Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine standardisierte Resektion von Hirntumoren bei Nagetieren durch einen minimalinvasiven Ansatz mit einem integrierten Gewebekonservierungssystem. Diese Technik hat Auswirkungen auf die genaue Widerspiegelung des Pflegestandards in Nagetier- und anderen Tiermodellen.
Abstract
Das vorliegende Protokoll beschreibt ein standardisiertes Paradigma für die Hirntumorresektion und Gewebekonservierung von Nagetieren. In der klinischen Praxis ist die maximale Tumorresektion die Standardbehandlung für die meisten Hirntumoren. Die meisten derzeit verfügbaren präklinischen Hirntumormodelle enthalten jedoch entweder keine Resektion oder verwenden chirurgische Resektionsmodelle, die zeitaufwendig sind und zu signifikanter postoperativer Morbidität, Mortalität oder experimenteller Variabilität führen. Darüber hinaus kann die Durchführung einer Resektion bei Nagetieren aus mehreren Gründen entmutigend sein, darunter das Fehlen klinisch vergleichbarer chirurgischer Instrumente oder Protokolle und das Fehlen einer etablierten Plattform für die standardisierte Gewebeentnahme. Dieses Protokoll hebt die Verwendung eines multifunktionalen, nicht-ablativen Resektionsgeräts und eines integrierten Gewebekonservierungssystems hervor, das von der klinischen Version des Geräts angepasst wurde. Das in der vorliegenden Studie eingesetzte Gerät kombiniert abstimmbare Saugkraft und eine zylindrische Klinge an der Apertur, um Gewebe präzise zu untersuchen, zu schneiden und abzusaugen. Das minimalinvasive Resektionsgerät erfüllt seine Funktionen über das gleiche Gratloch, das für die erste Tumorimplantation verwendet wurde. Dieser Ansatz minimiert Veränderungen der regionalen Anatomie während Biopsie oder Resektionsoperationen und reduziert das Risiko eines signifikanten Blutverlustes. Diese Faktoren reduzierten signifikant die Operationszeit (<2 min/Tier), verbesserten das postoperative Überleben der Tiere, verringerten die Variabilität in Versuchsgruppen und führen zu einer hohen Lebensfähigkeit von resezierten Geweben und Zellen für zukünftige Analysen. Dieser Prozess wird durch eine Klingengeschwindigkeit von ~ 1.400 Zyklen / min erleichtert, die die Ernte von Geweben in ein steriles geschlossenes System ermöglicht, das mit einer physiologischen Lösung der Wahl gefüllt werden kann. Angesichts der zunehmenden Bedeutung der Untersuchung und genauen Modellierung der Auswirkungen von Operationen, Konservierung und rigoroser vergleichender Analyse von regionalisierten Tumorresektionsproben und Intra-Cavity-Therapeutika wird dieses einzigartige Protokoll die Möglichkeiten erweitern, unbeantwortete Fragen zum perioperativen Management und zur therapeutischen Entdeckung von Hirntumorpatienten zu untersuchen.
Introduction
Das Glioblastom (GBM) ist der häufigste und aggressivste primäre Hirntumor bei Erwachsenen. Trotz der jüngsten Fortschritte in der Neurochirurgie, der gezielten Medikamentenentwicklung und der Strahlentherapie beträgt die 5-Jahres-Überlebensrate für GBM-Patienten weniger als 5%, eine Statistik, die sich seit über drei Jahrzehnten nicht signifikant verbessert hat1. Daher besteht ein Bedarf an effektiveren Behandlungsstrategien.
Um neue Therapien zu entwickeln, wird es immer offensichtlicher, dass Prüfprotokolle (1) übersetzbare präklinische Modelle verwenden müssen, die die Tumorheterogenität und Mikroumgebung genau rekapitulieren, (2) das Standardtherapieschema widerspiegeln, das bei Patienten mit GBM verwendet wird, das derzeit Operation, Strahlentherapie und Chemotherapie umfasst, und (3) den Unterschied zwischen reseziertem Kern und Rest berücksichtigen. invasives Tumorgewebe 2,3,4,5. Die meisten der derzeit verfügbaren präklinischen Hirntumormodelle implementieren jedoch entweder keine chirurgische Resektion oder verwenden chirurgische Resektionsmodelle, die relativ zeitaufwendig sind, was zu einem erheblichen Blutverlust führt oder keine Standardisierung aufweist. Darüber hinaus kann die Durchführung der Resektion von Nagetier-Hirntumoren aufgrund des Mangels an klinisch vergleichbaren chirurgischen Instrumenten oder Protokollen und des Fehlens einer etablierten Plattform6 für die systematische Gewebeentnahme eine Herausforderung darstellen (Tabelle 1).
Das vorliegende Protokoll zielt darauf ab, ein standardisiertes Paradigma für die Resektion und Gewebekonservierung von Nagetier-Hirntumoren unter Verwendung eines multifunktionalen nicht-ablativen minimal-invasiven Resektionssystems (MIRS) und eines integrierten Gewebekonservierungssystems (TPS) zu beschreiben (Abbildung 1). Es wird erwartet, dass diese einzigartige Technik eine standardisierte Plattform bietet, die in verschiedenen Studien in der präklinischen Forschung für GBM und andere Arten von Hirntumormodellen verwendet werden kann. Forscher, die therapeutische oder diagnostische Modalitäten für Hirntumoren untersuchen, können dieses Protokoll implementieren, um eine standardisierte Resektion in ihren Studien zu erreichen.
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Protocol
Alle Tierstudien wurden von der University of Maryland und dem Johns Hopkins University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. C57BL/6 weibliche Mäuse, 6-8 Wochen alt, wurden für die vorliegende Studie verwendet. Die Mäuse wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle). Alle Vorschriften der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) wurden eingehalten, einschließlich der Verwendung von Masken, Handschuhen und Kitteln.
1. Erste intrakranielle Tumorimplantation
- In der Anfangsphase der Studie injizieren Sie jeder Maus intrakraniell 100.000 Zellen (GL261 murine Gliom-Zelllinie), suspendiert in 4 μL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) bis zu einer Tiefe von 2,5 mm nach dem zuvor veröffentlichten Bericht7.
- Quantifizieren Sie das Tumorsignal in jeder Maus mit dem In-vivo-Bildgebungssystem 8 bis 9 Tage nach der Tumorimplantation.
HINWEIS: Falls erforderlich, stratifizieren Sie die Mäuse in zwei Gruppen basierend auf der Tumorlast. In der vorliegenden Studie waren die beiden Gruppen: (1) Mäuse mit relativ geringer Tumorlast (mittleres Biolumineszenzsignal = 5,5e+006 ± 0,1e+006 Photonen/s, n = 10) und (2) Mäuse mit relativ großer Tumorlast (mittleres Biolumineszenzsignal = 1,69e+007 ± 0,2e+007 Photonen/s, n = 10), (p < 0,05, Mann-Whitney-Test)9. - Teilen Sie jede Gruppe in zwei vergleichbare Untergruppen auf.
HINWEIS: In dieser Studie waren die beiden Untergruppen: unbehandelte Mäuse (n = 5) und Mäuse mit Tumoren, die sich einer chirurgischen Resektion mit dem MIRS unterzogen wurden (n = 5), (p > 0,05, Mann-Whitney-Test)9. - Verfolgen Sie ab dem Tag der Resektion die Tumorprogression mit dem In-vivo-Bildgebungssystem mit einer Frequenz, die auf dem Tumorwachstumsmuster basiert.
HINWEIS: Verfolgen Sie für die GL261-Zelllinie die Tumorprogression am Tag der Resektion und dann alle 3-6 Tage.
2. Tumorresektion mittels MIRS
- Anästhesieren Sie die Maus mit einem Isofluran-O2-Gasgemisch in einer Induktionskammer oder intraperitonealer Injektion von Xylazin / Ketamin-Lösung.
- Wenn Sie das Gasanästhetikum verwenden, stellen Sie den Gasdurchfluss auf 1,0 ml / min und den Verdampfer auf 2,0% für die Anästhesieinduktion ein, was normalerweise 3-5 Minuten in der Kammer erfordert (siehe Materialtabelle).
- Wenn Sie das injizierbare Anästhetikum verwenden, betäuben Sie die Mäuse, indem Sie 0,2 ml Anästhesielösung (80-100 mg / kg Ketamin und 10-12,5 mg / kg Xylazin, siehe Materialtabelle) intraperitoneal injizieren.
- Beurteilen Sie das Tier auf eine ausreichende Sedierung, indem Sie den Zeh kneifen. Tragen Sie Augensalbe auf die Augen auf, um Trockenheit der Hornhaut zu vermeiden. Verabreichen Sie vor dem Eingriff ein Analgetikum (0,03-0,06 mg/kg Buprenorphin subkutan).
- Setzen Sie die Maus auf den stereotaktischen Rahmen (siehe Materialtabelle), sobald die vollständige Sedierung bestätigt wurde.
HINWEIS: Wenn Sie das Gasanästhetikum verwenden, legen Sie die Nase der Maus in einen Nasenkegel, wo sie während des Eingriffs weiterhin das Isofluran-O2-Gemisch erhält (1,5%). - Entfernen Sie die vorherige Klammer und entfernen Sie dann die Haare entweder mit einer Enthaarungscreme oder durch Rasur. Desinfizieren Sie die Haut mit abwechselnden Zyklen eines Peelings auf Chlorhexidin/Betadin-Basis und Alkohol. Erstellen Sie dann mit einem sterilen Skalpell einen 1 cm langen Mittellinienschnitt entlang der vorherigen Operationsnarbe.
- Befestigen Sie das MIRS-Handstück über den Bühnenadapter/Handstückhalter am stereotaktischen Arm, um die Stabilität und Präzision zu verbessern.
- Richten Sie die MIRS-Maschine (siehe Materialtabelle) mit den folgenden Einstellungen ein (Abbildung 1).
- Stecken Sie das Netzkabel auf der Rückseite in die Netzkabelbuchse. Schalten Sie das System durch Umschalten ein oder aus (1 = ON, 0 = OFF).
- Stecken Sie ein Ende des Stickstoffschlauchs (im Lieferumfang der Konsole enthalten) in die männliche Armatur auf der Rückseite der Konsole. Drehen Sie die Verbindungsmutter im Uhrzeigersinn, um die Verbindung festzuziehen.
HINWEIS: Das gegenüberliegende Ende des Schlauchs muss an die Stickstoffversorgung angeschlossen werden. - Bevor Sie den Schlauch an die Stickstoffversorgung anschließen, vergewissern Sie sich, dass der Versorgungsdruck 100 psig nicht überschreitet, was dem für die Konsole empfohlenen Eingangsversorgungsdruck entspricht.
HINWEIS: Die Konsole erzeugt ihre eigene Aspiration, wenn sie durch das Fußpedal aktiviert wird, sobald der Stickstoff der Konsole zugeführt wurde. - Sichern Sie den Deckel des Vakuumanschlusses und dichten Sie ihn ab, um ein Auslaufen im Vakuumsystem zu vermeiden. Alle Lecks im Absaugsystem beeinträchtigen die Leistung der MIRS-Konsole.
- Wenn die Aspiration während der Einrichtung oder Ansaugung unter 17 liegt, überprüfen Sie, ob der Aspirationsknopf an der Vorderseite der Konsole auf den maximalen Pegel (100) eingestellt ist, stellen Sie sicher, dass das Absaugsystem nicht leckt, und vergewissern Sie sich, dass der Stickstoffeingangsversorgungsdruck korrekt ist.
- Um das Fußpedal mit der Konsole zu verbinden, stecken Sie den grauen Fußpedalanschluss in die graue Buchse, bis er einrastet und in Position passt.
HINWEIS: Der Fußpedalanschluss wird in einer Ausrichtung mit der Konsole verbunden und ist verschlüsselt. - Um das Handstück mit der Konsole zu verbinden, stecken Sie den blauen Handstückanschluss in die blaue Buchse, bis er einrastet und in Position passt.
HINWEIS: Der Handstückanschluss wird in einer Ausrichtung mit der Konsole verbunden und ist verschlüsselt. - Bereiten Sie jedes Handstück vor, bevor Sie das System verwenden, indem Sie sterile Flüssigkeit aus einer kleinen Schüssel in die Öffnung, durch den Schlauch und das Handstück und dann in den Kanister absaugen, um sicherzustellen, dass das Innere des Schlauchs und des Handstücks geschmiert wird, um die Gewebeverschlüsse zu reduzieren.
- Bereiten Sie sich auf die Aspiration allein oder die Aspiration mit Schneiden vor, indem Sie den entsprechenden Modus auf der Vorderseite der Konsole auswählen. Initiieren Sie mit dem Fußpedal.
- Führen Sie die 23 G MIRS-Kanüle bis zu einer Tiefe von 2,5 mm in das Gratloch ein.
- Leiten Sie den Resektionsprozess ein, indem Sie das mit der Kanüle verbundene Fußpedal drücken. Führen Sie einen vollständigen Zyklus (360°) oder mehr der Resektion mit dem Drehknopf im Handstück durch.
HINWEIS: Je mehr Zyklen durchgeführt werden, desto mehr Volumen an Tumorgewebe wird reseziert. - Sobald der Resektionsprozess abgeschlossen ist, ziehen Sie die 23 G MIRS-Kanüle aus dem Gratloch und verwenden Sie 5 ml 1x PBS, um den Schlauch zu spülen und Restablagerungen zu entfernen.
- Entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen und schließen Sie die Wunde mit einem Hefter oder 4-0-Nahtmaterial (siehe Materialtabelle).
- Legen Sie die Maus während der Erholung von der Narkose auf ein Heizkissen oder unter ein wärmendes Licht, bevor Sie sie in ihren Käfig zurückbringen.
- Nachdem das Experiment abgeschlossen ist, reinigen Sie die Kanüle durch Spülen. Abwechselnd mit gekühlten Medien und Luft, um das gesamte resezierte Gewebe zurück in den Sammelbehälter zu "schieben". Entfernen Sie den Sammelbehälter aus dem System und verschließen Sie ihn mit der mitgelieferten Kappe.
- Nach Abschluss von Schritt 2.12 legen Sie die distale Spitze der Kanüle in 3%H2O2und saugen Sie 24-25 in Hg an, um die Saugleitung zurück zum Saugsammelbehälter zu füllen und 60-90 s stehen zu lassen. Spülen Sie mit sterilen Medien, die Luft und Medien intermittierend pulsieren.
- Überwachen Sie die Mäuse nach dem Eingriff auf neurologische Anzeichen (abnormale unregelmäßige Bewegungen oder Krampfanfälle).
- Euthanasieren Sie die Mäuse mit schweren neurologischen Beeinträchtigungen (werden lethargisch, haben ein hageres Aussehen, beugen sich zurück oder haben unregelmäßige Bewegungen).
HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurden 200 mg/kg einer kommerziell erhältlichen Euthanasielösung (siehe Materialtabelle) verwendet, um jede Maus einzuschläfern.
3. Gewebeentnahme über TPS
- Tauchen Sie die Tumorprobe für 5 min bei Raumtemperatur in eine Gewebekulturschale, die ein RBC-Lysemedium enthält (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Das Gewebe, das aus dem MIRS in das TPS entnommen wird, liegt hauptsächlich in Form von Einzelzellen zusammen mit kleinen Gewebestücken vor. - Legen Sie einen 70-μm-Filter (siehe Materialtabelle) auf ein 50-ml-konisches Röhrchen und verwenden Sie einen Kolben einer 5-ml-Spritze, um die Tumorprobe durch den Filter zu leiten.
- Verwenden Sie mit einer Transferpipette das RPMI-1640-Medium, um das Passieren von Zellen und beliebiger Gewebemasse durch den Filter zu erleichtern.
- Zentrifugieren bei 428 x g für 5 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette.
- Resuspendieren Sie jede Probe in 5 ml vorbereitetem RPMI-1640-Medium.
- Um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhöhen, insbesondere wenn große Gewebebrocken beim ersten Eindruck sichtbar gemacht werden, fügen Sie jeder Probe die erforderlichen Volumina des Enzymcocktails (bestehend aus DNAse I, Kollagenase IV, Dispase, Papain und EDTA, siehe Materialtabelle) hinzu. Verwenden Sie den Wirbel, um die Lösungen zu mischen.
HINWEIS: Schritt 3.6 ist optional. Die Zusammensetzung des Enzymcocktails (für ein Gesamtvolumen von 5 ml/Probe): 300 μL DNAse I Grad II, 150 μL Kollagenase/Dispase (spaltet Fibronektin, Kollagenase IV, I und unpolare Aminosäuren), 250 μL Papain (unspezifische Protease) und 6 μL 0,5 M EDTA. - Legen Sie die Proben in einen Shaker-Inkubator, der auf 200 U/min, 37 °C für 20 min eingestellt ist.
- Nach 20 min drehen Sie die Proben bei 428 x g für 5 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand.
- Einzelne Zellen durch ein 70-μm-Zellsieb filtern und bei 274 x g für 3 min bei 4 °C herunterdrehen. Führen Sie eine Zelllebensfähigkeitsanalyse10 mit Trypanblau und Hämozytometer durch (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Die Lebensfähigkeit von Tag 0 liegt zwischen 30% und 70% und steigt innerhalb von 2-3 Tagen signifikant an. - Fahren Sie mit den Schritten 4, 5 oder 6 fort, je nachdem, welche Lebensfähigkeitsprüfung erforderlich ist.
4. Wachsende Zellen in adhärenter Kultur
- Resuspendieren Sie das Pellet in einer zertifizierten Laminar-Flow-Haube in serumhaltigem haftendem Medium (wie DMEM, 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin (P / S) -Lösung) und Plattenzellen in einem adhärenten Zellkolben.
- Halten Sie die Zellen in einer kontrollierten inkubierten Umgebung (37 °C, 5% CO2).
5. Wachsende Zellen in Suspensionskultur (Neurosphären)
- In einer zertifizierten Laminar-Flow-Haube wird das Pellet in serumfreiem vollständigem Stammzellmedium11 resuspendiert und in einem Suspensionskolben geplättet.
- Halten Sie die Zellen für 2-3 Tage in einer kontrollierten inkubierten Umgebung (37 °C, 5% CO2), um die Bildung von Neurosphären zu ermöglichen.
- Nach der Visualisierung der Neurosphären im Kulturmedium verwenden Sie Trypsin-EDTA oder Accutase (siehe Materialtabelle), um Einzelzellsuspensionen für das Passaging zu erhalten.
HINWEIS: Solange bei der Ernte besondere Sorgfalt angewendet wird und geeignete Medien verwendet werden, die neurale Stammzellen unterstützen, müssen die Stammzellen im entnommenen Gewebe innerhalb weniger Tage Neurosphären bilden.
6. Vorbereitung der Zellen auf die Reimplantation
- Resuspendieren Sie das Pellet in einer Konzentration von 100.000 lebenden Zellen pro 4 μL 1x PBS.
- Injizieren Sie sofort naive Mäuse mit der intrakraniellen Tumorimplantationsmethode (Schritt 1).
7. Histologische Analyse
- Unmittelbar nach der Resektion extrahieren und fixieren Sie das Gehirn in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 24 h12.
- Übertragen Sie die Gehirne in eine 30% ige Saccharoselösung, bis sie mit Saccharose gesättigt sind (auf den Boden des Behälters gesunken).
- Übertragen Sie das Gehirn in eine 70% ige Ethanollösung.
- Führen Sie die Einbettung, das Schneiden von Paraffinblöcken und die Standardfärbung von Hämatoxylin- und Eosin (H & E) gemäß dem zuvor veröffentlichten Bericht13 durch.
HINWEIS: Die Dicke jedes Abschnitts, der für die Färbung genommen wurde, betrug 10 μm.
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Representative Results
Chirurgische Resektion mit dem MIRS führt zu einer signifikanten Abnahme der Tumorlast
In der Gruppe mit einer geringeren Tumorlast betrug das mittlere Biolumineszenzsignal zu Studienbeginn 5,5e+006 Photonen/s ± 0,2e+006 in der Subgruppe, die einer Resektion unterzogen wurde. Nach der Resektion sank das mittlere biolumineszierende Signal auf 3,09e+006 Photonen/s ± 0,3e+006, (p <0,0001, Mann-Whitney-Test)9 (Abbildung 2). Das biolumineszierende Signal nahm in den folgenden Tagen zu, bis die Mäuse eingeschläfert wurden. In ähnlicher Weise betrug in der Gruppe mit einer größeren Tumorlast das mittlere Biolumineszenzsignal zu Beginn 1,68e + 007 Photonen / s ± 0,1e + 007 in der Subgruppe, die einer Resektion unterzogen wurde. Nach der Resektion sank das mittlere Biolumineszenzsignal auf 5,19e+006 Photonen/s ± 0,2e+006, (p <0,0001, Mann-Whitney-Test)9. Das biolumineszierende Signal nahm in den folgenden Tagen zu, bis die Mäuse eingeschläfert wurden.
Resektion mit dem MIRS kann für das gewünschte Resektionsvolumen eingestellt werden
In der Präresektionsbildgebung von syngenen CT2A-Tumoren kann der Tumor im Allgemeinen als heterogene Masse an der Impfstelle mit gestörter Parenchymarchitektur und peritumoralen Ödemen und Blutungen identifiziert werden, die durch heterogene Bereiche der T2-gewichteten (T2w) Hypo- und Hyperintensität angezeigt werden. Die Nadelspur, die für die stereotaktische Tumorzellinjektion verwendet wird, kann auf T2w-MRT-Scansidentifiziert werden 14.
Die Resektionshöhle kann auf T2w-MRT-Scans nach der Resektion als großer runder hypointensiver Bereich an der Tumorimpfstelle identifiziert werden (Abbildung 3). Das Resektionsverfahren verursachte keinen signifikanten Blutverlust oder eine Störung der umgebenden Gehirnarchitektur. In einigen Fällen sammelte sich Flüssigkeit in der Resektionshöhle an. Wie in Abbildung 4 gezeigt, erhöhte sich das Resektionsvolumen signifikant von 9,4 mm 3 für eine Umdrehung der Schnittöffnung auf 23,2 mm3 für zwei Umdrehungen (p = 0,0117), was eine Anpassung der Volumenresektion ermöglicht, um für eine bekannte Tumorlast zu optimieren.
Tumorresektion mit dem MIRS führt zu einer Verlängerung des medianen Überlebens tumortragender Mäuse um 7 Tage, ohne neurologische Symptome hervorzurufen
Wie in Abbildung 5 gezeigt, gab es eine Verlängerung des Überlebens von Mäusen, die sich einer chirurgischen Resektion unterzogen, in beiden Gruppen mit kleinen (6 Tage) und großen (7 Tage) Tumoren. In der Gruppe mit einer geringeren Tumorlast betrug das mediane Überleben der Kontrollsubgruppe 16 Tage, während das mediane Überleben der Subgruppe, die sich einer Resektion unterzog, 22 Tage betrug (p = 0,0044). In ähnlicher Weise betrug in der Gruppe mit einer größeren Tumorlast das mediane Überleben der Kontrollsubgruppe 12 Tage, während das mediane Überleben der Subgruppe, die einer Resektion unterzogen wurde, 19 Tage betrug (p = 0,0043). Darüber hinaus zeigte keine der Mäuse, die sich einer Resektion mit dem MIRS unterzogen, nach dem Eingriff Anzeichen einer neurologischen Verletzung. Dies deutet darauf hin, dass das MIRS eine sichere Resektion erreichen kann.
Das mit dem MIRS resezierte Gewebe hat eine hohe In-vitro- und In-vivo-Lebensfähigkeit
Zellen, die aus dem resezierten Gewebe extrahiert wurden, wurden gefiltert, quantifiziert und in dem geeigneten Medium resuspendiert (Abbildung 6), bevor in vitro oder in vivo Viabilitätsexperimente durchgeführt wurden. Um die In-vitro-Lebensfähigkeit der Zellen zu untersuchen und die Resektion des Tumors und das nicht normale Hirnparenchym zu bestätigen, wurden Zellen in Suspensionskultur gezüchtet. Die Neurosphärenbildung, ein Indikator für das Tumorinitiationspotenzial, erfolgte mit minimaler Gewebeverarbeitung nach der Resektion. Dies deutete darauf hin, dass die MIRS-Plattform gut dissoziiertes Gewebe erntete und nur minimale Auswirkungen auf die Gesundheit und Lebensfähigkeit des resezierten Gewebes hatte. Proben, die direkt aus dem TPS zur Lichtmikroskopie entnommen wurden, schienen hauptsächlich in Form einzelner Zellen zusammen mit dem Vorhandensein einiger kleiner Gewebestücke zu sein. Die Lebensfähigkeit von Tag 0 lag zwischen 30 % und 70 % (dies stellt die Lebensfähigkeit nach dem Passieren der Probe durch einen 70-μm-Filter und vor der Beschichtung dar). Das Resektionsgerät verfügt über eine Schnittöffnung, die sich um 360° um die Achse der Resektionssonde drehen lässt, was die Resektion konzentrischer Gewebevolumina ermöglicht. Im Durchschnitt können 2-3 Millionen Zellen mit einer 360°-Drehung der Schneidöffnung geerntet werden, ca. 7 Millionen Zellen mit zwei Windungen und insgesamt 12-14 Millionen Zellen mit drei 360°-Drehungen der Schnittöffnung. Nach der Beschichtung in Suspensionskolben mit serumfreiem vollständigem Stammzellmedium waren Neurosphären am Tag 2 lichtmikroskopisch und am Tag 7 mit bloßem Auge sichtbar (Abbildung 7).
Um die Lebensfähigkeit in vivo zu untersuchen, wurden extrahierte Zellen intrakranial in naive C57BL/6-Mäuse implantiert (n = 8 Mäuse, 100.000 lebende Zellen/Maus). Das Tumorwachstum wurde mit dem in vivo Bildgebungssystem bestätigt. Das Tumorsignal nahm weiter zu, bis alle Tiere am 14. Tag nach der Tumorimplantation eingeschläfert waren (medianes Überleben von 11 Tagen).
Der repräsentative H&E-Gewebeschnitt (Abbildung 3B) enthält eine klare, kreisförmige Resektionshöhle mit einem Rand aus Blutprodukten (tiefrosa), Entzündungen und Resttumorzellen (dunkelviolette Zellen). Makroskopisch sind die verbleibenden Tumorzellen mesenchymaler Natur und infiltrativ und zeigen eine ausgedehnte perivaskuläre Invasion und Proliferation. Mikroskopisch wurden ausgeprägte nukleare Atypien und mitotische Figuren identifiziert. Tumorassoziierte Makrophagen wurden auch um Bereiche von infarktiertem Gewebe und Mikroblutungen identifiziert. Die Gewebearchitektur im umgebenden Hirnparenchym schien nicht gestört zu sein.
Abbildung 1: Aufbau des MIRS-Systems. (A) Minimal-invasives Resektionssystem (MIRS) für Hirntumore in Nagetiermodellen mit integriertem Gewebekonservierungssystem. (B) Vorderseite der MIRS-Konsole. 1 = Systemleistung, 2 = Fußpedal, 3 = Prime-Taste, 4 = Aspiration, 5 = Aspiration Level Control Dial, 6 = Aspiration Level Indicator, 7 = Handstück, 8 = Cutter Enable Taste. (C) Rückseite der MIRS-Konsole. 1 = Netzkabelbuchse, 2 = Leistungsschalter, 3 = Stickstoffversorgungseingang. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Veränderungen der durchschnittlichen Tumorlast bei Mäusen mit unbehandelten Tumoren im Vergleich zu Mäusen, die sich einer Resektion von Tumoren durch MIRS unterziehen. (A) Mäuse mit geringer Ausgangstumorlast und (B) Mäuse mit großer Ausgangstumorlast (p < 0,0001, SD ≤0,3e+006 in allen Gruppen zu jedem Zeitpunkt und zu klein, um in der Grafik dargestellt zu werden). Tiere erlagen entweder der Tumorlast oder wurden eingeschläfert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: MRT- und H&E-Analyse. (A) T2-gewichtete Gehirn-MRT-Bilder vor und nach der Resektion und (B) ein repräsentativer H&E-gefärbter koronaler Hirnschnitt, der eine klare, kreisförmige Resektionshöhle mit einem Rand von Blutprodukten (tiefrosa), Entzündungen und verbleibenden Tumorzellen (dunkelviolette Zellen) zeigt. MRT-Bilder und H&E-Schnitte wurden unmittelbar nach der Resektion aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Bestimmung des Tumorresektionsvolumens. Die durchschnittlichen Volumina, die aus MRT-Bildern von Resektionshohlräumen berechnet wurden, die mit eins vs. zwei Umdrehungen der Schnittöffnung, n = 4 pro Gruppe. p = 0,01, zweiseitiger T-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Kaplan-Meier-Kurven von Mäusen mit unbehandelten Tumoren im Vergleich zu Mäusen, die sich einer Resektion von Tumoren durch MIRS unterzogen . (A) Mäuse mit geringer Ausgangstumorlast. (B) Mäuse mit großer Ausgangstumorlast. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Lebensfähigkeitstest der resezierten Tumorzellen . (A) Repräsentative lichtmikroskopische Bilder von Gewebe, das mit MIRS am Tag 0 um 20x entnommen wurde. (B) Kaplan-Meier-Kurve, die das Überleben von Mäusen nach intrakranieller Implantation von Zellen beschreibt, die aus reseziertem Gewebe gewonnen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Bildung von Neurosphären. Repräsentative lichtmikroskopische Bilder von Neurosphären, die aus reseziertem Gewebe am Tag 2 nach der Resektion bei (A) 20x und (B) 10x und am Tag 7 nach der Resektion bei (C) 20x und (D) 10x erzeugt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Minimalinvasives Resektionssystem | Historische Resektion | |||
| Operative Zeit und Fähigkeiten | Minimale Operationszeit (<2 min für jedes Tier). Minimale Fähigkeiten erforderlich. | Die Operationszeit ist nicht standardisiert und chirurgische Erfahrungen mit Kleintieren und Mikrochirurgie sind von Vorteil. | ||
| Blutverlust | Minimal | Unberechenbar | ||
| Standardisiertes Resektionsvolumen | Resektionsvolumen, das durch die Anzahl der Umdrehungen des Resektionswerkzeugs bestimmt/eingestellt wird | Volumen variiert stark zwischen den Fächern | ||
Tabelle 1: Vergleich zwischen dem minimalinvasiven Resektionssystem (MIRS) und historischen chirurgischen Resektionsmodellen.
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Discussion
Die Tumorresektion ist ein Eckpfeiler der neurochirurgischen onkologischen Behandlungspläne für niedriggradige und hochgradige Hirntumoren. Zytoreduktion und Debulking des Tumors korrelieren mit einer verbesserten neurologischen Funktion und einem Gesamtüberleben bei Patienten mit Hirntumoren 1,2,5,6. Obwohl Protokolle für die chirurgische Resektion zuvor in Nagetiermodellen beschrieben wurden, litten diese Protokolle unter mehreren Einschränkungen, die die generierten Ergebnisse und die allgemeine Übersetzbarkeit des präklinischen Modells beeinträchtigen können. Zum Beispiel haben zuvor berichtete chirurgische Resektionsprotokolle eine Kraniotomie mit 3-4 kleinen Gratlöchern zur Schaffung eines Knochenlappens und dann eine geschickte Unterscheidung und Differenzierung der Färbung und Konsistenz des Tumors im Vergleich zu normalem Hirngewebe enthalten6. Diese Protokolle sind zeitaufwendig und erfordern, dass das Forschungspersonal über fortgeschrittene Fähigkeiten im Umgang mit dem Operationsmikroskop, im Umgang mit chirurgischen Instrumenten, bei der Identifizierung der Tumorgrenzen in Bezug auf das umgebende normale Hirngewebe und beim Erreichen einer angemessenen Homöostase verfügt. Solche Verfahren führen oft zu erheblichem Blutverlust und Tiertod. Darüber hinaus kann es schwierig sein, eine standardisierte Resektion mit vergleichbaren Volumina von Tumorgewebe zu erreichen, die im selben Experiment über verschiedene Tiere reseziert wurden. Diese Kontinuität und Einheitlichkeit wird schwieriger, wenn mehrere Mitarbeiter das Verfahren durchführen.
Im Gegensatz dazu beseitigt das hier beschriebene MIRS-Protokoll diese Einschränkungen (Tabelle 1). Das vorliegende Protokoll erfordert einen minimalinvasiven Ansatz durch das gleiche Gratloch, das für die anfängliche Tumorimplantation verwendet wird. Wie im Protokollabschnitt beschrieben, kann das Resektionswerkzeug auf einem stereotaktischen Rahmen installiert werden, der ein genaues Einführen der Kanüle in die Tumorhöhle ermöglicht. Die Geschwindigkeit der Klinge und die Anzahl der durchgeführten Resektionszyklen können leicht durch ein Handstück eingestellt werden, mit dem das Forschungspersonal das Volumen des resezierten Tumors standardisiert kontrolliert, ohne einen signifikanten Blutverlust zu verursachen.
Wie in den Ergebnissen erwähnt, zeigten die Mäuse, die mit dem MIRS-Gerät resektioniert wurden, ein verlängertes Überleben im Vergleich zu der Kohorte von Mäusen mit nicht resezierten Tumoren. Zusammen mit den Daten zeigt dies, dass die Tumorlast in der resezierten Gruppe im Vergleich zur nicht resezierten Kontrollgruppe signifikant reduziert war, was darauf hindeutet, dass das MIRS-Gerät den Tumor effektiv mit minimaler Störung des umgebenden gesunden Hirngewebes debulkt. Darüber hinaus schritt die Tumorlast in den Tagen nach der Resektion aufgrund des Vorhandenseins eines Resttumors und der infiltrativen Natur der CT-2A-Tumorzelllinie stetig voran. Das MIRS-Modell kann somit den Debulking-Prozess infiltrativer Tumortypen replizieren, der mit Chemotherapeutika oder Strahlentherapie verfolgt werden kann, um das Behandlungsschema in den Behandlungsprotokollen für menschliche Hirntumoren 15,16,17 besser widerzuspiegeln.
Wie bei jeder Absaugvorrichtung kann das Verstopfen der Aspirationsschläuche eine der Einschränkungen des MIRS-Systems sein. Dies kann durch die Ansammlung von trockenem Gewebe oder Blut während oder nach der Verwendung der Maschine auftreten. Um dies zu vermeiden, wird empfohlen, unmittelbar am Ende jeder Resektionssitzung die Handstückkanüle zu spülen, indem mit gekühlten Medien gespült wird, die sich mit Luft abwechseln, um das gesamte resezierte Gewebe in den Entnahmebehälter zu "drücken", gefolgt von einer Spülung mit 3% H2O2. Dadurch wird das gesamte während der Resektion erworbene Gewebe erfasst und sichergestellt, dass keines in der Kanüle oder dem Schlauch verbleibt. Wenn das System nicht spuckt / schneidet, kann dies daran liegen, dass das Handstück nicht eingesteckt ist, der Resektionskanülenschneider nicht eingeschaltet ist, die Aspirationsleitung von der Konsole nicht mit dem Kanister verbunden ist, der Kanisterdeckel nicht fest ist oder das Fußpedal nicht eingesteckt ist.
Während wir gezeigt haben, dass das MIRS für eine effektive und standardisierte Resektion mit hoher In-vitro- und In-vivo-Lebensfähigkeit des resezierten Gewebes verwendet werden kann, werden zukünftige Studien ermutigt, andere Facetten der Implementierung solcher Systeme in der Hirntumorforschung weiter zu untersuchen. Dazu gehört die Untersuchung der Auswirkungen des Resektionsprozesses auf die molekularen und zellulären Komponenten der Tumormasse und die Tumormikroumgebung. Darüber hinaus sind Studien erforderlich, um zu bestätigen, dass das resezierte Gewebe, das das MIRS-Gerät verwendet, den elterlichen Tumor rekapituliert15.
Abschließend wird ein Protokoll eines minimalinvasiven Ansatzes für die standardisierte chirurgische Resektion in einem Nagetier-Hirntumor-Modell beschrieben, das mit einem integrierten und automatisierten Gewebekonservierungssystem gekoppelt ist. Dieses Protokoll ebnet den Weg zur Etablierung hochtranslationaler und prädiktiver präklinischer Hirntumor-Forschungsmodelle. Zukünftige Anwendungen dieses Protokolls können möglicherweise präklinische Studien umfassen, die verschiedene therapeutische oder diagnostische Modalitäten für Hirntumoren untersuchen, die dieses Protokoll implementieren können, um eine standardisierte Resektion zu erreichen.
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Disclosures
BT hat Forschungsgelder von NIH und ist Miteigentümer von Accelerating Combination Therapies*, und Ashvattha Therapeutics Inc. hat eines ihrer Patente lizenziert. GW verfügt über NIH-Mittel (R01NS107813). HB ist ein bezahlter Berater von Insightec und Vorsitzender des medizinischen Beirats des Unternehmens. Diese Vereinbarung wurde von der Johns Hopkins University gemäß ihren Richtlinien zu Interessenkonflikten überprüft und genehmigt. HB erhält Forschungsgelder von NIH, Johns Hopkins University und Philanthropie und ist Berater für CraniUS, Candel Therepeutics, Inc., Accelerating Combination Therapies*, Catalio Nexus Fund II, LLC*, LikeMinds, Inc*, Galen Robotics, Inc.* und Nurami Medical *. (*einschließlich Eigenkapital oder Optionen).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD | 309628 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430052 | |
| 200 proof ethanol | PharmCo | 111000200 | |
| 5 mL pipettes | CoStar | 4487 | |
| 70 micron filter | Fisher | 08-771-2 | |
| Accutase | Millipore Sigma | SIG-SCR005 | |
| Anased (Xylazine injection, 100 mg/mL) | Covetrus | 33198 | |
| Anesthesia System | Patterson Scientific | 78935903 | |
| Anesthesic Gas Waste Container | Patterson Scientific | 78909457 | |
| Bench protector underpad | Covidien | 10328 | |
| C57Bl/6, 6-8 week old mice | Charles River Laboratories | Strain Code 027 | |
| ChroMini Pro | Moser | Type 1591-Q | |
| Collagenase-Dispase | Roche | #10269638001 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher | ||
| Countess II FL Hemacytometer | Thermo Fisher | A25750 | |
| Debris Removal Solution | Miltenyi Biotech | #130-109-398 | |
| D-Luciferin | Goldbio | LUCK-1G | |
| DMEM F12 media | Corning | 10-090-CV | |
| DMEM media | Corning | 10-013-CV | |
| DNAse I | Sigma Aldrich | #10104159001 | |
| Eppendorf tubes | Posi-Click | 1149K01 | |
| Euthanasia solution | Henry Schein | 71073 | |
| FBS | Millipore Sigma | F4135 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10437-028 | |
| Formalin | Invitrogen | INV-28906 | |
| Gauze | Henry Schein | 101-4336 | |
| hEGF | PeproTech EC | 100-15 | |
| Heparin | Sigma | H-3149 | |
| hFGF-b | PeproTech EC | 1001-18B | |
| Induction Chamber | Patterson Scientific | 78933388 | |
| Isoflurane | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Isoflurane Vaporizer | Patterson Scientific | 78916954 | |
| Ketamine | Covetrus | 11695-0703-1 | |
| Kopf Stereotactic frame | Kopf Instruments | 5001 | |
| Lightfield Microscope | BioTek | Cytation 5 | |
| Microinjection Unit | Kopf | 5001 | |
| Micromotor drill | Foredom | F210418 | |
| MRI system | Bruker | 7T Biospec Avance III MRI Scanner | |
| NICO Myriad System | NICO Corporation | ||
| Ophthalmic ointment | Puralube vet ointment | ||
| Papain | Sigma Aldrich | #P4762 | |
| PBS | Invitrogen | #14190250 | |
| PenStrep | Millipore Sigma | N1638 | |
| Percoll solution | Sigma Aldrich | #P4937 | |
| Pipette controller | Falcon | A07260 | |
| Povidone-iodine solution | Aplicare | 52380-1905-08 | |
| Progesterone | Sigma | P-8783 | |
| Putrescine | Sigma | P-5780 | |
| RPMI Media | Invitrogen | INV-72400120 | |
| Scalpel blade | Covetrus | 7319 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Skin marker | Time Out | D538,851 | |
| Staple remover | MikRon | ACR9MM | |
| Stapler | MikRon | ACA9MM | |
| Staples | Clay Adams | 427631 | |
| Stereotactic Frame | Kopf Instruments | 5000 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Suture, vicryl 4-0 | Ethicon | J494H | |
| T-75 culture flask | Sarstedt | 83-3911-002 | |
| TheraPEAKTM ACK Lysing Buffer (1x) | Lonza | BP10-548E | |
| Trypsin-EDTA | Corning | MDT-25-053-CI |
References
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