Summary
Hier presenteren we een eenvoudige en effectieve testprocedure voor resorptieputtests met behulp van met calciumfosfaat gecoate celkweekplaten.
Abstract
Volwassen osteoclasten zijn multinucleaire cellen die bot kunnen afbreken door de afscheiding van zuren en enzymen. Ze spelen een cruciale rol bij verschillende ziekten (bijv. Osteoporose en botkanker) en zijn daarom belangrijke onderzoeksobjecten. In vitro kan hun activiteit worden geanalyseerd door de vorming van resorptieputten. In dit protocol beschrijven we een eenvoudige pit assay methode met behulp van calciumfosfaat (CaP) gecoate celkweekplaten, die gemakkelijk kunnen worden gevisualiseerd en gekwantificeerd. Osteoclastenprecursoren afgeleid van menselijke perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) werden gekweekt op de gecoate platen in aanwezigheid van osteoclastogene stimuli. Na 9 dagen incubatie werden osteoclasten gefixeerd en gekleurd voor fluorescentiebeeldvorming, terwijl de CaP-coating werd tegengekleurd door calceïne. Om het geresorbeerde gebied te kwantificeren, werd de CaP-coating op platen gekleurd met 5% AgNO3 en gevisualiseerd door brightfield-beeldvorming. Het resorptieputgebied werd gekwantificeerd met behulp van ImageJ.
Introduction
Osteoclasten (OC's) zijn weefselspecifieke macrofagen afgeleid van hematopoëtische stamcellen (HSC's), die een cruciale rol spelen bij botremodellering samen met osteoblasten1. Door geslachtshormonen geïnduceerde, immunologische en kwaadaardige botaandoeningen die bot systemisch of lokaal vernietigen, zijn te wijten aan overmatige osteoclastische activiteit, waaronder menopauze-gerelateerde osteoporose2, reumatoïde artritis3, parodontitis4, myeloom botziekte5 en osteolytische botmetastase6. Daarentegen kunnen defecten in OC-vorming en -functie ook osteopetrose veroorzaken7. HSC's ondergaan differentiatie in OC-voorlopercellen onder macrofaagkoloniestimulerende factor (M-CSF, gensymbool ACP5) stimulatie. In aanwezigheid van zowel M-CSF als receptoractivator van NF-κB ligand (RANKL, gensymbool TNFSF11) differentiëren OC-voorlopers verder in mononucleaire OC's en fuseren vervolgens tot multinucleaire OC's 8,9,10. Zowel cytokines M-CSF als RANKL zijn onmisbaar en voldoende voor inductie van osteoclastische markers zoals calcitoninereceptor (CT), receptoractivator van nucleaire factor κ B (RANK), protonpomp V-ATPase, chloridekanaal 7 alfa-subeenheid (CIC-7), integrine β3, tartraatresistente zuurfosfatase (TRAP, gensymbool ACP5), lysosomale cysteïneproteasekatheline K (CTSK) en matrixmetaalepteptidase 9 (MMP9). Geactiveerde OC's vormen een afdichtingszone op het botoppervlak door de vorming van een actinering met een gegolfde rand11,12. Binnen de afdichtingszone bemiddelen OC's resorptie door protonen af te scheiden via de protonpomp V-ATPase12,13, MMP914 en CTSK15, wat leidt tot de vorming van lacunes.
Voor in vitro experimenten kunnen OC-voorlopercellen worden verkregen door uitbreiding van beenmergmacrofagen uit het dijbeen en scheenbeen van muizen16,17, evenals door isolatie van menselijke perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) uit bloedmonsters en buffy coats 18,19,20, of door differentiatie van de vereeuwigde muriene monocytische cellen RAW 264.7 21,22.
In het huidige protocol beschrijven we een osteoclastische resorptietest in CaP-gecoate celkweekplaten met behulp van OC's afgeleid van primaire PBMC's. De CaP-gecoate celkweekplatenmethode die hier wordt gebruikt, is overgenomen en verfijnd van de methode die eerder is beschreven door Patntirapong et al.17 en Maria et al.21. Om OC-precursoren te verkrijgen, worden PBMC's geïsoleerd door dichtheidsgradiëntcentrifugatie en uitgebreid zoals eerder beschreven20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol werd beoordeeld en goedgekeurd door de lokale ethische commissie (goedkeuringsnummer 287/2020B02).
1. Bereiding van met calciumfosfaat beklede celkweekplaten
- Bereiding van calciumvoorraadoplossing (25 mM CaCl2·2H2O, 1,37 mM NaCl, 15 mM MgCl2·6H2O in Tris-buffer)
- Bereid 1,0 M Tris buffer en stel de pH in op 7,4 met behulp van 1 M HCl.
- Plaats een glazen bekerglas op een magneetroerder en voeg 100 ml 1,0 M Tris-buffer toe.
- Weeg 0,368 g CaCl2·2H 2O, 8,0 g NaCl en 0,305 g MgCl2·6H2O af en los één voor één op in Tris-buffer.
- Stel de pH in op 7,4 met 1 M HCl. Bewaren bij kamertemperatuur.
- Bereiding van fosfaatvoorraadoplossing (11,1 mM Na2HPO4· H2O, 42 mM NaHCO3 in Tris buffer)
- Plaats een glazen bekerglas op een magneetroerder en voeg 100 ml 1,0 M Tris-buffer toe.
- Weeg 0,158 g Na2HPO4· H2O en 0,353 g NaHCO3 en los één voor één op in Tris-buffer.
- Stel de pH in op 7,4 met 1 M HCl. Bewaren bij kamertemperatuur.
- Pre-calcificatie van 96-well celkweekplaten
- Bereid 30 ml werkoplossing door 15 ml 1,0 m Tris-buffer, 7,5 ml calciumvoorraad (stap 1.1.4) en 7,5 ml fosfaatvoorraadoplossing (stap 1.2.3) te mengen. Filter de oplossing met een filter van 0,2 μm.
- Bereid een 96-well celkweekplaat met platte bodem. Pipetteer 300 μL calciumfosfaatoplossing (stap 1.3.1.) naar elke put. Dek de plaat af met een deksel en incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 3 dagen.
- Bereiding van calciumfosfaatoplossing (2,25 mM Na2HPO4· H2O, 4 mM CaCl2·2H2O, 0,14 M NaCl, 50 mM Tris basis in ddH2O)
- Voeg 2 ml van 1 M HCl toe aan 40 ml gedeïoniseerd water in een bekerglas met een magnetische roerkraal en los 0,016 g Na2HPO4· H2O, 0,0295 g CaCl2·2H2O, 0,409 g NaCl en 0,303 g Tris-basis één voor één.
- Stel de pH in op 7,4 met 1 M HCl. Voeg gedeïoniseerd water toe om het volume te vullen tot 50 ml. Filter de oplossing met een filter van 0,2 μm.
- Verkalking van 96-well celkweekplaten
- Zuig prekalkoplossing uit de voorverkalkte 96-well celkweekplaten en voeg 300 μL calciumfosfaatoplossing (stap 1.4.2) toe aan elke put. Dek de platen af met een deksel en incubeer bij 37 °C gedurende 1 dag.
- Draai de plaat om om de oplossing uit te gieten en was de plaat drie keer grondig met gedeïoniseerd water. Droog de plaat onmiddellijk met een föhn of gecomprimeerd CO2 - of N2-gas om een uniform oppervlak te behouden.
- Steriliseer de gecoate plaat door UV-straling in een schone bank gedurende 1 uur. Gebruik de gecoate plaat onmiddellijk of sluit de plaat af met parafilm en bewaar deze bij kamertemperatuur.
2. Isolatie van PBMC's van menselijk perifeer bloed
- Trek 15 ml bloed uit de ader na het verkrijgen van schriftelijke geïnformeerde toestemming van de bloeddonor (ethische stemming: 287/2020B02).
- Verdun 15 ml vers bloed met een gelijk volume PBS en meng door de buis meerdere keren om te keren of door het mengsel in en uit een pipet te trekken.
- Bereid een conische buis van 50 ml met 15 ml dichtheidsgradiëntoplossing (bijv. Ficoll, materiaaltabel) per buis. Kantel de buis en leg voorzichtig 30 ml verdund bloedmonster op de 15 ml dichtheidsgradiëntoplossing (verdund bloedmonster: dichtheidsgradiëntoplossing, verhouding 1:0,5-1).
OPMERKING: Let er bij het overlayen van het monster op dat u de dichtheidsgradiëntoplossing niet mengt met het verdunde bloedmonster. - Centrifugeer bij 810 x g gedurende 20 minuten bij 20 °C in een zwenkbakrotor zonder rem.
- Zuig de bovenste laag op en laat de mononucleaire cellaag (lymfocyten, monocyten en trombocyten) ongestoord in de interfase.
- Breng de mononucleaire cellaag voorzichtig over naar een nieuwe conische buis van 50 ml.
- Vul de buis met PBS, meng en centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 20 °C (rem kan vanaf deze fase worden gebruikt).
- Verwijder het bovennatuurlijke middel voorzichtig volledig. Resuspend de celkorrel in 50 ml PBS en centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 20 °C. Verwijder het supernatant voorzichtig volledig.
- Voor het verwijderen van bloedplaatjes, resuspend de celkorrel in 50 ml PBS en centrifugeer bij 200 x g gedurende 10 minuten bij 20 °C. Verwijder het supernatant voorzichtig volledig.
- Breng geresuspendeerde cellen over naar celkweekkolven voor uitbreiding van OC-voorlopercellen.
3. Uitbreiding van OC-voorlopers
- Resuspend PBMC's in volledige α-MEM (10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% amfotericine B) met 20 ng/ml M-CSF. Zaad PBMC's met een dichtheid van 2,5 x 105 cellen/cm2. Gewoonlijk kunnen cellen geïsoleerd uit 15-20 ml vers bloed worden gezaaid in één kolf van 75 cm2 (1,5-2 x 107 cellen).
- Voed de cellen elke derde dag met verse complete α-MEM met 20 ng / ml M-CSF totdat de aangesloten cellen een gewenste samenvloeiing bereiken. Typische opbrengsten zijn 1,5-2 x 106 cellen /kolf wanneer cellen 95% confluent zijn. Meestal duurt de expansieperiode 6 dagen.
OPMERKING: Het osteoclastogene potentieel van de precursoren kan afnemen met een langere teelttijd.
4. Inductie van osteoclastogenese in CaP-gecoate platen
- Om de hechting van de cel te vergemakkelijken, incubeert u de cap-gecoate platen met 50 μL FBS gedurende 1 uur in een incubator van 37 °C.
- Om de OC-voorlopers los te maken, wast u de kolf tweemaal met PBS om dode of niet-hechtende cellen te verwijderen. Voeg gedurende 30 minuten 4 ml trypsine (materiaaltabel) toe per 75 cm2 kolf.
- Voeg 4 ml complete α-MEM toe om de spijsvertering te stoppen, maak de cellen voorzichtig los met behulp van een celschraper en breng de cellen over in een buis van 50 ml.
- Bepaal het totale celgetal met behulp van een Neubauer-kamer of iets dergelijks.
- Pellet de cellen door centrifugeren gedurende 7 min bij 350 x g. Resuspend de pellet in voldoende volledige α-MEM met 20 ng /ml M-CSF en 20 ng / ml RANKL om een concentratie van 1 x 106 cellen / ml te krijgen.
- Aspiraat FBS oplossing uit de CaP gecoate 96-well plaat en pipetteer 200 μL celsuspensie per put (2 x 105 cellen/put).
- Incubeer de OC-voorlopers gedurende de gewenste periode of met de gewenste reagentia die relevant zijn voor het experimentele ontwerp. Meestal kunnen grote aantallen grote en meerkleurige OC's worden waargenomen na 6 dagen en wanneer resorptieputten zich vormen. Voer cellen met verse complete α-MEM medium met 20 ng/ml M-CSF en 20 ng/ml RANKL om de drie dag.
- Was de cellen aan het einde van de incubatie tweemaal met PBS, fixeer met 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten en was opnieuw met PBS.
- Gebruik de vaste OC's direct voor fluorescentiekleuring of bewaar bij 4 °C.
5. Fluorescentiekleuring van OC's en CaP-coating
- Incubeer de vaste cellen met permeabilisatiebuffer (0,1% Triton in PBS) gedurende 5 minuten.
- Vlek actine filamenten met 100 μL AlexaFluor 546 gelabelde falloïde oplossing in PBS gedurende 30 minuten en zuig de kleuringsoplossing aan. Voeg gedurende 10 minuten 100 μL Hoechst 33342 kleuringsoplossing (10 μg/ml in PBS) toe aan de vlekkernen. DAPI kan ook worden gebruikt.
- Vlek CaP coating met 100 μL van 10 μM calceïne in PBS gedurende 10 min. Was drie keer met PBS en maak foto's.
- Na fluorescentiebeeldvorming kunnen dezelfde platen worden gebruikt om het resorptieputgebied te kwantificeren door Von Kossa-kleuring. Was hiervoor de borden twee keer met gedeïoniseerd water.
6. Kwantificering van het totale resorptieputgebied
- Om CaP-coating met Von Kossa-kleuring te beitsen, incubeer met 50 μL van 5% AgNO3 in gedeïoniseerd water per put onder UV-straling gedurende 1 uur, totdat de coating op de bodem van de putten bruin is geworden.
- Was de plaat drie keer met gedeïoniseerd water en maak brightfield-beelden. Een objectief met weinig vergroting, zoals een 1,25x objectief, kan worden gebruikt om de hele put in één beeld vast te leggen. Dit vergemakkelijkt de daaropvolgende beeldanalyse. Alternatieve methoden om het hele gebied van de put vast te leggen, kunnen worden toegepast.
- Een afbeeldingsbestand openen met ImageJ: Bestand | | openen Afbeelding | Soort | 8-bits. Controleer de schaaleenheid in de rechterbenedenhoek van de afbeelding met de rechte lijn | Analyseer | Schaal instellen. Voer de lengte in de deken 'bekende afstand' in, voer een nieuwe schaaleenheid in lengte-eenheid in en vink het selectievakje Globaal aan.
- Lijst meetparameters die moeten worden geanalyseerd: Analyseer | Stel metingen in. Schakel in het venster Metingen instellen de selectievakjes Gebied en Limiet tot drempel in.
- Meet het gebied van putten: Afbeelding | | aanpassen Drempel. Schakel in het venster Drempel het selectievakje Donkere achtergrond in en klik op Automatisch. Het gebied van putten wordt rood. Sluit het venster Drempel en selecteer | analyseren Meten. Het resultaatbestand opslaan: Bestand | Opslaan als.
7. Kwantificering van het aantal en de grootte van de obs en het genormaliseerde resorptieputgebied
- Open een fluorescentiebeeld van osteoclasten met ImageJ en controleer de schaaleenheid (zie stap 6.3).
- Lijst meetparameters die moeten worden geanalyseerd: Analyseer | Stel metingen in. Schakel in het venster Metingen instellen het selectievakje Gebied in .
- Schets de OC's met roi manager en polygoon selecties: analyseer | Gereedschap | ROI-manager. Klik op Polygoonselecties in toolset, schets één OC (cellen met actinering en ≥ drie kernen) en klik op Toevoegen [t] in het venster ROI-beheer. Herhaal het schetsen totdat alle OC's zijn opgenomen.
- Aantal en grootte van OC's meten: Selecteer alle items in ROI Manager en klik op Meten. Het resultaatbestand opslaan: Bestand | Opslaan als (figuur 3e).
- Meet het putgebied van fluorescentiebeelden. Open het fluorescerende beeld van de coating die is gecorreleerd met de afbeelding in stap 7.3 en controleer de schaaleenheid (zie stap 6.3).
- Maak een lijst van te analyseren meetparameters (zie stap 6.4). Selecteer Afbeelding | | aanpassen Drempel. Schakel in het venster Drempel alle selectievakjes uit en klik op Automatisch. Het gebied van de putten kleurt rood. Sluit het venster Drempel en selecteer | analyseren Meten. Sla het resultaatbestand op.
- Bereken het genormaliseerde putoppervlak op OC-getal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De calciumfosfaatcoating op de bodem van celkweekplaten werd uitgevoerd in twee coatingstappen bestaande uit een 3-daagse pre-calcificatie en een 1-daagse verkalkingsstap. Zoals te zien is in figuur 1, werd uniform verdeeld calciumfosfaat verkregen op de bodem van de 96-putplaten. De coating hechtte zeer goed aan de bodem na de uitgevoerde wasstappen.
Figuur 1: Representatief brightfieldbeeld van de calciumfosfaatcoating op 96-well celkweekplaten. De coating werd uitgevoerd in twee coatingstappen, bestaande uit een 3-daagse pre-calcificatiestap en een 1-daagse verkalkingsstap. De schaalbalk vertegenwoordigt 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
OC-precursoren afgeleid van menselijke PBMC's werden gekweekt op de CaP-gecoate platen. Resorptieputten en grote OC's (blanco gebied) werden gevormd in aanwezigheid van M-CVS en RANKL na 9 dagen cultuur (figuur 2A). De multinucleaire OC's in de putten van de CaP-coating drukten hoge niveaus van TRAP uit (figuur 2B).
Figuur 2: TRAP-expressie door OC's na rijping op de CaP-gecoate celkweekplaten. OC-voorlopers werden gekweekt op de CaP-gecoate platen in aanwezigheid van 20 ng / ml M-CSF en 20 ng / ml RANKL gedurende 9 dagen. (A) Leeg gebied vertegenwoordigde resorptieputten. (B) Verschillende multinucleaire TRAP-positieve (paarse) OC's werden waargenomen in de resorptieputten. De schaalbalk vertegenwoordigt 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Om de rijping van OC's op de CaP-gecoate platen verder te karakteriseren, werden cellen gekleurd voor actine (rode fluorescentie). Celkernen werden gekleurd met Hoechst (blauw) en calceïne werd gebruikt voor calciumvisualisatie in groen. Resorptieputten zijn zichtbaar als zwarte gebieden in de groene CaP-coating (figuur 3B). Functioneel volwassen OC's vertoonden drie of meer kernen en de karakteristieke actinering die essentieel is voor de osteoclastogene resorptie (figuur 3A,C). Het putgebied van fluorescentiebeelden kan worden gemeten met behulp van de drempeltool van ImageJ (figuur 3D). Het aantal en de grootte van OC's kunnen worden berekend met behulp van de ROI Manager en Polygon selectie tool van ImageJ (Figuur 3E).
Figuur 3: Morfologie van volwassen OC's op de CaP coating. OC-precursoren werden gedurende 9 dagen op de CaP-gecoate platen gekweekt in aanwezigheid van 20 ng / ml M-CSF en 20 ng / ml RANKL. (A) OC's werden gekleurd voor actine en kernen door falloïdine-Alexa Fluor 546 en Hoechst 33342. (B) CaP-coating werd gekleurd door calceïne. Zwarte gebieden vertegenwoordigen resorptieputten. (C) Samengevoegde afbeelding. (D) Kwantificering van het putgebied (rood gebied) met behulp van het drempelgereedschap van ImageJ. (E) OC-overzicht en -telling met behulp van de ROI Manager- en Polygoonselectietool van ImageJ. De schaalbalk vertegenwoordigt 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Voor de kwantificering van de resorptieputten op de caP-gecoate celkweekplaten werd calcium gekleurd door incubatie met 5% AgNO3 (Von Kossa-kleuring). Zoals te zien is in figuur 4A, bereikten OC-precursoren niet de volledige functionaliteit bij afwezigheid van RANKL en waren ze niet in staat om resorptieputten te vormen. Osteoclastogene putten werden alleen waargenomen in aanwezigheid van beide factoren M-CSF en RANKL (figuur 4B). Het resorptieputgebied werd gekwantificeerd met de drempeltool van ImageJ (figuur 4C).
Figuur 4: Visualisatie en kwantificering van resorptieputten. OC-voorlopers werden gekweekt op de CaP-gecoate 96-well celkweekplaten in afwezigheid van RANKL (A) en in aanwezigheid van beide factoren M-CSF en RANKL (B). (C) Aantallen gevormde resorptieputten werden gekwantificeerd met behulp van de drempeltool van ImageJ. Schaalbalk vertegenwoordigt 1.000 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een eenvoudige en betrouwbare methode voor een osteoclastische resorptietest met behulp van OC's afgeleid en uitgebreid in vitro van PBMC's. De gebruikte CaP-gecoate celkweekplaten kunnen eenvoudig worden voorbereid en gevisualiseerd met behulp van in het laboratorium beschikbare materialen. Naast ongesorteerde PBMC's die in dit protocol zijn aangenomen, zijn OC's gegenereerd uit muizenmonocytencellen21 en beenmergmacrofaagcellen17 ook gekweekt op vergelijkbare synthetische substraten voor pit-assay, dus deze celbronnen kunnen worden verplaatst naar deze benadering verwijzend naar de overeenkomstige literatuur.
Voor dit protocol gebruikten we een eenvoudige in het laboratorium gefabriceerde CaP-coating in plaats van dure in de handel verkrijgbare testplaten. Hoewel bot- en dentineplakken twee veel voorkomende en betaalbare resorbeerbare materialen zijn voor resorptieputtest, zijn de beschikbaarheid en gecompliceerde voorbereiding grote nadelen. Als een gemakkelijk te bereiden synthetisch substraat is CaP-coating handiger en gemakkelijker verkrijgbaar dan de twee originele materialen. Een ander voordeel van deze pit assay-benadering is dat cellen tijdens het kweken onder een heldere veldmicroscoop kunnen worden gevisualiseerd, terwijl cellen die groeien op ondoorzichtige bot- en dentineplakken niet kunnen worden waargenomen.
Deze CaP-coatingmethode kan flexibel worden aangepast aan de vereiste experimentele behoeften voor verschillende celkweekplaatgroottes.
In tegenstelling tot eerdergemelde 17,21, incuberen we de platen met coatingoplossing bij 37 °C in plaats van bij kamertemperatuur, wat resulteert in de spontane groei van apatietkernen op celkweekplaten bij lichaamstemperatuur. CaP-gecoate platen zijn beschikbaar voor experimenten onmiddellijk na het drogen en steriliseren door UV-straling, wat tijd bespaart in vergelijking met eerder gerapporteerde methoden17,21.
Filtratie van de coatingoplossing (stap 1.3.1 en 1.4.2) is een cruciale stap, die helpt bij het verkrijgen van een uniforme deeltjesgrootte en het verminderen van ongecoate vlekken in de coating veroorzaakt door luchtbellen en onzuiverheden in de oplossing. Het onmiddellijk drogen van de plaat (stap 1.5.2) is een andere kritieke stap, die helpt om een uniforme CaP-coating te maken. Anders is het gevoelig om een dikkere coating in het midden van de put te vormen.
Het is de moeite waard erop te wijzen dat de dikte van de coating en de dichtheid van calciumfosfaatafzettingen afhankelijk zijn van het volume van de coatingoplossing binnen een bepaald bereik. Daarom is het mogelijk om de laagdikte te regelen door het volume van de coatingoplossing in de put te veranderen. Er wordt echter voorgesteld om zoveel mogelijk volume coatingoplossing toe te voegen wanneer de 96-well celkweekplaat wordt gebruikt vanwege het kleine totale volume voor dit kweekplaatformaat. De binnenwand van de put wordt ook gecoat door CaP tijdens beide coatingstappen, daarom is voorzichtigheid geboden om de bodem of de muur niet aan te raken met de pipet om de coating tegen schade te beschermen.
Volgens onze waarneming kunnen de meeste OC-precursoren die zijn uitgebreid uit PBMC's zich zonder problemen aan de CaP-coating hechten. Het weken van de gecoate plaat met FBS vóór het zaaien van cellen verbetert echter de celadhesie-efficiëntie, zoals eerder gemeld21.
Het voorzichtig losmaken van de OC-precursoren met behulp van een celschraper (stap 4.2) is ook belangrijk omdat de meeste OC-precursoren nog steeds aanhecht waren en het minimaliseren van de mechanische schade gunstig is voor de levensvatbaarheid van de cel.
Een beperking van deze methode is dat de bulk PBMC's die we gebruikten als een bron van OC-precursoren een sterk gemengde cellulaire bron is, waarvan slechts een klein deel van de cellen (CD14 + cellen) echte OC-voorlopers zijn. Aangezien andere cellen die osteoclastogenese kunnen beïnvloeden (zoals stromale cellen en lymfocyten) aanwezig zijn bij geïsoleerde PBMC's, kan dit de testresultaten beïnvloeden op manieren die moeilijk te voorspellen zijn en de interpretatie van assays kunnen verstoren. Om de directe effecten van groeifactoren, cytokines of glucocorticoïden op de resorptieve activiteit van OC's beter te onderzoeken, worden methoden voor oc-precursorzuivering (bijv. fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en magnetische kralenzuivering20 op basis van specifieke celoppervlakmarkers 23,24,25,26) aanbevolen.
De beperkingen van het CaP-substraat bij het verkrijgen van brightfield-beelden van zowel cellen als onderliggende putten voor hetzelfde gebied worden veroorzaakt door de incompatibiliteit van TRAP- en Von Kossa-kleuring, zodat een genormaliseerd resorptiegebied van de hele put niet beschikbaar is. Maar in plaats daarvan kan fluorescentiebeeldvorming worden gebruikt om het resorptiegebied en het celnummer te visualiseren om genormaliseerde resorptiegegevens te verkrijgen. Deze gegevens kunnen belangrijk inzicht geven in de vraag of de toename van het totale resorptiegebied onder experimentele omstandigheden te wijten is aan een verhoogd aantal osteoclasten alleen of een verhoogde resorptiecapaciteit van individuele cellen. Bovendien maakt het de studie mogelijk van de relatieve effecten van osteoclastenaantal, grootte, kernnummer en resorptiecapaciteit.
Samenvattend beschrijven we een nuttig en eenvoudig protocol voor een resorptieputtest met behulp van een tweestaps calciumfosfaatcoating en OC's afgeleid van primaire menselijke PBMC's. Dit protocol biedt een eenvoudige methode om een in vitro botresorptiemodel op te zetten voor studies met betrekking tot osteoclastische resorptie en kan worden toegepast op het bestuderen van behandelingen voor botaandoeningsziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de China Scholarship Council [CSC Nr. 201808440394]. W.C. werd gefinancierd door CSC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AgNO3 | SERVA Electrophoresis GmbH | 35110 | Silver nitrate |
| a-MEM | Gibco | 32561-029 | MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides |
| amphotericin B | Biochrom | 03-028-1B | Amphotericin B Solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21097-50G | Calcium chloride Dihydrate |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | Calcein |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | fetal bovine serum |
| Ficoll | Cytiva | 17144002 | Ficoll Paque Plus |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | Paraformaldehyde |
| HCl | Merk | 1.09057.1000 | Hydrochloric acid |
| Hoechst 33342 | Promokine | PK-CA707-40046 | Hoechst 33342 |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | Recombinant Human M-CSF |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Magnesium chloride |
| Na2HPO4 | AppliChem GmbH | A2943,0250 | di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous |
| NaCl | Merk | S7653-250G | Sodium chloride |
| NaHCO3 | Merk | K15322429 | Bicarbonate of Soda |
| PBS | Lonza | 17-512F | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium |
| Pen-Strep | Lonza | DE17-602E | Penicillin-Streptomycin Mixture |
| Phalloidin-Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 Phalloidin |
| RANKL | PeproTech | 310-01 | Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived) |
| Tris | Sigma-Aldrich | 93362 | Tris(hydroxymethyl)aminomethan |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol |
| TrypLE Express | Gibco | 12605010 | Recombinant cell-dissociation enzymes |
References
- Jacome-Galarza, C. E., et al. Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts. Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).
- Moller, A. M. J., et al. Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone resorption. Bone Research. 8 (1), 1-11 (2020).
- Yokota, K., et al. Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).
- Teng, Y. T., et al. Functional human T-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection. Journal of Clinical Investigation. 106 (6), 59-67 (2000).
- Terpos, E., et al. Soluble receptor activator of nuclear factor kappaB ligand-osteoprotegerin ratio predicts survival in multiple myeloma: proposal for a novel prognostic index. Blood. 102 (3), 1064-1069 (2003).
- Morony, S., et al. Osteoprotegerin inhibits osteolysis and decreases skeletal tumor burden in syngeneic and nude mouse models of experimental bone metastasis. Cancer Research. 61 (11), 4432-4436 (2001).
- Sobacchi, C., Schulz, A., Coxon, F. P., Villa, A., Helfrich, M. H. Osteopetrosis: genetics, treatment and new insights into osteoclast function. Nature Reviews Endocrinology. 9 (9), 522-536 (2013).
- Amarasekara, D. S., et al. Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks. Immune Network. 18 (1), 8 (2018).
- Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis. Cells. 9 (9), (2020).
- Teitelbaum, S. L.
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L.
- Baron, R., Neff, L., Louvard, D., Courtoy, P. J. Cell-mediated extracellular acidification and bone resorption: evidence for a low pH in resorbing lacunae and localization of a 100-kD lysosomal membrane protein at the osteoclast ruffled border. Journal of Cell Biology. 101 (6), 2210-2222 (1985).
- Blair, H. C., Teitelbaum, S. L., Ghiselli, R., Gluck, S. Osteoclastic bone resorption by a polarized vacuolar proton pump. Science. 245 (4920), 855-857 (1989).
- Zhu, L., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), 6143 (2020).
- Gowen, M., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. The Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
- Abu-Amer, Y. IL-4 abrogates osteoclastogenesis through STAT6-dependent inhibition of NF-kappaB. Journal of Clinical Investigation. 107 (11), 1375-1385 (2001).
- Patntirapong, S., Habibovic, P., Hauschka, P. V. Effects of soluble cobalt and cobalt incorporated into calcium phosphate layers on osteoclast differentiation and activation. Biomaterials. 30 (4), 548-555 (2009).
- Sorensen, M. G., et al. Characterization of osteoclasts derived from CD14+ monocytes isolated from peripheral blood. The Journal of Bone and Mineral Metabolism. 25 (1), 36-45 (2007).
- Kumar, A., et al. Synergistic effect of biphasic calcium phosphate and platelet-rich fibrin attenuate markers for inflammation and osteoclast differentiation by suppressing NF-kappaB/MAPK signaling pathway in chronic periodontitis. Molecules. 26 (21), 6578 (2021).
- Henriksen, K., Karsdal, M. A., Taylor, A., Tosh, D., Coxon, F. P. Generation of human osteoclasts from peripheral blood. Methods in Molecular Biology. 816, 159-175 (2012).
- Maria, S. M., et al. Reproducible quantification of osteoclastic activity: characterization of a biomimetic calcium phosphate assay. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 102 (5), 903-912 (2014).
- Kong, L., Smith, W., Hao, D. Overview of RAW264.7 for osteoclastogensis study: Phenotype and stimuli. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3077-3087 (2019).
- Li, P., et al. Systemic tumor necrosis factor alpha mediates an increase in peripheral CD11bhigh osteoclast precursors in tumor necrosis factor alpha-transgenic mice. Arthritis & Rheumatology. 50 (1), 265-276 (2004).
- Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).
- Xing, L., et al. NF-kappaB p50 and p52 expression is not required for RANK-expressing osteoclast progenitor formation but is essential for RANK- and cytokine-mediated osteoclastogenesis. The Journal of Bone and Mineral Research. 17 (7), 1200-1210 (2002).
- Miyamoto, T., et al. Bifurcation of osteoclasts and dendritic cells from common progenitors. Blood. 98 (8), 2544-2554 (2001).
