Summary
Aqui, apresentamos um procedimento de ensaio simples e eficaz para ensaios de poço de resorção usando placas de cultura celular revestidas de fosfato de cálcio.
Abstract
Os osteoclasstos maduros são células multinucleadas que podem degradar o osso através da secreção de ácidos e enzimas. Eles desempenham um papel crucial em várias doenças (por exemplo, osteoporose e câncer ósseo) e, portanto, são objetos importantes de pesquisa. In vitro, sua atividade pode ser analisada pela formação de poços de resorção. Neste protocolo, descrevemos um método simples de ensaio de poços usando placas de cultura celular revestidas de fosfato de cálcio (CaP), que podem ser facilmente visualizadas e quantificadas. Precursores osteoclastas derivados de células mononucleares de sangue periféricos humanos (PBMCs) foram cultivados nas placas revestidas na presença de estímulos osteoclastogênicos. Após 9 dias de incubação, os osteoclastas foram fixadas e manchadas para imagens de fluorescência, enquanto o revestimento cap foi contra-manchado por calcein. Para quantificar a área resorbedada, o revestimento cap em placas foi manchado com 5% AgNO3 e visualizado por imagens de campo brilhante. A área do poço de resorção foi quantificada por meio do ImageJ.
Introduction
Os osteoclalts (OCs) são macrófagos específicos do tecido derivados de células-tronco hematopoiéticas (HSCs), desempenhando um papel fundamental na remodelagem óssea juntamente com os osteoblastos1. Distúrbios ósseos induzidos por hormônios sexuais, imunológicos e malignos que destroem osso sisticamente ou localmente são devido ao excesso de atividade osteoclástica, incluindo osteoporose relacionada à menopausa2, artrite reumatoide3, doença periodontal4, doença óssea de mieloma5 e metástaseóssea osteolítica 6. Em contraste, defeitos na formação e função de OC também podem causar osteopetrose7. Os HSCs sofrem diferenciação em progenitores oC sob fator estimulante de colônias de macrófagos (M-CSF, símbolo genético ACP5). Na presença tanto do M-CSF quanto do ativador receptor de ligante NF-κB (RANKL, símbolo genético TNFSF11), os progenitores OC se diferenciam ainda mais em OCs mononucleares e, posteriormente, fundem-se para se tornarem OCs multinucleados 8,9,10. Ambas as citocinas M-CSF e RANKL são indispensáveis e suficientes para a indução de marcadores osteoclásticos como receptor de calcitonina (TC), ativador receptor do fator nuclear κ B (RANK), bomba de prótons V-ATPase, subunidade alfa do canal 7 cloreto (CIC-7), integrin β3, fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP, símbolo genético ACP5), catarsina de cissinosa lysomal protease K (CTSK) e matriz metallopeptidase 9 (MMP9). Os OCs ativados formam uma zona de vedação na superfície óssea através da formação de um anel de actina com uma borda de babados11,12. Dentro da zona de vedação, os OCs mediam a resorção através de prótons secretando através da bomba de prótons V-ATPase12,13, MMP914 e CTSK15, levando à formação de lacunas.
Para experimentos in vitro, progenitores oC podem ser obtidos pela expansão de macrófagos de medula óssea do fêmur e tíbia16,17, bem como pelo isolamento das células mononucleares de sangue periféricos humanos (PBMCs) a partir de amostras de sangue e casacos buffy 18,19,20, ou pela diferenciação das células monocíticas murinas imortalizadas RAW 264,7 21,22.
No presente protocolo, descrevemos um ensaio de ressorção osteoclástica em placas de cultura celular revestidas de CaP usando OCs derivados de PBMCs primários. O método de placas de cultura celular revestida de CaP utilizado aqui são adotados e refinados a partir do método descrito anteriormente por Patntirapong et al.17 e Maria et al.21. Para obter precursores de OC, os PBMCs são isolados por centrifugação gradiente de densidade e expandidos como descrito anteriormente20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
O protocolo foi revisado e aprovado pelo comitê de ética local (aprovação nº 287/2020B02).
1. Preparação de placas de cultura celular revestidas de fosfato de cálcio
- Preparação de solução de estoque de cálcio (25 mM CaCl2·2H2O, 1,37 mM NaCl, 15 mM MgCl2·6H2O no buffer Tris)
- Prepare o buffer tris de 1,0 M e ajuste o pH para 7,4 usando 1 M HCl.
- Configure um béquer de vidro em um agitador magnético e adicione 100 mL de tampão tris de 1,0 M.
- Pesar 0,368 g de CaCl2·2H2O, 8,0 g de NaCl e 0,305 g de MgCl2·6H2O e dissolver-se no buffer Tris um a um.
- Ajuste o pH para 7,4 usando 1 M HCl. Armazenar à temperatura ambiente.
- Preparação da solução de estoque fosfato (11,1 mM Na2HPO4· H2O, 42 mM NaHCO3 em tampão Tris)
- Configure um béquer de vidro em um agitador magnético e adicione 100 mL de tampão tris de 1,0 M.
- Pese 0,158 g de Na2HPO4· H2O e 0,353 g de NaHCO3 e dissolver-se em tampão Tris um a um.
- Ajuste o pH para 7,4 usando 1 M HCl. Armazenar à temperatura ambiente.
- Pré-calcificação de placas de cultura celular de 96 poços
- Prepare 30 mL de solução de trabalho misturando 15 mL de tampão tris de 1,0 M, 7,5 mL de caldo de cálcio (etapa 1.1.4) solução e 7,5 mL de solução de estoque fosfato (etapa 1.2.3). Filtre a solução com um filtro de 0,2 μm.
- Prepare uma placa de cultura celular de 96 poços com fundo plano. Pipeta 300 μL de solução de fosfato de cálcio (passo 1.3.1.) para cada poço. Cubra a placa com uma tampa e incubar a placa a 37 °C por 3 dias.
- Preparação da solução de fosfato de cálcio (2,25 mM Na2HPO4· H2O, 4 mM CaCl2·2H2O, 0,14 M NaCl, 50 mM Tris base em ddH2O)
- Adicione 2 mL de 1 M HCl a 40 mL de água deionizada em um béquer com uma conta de agitação magnética e dissolva 0,016 g de Na2HPO4· H2O, 0,0295 g de CaCl2·2H 2O, 0,409 g de NaCl, e 0,303 g de Tris base um a um.
- Ajuste o pH para 7,4 usando 1 M HCl. Adicione água deionizada para encher o volume a 50 mL. Filtre a solução com um filtro de 0,2 μm.
- Calcificação de placas de cultura celular de 96 poços
- Solução de pré-calcificação aspirada a partir das placas de cultura celular pré-calcificadas de 96 poços e adicionar 300 μL de solução de fosfato de cálcio (passo 1.4.2) a cada poço. Cubra as placas com tampa e incubar a 37 °C durante 1 dia.
- Vire a placa para derramar a solução e lave a placa três vezes com água desionizada completamente. Seque a placa imediatamente usando um secador de cabelo ou gás CO2 ou N2 comprimido para manter uma superfície uniforme.
- Esterilize a placa revestida por radiação UV em um banco limpo por 1h. Use a placa revestida imediatamente ou sele a placa com parafilme e armazene-a em temperatura ambiente.
2. Isolamento de PBMCs do sangue periférico humano
- Retire 15 mL de sangue da veia após obter o consentimento por escrito informado do doador de sangue (voto ético: 287/2020B02).
- Diluir 15 mL de sangue fresco com um volume igual de PBS e misturar invertendo o tubo várias vezes ou desenhando a mistura dentro e fora de uma pipeta.
- Prepare um tubo cônico de 50 mL contendo 15 mL de solução de gradiente de densidade (por exemplo, Ficoll, Tabela de Materiais) por tubo. Incline o tubo e coloque cuidadosamente 30 mL de amostra de sangue diluído na solução de gradiente de densidade de 15 mL (amostra de sangue diluída: solução de gradiente de densidade, proporção de 1:0,5-1).
NOTA: Ao sobrepor a amostra, preste atenção para não misturar a solução gradiente de densidade com a amostra de sangue diluída. - Centrifugar a 810 x g por 20 min a 20 °C em um rotor de balde balançando sem freio.
- Aspirar a camada superior deixando a camada de célula mononuclear (linfócitos, monócitos e trombocitos) imperturbável na interfase.
- Transfira cuidadosamente a camada de célula mononuclear para um novo tubo cônico de 50 mL.
- Encha o tubo com PBS, misture e centrífuga a 300 x g por 10 min a 20 °C (o freio pode ser usado a partir desta fase).
- Remova cuidadosamente o supernatante completamente. Resuspense a pelota celular em 50 mL de PBS e centrífuga a 300 x g por 10 min a 20 °C. Remova cuidadosamente o supernatante completamente.
- Para a remoção de plaquetas, resuspenque a pelota celular em 50 mL de PBS e centrífuga a 200 x g por 10 min a 20 °C. Remova cuidadosamente o supernatante completamente.
- Transfira células resuspended para frascos de cultura celular para expansão de progenitores OC.
3. Expansão de progenitores oC
- Resuspend PBMs em α-MEM completo (10% FBS, 1% Caneta/Estreptococos, 1% anfotericina B) contendo 20 ng/mL M-CSF. PBMCs de sementes a uma densidade de 2,5 x 105 células/cm2. Normalmente, células isoladas de 15-20 mL de sangue fresco podem ser semeadas em um frasco de 75 cm2 (1,5-2 x 107 células).
- Alimente as células com α-MEM completos frescos contendo 20 ng/mL M-CSF todos os dias até que as células anexadas atinjam uma confluência desejada. Os rendimentos típicos são 1,5-2 x 106 células/frascos quando as células são 95% confluentes. Normalmente, o período de expansão dura 6 dias.
NOTA: O potencial osteoclastogênico dos precursores pode diminuir com o tempo de cultivo prolongado.
4. Indução de osteoclastogênese em placas revestidas de CAP
- Para facilitar a adesão celular, incubar as placas revestidas de CaP com 50 μL de FBS por 1h em uma incubadora de 37 °C.
- Para separar os precursores de OC, lave o frasco com PBS duas vezes para remover células mortas ou não aderentes. Adicione 4 mL de trippsina (Tabela de Materiais) por frasco de 75 cm2 , por 30 min.
- Adicione 4 mL de α-MEM completos para parar a digestão, desprender cuidadosamente as células usando um raspador de células e transfira as células para um tubo de 50 mL.
- Determine o número total de células usando uma câmara de Neubauer ou similar.
- Pelota as células por centrifugação por 7 min a 350 x g. Resuspenque a pelota em α-MEM completo suficiente contendo 20 ng/mL M-CSF e 20 ng/mL RANKL para obter uma concentração de 1 x 106 células/mL.
- Solução aspirada FBS a partir da placa revestida de CaP 96-well e pipeta 200 μL de suspensão celular por poço (2 x 105 células/bem).
- Incubar os precursores de OC para o período de tempo desejado ou com os reagentes desejados relevantes para o design experimental. Normalmente, um alto número de OCs grandes e multinucleados pode ser observado após 6 dias e quando os poços de resorção estão se formando. Células de alimentação com meio α-MEM completo fresco contendo 20 ng/mL M-CSF e 20 ng/mL RANKL a cada três dias.
- Ao final da incubação, lave as células com PBS duas vezes, fixe com 4% de paraformaldeído por 10 minutos e lave com PBS novamente.
- Use os OCs fixos diretamente para coloração de fluorescência ou armazene a 4 °C.
5. Coloração de fluorescência de OCs e revestimento cap
- Incubar as células fixas com tampão de permeabilização (Triton de 0,1% em PBS) por 5 min.
- Coloritos de filamentos com 100 μL de solução de falotóide etiquetada AlexaFluor 546 na PBS por 30 minutos e aspirar a solução de coloração. Adicione 100 μL de solução de coloração Hoechst 33342 (10 μg/mL em PBS) por 10 minutos para coloração de núcleos. DAPI também pode ser usado.
- Colorir revestimento CaP com 100 μL de calceina de 10 μM em PBS por 10 min. Lave três vezes com PBS e tire imagens.
- Após a fluorescência, as mesmas placas podem ser usadas para quantificar a área do poço de resorção pela coloração de Von Kossa. Para isso, lave as placas com água deionizada duas vezes.
6. Quantificação da área total do poço de resorção
- Para colorir o revestimento cap com coloração von Kossa, incubar com 50 μL de 5% AgNO3 em água deionizada por poço sob radiação UV por 1h, até que o revestimento na parte inferior dos poços tenha se tornado marrom.
- Lave a placa três vezes com água deionizada e tire imagens de campo brilhante. Um objetivo com pouca ampliação, como um objetivo de 1,25x, pode ser usado para capturar todo o poço em uma imagem. Isso facilita a análise de imagem subsequente. Métodos alternativos para capturar toda a área do poço podem ser aplicados.
- Abra um arquivo de imagem com ImageJ: Arquivo | | | de imagem Tipo | 8 bits. Verifique a unidade de escala no canto inferior direito da imagem usando linha reta | Analisar | Definir escala. Digite o comprimento no cobertor de "distância conhecida", digite nova unidade de escala na unidade de comprimento e verifique a caixa Global.
- Parâmetros de medição da lista a serem analisados: Analisar | Definir medidas. Na janela Definir medidas, verifique a área e o limite para caixas de limiar.
- Medir a área dos poços: Imagem | Ajuste | O limiar. Na janela Limiar, verifique o plano de fundo escuro e clique em Auto. A área dos poços fica vermelha. Feche a janela Limiar e selecione Analisar | Meça. Salvar o arquivo de resultado: Arquivo | Salve Como.
7. Quantificação do número e tamanho do OC e área normalizada do poço de resorção
- Abra uma imagem de fluorescência de osteoclatos com ImageJ e verifique a unidade de escala (ver passo 6.3).
- Parâmetros de medição da lista a serem analisados: Analisar | Definir medidas. Na janela Definir medidas, verifique a caixa Área .
- Delineie os OCs usando as seleções ROI Manager e Polygon: Analise | Ferramentas | Gerente do ROI. Clique em seleções de Polígono em toolset, delineie um OC (células com anel de actina e ≥ três núcleos) e clique em Adicionar [t] na janela ROI Manager. Repita o delineamento até que todos os OCs estejam incluídos.
- Medir número e tamanho de OCs: Selecione todos os itens no ROI Manager e clique em Medir. Salvar o arquivo de resultado: Arquivo | Salve Como (Figura 3E).
- Meça a área do poço de imagens de fluorescência. Abra a imagem fluorescente do revestimento correlacionada com a imagem na etapa 7.3 e verifique a unidade de escala (ver etapa 6.3).
- Liste parâmetros de medição a serem analisados (ver etapa 6.4). Selecione | de imagem Ajuste | O limiar. Na janela Limiar, desmarque todas as caixas e clique em Auto. A área dos poços fica vermelha. Feche a janela Limiar e selecione Analisar | Meça. Salve o arquivo de resultado.
- Calcule a área normalizada do poço pelo número de OC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O revestimento de fosfato de cálcio na parte inferior das placas de cultura celular foi realizado em duas etapas de revestimento que compreendem uma pré-calcificação de 3 dias e uma etapa de calcificação de 1 dia. Como mostrado na Figura 1, o fosfato de cálcio distribuído uniformemente foi obtido na parte inferior das placas de 96 poços. O revestimento aderiu muito bem ao fundo após as etapas de lavagem realizadas.
Figura 1: Imagem representativa do campo brilhante do revestimento de fosfato de cálcio em placas de cultura celular de 96 poços. O revestimento foi realizado em duas etapas de revestimento, compreendendo uma etapa de pré-calcificação de 3 dias e uma etapa de calcificação de 1 dia. A barra de escala representa 200 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Precursores oC derivados de PBMCs humanos foram cultivados nas placas revestidas de CaP. Poços de resorção e grandes OCs (área em branco) foram formados na presença de M-CFS e RANKL após 9 dias de cultura (Figura 2A). Os OCs multinucleados localizados nos poços do revestimento CaP expressaram altos níveis de TRAP (Figura 2B).
Figura 2: Expressão TRAP por OCs após a maturação nas placas de cultura celular revestidas de CaP. Os precursores oC foram cultivados nas placas revestidas de CaP na presença de 20 ng/mL M-CSF e 20 ng/mL RANKL por 9 dias. (A) Área em branco representava poços de resorção. (B) Vários OCs TRAP-positivos multinucleados (roxo) foram observados dentro dos poços de resorção. A barra de escala representa 200 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Para caracterizar ainda mais a maturação dos OCs nas placas revestidas de CAP, as células foram manchadas para actina (fluorescência vermelha). Os núcleos celulares foram manchados com Hoechst (azul) e calceína foi usado para visualização de cálcio em verde. Os poços de resorção são visíveis como áreas pretas no revestimento cap verde (Figura 3B). Os OCs maduros funcionais apresentaram três ou mais núcleos e o anel de actina característico que é essencial para a resorção osteoclastogênica (Figura 3A,C). A área do poço de imagens de fluorescência pode ser medida usando a ferramenta de limiar de ImageJ (Figura 3D). O número e o tamanho dos OCs podem ser calculados usando a ferramenta de seleção do ROI Manager e polygon da ImageJ (Figura 3E).
Figura 3: Morfologia de OCs maduros no revestimento cap. Os precursores oC foram cultivados nas placas revestidas de CaP por 9 dias na presença de 20 ng/mL M-CSF e 20 ng/mL RANKL. (A) Os OCs foram manchados para actina e núcleos por fhalloidin-Alexa Fluor 546 e Hoechst 33342. (B) O revestimento de CaP foi manchado por calcein. As áreas negras representam poços de resorção. (C) Imagem mesclada. (D) Quantificação da área do poço (área vermelha) utilizando a ferramenta de limiar do ImageJ. (E) OC delineando e contando usando a ferramenta de seleção roi manager e polygon do ImageJ. A barra de escala representa 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Para a quantificação dos poços de resorção nas placas de cultura celular revestidas de CaP, o cálcio foi manchado pela incubação com 5% agNO3 (mancha von Kossa). Como mostrado na Figura 4A, os precursores de OC não alcançaram a funcionalidade completa na ausência de RANKL e não foram capazes de formar poços de resorção. Os fossas osteoclastogênicas foram observadas apenas na presença de ambos os fatores M-CSF e RANKL (Figura 4B). A área do poço de resorção foi quantificada com a ferramenta de limiar de ImageJ (Figura 4C).
Figura 4: Visualização e quantificação de poços de resorção. Os precursores oC foram cultivados no CaP revestido de placas de cultura celular de 96 poços na ausência de RANKL (A) e na presença de ambos os fatores M-CSF e RANKL (B). (C) Os números de poços de resorção formados foram quantificados utilizando-se a ferramenta de limiar de ImageJ. A barra de escala representa 1.000 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aqui descrevemos um método simples e confiável para um ensaio de ressorção osteoclástica usando OCs derivados e expandidos in vitro a partir de PBMCs. As placas de cultura celular revestidas de CaP usadas podem ser facilmente preparadas e visualizadas usando materiais disponíveis em laboratório. Além dos PBMCs não variados adotados neste protocolo, os OCs gerados a partir de células monócíticas murinas21 e células macrófagos de medula óssea17 também foram cultivados em substratos sintéticos similares para ensaio de poços, assim essas fontes celulares podem ser movidas para essa abordagem referente à literatura correspondente.
Para este protocolo, usamos um simples revestimento CaP fabricado em laboratório em vez de placas de ensaio disponíveis comercialmente. Embora as fatias de osso e dentina sejam dois materiais resorbáveis comuns e acessíveis para ensaio de poço de resorção, a disponibilidade e a preparação complicada são grandes desvantagens. Como um substrato sintético facilmente preparado, o revestimento CaP é mais conveniente e prontamente disponível do que os dois materiais originais. Outra vantagem dessa abordagem de ensaio pit é que as células podem ser visualizadas sob um microscópio de campo brilhante durante a cultura, enquanto as células que crescem em fatias de osso opaco e dentina não podem ser observadas.
Este método de revestimento CaP pode ser adaptado de acordo com as necessidades experimentais necessárias para diferentes tamanhos de placas de cultura celular.
Ao contrário dos17,21 relatados anteriormente, incubamos as placas com solução de revestimento a 37 °C em vez de em temperatura ambiente, resultando no crescimento espontâneo de núcleos apatitas em placas de cultura celular à temperatura corporal. Placas revestidas de CAP estão disponíveis para experimentos imediatamente após serem secas e esterilizadas pela radiação UV, o que economiza tempo em comparação com os métodos relatados anteriormente17,21.
A filtragem da solução de revestimento (Passo 1.3.1 e 1.4.2) é um passo crucial, que ajuda a obter um tamanho uniforme de partícula e reduzir manchas não revestidas dentro do revestimento causadas por bolhas de ar e impurezas na solução. Secar a placa imediatamente (passo 1.5.2) é outro passo crítico, que ajuda a fazer um revestimento cap uniforme. Caso contrário, é propenso a formar um revestimento mais grosso no meio do poço.
Vale ressaltar que a espessura do revestimento e a densidade dos depósitos de fosfato de cálcio dependem do volume da solução de revestimento dentro de uma certa faixa. Portanto, é possível controlar a espessura do revestimento alterando o volume da solução de revestimento no poço. No entanto, sugere-se adicionar o máximo de volume de solução de revestimento possível quando a placa de cultura celular de 96 poços é usada devido ao pequeno volume total para este formato de placa de cultura. A parede interna do poço também é revestida por CaP durante ambos os degraus de revestimento, portanto é necessário cautela para não tocar na parte inferior nem na parede com a pipeta, a fim de proteger o revestimento de danos.
De acordo com nossa observação, a maioria dos precursores de OC expandidos de PBMCs são capazes de anexar ao revestimento cap sem problemas. No entanto, a imersão da placa revestida com FBS antes da semeadura celular melhora a eficiência de adesão celular, como relatado anteriormente21.
Desvincular os precursores de OC suavemente usando um raspador de célula (passo 4.2) também é importante porque a maioria dos precursores de OC ainda eram aderentes, e minimizar a lesão mecânica é favorável à viabilidade celular.
Uma limitação deste método é que os PBMCs a granel que usamos como fonte de precursores de OC é uma fonte celular altamente mista, da qual apenas uma pequena fração de células (células CD14+) são precursores reais de OC. Uma vez que outras células capazes de afetar a osteoclastogênese (como células estrômicas e linfócitos) estão presentes entre os PBMCs isolados, isso pode impactar os resultados de ensaios de maneiras difíceis de prever, e podem confundir a interpretação do ensaio. Para melhor investigar os efeitos diretos dos fatores de crescimento, citocinas ou glicocorticoides na atividade resorputada de OCs, são recomendados métodos de purificação precursora de OC (por exemplo, classificação celular ativada por fluorescência (FACS) e purificação de contas magnéticas20 com base em marcadores específicos da superfície celular 23,24,25,26).
As limitações do substrato CaP na obtenção de imagens de campo brilhante de ambas as células e poços subjacentes para a mesma área é causada pela incompatibilidade de manchas TRAP e Von Kossa, de modo que a área de resorção normalizada de todo o poço não está disponível. Mas, em vez disso, a imagem de fluorescência pode ser usada para visualizar área de resorção e número de célula para obter dados de resorção normalizados. Esses dados podem fornecer informações importantes sobre se o aumento da área de resorção total em condições experimentais deve-se ao aumento do número de osteoclatos sozinho ou ao aumento da capacidade de resorção de células individuais. Além disso, permite o estudo dos efeitos relativos do número osteoclante, tamanho, número do núcleo e capacidade de resorção.
Em resumo, descrevemos um protocolo útil e simples para um ensaio de poço de resorção usando um revestimento de fosfato de cálcio de duas etapas e OCs derivados de PBMCs humanos primários. Este protocolo fornece um método fácil para estabelecer um modelo de resorção óssea in vitro para estudos relacionados à resorção osteoclástica, podendo ser aplicado ao estudo de tratamentos para doenças de desordem óssea.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi parcialmente financiado pelo Conselho de Bolsas da China [CSC No. 201808440394]. W.C. foi financiado pelo CSC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AgNO3 | SERVA Electrophoresis GmbH | 35110 | Silver nitrate |
| a-MEM | Gibco | 32561-029 | MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides |
| amphotericin B | Biochrom | 03-028-1B | Amphotericin B Solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21097-50G | Calcium chloride Dihydrate |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | Calcein |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | fetal bovine serum |
| Ficoll | Cytiva | 17144002 | Ficoll Paque Plus |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | Paraformaldehyde |
| HCl | Merk | 1.09057.1000 | Hydrochloric acid |
| Hoechst 33342 | Promokine | PK-CA707-40046 | Hoechst 33342 |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | Recombinant Human M-CSF |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Magnesium chloride |
| Na2HPO4 | AppliChem GmbH | A2943,0250 | di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous |
| NaCl | Merk | S7653-250G | Sodium chloride |
| NaHCO3 | Merk | K15322429 | Bicarbonate of Soda |
| PBS | Lonza | 17-512F | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium |
| Pen-Strep | Lonza | DE17-602E | Penicillin-Streptomycin Mixture |
| Phalloidin-Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 Phalloidin |
| RANKL | PeproTech | 310-01 | Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived) |
| Tris | Sigma-Aldrich | 93362 | Tris(hydroxymethyl)aminomethan |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol |
| TrypLE Express | Gibco | 12605010 | Recombinant cell-dissociation enzymes |
References
- Jacome-Galarza, C. E., et al. Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts. Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).
- Moller, A. M. J., et al. Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone resorption. Bone Research. 8 (1), 1-11 (2020).
- Yokota, K., et al. Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).
- Teng, Y. T., et al. Functional human T-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection. Journal of Clinical Investigation. 106 (6), 59-67 (2000).
- Terpos, E., et al. Soluble receptor activator of nuclear factor kappaB ligand-osteoprotegerin ratio predicts survival in multiple myeloma: proposal for a novel prognostic index. Blood. 102 (3), 1064-1069 (2003).
- Morony, S., et al. Osteoprotegerin inhibits osteolysis and decreases skeletal tumor burden in syngeneic and nude mouse models of experimental bone metastasis. Cancer Research. 61 (11), 4432-4436 (2001).
- Sobacchi, C., Schulz, A., Coxon, F. P., Villa, A., Helfrich, M. H. Osteopetrosis: genetics, treatment and new insights into osteoclast function. Nature Reviews Endocrinology. 9 (9), 522-536 (2013).
- Amarasekara, D. S., et al. Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks. Immune Network. 18 (1), 8 (2018).
- Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis. Cells. 9 (9), (2020).
- Teitelbaum, S. L.
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L.
- Baron, R., Neff, L., Louvard, D., Courtoy, P. J. Cell-mediated extracellular acidification and bone resorption: evidence for a low pH in resorbing lacunae and localization of a 100-kD lysosomal membrane protein at the osteoclast ruffled border. Journal of Cell Biology. 101 (6), 2210-2222 (1985).
- Blair, H. C., Teitelbaum, S. L., Ghiselli, R., Gluck, S. Osteoclastic bone resorption by a polarized vacuolar proton pump. Science. 245 (4920), 855-857 (1989).
- Zhu, L., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), 6143 (2020).
- Gowen, M., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. The Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
- Abu-Amer, Y. IL-4 abrogates osteoclastogenesis through STAT6-dependent inhibition of NF-kappaB. Journal of Clinical Investigation. 107 (11), 1375-1385 (2001).
- Patntirapong, S., Habibovic, P., Hauschka, P. V. Effects of soluble cobalt and cobalt incorporated into calcium phosphate layers on osteoclast differentiation and activation. Biomaterials. 30 (4), 548-555 (2009).
- Sorensen, M. G., et al. Characterization of osteoclasts derived from CD14+ monocytes isolated from peripheral blood. The Journal of Bone and Mineral Metabolism. 25 (1), 36-45 (2007).
- Kumar, A., et al. Synergistic effect of biphasic calcium phosphate and platelet-rich fibrin attenuate markers for inflammation and osteoclast differentiation by suppressing NF-kappaB/MAPK signaling pathway in chronic periodontitis. Molecules. 26 (21), 6578 (2021).
- Henriksen, K., Karsdal, M. A., Taylor, A., Tosh, D., Coxon, F. P. Generation of human osteoclasts from peripheral blood. Methods in Molecular Biology. 816, 159-175 (2012).
- Maria, S. M., et al. Reproducible quantification of osteoclastic activity: characterization of a biomimetic calcium phosphate assay. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 102 (5), 903-912 (2014).
- Kong, L., Smith, W., Hao, D. Overview of RAW264.7 for osteoclastogensis study: Phenotype and stimuli. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3077-3087 (2019).
- Li, P., et al. Systemic tumor necrosis factor alpha mediates an increase in peripheral CD11bhigh osteoclast precursors in tumor necrosis factor alpha-transgenic mice. Arthritis & Rheumatology. 50 (1), 265-276 (2004).
- Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).
- Xing, L., et al. NF-kappaB p50 and p52 expression is not required for RANK-expressing osteoclast progenitor formation but is essential for RANK- and cytokine-mediated osteoclastogenesis. The Journal of Bone and Mineral Research. 17 (7), 1200-1210 (2002).
- Miyamoto, T., et al. Bifurcation of osteoclasts and dendritic cells from common progenitors. Blood. 98 (8), 2544-2554 (2001).
