Summary
Burada, kalsiyum fosfat kaplı hücre kültürü plakaları kullanılarak rezorpsiyon çukuru testleri için basit ve etkili bir tahlil prosedürü sunuyoruz.
Abstract
Olgun osteoklastlar, asit ve enzimlerin salgılanması yoluyla kemiği parçalayabilen çok çekirdekli hücrelerdir. Çeşitli hastalıklarda (örneğin, osteoporoz ve kemik kanseri) çok önemli bir rol oynarlar ve bu nedenle önemli araştırma nesneleridirler. In vitro, aktiviteleri rezorpsiyon çukurlarının oluşumu ile analiz edilebilir. Bu protokolde, kolayca görselleştirilebilen ve nicelleştirilebilen kalsiyum fosfat (CaP) kaplı hücre kültürü plakalarını kullanan basit bir çukur testi yöntemi tanımlamaktayız. İnsan periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) türetilen osteoklast öncülleri, osteoklastojenik uyaranların varlığında kaplanmış plakalar üzerinde kültüre alındı. 9 günlük inkübasyondan sonra, osteoklastlar floresan görüntüleme için sabitlendi ve boyanırken, CaP kaplaması kalsein ile karşı boyandı. Emilen alanı ölçmek için, plakalar üzerindeki CaP kaplama% 5AgNO3 ile boyandı ve parlak alan görüntüleme ile görselleştirildi. Rezorpsiyon çukuru alanı ImageJ kullanılarak ölçüldü.
Introduction
Osteoklastlar (OC'ler), hematopoetik kök hücrelerden (HSC'ler) türetilen ve osteoblastlarla birlikte kemik yeniden şekillenmesinde önemli bir rol oynayan dokuya özgü makrofajlardır1. Kemiği sistemik veya lokal olarak tahrip eden cinsiyet hormonuna bağlı, immünolojik ve malign kemik bozuklukları, menopoza bağlı osteoporoz2, romatoid artrit3, periodontal hastalık4, miyelom kemik hastalığı5 ve osteolitik kemik metastazı6 dahil olmak üzere aşırı osteoklastik aktiviteye bağlıdır. Buna karşılık, OC oluşumu ve fonksiyonundaki kusurlar da osteopetroz7'ye neden olabilir. HSC'ler, makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF, gen sembolü ACP5) stimülasyonu altında OC progenitörlerine farklılaşır. Hem M-CSF hem de NF-κB ligandının reseptör aktivatörü varlığında (RANKL, gen sembolü TNFSF11), OC progenitörleri mononükleer OC'lere daha da farklılaşır ve daha sonra çok çekirdekli OC'ler 8,9,10 olmak üzere kaynaşır. Hem sitokinler M-CSF hem de RANKL, kalsitonin reseptörü (BT), nükleer faktör κ B (RANK) reseptör aktivatörü, proton pompası V-ATPaz, klorür kanalı 7 alfa alt birimi (CIC-7), integrin β3, tartarat dirençli asit fosfataz (TRAP, gen sembolü ACP5), lizozomal sistein proteaz kathepsin K (CTSK) ve matriks metallopeptidaz 9 (MMP9) gibi osteoklastik belirteçlerin indüksiyonu için vazgeçilmez ve yeterlidir. Aktif OC'ler,11,12 numaralı fırfırlı bir aktin halkasının oluşumu yoluyla kemik yüzeyinde bir sızdırmazlık bölgesi oluşturur. Sızdırmazlık bölgesi içinde, OC'ler proton pompası V-ATPaz 12,13, MMP914 ve CTSK15 aracılığıyla protonları salgılayarak rezorpsiyona aracılık eder ve lakuna oluşumuna yol açar.
In vitro deneyler için, OC progenitörleri, kemik iliği makrofajlarının farelerin femurundan ve tibia 16,17'den genişlemesinin yanı sıra, insan periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) kan örneklerinden ve kabarık ceketlerden18,19,20'den izole edilmesiyle veya ölümsüzleştirilmiş murin monositik hücrelerinin farklılaştırılmasıyla elde edilebilir.
Bu protokolde, birincil PBMC'lerden türetilen OC'leri kullanarak CaP kaplı hücre kültürü plakalarında osteoklastik rezorpsiyon testini tanımladık. Burada kullanılan CaP kaplı hücre kültürü plakaları yöntemi, daha önce Patntirapong ve ark.17 ve Maria ve ark.21 tarafından açıklanan yöntemden uyarlanmış ve rafine edilmiştir. OC öncüllerini elde etmek için, PBMC'ler yoğunluk gradyanı santrifüjleme ile izole edilir ve daha önce açıklandığı gibigenişletilir 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokol yerel etik kurul tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır (onay numarası 287/2020B02).
1. Kalsiyum fosfat kaplı hücre kültürü plakalarının hazırlanması
- Kalsiyum stok çözeltisinin hazırlanması (Tris tamponunda 25 mM CaCl 2·2H 2 O, 1.37 mM NaCl, 15 mM MgCl2·6H2O)
- 1,0 M Tris tamponu hazırlayın ve 1 M HCl kullanarak pH'ı 7,4'e ayarlayın.
- Manyetik karıştırıcı üzerine bir cam kab yerleştirin ve 100 mL 1,0 M Tris tamponu ekleyin.
- 0.368 g CaCl 2 ·2H 2 O, 8.0 g NaCl ve 0.305 g MgCl2 · 6H2O ağırlığında olun ve Tris tamponunda birer birer çözün.
- 1 M HCl. Oda sıcaklığında saklayın.
- Fosfat stok çözeltisinin hazırlanması (11,1 mM Na2HPO4· H2O, Tris tamponunda 42 mM NaHCO3 )
- Manyetik karıştırıcı üzerine bir cam kab yerleştirin ve 100 mL 1,0 M Tris tamponu ekleyin.
- 0,158 g Na2HPO4· ağırlığında H2O ve 0.353 g NaHCO3 ve Tris tamponunda tek tek çözünür.
- 1 M HCl. Oda sıcaklığında saklayın.
- 96 delikli hücre kültürü plakalarının ön kalsifikasyonu
- 15 mL 1.0 M Tris tamponu, 7.5 mL kalsiyum stoğu (adım 1.1.4) çözeltisi ve 7.5 mL fosfat stok çözeltisi (adım 1.2.3) karıştırarak 30 mL çalışma çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtreyle filtreleyin.
- Düz tabanlı 96 kuyucuklu bir hücre kültürü plakası hazırlayın. Her bir kuyucuğa 300 μL kalsiyum fosfat çözeltisi (adım 1.3.1.) pipetin. Plakayı bir kapakla örtün ve plakayı 3 gün boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Kalsiyum fosfat çözeltisinin hazırlanması (2.25 mM Na2HPO4· H 2 O, 4 mM CaCl 2·2H2O, 0,14 M NaCl, ddH2 O'da 50 mM Tris tabanı)
- Manyetik karıştırma boncuğuna sahip bir beherde 40 mL deiyonize suya 2 mL 1 M HCl ekleyin ve 0,016 g Na2HPO4· çözün H2 O, 0.0295 g CaCl 2·2H 2O, 0.409 g NaCl ve 0.303 g Tris baz tek tek.
- 1 M HCl kullanarak pH'ı 7,4'e ayarlayın. hacmi 50 mL'ye doldurmak için deiyonize su ekleyin. Çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtreyle filtreleyin.
- 96 delikli hücre kültürü plakalarının kalsifikasyonu
- Önceden kalsifiye edilmiş 96 delikli hücre kültürü plakalarından ön kalsifikasyon çözeltisini aspire edin ve her bir oyuğa 300 μL kalsiyum fosfat çözeltisi (adım 1.4.2) ekleyin. Plakaları bir kapakla örtün ve 1 gün boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Çözeltiyi dökmek için plakayı ters çevirin ve plakayı üç kez deiyonize suyla iyice yıkayın. Düzgün bir yüzey sağlamak için plakayı hemen bir saç kurutma makinesi veya sıkıştırılmış CO 2 veya N2 gazı kullanarak kurulayın.
- Kaplanmış plakayı UV radyasyonu ile temiz bir tezgahta 1 saat boyunca sterilize edin. Kaplanmış plakayı hemen kullanın veya plakayı parafilm ile kapatın ve oda sıcaklığında saklayın.
2. PBMC'lerin insan periferik kanından izolasyonu
- Kan bağışçısından yazılı bilgilendirilmiş onam aldıktan sonra damardan 15 mL kan alın (etik oy: 287/2020B02).
- 15 mL taze kanı eşit hacimde PBS ile seyreltin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek veya karışımı bir pipetin içine ve dışına çekerek karıştırın.
- Tüp başına 15 mL yoğunluk gradyanı çözeltisi (örneğin, Ficoll, Malzeme Tablosu) içeren 50 mL'lik bir konik tüp hazırlayın. Tüpü eğin ve 30 mL seyreltilmiş kan örneğini 15 mL yoğunluk gradyanı çözeltisine dikkatlice katlayın (seyreltilmiş kan örneği: yoğunluk gradyanı çözeltisi, 1: 0.5-1 oranı).
NOT: Numuneyi üst üste koyarken, yoğunluk gradyanı çözeltisini seyreltilmiş kan örneği ile karıştırmamaya dikkat edin. - Frensiz sallanan kova rotorunda 20 °C'de 20 dakika boyunca 810 x g'de santrifüj.
- Üst tabakayı aspire ederek mononükleer hücre tabakasını (lenfositler, monositler ve trombositler) interfazda bozulmadan bırakın.
- Mononükleer hücre tabakasını dikkatlice yeni bir 50 mL konik tüpe aktarın.
- Tüpü PBS ile doldurun, 20 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de karıştırın ve santrifüj yapın (fren bu aşamadan itibaren kullanılabilir).
- Süpernatantı dikkatlice tamamen çıkarın. Hücre peletini 50 mL PBS'de yeniden askıya alın ve 20 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice tamamen çıkarın.
- Trombositlerin çıkarılması için, hücre peletini 50 mL PBS'de yeniden askıya alın ve 20 ° C'de 10 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice tamamen çıkarın.
- OC progenitörlerinin genişlemesi için resuspended hücreleri hücre kültürü şişelerine aktarın.
3. OC progenitörlerinin genişletilmesi
- PBMC'leri 20 ng/mL M-CSF içeren tam α-MEM'de (%10 FBS, %1 Pen/Strep, %1 amfoterisin B) yeniden askıya alın. 2,5 x 105 hücre/cm2 yoğunlukta tohum PBMC'leri. Genellikle, 15-20 mL taze kandan izole edilen hücreler bir 75cm2 şişede (1.5-2 x 107 hücre) ekilebilir.
- Hücreleri, bağlı hücreler istenen bir akıcılığa ulaşana kadar her üç günde bir 20 ng / mL M-CSF içeren taze tam α-MEM ile besleyin. Tipik verimler, hücreler% 95 birleştiğinde 1.5-2 x 106 hücre / şişedir. Genellikle, genişleme süresi 6 gün sürer.
NOT: Öncüllerin osteoklastojenik potansiyeli, ekim süresinin uzamasıyla azalabilir.
4. CaP kaplı plakalarda osteoklastogenezin indüksiyonu
- Hücre yapışmasını kolaylaştırmak için, CaP kaplı plakaları 37 °C'lik bir inkübatörde 1 saat boyunca 50 μL FBS ile inkübe edin.
- OC öncüllerini ayırmak için, ölü veya yapışkan olmayan hücreleri çıkarmak için şişeyi PBS ile iki kez yıkayın. 30 dakika boyunca 75cm2 şişe başına 4 mL tripsin (Malzeme Tablosu) ekleyin.
- Sindirimi durdurmak için 4 mL komple α-MEM ekleyin, bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri dikkatlice ayırın ve hücreleri 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Neubauer odası veya benzerini kullanarak toplam hücre sayısını belirleyin.
- Hücreleri 350 x g'da 7 dakika santrifüjleme ile pelet edin. Pelet, 1 x 106 hücre / mL'lik bir konsantrasyon elde etmek için 20 ng / mL M-CSF ve 20 ng / mL RANKL içeren yeterli tam α-MEM'de yeniden askıya alın.
- CaP kaplamalı 96 delikli plaka ve pipetten aspirat FBS çözeltisi, kuyu başına 200 μL hücre süspansiyonu (2 x 105 hücre/kuyu).
- OC öncüllerini istenen zaman diliminde veya deneysel tasarımla ilgili istenen reaktiflerle inkübe edin. Genellikle, 6 gün sonra ve rezorpsiyon çukurları oluştuğunda çok sayıda büyük ve çok çekirdekli OC gözlenebilir. Her üç günde bir 20 ng / mL M-CSF ve 20 ng / mL RANKL içeren taze komple α-MEM ortamına sahip hücreleri besleyin.
- Kuluçka sonunda, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın, 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin ve tekrar PBS ile yıkayın.
- Sabit OC'leri floresan boyama için doğrudan kullanın veya 4 °C'de saklayın.
5. OC'lerin ve CaP kaplamanın floresan boyanması
- Sabit hücreleri 5 dakika boyunca geçirgenlik tamponu (PBS'de% 0.1 Triton) ile inkübe edin.
- PBS'de 100 μL AlexaFluor 546 etiketli falloidin çözeltisi ile 30 dakika boyunca lekeli aktin filamentleri ve boyama çözeltisini aspire eder. Çekirdekleri boyamak için 10 dakika boyunca 100 μL Hoechst 33342 boyama çözeltisi (PBS'de 10 μg / mL) ekleyin. DAPI de kullanılabilir.
- 10 dakika boyunca PBS'de 100 μL 10 μM kalsein ile leke CaP kaplama. PBS ile üç kez yıkayın ve fotoğraf çekin.
- Floresan görüntülemeden sonra aynı plakalar Von Kossa boyama ile rezorpsiyon çukuru alanını ölçmek için kullanılabilir. Bunu yapmak için, plakaları iki kez deiyonize suyla yıkayın.
6. Toplam rezorpsiyon çukuru alanının nicelleştirilmesi
- CaP kaplamayı Von Kossa boyama ile boyamak için, kuyucukların dibindeki kaplama kahverengiye dönene kadar, UV radyasyonu altında kuyu başına 50 μL% 5 AgNO3 ile 1 saat boyunca deiyonize suda inkübe edin.
- Plakayı üç kez deiyonize suyla yıkayın ve parlak alan görüntüleri alın. 1,25x hedefi gibi çok az büyütmeye sahip bir hedef, tüm kuyuyu tek bir görüntüde yakalamak için kullanılabilir. Bu, sonraki görüntü analizini kolaylaştırır. Kuyunun tüm alanını yakalamak için alternatif yöntemler uygulanabilir.
- ImageJ ile bir görüntü dosyası açma: Dosya | Açık | Resim | Tip | 8 bit. Görüntünün sağ alt köşesindeki ölçek birimini Düz Çizgi | | analiz edin Ölçeği ayarlayın. "Bilinen mesafe" battaniyesine uzunluğu girin, Uzunluk birimi'ne yeni ölçek birimi girin ve Genel kutusunu işaretleyin.
- Analiz edilecek ölçüm parametrelerini listeleyin: | analiz edin Ölçümleri ayarlayın. Ölçümleri Ayarla penceresinde, Alan ve Eşikle sınırla kutularını işaretleyin.
- Çukurların alanını ölçme: Resim | | ayarlama Eşik. Eşik penceresinde, Koyu arka plan onay kutusunu işaretleyin ve Otomatik'i tıklatın. Çukurların alanı kırmızıya döner. Eşik penceresini kapatın ve | Çözümle'yi seçin Ölçün. Sonuç dosyasını kaydetme: Dosya | Farklı Kaydet.
7. OC sayısının ve boyutunun ve normalleştirilmiş rezorpsiyon çukuru alanının nicelleştirilmesi
- ImageJ ile osteoklastların floresan görüntüsünü açın ve ölçek birimini doğrulayın (bkz. adım 6.3).
- Analiz edilecek ölçüm parametrelerini listeleyin: Analiz | Ölçümleri ayarlayın. Ölçümleri Ayarla penceresinde, Alan kutusunu işaretleyin.
- YG Yöneticisi ve Çokgen seçimlerini kullanarak OC'leri ana hatlarıyla belirtin: | analiz edin Araçlar | Yatırım Getirisi Yöneticisi. Araç setinde Poligon seçimleri'ne tıklayın, bir OC'yi (aktin halkalı ve ≥ üç çekirdeğe sahip hücreler) özetleyin ve YG Yöneticisi penceresinde [t] Ekle'ye tıklayın. Tüm OC'ler dahil edilene kadar anahat oluşturmayı tekrarlayın.
- OC'lerin sayısını ve boyutunu ölçme: YG Yöneticisi'nde tüm öğeleri seçin ve Ölç'ü tıklayın. Sonuç dosyasını kaydetme: Dosya | Farklı Kaydet (Şekil 3E).
- Floresan görüntülerin çukur alanını ölçün. Adım 7.3'teki görüntüyle ilişkili kaplamanın floresan görüntüsünü açın ve ölçek birimini doğrulayın (bkz. adım 6.3).
- Analiz edilecek ölçüm parametrelerini listeleyin (bkz. adım 6.4). Görüntü | | ayarlama Eşik. Eşik penceresinde, tüm kutuların işaretini kaldırın ve Otomatik'i tıklatın. Çukurların alanı kırmızıya döner. Eşik penceresini kapatın ve | Çözümle'yi seçin Ölçün. Sonuç dosyasını kaydedin.
- Normalleştirilmiş çukur alanını OC numarasına göre hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hücre kültürü plakalarının altındaki kalsiyum fosfat kaplama, 3 günlük ön kalsifikasyon ve 1 günlük kalsifikasyon adımından oluşan iki kaplama adımında gerçekleştirildi. Şekil 1'de gösterildiği gibi, 96 kuyucuklu plakaların dibinde eşit olarak dağılmış kalsiyum fosfat elde edilmiştir. Yapılan yıkama adımlarından sonra kaplama tabana çok iyi yapışmıştır.
Resim 1: 96 delikli hücre kültürü plakaları üzerindeki kalsiyum fosfat kaplamanın temsili parlak alan görüntüsü. Kaplama, 3 günlük bir ön kireçlenme adımı ve 1 günlük bir kireçlenme adımından oluşan iki kaplama adımında gerçekleştirildi. Ölçek çubuğu 200 μm'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
İnsan PBMC'lerinden türetilen OC öncülleri, CaP kaplı plakalar üzerinde kültürlendi. 9 günlük kültürden sonra M-CFS ve RANKL varlığında rezorpsiyon çukurları ve büyük OC'ler (boş alan) oluşmuştur (Şekil 2A). CaP kaplamanın çukurlarında bulunan çok çekirdekli OC'ler yüksek seviyelerde TRAP ifade ediyordu (Şekil 2B).
Şekil 2: CaP kaplı hücre kültürü plakalarında olgunlaşmadan sonra OC'ler tarafından TRAP ekspresyonu. OC öncülleri, CaP kaplı plakalar üzerinde 9 gün boyunca 20 ng / mL M-CSF ve 20 ng / mL RANKL varlığında kültürlendi. (A) Boş alan rezorpsiyon çukurlarını temsil eder. (B) Rezorpsiyon çukurlarında birkaç çok çekirdekli TRAP-pozitif (mor) OC gözlendi. Ölçek çubuğu 200 μm'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
OC'lerin CaP kaplı plakalar üzerindeki olgunlaşmasını daha da karakterize etmek için, hücreler aktin (kırmızı floresan) için boyandı. Hücre çekirdekleri Hoechst (mavi) ile boyandı ve kalsiyum görselleştirmesi için yeşil renkte kalsein kullanıldı. Rezorpsiyon çukurları yeşil CaP kaplamada siyah alanlar olarak görülür (Şekil 3B). Fonksiyonel olgun OC'lerde üç veya daha fazla çekirdek ve osteoklastojenik rezorpsiyon için gerekli olan karakteristik aktin halkası görüldü (Şekil 3A,C). Floresan görüntülerin çukur alanı, ImageJ'nin eşik aracı kullanılarak ölçülebilir (Şekil 3D). OC'lerin sayısı ve boyutu, ROI Yöneticisi ve ImageJ'nin Poligon seçim aracı kullanılarak hesaplanabilir (Şekil 3E).
Şekil 3: CaP kaplama üzerindeki olgun OC'lerin morfolojisi. OC öncülleri, CaP kaplı plakalar üzerinde 9 gün boyunca 20 ng / mL M-CSF ve 20 ng / mL RANKL varlığında kültürlendi. (A) OC'ler aktin ve çekirdekler için falloidin-Alexa Fluor 546 ve Hoechst 33342 ile boyandı. (B) CaP kaplama kalsein ile boyandı. Siyah alanlar rezorpsiyon çukurlarını temsil eder. (C) Birleştirilmiş görüntü. (D) ImageJ'nin eşik aracını kullanarak çukur alanının (kırmızı alan) ölçülmesi. (E) ImageJ'nin ROI Manager ve Polygon seçim aracını kullanarak OC anahatlarını çizme ve sayma. Ölçek çubuğu 500 μm'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
CaP kaplı hücre kültürü plakaları üzerindeki rezorpsiyon çukurlarının miktarının belirlenmesi için kalsiyum, inkübasyonla% 5AgNO3 (Von Kossa boyaması) ile boyandı. Şekil 4A'da gösterildiği gibi, OC öncülleri RANKL yokluğunda tam işlevselliğe ulaşamadı ve rezorpsiyon çukurları oluşturamadı. Osteoklastojenik çukurlar sadece M-CSF ve RANKL faktörlerinin varlığında gözlendi (Şekil 4B). Rezorpsiyon çukuru alanı ImageJ'nin eşik aleti ile ölçüldü (Şekil 4C).
Şekil 4: Rezorpsiyon çukurlarının görselleştirilmesi ve nicelleştirilmesi. OC öncülleri, CaP kaplı 96 delikli hücre kültürü plakaları üzerinde, RANKL (A) yokluğunda ve her iki faktör M-CSF ve RANKL (B) varlığında kültürlendi. (C) Oluşturulan rezorpsiyon çukurlarının sayısı, ImageJ'nin eşik aracı kullanılarak ölçülmüştür. Ölçek çubuğu 1.000 μm'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, PBMC'lerden in vitro olarak türetilen ve genişletilen OC'leri kullanarak osteoklastik rezorpsiyon testi için basit ve güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır. Kullanılan CaP kaplamalı hücre kültürü plakaları, laboratuvarda bulunan malzemeler kullanılarak kolayca hazırlanabilir ve görselleştirilebilir. Bu protokolde benimsenen sıralanmamış PBMC'lere ek olarak, murin monositik hücreler21 ve kemik iliği makrofaj hücreleri17'den üretilen OC'ler de çukur testi için benzer sentetik substratlar üzerinde kültürlenmiştir, böylece bu hücre kaynakları ilgili literatüre atıfta bulunarak bu yaklaşıma taşınabilir.
Bu protokol için, ticari olarak temin edilebilen pahalı tahlil plakaları yerine basit bir laboratuar içi fabrikasyon CaP kaplama kullandık. Kemik ve dentin dilimleri, rezorpsiyon çukuru testi için iki yaygın ve uygun fiyatlı emilebilir malzeme olmasına rağmen, kullanılabilirlik ve karmaşık preparat önemli dezavantajlardır. Kolayca hazırlanan sentetik bir substrat olarak, CaP kaplama, iki orijinal malzemeden daha kullanışlı ve kolayca temin edilebilir. Bu çukur testi yaklaşımının bir diğer avantajı, hücrelerin kültür sırasında parlak alan mikroskobu altında görselleştirilebilmesi, oysa opak kemik ve dentin dilimleri üzerinde büyüyen hücrelerin gözlenememesidir.
Bu CaP kaplama yöntemi, gerekli deneysel ihtiyaçlara göre farklı hücre kültürü plaka boyutlarına esnek bir şekilde uyarlanabilir.
Daha önce bildirilen 17,21'den farklı olarak, plakaları oda sıcaklığı yerine37 ° C'de kaplama çözeltisi ile inkübe ediyoruz, bu da vücut sıcaklığında hücre kültürü plakaları üzerinde apatit çekirdeklerinin kendiliğinden büyümesine neden oluyor. CaP kaplı plakalar, UV radyasyonu ile kurutulduktan ve sterilize edildikten hemen sonra deneyler için mevcuttur, bu da daha önce bildirilen yöntemlere kıyasla zaman kazandırır17,21.
Kaplama çözeltisinin filtrelenmesi (Adım 1.3.1 ve 1.4.2), homojen bir partikül boyutu elde etmeye ve çözeltideki hava kabarcıkları ve safsızlıkların neden olduğu kaplama içindeki kaplanmamış lekeleri azaltmaya yardımcı olan çok önemli bir adımdır. Plakanın hemen kurutulması (adım 1.5.2), düzgün bir CaP kaplaması yapılmasına yardımcı olan bir başka kritik adımdır. Aksi takdirde, kuyunun ortasında daha kalın bir kaplama oluşturmaya eğilimlidir.
Kaplamanın kalınlığının ve kalsiyum fosfat birikintilerinin yoğunluğunun, belirli bir aralıktaki kaplama çözeltisinin hacmine bağlı olduğuna dikkat çekmek önemlidir. Bu nedenle, kuyudaki kaplama çözeltisinin hacmini değiştirerek kaplama kalınlığını kontrol etmek mümkündür. Bununla birlikte, bu kültür plakası formatı için küçük toplam hacim nedeniyle, 96 delikli hücre kültürü plakası kullanıldığında mümkün olduğunca fazla miktarda kaplama çözeltisi eklenmesi önerilir. Kuyunun iç duvarı da her iki kaplama adımında da CaP ile kaplanır, bu nedenle kaplamayı hasardan korumak için tabana veya duvara pipetle temas etmemeye dikkat edilmelidir.
Gözlemimize göre, PBMC'lerden genişletilen OC öncüllerinin çoğu, CaP kaplamaya sorunsuz bir şekilde bağlanabiliyor. Bununla birlikte, kaplanmış plakanın hücre tohumlamadan önce FBS ile ıslatılması, daha önce bildirildiği gibi hücre yapışma verimliliğini artırır21.
OC öncüllerinin bir hücre kazıyıcı (adım 4.2) kullanılarak nazikçe ayrılması da önemlidir, çünkü OC öncüllerinin çoğu hala yapışkandır ve mekanik hasarı en aza indirmek hücre canlılığı için elverişlidir.
Bu yöntemin bir sınırlaması, OC öncüllerinin kaynağı olarak kullandığımız toplu PBMC'lerin, hücrelerin yalnızca küçük bir kısmının (CD14 + hücreleri) gerçek OC öncüleri olduğu oldukça karışık bir hücresel kaynak olmasıdır. İzole PBMC'ler arasında osteoklastogenezi etkileyebilen diğer hücreler (stromal hücreler ve lenfositler gibi) bulunduğundan, bu test sonuçlarını tahmin edilmesi zor olabilecek şekillerde etkileyebilir ve tahlil yorumunu karıştırabilir. Büyüme faktörlerinin, sitokinlerin veya glukokortikoidlerin OC'lerin rezorptif aktivitesi üzerindeki doğrudan etkilerini daha iyi araştırmak için, OC öncü saflaştırma yöntemleri (örneğin, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) ve spesifik hücre yüzeyi belirteçlerine dayanan manyetik boncuk saflaştırma20 23,24,25,26) önerilir.
CaP substratının aynı alan için hem hücrelerin hem de altta yatan çukurların parlak alan görüntülerini elde etmedeki sınırlamaları, TRAP ve Von Kossa boyamasının uyumsuzluğundan kaynaklanmaktadır, bu nedenle tüm kuyunun normalleştirilmiş rezorpsiyon alanı mevcut değildir. Ancak bunun yerine, normalleştirilmiş rezorpsiyon verilerini elde etmek için rezorpsiyon alanını ve hücre numarasını görselleştirmek için floresan görüntüleme kullanılabilir. Bu veriler, deneysel koşullar altında toplam rezorpsiyon alanındaki artışın tek başına artan osteoklast sayısından mı yoksa bireysel hücrelerin artan rezorpsiyon kapasitesinden mi kaynaklandığına dair önemli bilgiler sağlayabilir. Ek olarak, osteoklast sayısının, boyutunun, çekirdek sayısının ve rezorpsiyon kapasitesinin göreceli etkilerinin incelenmesine izin verir.
Özetle, iki aşamalı bir kalsiyum fosfat kaplama ve birincil insan PBMC'lerinden türetilen OC'ler kullanarak bir rezorpsiyon çukuru testi için yararlı ve basit bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, osteoklastik rezorpsiyon ile ilgili çalışmalar için in vitro kemik rezorpsiyon modeli oluşturmak için kolay bir yöntem sağlar ve kemik bozukluğu hastalıkları için tedavileri incelemek için uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen Çin Burs Konseyi [CSC No. 201808440394] tarafından finanse edilmiştir. W.C. CSC tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AgNO3 | SERVA Electrophoresis GmbH | 35110 | Silver nitrate |
| a-MEM | Gibco | 32561-029 | MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides |
| amphotericin B | Biochrom | 03-028-1B | Amphotericin B Solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21097-50G | Calcium chloride Dihydrate |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | Calcein |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | fetal bovine serum |
| Ficoll | Cytiva | 17144002 | Ficoll Paque Plus |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | Paraformaldehyde |
| HCl | Merk | 1.09057.1000 | Hydrochloric acid |
| Hoechst 33342 | Promokine | PK-CA707-40046 | Hoechst 33342 |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | Recombinant Human M-CSF |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Magnesium chloride |
| Na2HPO4 | AppliChem GmbH | A2943,0250 | di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous |
| NaCl | Merk | S7653-250G | Sodium chloride |
| NaHCO3 | Merk | K15322429 | Bicarbonate of Soda |
| PBS | Lonza | 17-512F | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium |
| Pen-Strep | Lonza | DE17-602E | Penicillin-Streptomycin Mixture |
| Phalloidin-Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 Phalloidin |
| RANKL | PeproTech | 310-01 | Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived) |
| Tris | Sigma-Aldrich | 93362 | Tris(hydroxymethyl)aminomethan |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol |
| TrypLE Express | Gibco | 12605010 | Recombinant cell-dissociation enzymes |
References
- Jacome-Galarza, C. E., et al. Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts. Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).
- Moller, A. M. J., et al. Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone resorption. Bone Research. 8 (1), 1-11 (2020).
- Yokota, K., et al. Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).
- Teng, Y. T., et al. Functional human T-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection. Journal of Clinical Investigation. 106 (6), 59-67 (2000).
- Terpos, E., et al. Soluble receptor activator of nuclear factor kappaB ligand-osteoprotegerin ratio predicts survival in multiple myeloma: proposal for a novel prognostic index. Blood. 102 (3), 1064-1069 (2003).
- Morony, S., et al. Osteoprotegerin inhibits osteolysis and decreases skeletal tumor burden in syngeneic and nude mouse models of experimental bone metastasis. Cancer Research. 61 (11), 4432-4436 (2001).
- Sobacchi, C., Schulz, A., Coxon, F. P., Villa, A., Helfrich, M. H. Osteopetrosis: genetics, treatment and new insights into osteoclast function. Nature Reviews Endocrinology. 9 (9), 522-536 (2013).
- Amarasekara, D. S., et al. Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks. Immune Network. 18 (1), 8 (2018).
- Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis. Cells. 9 (9), (2020).
- Teitelbaum, S. L.
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L.
- Baron, R., Neff, L., Louvard, D., Courtoy, P. J. Cell-mediated extracellular acidification and bone resorption: evidence for a low pH in resorbing lacunae and localization of a 100-kD lysosomal membrane protein at the osteoclast ruffled border. Journal of Cell Biology. 101 (6), 2210-2222 (1985).
- Blair, H. C., Teitelbaum, S. L., Ghiselli, R., Gluck, S. Osteoclastic bone resorption by a polarized vacuolar proton pump. Science. 245 (4920), 855-857 (1989).
- Zhu, L., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), 6143 (2020).
- Gowen, M., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. The Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
- Abu-Amer, Y. IL-4 abrogates osteoclastogenesis through STAT6-dependent inhibition of NF-kappaB. Journal of Clinical Investigation. 107 (11), 1375-1385 (2001).
- Patntirapong, S., Habibovic, P., Hauschka, P. V. Effects of soluble cobalt and cobalt incorporated into calcium phosphate layers on osteoclast differentiation and activation. Biomaterials. 30 (4), 548-555 (2009).
- Sorensen, M. G., et al. Characterization of osteoclasts derived from CD14+ monocytes isolated from peripheral blood. The Journal of Bone and Mineral Metabolism. 25 (1), 36-45 (2007).
- Kumar, A., et al. Synergistic effect of biphasic calcium phosphate and platelet-rich fibrin attenuate markers for inflammation and osteoclast differentiation by suppressing NF-kappaB/MAPK signaling pathway in chronic periodontitis. Molecules. 26 (21), 6578 (2021).
- Henriksen, K., Karsdal, M. A., Taylor, A., Tosh, D., Coxon, F. P. Generation of human osteoclasts from peripheral blood. Methods in Molecular Biology. 816, 159-175 (2012).
- Maria, S. M., et al. Reproducible quantification of osteoclastic activity: characterization of a biomimetic calcium phosphate assay. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 102 (5), 903-912 (2014).
- Kong, L., Smith, W., Hao, D. Overview of RAW264.7 for osteoclastogensis study: Phenotype and stimuli. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3077-3087 (2019).
- Li, P., et al. Systemic tumor necrosis factor alpha mediates an increase in peripheral CD11bhigh osteoclast precursors in tumor necrosis factor alpha-transgenic mice. Arthritis & Rheumatology. 50 (1), 265-276 (2004).
- Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).
- Xing, L., et al. NF-kappaB p50 and p52 expression is not required for RANK-expressing osteoclast progenitor formation but is essential for RANK- and cytokine-mediated osteoclastogenesis. The Journal of Bone and Mineral Research. 17 (7), 1200-1210 (2002).
- Miyamoto, T., et al. Bifurcation of osteoclasts and dendritic cells from common progenitors. Blood. 98 (8), 2544-2554 (2001).
