C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside) | Fisher Scientific | 11590276 | |
| Chloroquin -diphosphat | Sigma aldrich | C6628 | |
| Cleanser (Coulter Clenz) | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit | Thermo Scientific | C10418 | |
| Daunorubicin | Medchemexpress | HY-13062A | |
| Debubbler (70% Isopropanol) | Millipore | 1.3704 | |
| Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3) | Luminex | CN-SW69-12 | |
| Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software) | Luminex | 100220 | |
| KARPAS | DSMZ | ACC 31 | |
| mafosfamide cyclohexylamine | Niomech | D-17272 | |
| OCI-LY1 | DSMZ | ACC 722 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 11473704 | |
| PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid) | Sigma aldrich | P4902 | |
| saponin | Sigma aldrich | 47036 | |
| Sheath | Millipore | BSS-1006-B | |
| SpeedBead Kit for ImageStream | Luminex | 400041 | |
| Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite) | VWR | JT9416-1 | |
| SU-DHL6 | DSMZ | ACC 572 | |
| WSU-DLCL2 | DSMZ | ACC 575 |
References
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S.
- Di Micco, R., et al. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).
- Milanovic, M., et al. Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness. Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).
- Passos, J. F., et al. Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence. Molecular Systems Biology. 6 (1), 347 (2010).
- Lee, S., Schmitt, C. A. The dynamic nature of senescence in cancer. Nature Cell Biology. 21 (1), 94-101 (2019).
- Toussaint, O., et al. Stress-induced premature senescence or stress-induced senescence-like phenotype: one in vivo reality, two possible definitions. The Scientific World Journal. 2, 230-247 (2002).
- Collado, M., Blasco, M. A., Serrano, M. Cellular senescence in cancer and aging. Cell. 130 (2), 223-233 (2007).
- Munoz-Espin, D., et al. Programmed cell senescence during mammalian embryonic development. Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).
- Faget, D. V., Ren, Q., Stewart, S. A. Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer. Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).
- Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
- Chandra, T., et al. Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells. Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).
- Rodier, F., et al. Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion. Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).
- Schleich, K., et al. H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients. Nature Communications. 11 (1), 3651 (2020).
- Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d'Adda di Fagagna, F. Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).
- Fan, D. N., Schmitt, C. A. Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).
- Schmitt, C. A., Lowe, S. W. Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models. Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).
- Dorr, J. R., et al. Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy. Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).
- Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A.
- Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
- Biran, A., et al. Quantitative identification of senescent cells in aging and disease. Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).
- Rossi, M., Abdelmohsen, K. The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets. Cells. 10 (7), 1740 (2021).
- Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).
