Summary
Nous présentons ici une procédure de dosage simple et efficace pour les essais en fosse de résorption utilisant des plaques de culture cellulaire revêtues de phosphate de calcium.
Abstract
Les ostéoclastes matures sont des cellules multinucléées qui peuvent dégrader les os par la sécrétion d’acides et d’enzymes. Ils jouent un rôle crucial dans diverses maladies (p. ex. ostéoporose et cancer des os) et sont donc des objets de recherche importants. In vitro, leur activité peut être analysée par la formation de fosses de résorption. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode simple de dosage en fosse utilisant des plaques de culture cellulaire revêtues de phosphate de calcium (CaP), qui peuvent être facilement visualisées et quantifiées. Des précurseurs d’ostéoclastes dérivés de cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC) ont été cultivés sur les plaques revêtues en présence de stimuli ostéoclastogènes. Après 9 jours d’incubation, les ostéoclastes ont été fixés et colorés pour l’imagerie par fluorescence tandis que le revêtement CaP a été contre-coloré par la calcéine. Pour quantifier la zone résorbée, le revêtement CaP sur les plaques a été coloré avec 5% d’AgNO3 et visualisé par imagerie en champ clair. La zone de la fosse de résorption a été quantifiée à l’aide d’ImageJ.
Introduction
Les ostéoclastes (OC) sont des macrophages spécifiques aux tissus dérivés de cellules souches hématopoïétiques (CSH), jouant un rôle central dans le remodelage osseux avec les ostéoblastes1. Les troubles osseux induits par les hormones sexuelles, immunologiques et malins qui détruisent les os de manière systémique ou locale sont dus à une activité ostéoclastique excessive, y compris l’ostéoporose liée à la ménopause2, la polyarthrite rhumatoïde3, la maladie parodontale4, la maladie osseuse myélomateuse5 et les métastases osseuses ostéolytiques6. En revanche, des défauts dans la formation et la fonction du CO peuvent également provoquer une ostéopétrose7. Les CSH subissent une différenciation en progéniteurs OC sous stimulation du facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF, symbole du gène ACP5). En présence à la fois de M-CSF et d’activateur de récepteur du ligand NF-κB (RANKL, symbole du gène TNFSF11), les progéniteurs OC se différencient davantage en OC mononucléaires et fusionnent ensuite pour devenirdes OC multinucléés 8,9,10. Les cytokines M-CSF et RANKL sont indispensables et suffisantes pour l’induction de marqueurs ostéoclastiques tels que le récepteur de la calcitonine (CT), l’activateur du récepteur du facteur nucléaire κ B (RANK), la pompe à protons V-ATPase, la sous-unité alpha du canal chlorure 7 (CIC-7), l’intégrine β3, la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP, symbole du gène ACP5), la cystéine protéase lysosomale cathepsine K (CTSK) et la métallopeptidase matricielle 9 (MMP9). Les CO activés forment une zone d’étanchéité à la surface osseuse par la formation d’un anneau d’actine avec une bordure ébouriffée11,12. Dans la zone d’étanchéité, les CO médient la résorption par la sécrétisation de protons via la pompe à protons V-ATPase 12,13, MMP914 et CTSK15, conduisant à la formation de lacunes.
Pour les expériences in vitro, les progéniteurs OC peuvent être obtenus par expansion des macrophages de la moelle osseuse à partir du fémur et du tibiade souris 16,17, ainsi que par isolement des cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC) à partir d’échantillons de sang et de pelages bouffants 18,19,20, ou par différenciation des cellules monocytaires murines immortalisées RAW 264,7 21,22.
Dans le présent protocole, nous décrivons un test de résorption ostéoclastique dans des plaques de culture cellulaire revêtues de CaP à l’aide d’OC dérivés de PBMC primaires. La méthode des plaques de culture cellulaire revêtues de CaP utilisée ici est adoptée et affinée à partir de la méthode décrite précédemment par Patntirapong et al.17 et Maria et al.21. Pour obtenir des précurseurs OC, les PBMC sont isolés par centrifugation par gradient de densité et élargis comme décrit précédemment20.
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Protocol
Le protocole a été examiné et approuvé par le comité d’éthique local (numéro d’approbation 287/2020B02).
1. Préparation de plaques de culture cellulaire revêtues de phosphate de calcium
- Préparation de la solution mère de calcium (25 mM CaCl2·2H2O, 1,37 mM NaCl, 15 mM MgCl2·6H2O dans le tampon Tris)
- Préparez un tampon Tris de 1,0 M et ajustez le pH à 7,4 à l’aide de 1 M HCl.
- Installez un bécher en verre sur un agitateur magnétique et ajoutez 100 mL de tampon Tris de 1,0 M.
- Peser 0,368 g de CaCl2·2H2O, 8,0 g de NaCl et 0,305 g de MgCl2·6H2O et dissoudre dans le tampon Tris un par un.
- Ajuster le pH à 7,4 à l’aide de 1 M HCl. Conserver à température ambiante.
- Préparation de la solution mère de phosphate (11,1 mM Na2HPO4· H2O, 42 mM NaHCO3 dans le tampon Tris)
- Installez un bécher en verre sur un agitateur magnétique et ajoutez 100 mL de tampon Tris de 1,0 M.
- Peser 0,158 g de Na2HPO4· H2O et 0,353 g de NaHCO3 et dissoudre dans le tampon Tris un par un.
- Ajuster le pH à 7,4 à l’aide de 1 M HCl. Conserver à température ambiante.
- Pré-calcification des plaques de culture cellulaire à 96 puits
- Préparer 30 mL de solution de travail en mélangeant 15 mL de tampon Tris de 1,0 M, 7,5 mL de solution de calcium (étape 1.1.4) et 7,5 mL de solution mère de phosphate (étape 1.2.3). Filtrer la solution avec un filtre de 0,2 μm.
- Préparez une plaque de culture cellulaire de 96 puits avec un fond plat. Pipette 300 μL de solution de phosphate de calcium (étape 1.3.1.) dans chaque puits. Couvrir la plaque avec un couvercle et incuber la plaque à 37 °C pendant 3 jours.
- Préparation d’une solution de phosphate de calcium (2,25 mM Na2HPO4· H 2 O, 4 mM CaCl2·2H2O, 0,14 M NaCl, 50 mM De base Tris en ddH2O)
- Ajouter 2 mL de 1 M HCl à 40 mL d’eau désionisée dans un bécher avec une bille d’agitation magnétique et dissoudre 0,016 g de Na2HPO4· H2O, 0,0295 g de CaCl2·2H2O, 0,409 g de NaCl et 0,303 g de base Tris un par un.
- Ajuster le pH à 7,4 à l’aide de 1 M HCl. Ajouter de l’eau désionisée pour remplir le volume à 50 mL. Filtrer la solution avec un filtre de 0,2 μm.
- Calcification de plaques de culture cellulaire à 96 puits
- Aspirer la solution de précalcification des plaques de culture cellulaire pré-calcifiées à 96 puits et ajouter 300 μL de solution de phosphate de calcium (étape 1.4.2) à chaque puits. Couvrir les plaques avec un couvercle et incuber à 37 °C pendant 1 jour.
- Retournez la plaque pour verser la solution et lavez la plaque trois fois avec de l’eau désionisée à fond. Séchez immédiatement la plaque à l’aide d’un sèche-cheveux ou d’un gaz CO2 ouN2 comprimé pour maintenir une surface uniforme.
- Stériliser la plaque enduite par rayonnement UV dans un banc propre pendant 1 h. Utilisez immédiatement la plaque revêtue ou scellez la plaque avec un parafilm et conservez-la à température ambiante.
2. Isolement des PBMC du sang périphérique humain
- Prélever 15 mL de sang dans la veine après avoir obtenu le consentement éclairé écrit du donneur de sang (vote éthique: 287/2020B02).
- Diluer 15 mL de sang frais avec un volume égal de PBS et mélanger en inversant le tube plusieurs fois ou en tirant le mélange dans et hors d’une pipette.
- Préparer un tube conique de 50 mL contenant 15 mL de solution de gradient de densité (p. ex. Ficoll, Table des matériaux) par tube. Inclinez le tube et superposez soigneusement 30 mL d’échantillon de sang dilué sur la solution de gradient de densité de 15 mL (échantillon de sang dilué : solution de gradient de densité, rapport 1:0,5-1).
REMARQUE: Lors de la superposition de l’échantillon, veillez à ne pas mélanger la solution de gradient de densité avec l’échantillon de sang dilué. - Centrifuger à 810 x g pendant 20 min à 20 °C dans un rotor à godet oscillant sans frein.
- Aspirer la couche supérieure en laissant la couche cellulaire mononucléaire (lymphocytes, monocytes et thrombocytes) intacte à l’interphase.
- Transférez soigneusement la couche cellulaire mononucléaire dans un nouveau tube conique de 50 mL.
- Remplissez le tube avec du PBS, du mélange et de la centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à 20 °C (le frein peut être utilisé à partir de cette étape).
- Retirez soigneusement le surnageant complètement. Remettre en suspension la pastille de la cellule dans 50 mL de PBS et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 20 °C. Retirez soigneusement le surnageant complètement.
- Pour l’élimination des plaquettes, remettre la pastille de cellule dans 50 mL de PBS et centrifuger à 200 x g pendant 10 min à 20 °C. Retirez soigneusement le surnageant complètement.
- Transférer les cellules remises en suspension dans des flacons de culture cellulaire pour l’expansion des progéniteurs OC.
3. Expansion des progéniteurs OC
- Remettre en suspension les PBMC en α-MEM complets (10 % FBS, 1 % Pen/Strep, 1 % amphotéricine B) contenant 20 ng/mL M-CSF. Semez des PBMC à une densité de 2,5 x 105 cellules/cm2. Habituellement, les cellules isolées de 15-20 mL de sang frais peuvent être ensemencées dans une fiole de 75 cm2 (1,5-2 x 107 cellules).
- Nourrissez les cellules avec du α-MEM complet frais contenant 20 ng / mL de M-CSF tous les trois jours jusqu’à ce que les cellules attachées atteignent la confluence souhaitée. Les rendements typiques sont de 1,5-2 x 106 cellules / flacon lorsque les cellules sont confluentes à 95%. Habituellement, la période d’expansion dure 6 jours.
REMARQUE: Le potentiel ostéoclastogène des précurseurs peut diminuer avec un temps de culture prolongé.
4. Induction de l’ostéoclastogenèse dans les plaques revêtues de CaP
- Pour faciliter l’adhésion cellulaire, incuber les plaques revêtues de CaP avec 50 μL de FBS pendant 1 h dans un incubateur à 37 °C.
- Pour détacher les précurseurs de CO, lavez la fiole avec du PBS deux fois pour éliminer les cellules mortes ou non adhérentes. Ajouter 4 mL de trypsine (Table des matériaux) par flacon de 75 cm2 , pendant 30 min.
- Ajouter 4 mL de α-MEM complet pour arrêter la digestion, détacher soigneusement les cellules à l’aide d’un grattoir cellulaire et transférer les cellules dans un tube de 50 mL.
- Déterminez le nombre total de cellules à l’aide d’une chambre de Neubauer ou similaire.
- Granulés les cellules par centrifugation pendant 7 min à 350 x g. Remettre en suspension la pastille dans suffisamment de α-MEM complet contenant 20 ng/mL M-CSF et 20 ng/mL RANKL pour obtenir une concentration de 1 x 106 cellules/mL.
- Aspirer la solution FBS de la plaque de 96 puits revêtue de CaP et pipette 200 μL de suspension cellulaire par puits (2 x 105 cellules/puits).
- Incuber les précurseurs OC pendant la période souhaitée ou avec les réactifs souhaités pertinents pour la conception expérimentale. Habituellement, un nombre élevé d’OC de grande taille et multinucléés peut être observé après 6 jours et lorsque des fosses de résorption se forment. Cellules d’alimentation avec un milieu α-MEM complet frais contenant 20 ng/mL de M-CSF et 20 ng/mL de RANKL tous les trois jours.
- À la fin de l’incubation, lavez les cellules avec du PBS deux fois, fixez-les avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 minutes et lavez à nouveau avec du PBS.
- Utilisez les CO fixes directement pour la coloration par fluorescence ou stockez-les à 4 °C.
5. Coloration par fluorescence des CO et du revêtement CaP
- Incuber les cellules fixes avec un tampon de perméabilisation (0,1% de Triton dans PBS) pendant 5 min.
- Colorez les filaments d’actine avec 100 μL de solution de phalloïdine marquée AlexaFluor 546 dans du PBS pendant 30 min et aspirez la solution de coloration. Ajouter 100 μL de solution de coloration Hoechst 33342 (10 μg/mL dans le PBS) pendant 10 min pour colorer les noyaux. DAPI peut également être utilisé.
- Revêtement De coloration CaP avec 100 μL de 10 μM de calccéine dans le PBS pendant 10 min. Lavez trois fois avec PBS et prenez des images.
- Après l’imagerie par fluorescence, les mêmes plaques peuvent être utilisées pour quantifier la zone de la fosse de résorption par coloration de Von Kossa. Pour ce faire, lavez les assiettes à l’eau désionisée deux fois.
6. Quantification de la surface totale de la fosse de résorption
- Pour tacher le revêtement CaP avec coloration Von Kossa, incuber avec 50 μL de 5% AgNO3 dans de l’eau désionisée par puits sous rayonnement UV pendant 1 h, jusqu’à ce que le revêtement au fond des puits soit devenu brun.
- Lavez la plaque trois fois avec de l’eau désionisée et prenez des images en champ lumineux. Un objectif avec peu de grossissement, tel qu’un objectif 1,25x, peut être utilisé pour capturer l’ensemble du puits dans une seule image. Cela facilite l’analyse ultérieure de l’image. D’autres méthodes pour capturer toute la zone du puits peuvent être appliquées.
- Ouvrez un fichier image avec ImageJ: File | Ouvrir | | de l’image Type | 8 bits. Vérifiez l’unité d’échelle dans le coin inférieur droit de l’image à l’aide de la ligne droite | Analyser | Définir l’échelle. Entrez la longueur dans la couverture « distance connue », entrez une nouvelle unité d’échelle dans Unité de longueur et cochez la case Global.
- Liste des paramètres de mesure à analyser : Analyser | Définir les mesures. Dans la fenêtre Définir les mesures, cochez les cases Zone et Limite au seuil.
- Mesurer la surface des fosses : image | Ajuster | Seuil. Dans la fenêtre Seuil, cochez la case Arrière-plan sombre et cliquez sur Auto. La zone des fosses devient rouge. Fermez la fenêtre Seuil et sélectionnez Analyser | Mesure. Enregistrez le fichier de résultats : Fichier | Enregistrer sous.
7. Quantification du nombre et de la taille du CO, et de la zone normalisée de la fosse de résorption
- Ouvrez une image de fluorescence d’ostéoclastes avec ImageJ et vérifiez l’unité d’échelle (voir étape 6.3).
- Liste des paramètres de mesure à analyser : Analyser | Définir les mesures. Dans la fenêtre Définir les mesures, cochez la case Zone .
- Décrire les OC à l’aide des sélections ROI Manager et Polygon : Analyser | Outils | Gestionnaire de retour sur investissement. Cliquez sur Sélections de polygones dans l’ensemble d’outils, dessinez un OC (cellules avec anneau d’actine et ≥ trois noyaux) et cliquez sur Ajouter [t] dans la fenêtre gestionnaire de retour sur investissement. Répétez la description jusqu’à ce que tous les CO soient inclus.
- Mesurer le nombre et la taille des CO : sélectionnez tous les éléments dans le Gestionnaire de retour sur investissement et cliquez sur Mesurer. Enregistrez le fichier de résultats : Fichier | Enregistrer sous (Figure 3E).
- Mesurez la zone de fosse des images de fluorescence. Ouvrez l’image fluorescente du revêtement en corrélation avec l’image de l’étape 7.3 et vérifiez l’unité d’échelle (voir l’étape 6.3).
- Énumérer les paramètres de mesure à analyser (voir étape 6.4). Sélectionnez | d’image Ajuster | Seuil. Dans la fenêtre Seuil, décochez toutes les cases et cliquez sur Auto. La zone des fosses devient rouge. Fermez la fenêtre Seuil et sélectionnez Analyser | Mesure. Enregistrez le fichier de résultats.
- Calculez la surface normalisée de la fosse par numéro OC.
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Representative Results
Le revêtement de phosphate de calcium sur le fond des plaques de culture cellulaire a été effectué en deux étapes de revêtement comprenant une pré-calcification de 3 jours et une étape de calcification de 1 jour. Comme le montre la figure 1, du phosphate de calcium uniformément réparti a été obtenu au fond des plaques de 96 puits. Le revêtement a très bien adhéré au fond après les étapes de lavage effectuées.
Figure 1 : Image représentative en champ lumineux du revêtement de phosphate de calcium sur des plaques de culture cellulaire de 96 puits. Le revêtement a été réalisé en deux étapes de revêtement comprenant une étape de pré-calcification de 3 jours et une étape de calcification de 1 jour. La barre d’échelle représente 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Les précurseurs oc dérivés de PBMC humains ont été cultivés sur les plaques revêtues de CaP. Des fosses de résorption et de grands OC (zone vierge) se sont formés en présence de M-CFS et de RANKL après 9 jours de culture (figure 2A). Les CO multinucléés situés dans les fosses du revêtement CaP exprimaient des niveaux élevés de TRAP (Figure 2B).
Figure 2 : Expression trap par les OC après maturation sur les plaques de culture cellulaire revêtues de CaP. Les précurseurs de CO ont été cultivés sur les plaques revêtues de CaP en présence de 20 ng/mL de M-CSF et de 20 ng/mL de RANKL pendant 9 jours. (A) La zone vierge représentait les fosses de résorption. (B) Plusieurs OC TRAP positifs (violets) multinucléés ont été observés dans les fosses de résorption. La barre d’échelle représente 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Pour caractériser davantage la maturation des OC sur les plaques revêtues de CaP, les cellules ont été colorées pour l’actine (fluorescence rouge). Les noyaux cellulaires ont été colorés avec Hoechst (bleu) et la calcéine a été utilisée pour la visualisation du calcium en vert. Les fosses de résorption sont visibles sous forme de zones noires dans le revêtement vert CaP (Figure 3B). Les OC matures fonctionnels présentaient trois noyaux ou plus et l’anneau d’actine caractéristique qui est essentiel pour la résorption ostéoclastogène (Figure 3A,C). La zone de fosse des images de fluorescence peut être mesurée à l’aide de l’outil de seuil d’ImageJ (Figure 3D). Le nombre et la taille des OC peuvent être calculés à l’aide du gestionnaire de retour sur investissement et de l’outil de sélection de polygones d’ImageJ (Figure 3E).
Figure 3 : Morphologie des OC matures sur le revêtement CaP. Les précurseurs de CO ont été cultivés sur les plaques revêtues de CaP pendant 9 jours en présence de 20 ng/mL M-CSF et de 20 ng/mL RANKL. (A) Les CO ont été colorés pour l’actine et les noyaux par la phalloïdine-Alexa Fluor 546 et Hoechst 33342. (B) Le revêtement en CaP a été taché par la calcéine. Les zones noires représentent des fosses de résorption. (C) Image fusionnée. (D) Quantification de la surface de la fosse (zone rouge) à l’aide de l’outil de seuilnement d’ImageJ. (E) Oc décrivant et comptant à l’aide du gestionnaire de retour sur investissement et de l’outil de sélection de polygones d’ImageJ. La barre d’échelle représente 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Pour la quantification des fosses de résorption sur les plaques de culture cellulaire revêtues de CaP, le calcium a été coloré par incubation avec 5% d’AgNO3 (coloration de Von Kossa). Comme le montre la figure 4A, les précurseurs du CO n’ont pas atteint leur pleine fonctionnalité en l’absence de RANKL et n’ont pas été en mesure de former des fosses de résorption. Des fosses ostéoclastogènes n’ont été observées qu’en présence des deux facteurs M-CSF et RANKL (figure 4B). La zone de la fosse de résorption a été quantifiée à l’aide de l’outil de seuillage d’ImageJ (Figure 4C).
Figure 4 : Visualisation et quantification des fosses de résorption. Les précurseurs du CO ont été cultivés sur les plaques de culture cellulaire de 96 puits revêtues de CaP en l’absence de RANKL (A) et en présence des deux facteurs M-CSF et RANKL (B). (C) Le nombre de fosses de résorption formées a été quantifié à l’aide de l’outil de seuillage d’ImageJ. La barre d’échelle représente 1 000 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Nous décrivons ici une méthode simple et fiable pour un test de résorption ostéoclastique utilisant des CO dérivés et développés in vitro à partir de PBMC. Les plaques de culture cellulaire revêtues de CaP utilisées peuvent être facilement préparées et visualisées à l’aide de matériaux disponibles en laboratoire. En plus des PBMC non triés adoptés dans ce protocole, les OC générés à partir de cellules monocytaires murines21 et de cellules macrophages de moelle osseuse17 ont également été cultivés sur des substrats synthétiques similaires pour le dosage en fosse, de sorte que ces sources cellulaires peuvent être déplacées vers cette approche en se référant à la littérature correspondante.
Pour ce protocole, nous avons utilisé un simple revêtement CaP fabriqué en laboratoire au lieu de plaques d’essai coûteuses disponibles dans le commerce. Bien que les tranches d’os et de dentine soient deux matériaux résorbables courants et abordables pour le dosage en fosse de résorption, la disponibilité et la préparation compliquée sont des inconvénients majeurs. En tant que substrat synthétique facile à préparer, le revêtement CaP est plus pratique et facilement disponible que les deux matériaux d’origine. Un autre avantage de cette approche de dosage en fosse est que les cellules peuvent être visualisées sous un microscope à champ lumineux pendant la culture, alors que les cellules se développant sur des tranches opaques d’os et de dentine ne peuvent pas être observées.
Cette méthode de revêtement CaP peut être adaptée de manière flexible en fonction des besoins expérimentaux requis à différentes tailles de plaques de culture cellulaire.
Contrairement à 17,21 précédemment rapportés, nous incubons les plaques avec une solution de revêtement à 37 °C au lieu de température ambiante, ce qui entraîne la croissance spontanée de noyaux d’apatite sur des plaques de culture cellulaire à la température du corps. Les plaques revêtues de CaP sont disponibles pour des expériences immédiatement après avoir été séchées et stérilisées par rayonnement UV, ce qui permet de gagner du temps par rapport aux méthodes précédemment rapportées17,21.
La filtration de la solution de revêtement (étape 1.3.1 et 1.4.2) est une étape cruciale, qui permet d’obtenir une taille de particule uniforme et de réduire les taches non revêtues dans le revêtement causées par les bulles d’air et les impuretés dans la solution. Le séchage immédiat de la plaque (étape 1.5.2) est une autre étape critique, qui aide à obtenir un revêtement CaP uniforme. Sinon, il est susceptible de former un revêtement plus épais au milieu du puits.
Il convient de souligner que l’épaisseur du revêtement et la densité des dépôts de phosphate de calcium dépendent du volume de la solution de revêtement dans une certaine plage. Par conséquent, il est possible de contrôler l’épaisseur du revêtement en modifiant le volume de la solution de revêtement dans le puits. Cependant, il est suggéré d’ajouter autant de volume de solution de revêtement que possible lorsque la plaque de culture cellulaire à 96 puits est utilisée en raison du faible volume total pour ce format de plaque de culture. La paroi intérieure du puits est également recouverte de CaP pendant les deux étapes de revêtement, il faut donc faire preuve de prudence pour ne pas toucher le fond ni le mur avec la pipette afin de protéger le revêtement des dommages.
Selon notre observation, la plupart des précurseurs OC développés à partir de PBMC sont capables de se fixer au revêtement CaP sans aucun problème. Cependant, le trempage de la plaque enduite avec du FBS avant l’ensemencement cellulaire améliore l’efficacité de l’adhésion cellulaire, comme indiqué précédemment21.
Le détachement en douceur des précurseurs occlusion à l’aide d’un grattoir cellulaire (étape 4.2) est également important car la plupart des précurseurs OC étaient encore adhérents et la minimisation des lésions mécaniques est favorable à la viabilité cellulaire.
Une limitation de cette méthode est que les PBMC en vrac que nous avons utilisés comme source de précurseurs OC sont une source cellulaire hautement mélangée, dont seule une petite fraction de cellules (cellules CD14+) sont des précurseurs RÉELS DE CO. Étant donné que d’autres cellules capables d’affecter l’ostéoclastogenèse (telles que les cellules stromales et les lymphocytes) sont présentes parmi les PBMC isolés, cela peut avoir un impact sur les résultats des tests d’une manière qui peut être difficile à prédire et pourrait confondre l’interprétation des tests. Pour mieux étudier les effets directs des facteurs de croissance, des cytokines ou des glucocorticoïdes sur l’activité résorptive des CO, des méthodes de purification des précurseurs du CO (p. ex., tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et purification des billes magnétiques20 basées sur des marqueurs spécifiques de surface cellulaire 23,24,25,26) sont recommandées.
Les limites du substrat CaP dans l’obtention d’images en champ clair des cellules et des fosses sous-jacentes pour la même zone sont causées par l’incompatibilité de la coloration TRAP et Von Kossa, de sorte que la zone de résorption normalisée de l’ensemble du puits n’est pas disponible. Mais au lieu de cela, l’imagerie par fluorescence peut être utilisée pour visualiser la zone de résorption et le nombre de cellules afin d’obtenir des données de résorption normalisées. Ces données peuvent fournir des informations importantes pour savoir si l’augmentation de la surface de résorption totale dans des conditions expérimentales est due à l’augmentation du nombre d’ostéoclastes seuls ou à l’augmentation de la capacité de résorption des cellules individuelles. En outre, il permet d’étudier les effets relatifs du nombre d’ostéoclastes, de la taille, du nombre de noyaux et de la capacité de résorption.
En résumé, nous décrivons un protocole utile et simple pour un essai en fosse de résorption utilisant un revêtement de phosphate de calcium en deux étapes et des OC dérivés de PBMC humains primaires. Ce protocole fournit une méthode facile pour établir un modèle de résorption osseuse in vitro pour les études liées à la résorption ostéoclastique, et pourrait être appliqué à l’étude des traitements pour les maladies des troubles osseux.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été partiellement financé par le China Scholarship Council [CSC n° 201808440394]. W.C. a été financé par le SCC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AgNO3 | SERVA Electrophoresis GmbH | 35110 | Silver nitrate |
| a-MEM | Gibco | 32561-029 | MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides |
| amphotericin B | Biochrom | 03-028-1B | Amphotericin B Solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21097-50G | Calcium chloride Dihydrate |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | Calcein |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | fetal bovine serum |
| Ficoll | Cytiva | 17144002 | Ficoll Paque Plus |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | Paraformaldehyde |
| HCl | Merk | 1.09057.1000 | Hydrochloric acid |
| Hoechst 33342 | Promokine | PK-CA707-40046 | Hoechst 33342 |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | Recombinant Human M-CSF |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Magnesium chloride |
| Na2HPO4 | AppliChem GmbH | A2943,0250 | di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous |
| NaCl | Merk | S7653-250G | Sodium chloride |
| NaHCO3 | Merk | K15322429 | Bicarbonate of Soda |
| PBS | Lonza | 17-512F | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium |
| Pen-Strep | Lonza | DE17-602E | Penicillin-Streptomycin Mixture |
| Phalloidin-Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 Phalloidin |
| RANKL | PeproTech | 310-01 | Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived) |
| Tris | Sigma-Aldrich | 93362 | Tris(hydroxymethyl)aminomethan |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol |
| TrypLE Express | Gibco | 12605010 | Recombinant cell-dissociation enzymes |
References
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