Summary
Her presenterer vi en flowcytometribasert metode for visualisering og kvantifisering av multiple senescensassosierte markører i enkeltceller.
Abstract
Kjemoterapeutiske legemidler kan indusere uopprettelig DNA-skade i kreftceller, noe som fører til apoptose eller for tidlig senescens. I motsetning til apoptotisk celledød, er senescence et fundamentalt annet maskineri som begrenser forplantning av kreftceller. Tiår med vitenskapelige studier har avslørt de komplekse patologiske effektene av senescent kreftceller i svulster og mikromiljøer som modulerer kreftceller og stromale celler. Nye bevis tyder på at senescens er en potent prognostisk faktor under kreftbehandling, og derfor er rask og nøyaktig påvisning av senescentceller i kreftprøver avgjørende. Denne artikkelen presenterer en metode for å visualisere og oppdage terapiindusert senescens (TIS) i kreftceller. Diffuse store B-cellelymfom (DLBCL) cellelinjer ble behandlet med mafosfamid (MAF) eller daunorubicin (DN) og undersøkt for senescensmarkør, senescensassosiert β-galaktosidase (SA-β-gal), DNA-syntesemarkør 5-ethynyl-2′-deoksyuridin (EdU) og DNA-skademarkør gamma-H2AX (γH2AX). Flowcytometeravbildning kan bidra til å generere høyoppløselige enkeltcellebilder på kort tid for samtidig å visualisere og kvantifisere de tre markørene i kreftceller.
Introduction
En rekke stimuli kan utløse cellulær senescens, noe som får celler til å gå inn i en tilstand av stabil cellesyklusarrest. Disse stimuli inkluderer inneboende signalendringer eller ekstrinsiske påkjenninger. Intrinsiske signaler inkluderer progressiv telomerforkortelse, endringer i telomerstruktur, epigenetisk modifikasjon, proteostaseforstyrrelser, mitokondriell dysfunksjon og aktivering av onkogener. Ytre påkjenninger inkluderer betennelses- og/eller vevsskadesignaler, stråling eller kjemisk behandling, og næringsdeprivasjon 1,2,3,4. Blant forskjellige typer senescens er de mest sett og godt studerte replikativ senescens, onkogenindusert senescens (OIS), strålingsindusert senescens og terapi-indusert senescens (TIS). OIS er en akutt cellulær respons på gentoksisk skade forårsaket av replikativt stress generert av avvikende onkogenaktivering og kan til en viss grad forhindre den patologiske progresjonen fra en preneoplastisk lesjon til en fullblåst tumor. TIS skjer når tumorceller blir stresset av kjemoterapeutiske legemidler eller ioniserende stråling 5,6.
Senescence regnes som et tveegget sverd i patologi på grunn av sin svært dynamiske natur. Det ble opprinnelig beskrevet som en gunstig tumorundertrykkende mekanisme for å fjerne skadede celler fra det sirkulerende bassenget av delende celler, beskytte organets normale funksjon og hemme tumorvekst 7,8,9. Imidlertid har nye bevis antydet en mørk side av senescence. Senescentceller utskiller proinflammatoriske cytokiner, kjent som senescensassosiert sekretorisk fenotype (SASP), noe som fører til fibrose og funksjonsfeil organer og fremmer tumorinitiering og progresjon10. Videre gjennomgår senescent kreftceller epigenetisk og genuttrykksreprogrammering parallelt med kromatinremodellering og aktivering av en vedvarende DNA-skaderespons (DDR)11,12, nyinnkjøp av nye kreftstamcelleegenskaper3. Selv om senescens-kompatible svulster reagerer bedre på terapeutisk intervensjon sammenlignet med senescence-incapable de13, kan persistensen av senescentceller føre til en dårlig langsiktig prognose hvis de ikke effektivt identifiseres og elimineres av senolytiske legemidler5. Uansett er en pålitelig metode for å vurdere senescens av betydelig klinisk interesse, ikke bare for prognosen for terapibehandling, men også for utvikling av nye strategier rettet mot senescentceller.
Uavhengig av forskjellige utløsere, viser senescentceller noen vanlige trekk, inkludert forstørret, flatt, multinukleær morfologi med store vakuoler, signifikant utvidede kjerner, dannelse av H3K9me3-rik senescensassosiert heterokromatin (SAHF) i kjernen, vedvarende akkumulering av DNA-skademarkør γH2AX foci, aktivert p53-p21CIP1 og Rb-p16INK4a cellesyklusreguleringsmekanismer, stabil G1-cellesyklusarrest, massiv induksjon av SASP og forhøyet senescensassosiert β-galaktosidase (SA-β-gal) aktivitet14. Siden ingen enkelt markør er tilstrekkelig til å definere senescens, kombineres enzymatisk farging for SA-β-gal-aktivitet, som regnes som gullstandarden for senescensdeteksjon, vanligvis med immunhistokjemisk farging for H3K9me3 og Ki67 for å oppdage TIS15. Kjemisk kromogenbasert SA-β-gal er imidlertid vanskelig å kvantifisere. Her kombinerte vi 5-dodekanoylaminofluorescein-di-β-D-galactopyranoside (C12FDG) fluorescensbasert SA-β-gal (fSA-β-gal) deteksjon med immunfluorescerende farging for γH2AX og EdU-inkorporert DNA for å identifisere C12FDG + EdU-γH2AX + senescentceller ved hjelp av det avanserte imaging flow cytometer-systemet, som kombinerer hastighet, følsomhet og detaljerte enkeltcellebilder med romlig informasjon som ikke kan leveres ved flowcytometri og mikroskopi. Denne metoden muliggjør rask generering av høyoppløselige bilder som muliggjør posisjonering og kvantifisering av fluorescerende signaler i celler, samtidig som den lisensierer rask analyse av flere prøver ved å bygge standard rørledninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. DLBCL-cellelinjer med mafosfamid- eller daunorubicinbehandling for å indusere cellulær senescens
MERK: Protokollen fungerer også for adherent kreftceller. Avhengig av cellestørrelse, frø 1-2 × 105 celler i en brønn av en 6-brønns plate og inkuberer platen i en 5% CO2, 37 ° C inkubator over natten før behandling. Protokolltrinnene er de samme som for suspensjonsceller, men med to unntak. Først må cellene trypsiniseres av platen etter trinn 3.4. For det andre utføres vasketrinn uten sentrifugering før trypsinisering.
- Tell DLBCL-celler og frø 1 × 106 celler / ml i 4 ml medium per brønn i en 6-brønns kulturplate. Dyrk DLBCL-celler i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 100 U / ml penicillin / streptomycin.
- Tilsett MAF (5 μg/ml) eller DN (20 ng/ml) i cellekulturen og vugg platen forsiktig for å blande.
MERK: MAF og DN er ikke stabile. Etter oppløsning i DMSO skal stamløsningen aliquoteres og oppbevares ved -20 °C. Fryse-/tinesykluser bør unngås. - Inkuber platen i en inkubator på 5 % CO2, 37 °C i 3 dager.
- Etter en 3 dagers inkubasjon samler du DLBCL-cellene i 15 ml sterile sentrifugerør og spinner ved 100 × g, 4 °C i 5 minutter.
- Kast supernatanten, resuspender cellepellets med 4 ml ferskt medium, og tilsett suspensjonene tilbake i 6-brønnsplaten.
- Dyrk celleplaten i en inkubator på 5% CO2, 37 ° C i ytterligere 2 dager før høsting for analyse.
2. Klargjør løsninger for farging (tabell 1)
3. Flekk DLBCL-celler med forskjellige senescensmarkører
MERK: Celleprøver farget med individuelle markører (dvs. stillehavsblå-EdU, C12FDG eller Alexa Fluor 647-γH2AX) er forberedt på å generere en kompensasjonsmatrise for å korrigere fluorescensutslippet under måling. Selv om det er sterkt foreslått, kan dette trinnet suspenderes når det er en utelatbar overlapping (kompensasjonskoeffisientverdi ≤ 0,1) av utslippsspektrene blant forskjellige fluoroforer. Brukerne må imidlertid bestemme standardiserte kompensasjonstrinn ved bruk av forskjellige instrumenter og fluorescerende paneler.
- Tilsett 10 mM EdU-løsning i forholdet 1:1000 i DLBCL-cellekulturen generert fra trinn 1.6 (endelig EdU-konsentrasjon er 10 μM). Vugg platen forsiktig for å blande og ruge i en inkubator på 5 % CO2, 37 °C i 3 timer.
- Ta platen ut av inkubatoren og tilsett 100 mM klorokinoppløsning til en endelig konsentrasjon på 75 μM (se diskusjon). Vugg platen forsiktig for å blande og ruge i en inkubator på 5 % CO2, 37 °C i 30 minutter.
- Ta platen ut av inkubatoren og tilsett 20 mM C12FDG-løsning ved 1: 1000 til en endelig C12FDG-konsentrasjon på 20 μM. Rist platen forsiktig for å blande og inkubere i en inkubator på 5% CO2, 37 ° C i 1 time.
- Ta platen ut av inkubatoren og tilsett 100 mM 2-fenyletyl-β-D-tiogalaktosid (PETG) løsning kl. 1:50 for å stoppe fSA-β-gal-fargingen (endelig PETG-konsentrasjon på 2 mM). Roter platen forsiktig for å blande.
- Overfør cellene til 15 ml sterile sentrifugerør og spinn ved 100 × g, 4 °C i 5 minutter. Kast supernatanten og vask cellene med 4 ml fosfatbufret saltvann (PBS).
- Gjenta PBS vasketrinn. Kast supernatanten og resuspender cellepellets i 500 μL 4% paraformaldehydfikseringsløsning.
- Etter 10 min inkubasjon ved romtemperatur, sentrifuge ved 250 × g, romtemperatur i 5 min. Kast supernatanten og vask cellene med 4 ml PBS.
- Gjenta PBS vasketrinn. Kast supernatanten, resuspender cellepelleten i 200 μL saponinpermeabiliseringsbuffer og overfør suspensjonen til et nytt rør på 1,5 ml. Etter 10 min inkubasjon ved romtemperatur, sentrifuge ved 250 × g, romtemperatur i 5 min.
- Kast supernatanten og resuspender cellepellets i 200 μL primær antistoffløsning (1:500 γH2AX antistoff i antistoffinkubasjonsløsning). Rug på 4 °C over natten i mørket.
- Sentrifuger rørene ved 250 × g, 4 °C i 5 minutter. Kast supernatanten og vask med 100 μL saponinoppløsning.
- Gjenta vasketrinnet ytterligere to ganger. Kast supernatanten og resuspender cellepellets i 500 μL EdU deteksjonscocktail.
- Rug ved romtemperatur i 30 minutter i mørket. Sentrifuge ved 250 × g, romtemperatur i 5 minutter. Kast supernatanten og vask med 1 ml saponinvaskevæske.
- Gjenta vasketrinnet to ganger. Kast supernatanten og resuspender cellepellets i 20-50 μL PBS. Gå videre til seksjon 4 for prøvemåling.
4. Imaging senescens markører ved hjelp av imaging flow cytometer system
- Tøm avfallsvæskeflasken. Kontroller nivåene av hastighetsperler, sterilisator, rengjøringsmiddel, feilsøkingsmaskin, kappe og skyllingsreagenser (avionisert vann) for å sikre tilstrekkelig væske før du slår på instrumentet (se materialtabellen).
- Slå på instrumentet og bildebehandlingsprogramvaren (se programvaregrensesnittet i figur 1A).
- Klikk på Oppstart-knappen for å initialisere fluidikk og systemkalibrering.
MERK: Denne prosedyren tar omtrent 45 minutter. - Sett forstørrelsen til 40x, sett fluidics-hastigheten til lav, og slå på laserne som trengs i eksperimentet. Slå på 405 nm, 488 nm og 642 nm lasere for å måle henholdsvis EdU-pacific blue, C12FDG og Alexa Fluor 647-γH2AX (eller Alexa Fluor 647-Ki67). Sett Ch6 for scatter kanal, og Ch1 og Ch9 for brightfield.
- Start med prøven som forventes å ha den høyeste fluorescensen for å sette opp intensiteten til laserne. Vend prøverøret forsiktig for å blande. Åpne rørlokket, og sett prøverøret inn på dokken. Klikk på Last inn for å starte.
- Åpne et punktdiagram, og velg funksjonene Area_M01 og Aspekt Ratio_M01 for henholdsvis X- og Y-aksene. Sett en port over sideforholdet på 0,5 for å ekskludere dubletter og celleaggregater under og på høyre side, og hastighetsperlepopulasjonen på venstre side (figur 1B).
- Åpne et histogramdiagram, og velg funksjonen Gradering RMS_M01_Ch01 for X-aksen. Velg singletpopulasjonen og sett porten til å velge for fokuserte celler (figur 1C).
MERK: Bildesystemet vil automatisk bruke hastighetsperler for å justere fokuset for bildebehandling. Det anbefales imidlertid å velge riktig halvdel av histogramtoppen for den best fokuserte populasjonen. - Åpne et histogramplott, og velg Rå maks. bildepunktintensiteter for X-aksen for hver fargekanal (Ch2, 7 og 11). Juster lasereffektene (dvs. 488 nm, 405 nm og 642 nm lasere for henholdsvis Ch2, 7 og 11), slik at hver fluorkrom har en Raw Max Pixel-verdi mellom 100 og 4000 for å unngå overmetning.
MERK: For dette eksperimentet er lasereffektinnstillingen 50 mW, 200 mW og 50 mW for lasere henholdsvis 488 nm, 405 nm og 642 nm. - Velg den fokuserte populasjonen du vil registrere, og klikk på Hent for å måle DLBCL-prøvene med konsekvente innstillinger. Når du endrer prøver for måling, klikker du på Return for å gjenopprette prøverøret. Trykk last inn for å forkaste prøven.
- Etter at alle prøvene er målt, slå av brightfield og scatter laser. Mål kontrollprøver i én farge for å generere en kompensasjonsmatrise.
- Klikk på Shutdown for å lukke bildesystemet.
- Analyser dataene i bildeanalyseprogramvaren.
- Bruk Spot Wizard-verktøyet i bildeanalyseprogramvaren til automatisk å telle og kvantifisere kjernefysiske γH2AX-foci i levende cellebilder. Velg to cellepopulasjoner (én med høyt og ett med lavt punkttall) for å lære opp punktveiviseren for videre automatisk analyse av punkttelling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En kompensasjonsmatrise ble generert ved hjelp av bildeanalyseprogramvare ved å laste inn registrerte data fra enkeltfargekontrollprøver. Som vist i supplerende figur S1 ble det påvist en ikke-neglisjerbar (koeffisientverdi ≥ 0,1) lysoverløp fra EdU til C12FDG med crosstalk-koeffisientverdi 0,248, mens crosstalk blant andre kanaler ikke var signifikant. Fire forskjellige DLBCL-cellelinjer ble behandlet med 5 μg / ml MAF eller 20 ng / ml DN for å indusere cellulær senescens og analysert ved hjelp av enten konvensjonell SA-β-gal-farging eller avbildning av flowcytometri-metoden.
Mer enn 70 % av KARPAS422-, WSU-DLCL2- og OCI-LY1-cellene gikk inn i senescensstatus, indikert med positiv SA-β-gal, mens SU-DHL6 var fullt motstandsdyktig mot senescensinduksjon av MAF og DN (supplerende figur S2A). Spesielt induserte MAF og DN også celledød i alle DLBCL-celler, men ikke dramatisk (supplerende figur S2B). Ved bruk av avbildning av flowcytometrimetoden viste enkeltcellebilder og flowcytometribasert kvantifisering en økt C12FDG+EdU-γH2AX+-senescentpopulasjon i KARPAS422, WSU-DLCL2 og OCI-LY1, men ikke i SU-DHL6-celler (figur 2A-D), som var i samsvar med de konvensjonelle SA-β-gal-fargeresultatene. Prosentandelen av C12FDG+EdU-γH2AX+-senescentpopulasjonen var imidlertid signifikant lavere enn den konvensjonelle SA-β-gal-fargemetoden (figur 2 og supplerende figur S2).
Videre viste avbildning av flowcytometrianalyse variert senescensinduserbarhet blant forskjellige DLBCL-cellelinjer, som ikke var tydelig preget av konvensjonell SA-β-gal-farging. Prosentandelen av C12FDG+EdU-γH2AX+ senescent OCI-LY1-celler (dvs. 43,2 % og 31,9 % med henholdsvis MAF og DN), var signifikant lavere enn for KARPAS422 (henholdsvis 62,2 % og 73,8 % med henholdsvis MAF og DN) og WSU-DLCL2 (60 % og 58,1 % med henholdsvis MAF og DN) (figur 2). Det er viktig at bildebasert analyse presenterte signifikant høyere antall γH2AX-foci i KARPAS422, WSU-DLCL2 og OCI-LY1, men ikke i SU-DHL6-celler (figur 3A, B).
Figur 1: Operativsystemprogramvaregrensesnitt og instrumentoppsett. (A) Imaging flow-cytometer programvaregrensesnitt. Live-cell-bildepanelet (øverst til venstre) inneholder live-cell-bilder av alle 12 bildekanaler og bildejusteringsverktøy (f.eks. zoom, cellepopulasjonsvalg, fargeendring, maske og justering av bildeegenskaper). Analyseområdet for flowcytometri (nederst til venstre) inneholder en verktøylinje for flowcytometrianalyse, for eksempel histogramplott, spredningsplott, ulike regiongating, layout og populasjonsstatistikk. Kontrollpanelet (til høyre) inneholder menyer for datainnsamling og lagring, belysningsinnstilling, forstørrelse, fluidics hastighetskontroll, fokus og sentrering. (B) Valg av enkeltcellepopulasjon. (C) Valg av fokusert cellepopulasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Visualisering og kvantifisering av senescentceller på encellenivå. Representative bilder (venstre panel) og flowcytometrianalyse av C12FDG+EdU-γH2AX+ senescentceller (høyre panel) av (A) KARPAS422, (B) WSU-DLCL2, (C) OCI-LY1, og (D) SU-DHL6 celler behandlet med 5 μg/ml MAF eller 20 ng/ml DN i 5 dager og farget for fSA-β-gal, EdU og γH2AX. DMSO-behandlede celler ble brukt som kontroll. Forkortelser: C12FDG = 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-Dgalactopyranoside; EdU = 5-ethynyl-2′-deoksyuridin; γH2AX = fosforylert form av histon H2AX; DMSO = dimetylsulfoksid; MAF = mafosfamid; DN = daunorubicin; fSA-β-gal = fluorescensbasert senescensassosiert β-galaktosidase. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Avbildningsbasert kvantifisering av nukleære γH2AX-foci i senescentceller. (A) Representative bilder av γH2AX-foci i DLBCL-celler (se tekst i figur 2 for behandlings- og fargedetaljer). (B) Frekvens (venstre) og kvantifisering (høyre) av γH2AX foci teller i DLBCL celler. Forkortelser: γH2AX = fosforylert form av histon H2AX; DMSO = dimetylsulfoksid; MAF = mafosfamid; DN = daunorubicin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Løsning | Kommentarer | |
| 10 mM EdU-løsning i DMSO | Oppbevares ved -20 °C. | |
| 20 mM C12FDG-løsning i DMSO | Oppbevares ved -20 °C. | |
| 100 mM klorokinløsning i avionisert vann | Oppbevares ved -20 °C. | |
| 100 mM PETG-løsning i avionisert vann | Oppbevares ved -20 °C. | |
| Fikseringsløsning: 4% PFA (paraformaldehyd) i PBS | ferskt tilberedt; FORSIKTIG: PFA er skadelig. Brukes med passende forholdsregler. | |
| Permeabiliseringsbuffer: 1% saponin (w / v), 3% BSA (w / v) i PBS, tilberedt. | nylaget | |
| Antistoff inkubasjon løsning: 0,1% saponin (w / v), 3% BSA (w / v) i PBS | nylaget | |
| Vaskeoppløsning: 0,1 % saponin (w/v), 0,5 % BSA (w/v) i PBS | nylaget | |
| EdU-deteksjonscocktail: Fortynnet CuSO4 (100 mM) ved 1:50, stillehavsblå azidoppløsning ved 1:200 og reaksjonsbufferadditiv (200 mg/ml) ved 1:100 i PBS | nylaget | |
Tabell 1: Løsninger for farging.
Supplerende figur S1: Kompensasjonsmatrise av EdU-pacific blue, C12FDG-Fluorescein og AF647-γH2AX. Forkortelser: C12FDG = 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-Dgalactopyranoside; EdU = 5-ethynyl-2′-deoksyuridin; γH2AX = fosforylert form av histon H2AX; AF647 = Alexa Fluor 647. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S2: Terapiindusert senescens av DLBCL-cellelinjer. (A) Konvensjonell SA-β-gal farging (venstre panel) og kvantifisering (høyre panel) av indikerte DLBCL-cellelinjer behandlet med 5 μg / ml MAF eller 20 ng / ml DN. Skalastenger = 50 μm. (B) Prosentandel av celledød analysert ved flowcytometri (venstre panel) og kvantifisering (høyre panel) av DLBCL-cellelinjer som i A. Cellene ble farget med spøkelsesfarge-stillehavsblå ved romtemperatur i 15 minutter. Forkortelser: DMSO = dimetylsulfoksid; MAF = mafosfamid; DN = daunorubicin; SA-β-gal = senescens-assosiert β-galaktosidase. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S3: Representative bilder og flowcytometrianalyse. (A) Representative bilder og flowcytometrianalyse av C12FDG+EdU-Ki67+ senescentceller (B) av KARPAS422- og WSU-DLCL2-celler behandlet med MAF i 5 dager og farget for fSA-β-gal, EdU og Ki67. DMSO-behandlede celler ble brukt som kontroll. Forkortelser: C12FDG = 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-Dgalactopyranoside; EdU = 5-ethynyl-2′-deoksyuridin; DMSO = dimetylsulfoksid; MAF = mafosfamid; DN = daunorubicin; fSA-β-gal = fluorescensbasert senescensassosiert β-galaktosidase. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metoden undersøkte senescens-entering-evnen til fire forskjellige DLBCL-cellelinjer ved kjemoterapibehandling, med lysfeltavbildning og flowcytometribasert kvantifisering. På enkeltcellenivå påviste vi store C12FDG+EdU-Ki67+senescentpopulasjoner i behandlede KARPAS422- og WSU-DLCL2-celler, og i mindre grad i OCI-LY1-celler, mens SU-DHL6-cellelinjen var resistent mot behandlingen. Forskjellen i senescens-entering evne blant cellelinjer kan forklares av deres distinkte genomiske defekter16,17. Uhensiktsmessig cellekulturtetthet eller legemiddelkonsentrasjon kan imidlertid også påvirke induserbarheten av senescens. Serielle fortynninger av celletetthet og legemiddelkonsentrasjon bør velges nøye for en mer omfattende undersøkelse. Spesielt var denne metoden følsom nok til å nøyaktig oppdage den naturlig forekommende senescentpopulasjonen i DLBCL-celler uten ytterligere genotoksisk stimulering (C12FDG + EdU-Ki67 + DMSO-behandlet gruppe i figur 3).
Nivået på β-galaktosidaseaktivitet og rytmen av DNA-syntese varierer betydelig mellom forskjellige celletyper. Den angitte inkubasjonstiden (dvs. 3 timer for EdU og 1 time for C12FDG) er generelt tilstrekkelig til å diskriminere positiv og negativ farging in vitro. Under spesielle omstendigheter (f.eks. saktevoksende celler eller celler med ekstremt høy β-galaktosidaseaktivitet) kan det imidlertid være nødvendig å forlenge EdU-merkingen eller forkorte C12FDG-farging for bedre diskriminering. Det foreslås å utføre et piloteksperiment med en seriell inkubasjonstid for å optimalisere eksperimentelle forhold (f.eks. 30 min økning eller 15 min reduksjon for henholdsvis EdU eller C12FDG). For bedre å skille forskjellene i fSA-β-gal mellom prolifererende celler og deres senescente kolleger, anbefales preinkubering med klorokin eller bafilomycin A1 for å senke den basale lysosomale aktiviteten ved å indusere lysosomal alkalinisering18,19. For celler med relativt lav lysosomal aktivitet kan preinkuberingstrinnet utelates.
Intakt cellemembranstruktur er avgjørende for fSA-β-gal-deteksjon. I denne metoden brukte vi EdU i stedet for BrdU (5-brom-2'-deoksyuridin) for å måle DNA-syntese. Sammenlignet med BrdU-inkorporering trenger EdU en relativt mild fargetilstand, som bevarer den intakte membranstrukturen og tillater samfarging med fSA-β-gal. Spesielt trenger antistoffmediert påvisning av intracellulære eller nukleære proteiner (f.eks. γH2AX) beskrevet her også permeabilisering av cellemembranen for å tillate antistoffinngang. Her ble saponin byttet ut med det sterke vaskemiddelet Triton X-100 for å unngå slukking av fSA-β-gal-signal.
Kjemoterapeutisk behandling utløser ikke bare senescens, men også celledød i DLBCL-celler. Døde celler kan ha en ikke-ubetydelig innvirkning når man kvantifiserer senescenspopulasjonen, da de kan føre til falske positiver eller falske negativer under farging. Selv om det meste av celleavfall og små døde cellelegemer vil bli utelukket under flere vaske- og sentrifugeringstrinn, kan den gjenværende døde cellepopulasjonen fortsatt ha en ikke-ubetydelig innflytelse. Det foreslås å optimalisere legemiddelkonsentrasjonen for å unngå drastisk celledød. I tillegg kan celle levedyktighetsfarging (f.eks. Spøkelsesfargestoff) brukes til å lette diskriminerende dødcellepopulasjon og kvantifisere senescenspopulasjonen strengere.
Det avanserte flowcytometrisystemet som brukes i denne metoden er et flerkanals flowcytometer, som gjør det mulig å kvantifisere flowcytometribaserte målinger og inspisere flerfargebilder av enkeltceller parallelt. Det gir en rask, effektiv og nøyaktig kvantitativ løsning for senescensdeteksjon, og i mellomtiden genererer enkeltcelleoppløsning, flerfargede bilder med romlig informasjon om flere markører. Noen begrensninger vedvarer imidlertid. For eksempel er bildeoppløsningen begrenset sammenlignet med high-end mikroskopet, noe som hindrer en omfattende analyse av subcellulær lokalisering ved sporing av proteiner som ligger i andre mindre organeller enn kjernen. Sammenlignet med sofistikert drifts- og analyseprogramvare for et standard flowcytometer, er det mindre praktisk og mindre effektivt å sette opp eller endre populasjonsgatingstrategier. Kvantifisering og statistisk analyse er også mer komplisert.
fSA-β-gal-farging har betydelige fordeler i forhold til konvensjonelle SA-β-gal for rask farging og objektiv kvantifisering og har potensial for effektiv klassifisering av senescentceller. Denne teknikken har blitt brukt til å skjerme for senescentceller som kommer inn i celledelingssyklusen 3,18,19,20. I denne metoden tok vi et skritt videre for å kombinere fSA-β-gal med EdU og γH2AX for å identifisere senescentceller mer nøyaktig og pålitelig. Spesielt, selv om fSA-β-gal, EdU og γH2AX ble valgt som senescensassosierte markører i denne metoden, kan andre pålitelige senescensmarkører enkelt tilpasses for å erstatte eller legge til de tre markørene. På grunn av den høye interessen for senescens i akademia, har mange pålitelige senescensassosierte markører blitt identifisert, for eksempel forhøyet cytoplasmatisk reaktiv oksygenart (ROS) produksjon, utskilte SASP-faktorer, nedregulert Ki67, tap av nukleært konvoluttprotein Lamin B1 og økt heterokromatinmarkør H3K9me321,22. Supplerende figur S3 viste vellykket påvisning av C12FDG + EdU-Ki67- senescent populasjoner i TIS KARPAS422 og WSU-DLCL2 celler.
Videre er det mange senescenscelleoverflatemarkører tilgjengelig for å bli testet ved hjelp av denne metoden, for eksempel ICAM-1, NOTCH1, NOTCH3, DDP4, CD36 og uPAR. Påvisning av celleoverflatemarkører krever bare en kort antistoffinkubasjonstid uten cellefiksering og permeabilisering, noe som vil forkorte fargeprosedyren til en 6 timers arbeidsflyt i kombinasjon med fSA-β-gal og EdU, eller til og med til et 2-timers eksperiment i kombinasjon med fSA-β-gal, og enda viktigere, det tillater levende celleavbildning. Den modifiserte metoden kan potensielt tjene som en rask, pålitelig og gjennomførbar tilnærming i klinikken for å identifisere senescensceller in vivo, ikke bare for diagnostisk og prognostisk evaluering, men også for å støtte videre senolytisk intervensjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et stipend til Yong Yu fra Johannes Kepler University Linz (BERM16108001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613407 | |
| Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647) | Biolegend | 350509 | |
| C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside) | Fisher Scientific | 11590276 | |
| Chloroquin -diphosphat | Sigma aldrich | C6628 | |
| Cleanser (Coulter Clenz) | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit | Thermo Scientific | C10418 | |
| Daunorubicin | Medchemexpress | HY-13062A | |
| Debubbler (70% Isopropanol) | Millipore | 1.3704 | |
| Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3) | Luminex | CN-SW69-12 | |
| Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software) | Luminex | 100220 | |
| KARPAS | DSMZ | ACC 31 | |
| mafosfamide cyclohexylamine | Niomech | D-17272 | |
| OCI-LY1 | DSMZ | ACC 722 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 11473704 | |
| PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid) | Sigma aldrich | P4902 | |
| saponin | Sigma aldrich | 47036 | |
| Sheath | Millipore | BSS-1006-B | |
| SpeedBead Kit for ImageStream | Luminex | 400041 | |
| Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite) | VWR | JT9416-1 | |
| SU-DHL6 | DSMZ | ACC 572 | |
| WSU-DLCL2 | DSMZ | ACC 575 |
References
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S.
- Di Micco, R., et al. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).
- Milanovic, M., et al. Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness. Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).
- Passos, J. F., et al. Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence. Molecular Systems Biology. 6 (1), 347 (2010).
- Lee, S., Schmitt, C. A. The dynamic nature of senescence in cancer. Nature Cell Biology. 21 (1), 94-101 (2019).
- Toussaint, O., et al. Stress-induced premature senescence or stress-induced senescence-like phenotype: one in vivo reality, two possible definitions. The Scientific World Journal. 2, 230-247 (2002).
- Collado, M., Blasco, M. A., Serrano, M. Cellular senescence in cancer and aging. Cell. 130 (2), 223-233 (2007).
- Munoz-Espin, D., et al. Programmed cell senescence during mammalian embryonic development. Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).
- Faget, D. V., Ren, Q., Stewart, S. A. Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer. Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).
- Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
- Chandra, T., et al. Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells. Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).
- Rodier, F., et al. Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion. Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).
- Schleich, K., et al. H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients. Nature Communications. 11 (1), 3651 (2020).
- Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d'Adda di Fagagna, F. Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).
- Fan, D. N., Schmitt, C. A. Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).
- Schmitt, C. A., Lowe, S. W. Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models. Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).
- Dorr, J. R., et al. Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy. Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).
- Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A.
- Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
- Biran, A., et al. Quantitative identification of senescent cells in aging and disease. Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).
- Rossi, M., Abdelmohsen, K. The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets. Cells. 10 (7), 1740 (2021).
- Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).
