Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल एक एकीकृत ऊतक संरक्षण प्रणाली के साथ एक न्यूनतम इनवेसिव दृष्टिकोण के माध्यम से कृन्तकों में मस्तिष्क ट्यूमर के एक मानकीकृत लकीर का वर्णन करता है। कृंतक और अन्य पशु मॉडल में देखभाल के मानक को सटीक रूप से प्रतिबिंबित करने के लिए इस तकनीक के निहितार्थ हैं।
Abstract
वर्तमान प्रोटोकॉल कृंतक मस्तिष्क ट्यूमर लकीर और ऊतक संरक्षण के लिए एक मानकीकृत प्रतिमान का वर्णन करता है। नैदानिक अभ्यास में, अधिकतम ट्यूमर लकीर अधिकांश मस्तिष्क ट्यूमर के लिए मानक देखभाल उपचार है। हालांकि, वर्तमान में उपलब्ध अधिकांश प्रीक्लिनिकल ब्रेन ट्यूमर मॉडल में या तो लकीर शामिल नहीं है, या सर्जिकल लकीर मॉडल का उपयोग करते हैं जो समय लेने वाले होते हैं और महत्वपूर्ण पश्चात रुग्णता, मृत्यु दर या प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता का कारण बनते हैं। इसके अलावा, कृन्तकों में लकीर प्रदर्शन करना कई कारणों से चुनौतीपूर्ण हो सकता है, जिसमें नैदानिक रूप से तुलनीय सर्जिकल टूल या प्रोटोकॉल की कमी और मानकीकृत ऊतक संग्रह के लिए एक स्थापित मंच की अनुपस्थिति शामिल है। यह प्रोटोकॉल एक बहु-कार्यात्मक, गैर-एब्लेटिव लकीर डिवाइस और डिवाइस के नैदानिक संस्करण से अनुकूलित एक एकीकृत ऊतक संरक्षण प्रणाली के उपयोग पर प्रकाश डालता है। वर्तमान अध्ययन में लागू डिवाइस ट्यून करने योग्य चूषण और एपर्चर पर एक बेलनाकार ब्लेड को ठीक से जांच, कट और चूषण ऊतक को जोड़ती है। न्यूनतम इनवेसिव लकीर डिवाइस प्रारंभिक ट्यूमर प्रत्यारोपण के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही गड़गड़ाहट छेद के माध्यम से अपने कार्य करता है। यह दृष्टिकोण बायोप्सी या लकीर सर्जरी के दौरान क्षेत्रीय शरीर रचना विज्ञान में परिवर्तन को कम करता है और महत्वपूर्ण रक्त हानि के जोखिम को कम करता है। इन कारकों ने ऑपरेटिव समय (<2 मिनट / पशु) को काफी कम कर दिया, पश्चात पशु अस्तित्व में सुधार, प्रयोगात्मक समूहों में कम परिवर्तनशीलता, और भविष्य के विश्लेषण के लिए विच्छेदित ऊतकों और कोशिकाओं की उच्च व्यवहार्यता के परिणामस्वरूप। मिनट की ब्लेड गति से सुविधा होती है, जो ऊतकों की कटाई को एक बाँझ बंद प्रणाली में अनुमति देती है जिसे पसंद के शारीरिक समाधान से भरा जा सकता है। सर्जरी, संरक्षण और क्षेत्रीय ट्यूमर लकीर नमूनों के कठोर तुलनात्मक विश्लेषण, और इंट्रा-कैविटी-वितरित चिकित्सीय के प्रभाव का अध्ययन और सटीक मॉडलिंग के उभरते महत्व को देखते हुए, यह अनूठा प्रोटोकॉल मस्तिष्क ट्यूमर रोगियों के लिए पेरिऑपरेटिव प्रबंधन और चिकित्सीय खोज के बारे में अनुत्तरित प्रश्नों का पता लगाने के अवसरों का विस्तार करेगा।
Introduction
ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) वयस्कों में सबसे आम और आक्रामक प्राथमिक मस्तिष्क ट्यूमर है। न्यूरोसर्जरी, लक्षित दवा विकास और विकिरण चिकित्सा में हालिया प्रगति के बावजूद, जीबीएम रोगियों के लिए 5 साल की जीवित रहने की दर 5% से कम है, एक आंकड़ा जो तीन दशकों में काफी सुधार नहीं हुआ है1. इसलिए, अधिक प्रभावी उपचार रणनीतियों की आवश्यकता है।
नए उपचार विकसित करने के लिए, यह तेजी से स्पष्ट हो रहा है कि जांच प्रोटोकॉल को (1) अनुवाद योग्य प्रीक्लिनिकल मॉडल का उपयोग करने की आवश्यकता है जो ट्यूमर विषमता और माइक्रोएन्वायरमेंट को सटीक रूप से दोहराते हैं, (2) जीबीएम वाले रोगियों में उपयोग किए जाने वाले मानक चिकित्सीय आहार को दर्पण करते हैं, जिसमें वर्तमान में सर्जरी, रेडियोथेरेपी और कीमोथेरेपी शामिल है, और (3) विच्छेदित कोर और अवशिष्ट के बीच अंतर के लिए खाता, आक्रामक ट्यूमर ऊतक 2,3,4,5. हालांकि, वर्तमान में उपलब्ध अधिकांश प्रीक्लिनिकल ब्रेन ट्यूमर मॉडल या तो सर्जिकल लकीर को लागू नहीं करते हैं या सर्जिकल लकीर मॉडल का उपयोग करते हैं जो अपेक्षाकृत समय लेने वाले होते हैं, जिससे महत्वपूर्ण मात्रा में रक्त हानि होती है या मानकीकरण की कमी होती है। इसके अलावा, कृंतक मस्तिष्क ट्यूमर के लकीर प्रदर्शन नैदानिक तुलनीय सर्जिकल उपकरण या प्रोटोकॉल की कमी और व्यवस्थित ऊतक संग्रह (तालिका 1) के लिए एक स्थापित मंच6 की अनुपस्थिति के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है।
वर्तमान प्रोटोकॉल कृंतक मस्तिष्क ट्यूमर लकीर और ऊतक संरक्षण के लिए एक मानकीकृत प्रतिमान का वर्णन करने के लिए एक बहु कार्यात्मक गैर-एब्लेटिव न्यूनतम इनवेसिव लकीर प्रणाली (एमआईआरएस) और एक एकीकृत ऊतक संरक्षण प्रणाली (टीपीएस) (चित्रा 1) का उपयोग कर का उद्देश्य है। यह उम्मीद की जाती है कि यह अनूठी तकनीक एक मानकीकृत मंच प्रदान करेगी जिसका उपयोग जीबीएम और अन्य प्रकार के मस्तिष्क ट्यूमर मॉडल के लिए प्रीक्लिनिकल अनुसंधान में विभिन्न अध्ययनों में किया जा सकता है। मस्तिष्क ट्यूमर के लिए चिकित्सीय या नैदानिक तौर-तरीकों की जांच करने वाले शोधकर्ता अपने अध्ययन में एक मानकीकृत लकीर प्राप्त करने के लिए इस प्रोटोकॉल को लागू कर सकते हैं।
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Protocol
सभी जानवरों के अध्ययन को मैरीलैंड विश्वविद्यालय और जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। वर्तमान अध्ययन के लिए 6-8 सप्ताह की उम्र के सी 57 बीएल / 6 मादा चूहों का उपयोग किया गया था। चूहों को वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। मास्क, दस्ताने और गाउन के उपयोग सहित सभी जैव सुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल -2) नियमों का पालन किया गया था।
1. प्रारंभिक इंट्राक्रैनियल ट्यूमर प्रत्यारोपण
- अध्ययन के प्रारंभिक चरण में, इंट्राक्रैनियल रूप से प्रत्येक माउस को 100,000 कोशिकाओं (जीएल 261 म्यूरिन ग्लियोमा सेल लाइन) के साथ फॉस्फेट-बफर खारा (1 एक्स पीबीएस) के 4 μL में 2.5 मिमी की गहराई तक पहले प्रकाशित रिपोर्ट7 के बाद इंजेक्ट करें।
- ट्यूमर प्रत्यारोपण के बाद8 9 दिनों में विवो इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके प्रत्येक माउस में ट्यूमर सिग्नल की मात्रा निर्धारित करें।
नोट: यदि आवश्यक हो, तो ट्यूमर के बोझ के आधार पर चूहों को दो समूहों में स्तरीकृत करें। वर्तमान अध्ययन में, दो समूह थे: (1) अपेक्षाकृत छोटे ट्यूमर बोझ वाले चूहे (मतलब बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल = 5.5 ई + 006 ± 0.1 ई + 006 फोटॉन / एस, एन = 10) और (2) अपेक्षाकृत बड़े ट्यूमर बोझ वाले चूहे (मतलब बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल = 1.69 ई + 007 ± <0.2 ई + 007 फोटॉन / - प्रत्येक समूह को दो तुलनीय उपसमूहों में विभाजित करें।
नोट: इस अध्ययन में, दो उपसमूह थे: अनुपचारित चूहों (एन = 5) और एमआईआरएस (एन = 5) का उपयोग करके सर्जिकल लकीर से गुजरने वाले ट्यूमर के साथ चूहे, (पी > 0.05, मान-व्हिटनी परीक्षण)9। - लकीर के दिन से शुरू, ट्यूमर विकास पैटर्न के आधार पर एक आवृत्ति पर विवो इमेजिंग प्रणाली में का उपयोग कर ट्यूमर प्रगति को ट्रैक।
नोट: जीएल 261 सेल लाइन के लिए, लकीर के दिन और फिर हर 3-6 दिनों में ट्यूमर प्रगति को ट्रैक करें।
2. एमआईआरएस का उपयोग करके ट्यूमर लकीर
- केटामाइन समाधान के प्रेरण कक्ष या इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन में आइसोफ्लूरेन-ओ2 गैस मिश्रण का उपयोग करके माउस को संवेदनाहारी करें।
- यदि गैस संवेदनाहारी का उपयोग कर रहे हैं, तो संज्ञाहरण प्रेरण के लिए गैस प्रवाह दर को 1.0 एमएल / मिनट और वाष्पीकरणकर्ता को 2.0% पर सेट करें, आमतौर पर कक्ष में 3-5 मिनट की आवश्यकता होती है ( सामग्री की तालिका देखें)।
- इंजेक्शन योग्य संवेदनाहारी का उपयोग करते समय, 0.2 मिलीलीटर संवेदनाहारी समाधान (80-100 मिलीग्राम / किग्रा केटामाइन और 10-12.5 मिलीग्राम / किग्रा ज़ाइलाज़िन, सामग्री की तालिका देखें) को इंजेक्ट करके चूहों को संवेदनाहारी करें।
- पैर की अंगुली चुटकी द्वारा पर्याप्त बेहोश करने की क्रिया के लिए जानवर का आकलन करें। कॉर्निया के सूखापन से बचने के लिए आंखों पर नेत्र मरहम लगाएं। प्रक्रिया से पहले एक एनाल्जेसिक (0.03-0.06 मिलीग्राम / किग्रा ब्यूप्रेनोर्फिन चमड़े के नीचे) का प्रशासन करें।
- माउस स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम पर रखें ( सामग्री की तालिका देखें) एक बार पूर्ण बेहोश करने की क्रिया की पुष्टि की गई है।
नोट: यदि गैस संवेदनाहारी का उपयोग कर रहे हैं, तो माउस की नाक को नाक शंकु में रखें जहां यह प्रक्रिया (1.5%) के दौरान आइसोफ्लूरेन-ओ2 मिश्रण प्राप्त करना जारी रखेगा। - पिछले स्टेपल को हटा दें, फिर बालों को या तो एक डिपिलेटरी क्रीम के साथ या शेविंग करके हटा दें। बीटाडीन-आधारित स्क्रब और अल्कोहल के वैकल्पिक चक्रों के साथ त्वचा को कीटाणुरहित करें। फिर, एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग करके, पिछले सर्जिकल निशान के साथ 1 सेमी अनुदैर्ध्य मिडलाइन चीरा बनाएं।
- बढ़ी हुई स्थिरता और परिशुद्धता के लिए स्टेज एडाप्टर /हैंडपीस धारक के माध्यम से स्टीरियोटैक्टिक बांह में एमआईआरएस हैंडपीस संलग्न करें।
- निम्नलिखित सेटिंग्स (चित्रा 1) का उपयोग करके एमआईआरएस मशीन (सामग्री की तालिका देखें) सेट करें।
- रियर पैनल पर सेट पावर कॉर्ड को पावर कॉर्ड रिसेप्टेक में डालें। टॉगल करके सिस्टम को चालू या बंद करें (1 = चालू, 0 = बंद)।
- कंसोल के रियर पैनल पर पुरुष फिटिंग में नाइट्रोजन नली (कंसोल के साथ आपूर्ति) का एक छोर डालें। कनेक्शन को कसने के लिए कनेक्शन अखरोट को दक्षिणावर्त घुमाएं।
नोट: नली के विपरीत छोर को नाइट्रोजन आपूर्ति से जोड़ा जाना चाहिए। - नाइट्रोजन आपूर्ति के लिए नली संलग्न करने से पहले, पुष्टि करें कि आपूर्ति का दबाव 100 पीएसआईजी से अधिक नहीं है, जो कंसोल के लिए अनुशंसित इनपुट आपूर्ति दबाव है।
नोट: कंसोल को नाइट्रोजन की आपूर्ति होने के बाद पैर पेडल द्वारा सक्रिय होने पर कंसोल अपनी आकांक्षा उत्पन्न करेगा। - वैक्यूम पोर्ट के ढक्कन को सुरक्षित करें और वैक्यूम सिस्टम में किसी भी रिसाव से बचने के लिए इसे सील करें। आकांक्षा प्रणाली में कोई भी लीक एमआईआरएस कंसोल के प्रदर्शन को प्रभावित करेगा।
- यदि आकांक्षा सेटअप या प्राइमिंग के दौरान 17 से नीचे है, तो जांचें कि कंसोल के मोर्चे पर आकांक्षा घुंडी अधिकतम स्तर (100) पर सेट है, सुनिश्चित करें कि आकांक्षा प्रणाली में कोई रिसाव नहीं है, और पुष्टि करें कि नाइट्रोजन इनपुट आपूर्ति दबाव सही है।
- पैर पेडल को कंसोल से कनेक्ट करने के लिए, ग्रे फुट पेडल कनेक्टर को उसके ग्रे रिसेप्टेक में तब तक डालें जब तक कि यह क्लिक न हो जाए और स्थिति में फिट न हो जाए।
नोट:: पैर पेडल कनेक्टर एक ओरिएंटेशन में कंसोल से कनेक्ट होता है, और इसे कुंजीबद्ध किया जाता है। - हैंडपीस को कंसोल से कनेक्ट करने के लिए, नीले हैंडपीस कनेक्टर को अपने नीले रिसेप्टेक में तब तक डालें जब तक कि यह क्लिक न करे और स्थिति में फिट न हो जाए।
नोट: हैंडपीस कनेक्टर कंसोल से एक ओरिएंटेशन में कनेक्ट होता है, और इसे कुंजीबद्ध किया जाता है। - टयूबिंग और हैंडपीस के माध्यम से एपर्चर में एक छोटे कटोरे से बाँझ तरल पदार्थ की आकांक्षा करके सिस्टम का उपयोग करने से पहले प्रत्येक हैंडपीस को प्राइम करें, और फिर कनस्तर में यह सुनिश्चित करने के लिए कि टयूबिंग और हैंडपीस के अंदर ऊतक रोड़ा को कम करने के लिए चिकनाई की जाती है।
- कंसोल के फ्रंट पैनल पर उपयुक्त मोड का चयन करके अकेले आकांक्षा या काटने के साथ आकांक्षा के लिए तैयार करें। पैर पेडल का उपयोग करना शुरू करें।
- 23 जी एमआईआरएस प्रवेशनी को गड़गड़ाहट छेद में 2.5 मिमी की गहराई तक डालें।
- प्रवेशनी से जुड़े पैर पेडल को निराश करके लकीर प्रक्रिया शुरू करें। हैंडपीस में नियंत्रण घुंडी का उपयोग करके एक पूर्ण चक्र (360 °) या लकीर के अधिक प्रदर्शन करें।
नोट: अधिक चक्र प्रदर्शन किया, ट्यूमर ऊतक की अधिक मात्रा। - एक बार लकीर प्रक्रिया पूरी हो जाने के बाद, गड़गड़ाहट छेद से 23 जी एमआईआरएस प्रवेशनी को वापस ले लें और ट्यूबिंग को फ्लश करने और किसी भी अवशिष्ट मलबे को हटाने के लिए 1 एक्स पीबीएस के 5 एमएल का उपयोग करें।
- स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम से माउस निकालें और एक स्टेपलर या 4-0 टांके सामग्री के साथ घाव बंद करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- एक हीटिंग पैड पर या अपने पिंजरे में लौटने से पहले संज्ञाहरण से वसूली के दौरान एक वार्मिंग प्रकाश के तहत माउस प्लेस।
- प्रयोग पूरा होने के बाद, निस्तब्धता के माध्यम से प्रवेशनी को शुद्ध करें। संग्रह कनस्तर के लिए वापस सभी विच्छेदित ऊतक को "धक्का" देने के लिए ठंडा मीडिया और हवा के साथ वैकल्पिक। सिस्टम से संग्रह कनस्तर निकालें और प्रदान की गई टोपी के साथ कैप बंद करें।
- चरण 2.12 को पूरा करने के बाद, प्रवेशनी के डिस्टल टिप को 3% एच 2ओ 2में रखें और चूषण संग्रह कनस्तर पर वापस चूषण लाइन भरने के लिए एचजी में 24-25 पर चूषण लागू करें और 60-90 एस के लिए खड़े होने दें। आंतरायिक रूप से हवा और मीडिया स्पंदन बाँझ मीडिया के साथ फ्लश।
- प्रक्रिया के बाद किसी भी न्यूरोलॉजिकल संकेत (असामान्य अनियमित आंदोलनों या दौरे) के लिए चूहों की निगरानी करें।
- गंभीर न्यूरोलॉजिकल हानि के साथ चूहों को इच्छामृत्यु दें (सुस्त हो जाएं, गौंट उपस्थिति हो, पीठ झुकाएं, या अनियमित आंदोलनों हों)।
नोट: वर्तमान अध्ययन के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इच्छामृत्यु समाधान के 200 मिलीग्राम / किग्रा ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग प्रत्येक माउस को इच्छामृत्यु देने के लिए किया गया था।
3. टीपीएस के माध्यम से ऊतक संग्रह
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक आरबीसी लाइसिस माध्यम ( सामग्री की तालिका देखें) युक्त एक ऊतक संस्कृति पकवान में ट्यूमर के नमूने को विसर्जित करें।
नोट: एमआईआरएस से टीपीएस में काटा गया ऊतक मुख्य रूप से ऊतक के छोटे टुकड़ों के साथ एकल कोशिकाओं के रूप में होगा। - एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पर एक 70 μm फिल्टर ( सामग्री की तालिका देखें) रखें और फिल्टर के माध्यम से ट्यूमर के नमूने को पारित करने के लिए 5 एमएल सिरिंज के सवार का उपयोग करें।
- एक हस्तांतरण विंदुक के साथ, फिल्टर के माध्यम से कोशिकाओं और किसी भी ऊतक द्रव्यमान के पारित होने की सुविधा के लिए आरपीएमआई -1640 मीडिया का उपयोग करें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 428 x g पर अपकेंद्रित्र। एक पिपेट द्वारा सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
- तैयार आरपीएमआई -1640 माध्यम के 5 एमएल में प्रत्येक नमूने को फिर से निलंबित करें।
- ऊतक व्यवहार्यता को बढ़ाने के लिए, खासकर यदि प्रारंभिक छाप पर बड़े ऊतक विखंडू की कल्पना की जाती है, तो प्रत्येक नमूने में एंजाइम कॉकटेल (डीएनएएसई आई, कोलेजनेज चतुर्थ, डिस्पेज, पपैन और ईडीटीए युक्त, सामग्री की तालिका देखें) की आवश्यक मात्रा जोड़ें। समाधान मिश्रण करने के लिए भंवर का उपयोग करें।
नोट: चरण 3.6 वैकल्पिक है। एंजाइम कॉकटेल की संरचना (5 एमएल / नमूने की कुल मात्रा के लिए): डीएनएएसई I ग्रेड II के 300 μL, कोलेजनेज / डिस्पेज़ के 150 μL (क्लीव्स फाइब्रोनेक्टिन, कोलेजनेज IV, I, और नॉनपोलर अमीनो एसिड), पपैन के 250 μL (निरर्थक प्रोटीज), और 0.5 एम ईडीटीए के 6 μL। - 20 मिनट के लिए 200 आरपीएम, 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक प्रकार के बरतन इनक्यूबेटर में नमूने रखें।
- 20 मिनट के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 428 एक्स जी पर नमूने स्पिन। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
- एक 70 μm सेल छलनी के माध्यम से एकल कोशिकाओं फ़िल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 274 x g पर नीचे स्पिन। ट्रिपैन ब्लू और हेमोसाइटोमीटर के साथ सेल व्यवहार्यता विश्लेषण10 का संचालन करें (सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: दिन 0 व्यवहार्यता 30% -70% से होती है और 2-3 दिनों के भीतर काफी बढ़ जाती है। - आवश्यक व्यवहार्यता परीक्षण के आधार पर चरण 4, 5, या 6 पर आगे बढ़ें।
4. अनुयायी संस्कृति में बढ़ती कोशिकाएं
- एक प्रमाणित लामिना प्रवाह हुड में, सीरम युक्त अनुयायी माध्यम (जैसे डीएमईएम, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) समाधान) और एक अनुयायी सेल फ्लास्क में प्लेट कोशिकाओं में गोली को फिर से निलंबित करें।
- एक नियंत्रित ऊष्मायन वातावरण (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में कोशिकाओं को बनाए रखें।
5. निलंबन संस्कृति में बढ़ती कोशिकाएं (न्यूरोस्फीयर)
- एक प्रमाणित लामिना प्रवाह हुड में, सीरम मुक्त पूर्ण स्टेम सेल माध्यम11 और एक निलंबन फ्लास्क में प्लेट में गोली को फिर से निलंबित करें।
- न्यूरोस्फीयर गठन की अनुमति देने के लिए2-3 दिनों के लिए एक नियंत्रित ऊष्मायन वातावरण (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) में कोशिकाओं को बनाए रखें।
- संस्कृति माध्यम में न्यूरोस्फीयर के दृश्य के बाद, पासिंग के लिए एकल-कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए ट्रिप्सिन-ईडीटीए या एक्यूटेज ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें।
नोट: जब तक फसल के दौरान विशेष देखभाल की जाती है और तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं का समर्थन करने वाले उपयुक्त मीडिया का उपयोग किया जाता है, तब तक कटे हुए ऊतक में स्टेम कोशिकाओं को कुछ दिनों के भीतर न्यूरोस्फीयर बनाना चाहिए।
6. पुन: प्रत्यारोपण के लिए कोशिकाओं को तैयार करना
- 1x पीबीएस के 4 μL प्रति 100,000 जीवित कोशिकाओं की एकाग्रता पर गोली को फिर से निलंबित करें।
- तुरंत इंट्राक्रैनियल ट्यूमर आरोपण विधि (चरण 1) का उपयोग करके भोले चूहों में इंजेक्ट करें।
7. हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण
- लकीर के तुरंत बाद, 24 घंटे12 के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) में दिमाग को निकालें और ठीक करें।
- मस्तिष्क को 30% सुक्रोज समाधान में स्थानांतरित करें जब तक कि वे सुक्रोज से संतृप्त न हों (कंटेनर के नीचे धंस गए)।
- मस्तिष्क को 70% इथेनॉल समाधान में स्थानांतरित करें।
- पहले प्रकाशित रिपोर्ट13 के बाद पैराफिन ब्लॉक एम्बेडिंग, सेक्शनिंग और मानक हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) धुंधला करें।
नोट: धुंधला के लिए लिया प्रत्येक अनुभाग की मोटाई 10 μm था।
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Representative Results
एमआईआरएस का उपयोग करके सर्जिकल लकीर के परिणामस्वरूप ट्यूमर के बोझ में महत्वपूर्ण कमी आती है
एक छोटे ट्यूमर बोझ वाले समूह में, औसत बेसलाइन बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल 5.5 ई + 006 फोटॉन / एस ± उपसमूह में 0.2 ई + 006 था जो लकीर से गुजरता था। लकीर के बाद, औसत बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल 0.3 ई + 006 ± 3.09 ई + 006 फोटॉन / एस तक कम हो गया, (पी <0.0001, मान-व्हिटनी परीक्षण)9 (चित्रा 2)। बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल अगले कुछ दिनों में बढ़ गया जब तक कि चूहों को इच्छामृत्यु नहीं दी गई। इसी तरह, एक बड़े ट्यूमर बोझ वाले समूह में, औसत बेसलाइन बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल 1.68 ई + 007 फोटॉन / एस ± उपसमूह में 0.1 ई + 007 था जो लकीर से गुजरता था। लकीर के बाद, औसत बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल 0.2 ई + 006 ± 5.19 ई + 006 फोटॉन / सेकंड तक कम हो गया, (पी <0.0001, मान-व्हिटनी परीक्षण)9। बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल अगले कुछ दिनों में बढ़ गया जब तक कि चूहों को इच्छामृत्यु नहीं दी गई।
एमआईआरएस का उपयोग करके लकीर लकीर की वांछित मात्रा के लिए समायोजित किया जा सकता है
सिंजेनिक सीटी 2 ए ट्यूमर के पूर्व-लकीर इमेजिंग में, ट्यूमर को आम तौर पर बाधित पैरेन्काइमल आर्किटेक्चर और पेरिट्यूमोरल एडिमा और रक्तस्राव के साथ टीकाकरण स्थल पर एक विषम द्रव्यमान के रूप में पहचाना जा सकता है जो टी 2-भारित (टी 2 डब्ल्यू) हाइपो- और हाइपर-तीव्रता के विषम क्षेत्रों द्वारा इंगित किया जाता है। स्टीरियोटैक्टिक ट्यूमर सेल इंजेक्शन के लिए उपयोग की जाने वाली सुई ट्रैक को टी 2 डब्ल्यू एमआरआई स्कैन14 पर पहचाना जा सकता है।
लकीर गुहा ट्यूमर टीकाकरण स्थल (चित्रा 3) पर एक बड़े दौर हाइपोइंटेंस क्षेत्र के रूप में पोस्ट लकीर टी 2 डब्ल्यू एमआरआई स्कैन पर पहचाना जा सकता है। लकीर प्रक्रिया ने आसपास के मस्तिष्क वास्तुकला के महत्वपूर्ण रक्त हानि या व्यवधान का कारण नहीं बना। कुछ मामलों में, लकीर गुहा में तरल पदार्थ जमा होता है। जैसा कि चित्रा 4 में दिखाया गया है, लकीर की मात्रा काटने वाले एपर्चर के एक रोटेशन के लिए 9.4 मिमी3 से बढ़कर दो घूर्णन (पी = 0.0117) के लिए23.2 मिमी 3 हो गई, जिससे ज्ञात ट्यूमर बोझ के लिए अनुकूलित करने के लिए वॉल्यूम लकीर के समायोजन की अनुमति मिलती है।
एमआईआरएस का उपयोग करके ट्यूमर लकीर किसी भी न्यूरोलॉजिकल संकेतों को प्रेरित किए बिना ट्यूमर-असर वाले चूहों के औसत अस्तित्व में 7-दिन की लम्बाई की ओर जाता है
जैसा कि चित्रा 5 में दिखाया गया है, चूहों के अस्तित्व में एक लम्बाई थी जो छोटे (6 दिन) और बड़े (7 दिन) ट्यूमर वाले दोनों समूहों में सर्जिकल लकीर से गुजरती थी। एक छोटे ट्यूमर बोझ वाले समूह में, नियंत्रण उपसमूह का औसत अस्तित्व 16 दिन था, जबकि लकीर से गुजरने वाले उपसमूह का औसत अस्तित्व 22 दिन (पी = 0.0044) था। इसी तरह, एक बड़े ट्यूमर बोझ वाले समूह में, नियंत्रण उपसमूह का औसत अस्तित्व 12 दिन था, जबकि लकीर से गुजरने वाले उपसमूह का औसत अस्तित्व 19 दिन (पी = 0.0043) था। इसके अलावा, एमआईआरएस का उपयोग करके लकीर से गुजरने वाले चूहों में से किसी ने भी प्रक्रिया के बाद न्यूरोलॉजिकल चोट का कोई संकेत नहीं दिखाया। यह इंगित करता है कि एमआईआरएस सुरक्षित लकीर प्राप्त कर सकता है।
एमआईआरएस का उपयोग करने वाले ऊतक में इन विट्रो और विवो व्यवहार्यता में उच्च होता है
विच्छेदित ऊतक से निकाले गए कोशिकाओं को इन विट्रो या विवो व्यवहार्यता प्रयोगों में आयोजित करने से पहले उपयुक्त माध्यम (चित्रा 6) में फ़िल्टर, मात्रा निर्धारित और पुन: निलंबित कर दिया गया था। कोशिकाओं की इन विट्रो व्यवहार्यता की जांच करने और ट्यूमर के लकीर की पुष्टि करने के लिए और सामान्य मस्तिष्क पैरेन्काइमा नहीं, कोशिकाओं को निलंबन संस्कृति में उगाया गया था। न्यूरोस्फीयर गठन, ट्यूमर दीक्षा क्षमता के लिए एक संकेतक, न्यूनतम ऊतक प्रसंस्करण पोस्ट-लकीर के साथ हुआ। इसने सुझाव दिया कि एमआईआरएस प्लेटफ़ॉर्म ने अच्छी तरह से पृथक ऊतक काटा और विच्छेदित ऊतक के स्वास्थ्य और व्यवहार्यता पर न्यूनतम प्रभाव डाला। टीपीएस से सीधे प्रकाश माइक्रोस्कोपी में लिए गए नमूने मुख्य रूप से ऊतक के कुछ छोटे टुकड़ों की उपस्थिति के साथ एकल कोशिकाओं के रूप में दिखाई दिए। दिन 0 व्यवहार्यता 30% -70% से लेकर (यह 70 μm फिल्टर के माध्यम से और चढ़ाना से पहले नमूना पारित करने के बाद व्यवहार्यता का प्रतिनिधित्व करता है)। लकीर डिवाइस में एक काटने वाला एपर्चर होता है जो लकीर जांच की धुरी पर 360 ° घुमा सकता है, जिससे गाढ़ा ऊतक वॉल्यूम के लकीर की अनुमति मिलती है। औसतन, 2-3 मिलियन कोशिकाओं को काटने वाले एपर्चर के एक 360 ° मोड़ के साथ काटा जा सकता है, दो मोड़ों के साथ लगभग 7 मिलियन कोशिकाएं, और काटने वाले एपर्चर के तीन 360 ° मोड़ के साथ कुल 12-14 मिलियन कोशिकाओं को प्राप्त किया जा सकता है। सीरम मुक्त पूर्ण स्टेम सेल माध्यम युक्त निलंबन फ्लास्क में चढ़ाना के बाद, न्यूरोस्फीयर दिन 2 पर प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा और दिन 7 (चित्रा 7) द्वारा नग्न आंखों से दिखाई दे रहे थे।
विवो व्यवहार्यता में जांच करने के लिए, निकाली गई कोशिकाओं को भोले सी 57 बीएल / 6 चूहों (एन = 8 चूहों, 100,000 जीवित कोशिकाओं / माउस) में प्रत्यारोपित किया गया था। विवो इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके ट्यूमर के विकास की पुष्टि की गई थी। ट्यूमर सिग्नल तब तक बढ़ता रहा जब तक कि सभी जानवरों को ट्यूमर प्रत्यारोपण (11 दिनों का औसत अस्तित्व) के बाद 14 दिन तक इच्छामृत्यु नहीं दी गई।
प्रतिनिधि एच एंड ई ऊतक अनुभाग (चित्रा 3 बी) में रक्त उत्पादों (गहरी गुलाबी), सूजन और अवशिष्ट ट्यूमर कोशिकाओं (गहरे बैंगनी कोशिकाओं) के रिम के साथ एक स्पष्ट, परिपत्र लकीर गुहा होता है। मैक्रोस्कोपिक रूप से, अवशिष्ट ट्यूमर कोशिकाएं प्रकृति में मेसेनकाइमल और घुसपैठ करती हैं, जो व्यापक पेरिवास्कुलर आक्रमण और प्रसार का प्रदर्शन करती हैं। माइक्रोस्कोपिक रूप से, चिह्नित परमाणु एटिपिया और माइटोटिक आंकड़ों की पहचान की गई थी। ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज की पहचान रोधगलित ऊतक और माइक्रोहेमरेज के क्षेत्रों के आसपास भी की गई थी। आसपास के मस्तिष्क पैरेन्काइमा में ऊतक वास्तुकला परेशान नहीं दिखाई दी।
चित्रा 1: एमआईआरएस सिस्टम सेटअप (ए) एक एकीकृत ऊतक संरक्षण प्रणाली के साथ कृंतक मॉडल में मस्तिष्क ट्यूमर के लिए न्यूनतम इनवेसिव लकीर प्रणाली (एमआईआरएस)। (बी) एमआईआरएस कंसोल का फ्रंट पैनल। 1 = सिस्टम पावर, 2 = फुट पेडल, 3 = प्राइम बटन, 4 = एस्पिरेशन, 5 = एस्पिरेशन लेवल कंट्रोल डायल, 6 = एस्पिरेशन लेवल इंडिकेटर, 7 = हैंडपीस, 8 = कटर इनेबल बटन। (सी) एमआईआरएस कंसोल का रियर पैनल। 1 = पावर कॉर्ड रिसेप्टेक, 2 = सर्किट ब्रेकर, 3 = नाइट्रोजन सप्लाई इनपुट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: अनुपचारित ट्यूमर के साथ चूहों में औसत ट्यूमर बोझ में परिवर्तन बनाम एमआईआरएस द्वारा ट्यूमर के लकीर से गुजरने वाले चूहों (ए) छोटे आधारभूत ट्यूमर बोझ के साथ चूहों और (बी) बड़े आधारभूत ट्यूमर बोझ के साथ चूहों (पी < 0.0001, एसडी ≤प्रत्येक समय बिंदु पर सभी समूहों में 0.3 ई + 006 और ग्राफ पर प्रदर्शित होने के लिए बहुत छोटा)। जानवरों ने या तो ट्यूमर के बोझ के आगे घुटने टेक दिए या उन्हें इच्छामृत्यु दे दी गई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: एमआरआई और एच एंड ई विश्लेषण (ए) पूर्व और बाद के लकीर टी 2-भारित मस्तिष्क एमआरआई छवियां और (बी) एक प्रतिनिधि एच एंड ई-सना हुआ कोरोनल मस्तिष्क अनुभाग रक्त उत्पादों (गहरी गुलाबी), सूजन और अवशिष्ट ट्यूमर कोशिकाओं (गहरे बैंगनी कोशिकाओं) के रिम के साथ एक स्पष्ट, परिपत्र लकीर गुहा दिखा रहा है। एमआरआई छवियों और एच एंड ई अनुभागों को लकीर के तुरंत बाद प्राप्त किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: ट्यूमर लकीर की मात्रा का निर्धारण। एक बनाम के साथ बनाई गई लकीर गुहाओं की एमआरआई छवियों से गणना की गई औसत मात्रा। काटने एपर्चर के दो घूर्णन, एन = 4 प्रति समूह। पी = 0.01, दो पूंछ वाले टी-टेस्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: अनुपचारित ट्यूमर बनाम एमआईआरएस द्वारा ट्यूमर के लकीर से गुजरने वाले चूहों के साथ चूहों के कपलान-मेयर घटता( ए) छोटे आधारभूत ट्यूमर बोझ के साथ चूहों। (बी) बड़े आधारभूत ट्यूमर बोझ के साथ चूहों। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6: विच्छेदित ट्यूमर कोशिकाओं की व्यवहार्यता परीक्षण( ए) 20x पर दिन 0 पर एमआईआरएस के साथ काटे गए ऊतक की प्रतिनिधि प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवियां ( बी ) कपलान-मीयर वक्र विच्छेदित ऊतक से काटा कोशिकाओं के इंट्राक्रैनियल आरोपण के बाद चूहों के अस्तित्व का वर्णन करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 7: न्यूरोस्फीयर का गठन। (ए) 20x और (B) 10x पर दिन 2 पोस्ट-लकीर पर विच्छेदित ऊतक से उत्पन्न न्यूरोस्फीयर की प्रतिनिधि प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवियां, और (सी) 20x और (डी) 10x पर दिन 7 पोस्ट-लकीर पर । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| न्यूनतम इनवेसिव लकीर प्रणाली | ऐतिहासिक लकीर | |||
| ऑपरेटिव समय और कौशल | न्यूनतम ऑपरेटिव समय (<प्रत्येक जानवर के लिए 2 मिनट)। न्यूनतम कौशल की आवश्यकता है। | सर्जिकल समय मानकीकृत नहीं है और छोटे जानवरों और माइक्रोसर्जरी के साथ सर्जिकल अनुभव फायदेमंद है। | ||
| खून की कमी | न्यूनतम | अननुमेय | ||
| लकीर की मानकीकृत मात्रा | लकीर उपकरण के घूर्णन की संख्या द्वारा निर्धारित/समायोजित लकीर की मात्रा | वॉल्यूम विषयों के बीच बहुत भिन्न होता है | ||
तालिका 1: न्यूनतम इनवेसिव लकीर प्रणाली (एमआईआरएस) और ऐतिहासिक सर्जिकल लकीर मॉडल के बीच तुलना।
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Discussion
ट्यूमर लकीर निम्न-ग्रेड और उच्च-ग्रेड मस्तिष्क ट्यूमर दोनों के लिए न्यूरोसर्जिकल ऑन्कोलॉजी उपचार योजनाओं की आधारशिला है। ट्यूमर के साइटोरिडक्शन और डिबल्किंग मस्तिष्क ट्यूमर 1,2,5,6 वाले रोगियों में बेहतर न्यूरोलॉजिकल फ़ंक्शन और समग्र अस्तित्व के साथ सहसंबंधित हैं। यद्यपि सर्जिकल लकीर के लिए प्रोटोकॉल पहले कृंतक मॉडल में वर्णित किया गया है, इन प्रोटोकॉल उत्पन्न परिणामों और प्रीक्लिनिकल मॉडल के समग्र अनुवाद को भ्रमित कर सकते हैं कि कई सीमाओं से पीड़ित हैं। उदाहरण के लिए, पहले रिपोर्ट किए गए सर्जिकल लकीर प्रोटोकॉल में हड्डी के प्रालंब बनाने के लिए 3-4 छोटे गड़गड़ाहट छेद के साथ एक क्रानियोटॉमी शामिल है और फिर सामान्य मस्तिष्क ऊतक6 की तुलना में ट्यूमर के रंग और स्थिरता का कुशल भेद और भेदभाव शामिल है। ये प्रोटोकॉल समय लेने वाले हैं और सर्जिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करने, सर्जिकल उपकरणों को संभालने, आसपास के सामान्य मस्तिष्क के ऊतकों से संबंधित ट्यूमर सीमाओं की पहचान करने और पर्याप्त होमोस्टैसिस प्राप्त करने में उन्नत कौशल रखने के लिए अनुसंधान कर्मियों की आवश्यकता होती है। ऐसी प्रक्रियाएं अक्सर महत्वपूर्ण रक्त हानि और जानवरों की मृत्यु का कारण बनती हैं। इसके अलावा, एक ही प्रयोग में विभिन्न जानवरों में ट्यूमर ऊतक की तुलनीय मात्रा के साथ मानकीकृत लकीर प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। यह निरंतरता और एकरूपता प्रक्रिया करने वाले कई कर्मियों के साथ अधिक चुनौतीपूर्ण हो जाती है।
इसके विपरीत, यहां वर्णित एमआईआरएस प्रोटोकॉल इन सीमाओं को हटा देता है (तालिका 1)। वर्तमान प्रोटोकॉल प्रारंभिक ट्यूमर आरोपण के लिए इस्तेमाल किया एक ही गड़गड़ाहट छेद के माध्यम से एक न्यूनतम इनवेसिव दृष्टिकोण की आवश्यकता है। प्रोटोकॉल अनुभाग में विस्तृत के रूप में, लकीर उपकरण ट्यूमर गुहा में प्रवेशनी के सटीक सम्मिलन के लिए अनुमति देता है कि एक स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम पर स्थापित किया जा सकता है। ब्लेड की गति और प्रदर्शन किए गए लकीर चक्रों की संख्या को अनुसंधान कर्मियों द्वारा उपयोग किए जाने वाले हैंडपीस के माध्यम से आसानी से समायोजित किया जा सकता है ताकि रक्त की हानि की एक महत्वपूर्ण मात्रा के बिना मानकीकृत फैशन में ट्यूमर की मात्रा को नियंत्रित किया जा सके।
जैसा कि परिणामों में उल्लेख किया गया है, एमआईआरएस डिवाइस के साथ लकीर से गुजरने वाले चूहों ने असंबद्ध ट्यूमर वाले चूहों के समूह की तुलना में लंबे समय तक जीवित रहने का प्रदर्शन किया। यह, डेटा के साथ, दिखाता है कि अनियंत्रित नियंत्रण समूह की तुलना में विच्छेदित समूह में ट्यूमर का बोझ काफी कम हो गया था, यह दर्शाता है कि एमआईआरएस डिवाइस आसपास के स्वस्थ मस्तिष्क के ऊतकों में न्यूनतम गड़बड़ी के साथ ट्यूमर को प्रभावी ढंग से डिबल्क करता है। इसके अलावा, लकीर के बाद के दिनों में, अवशिष्ट ट्यूमर की उपस्थिति और सीटी -2 ए ट्यूमर सेल लाइन की घुसपैठ प्रकृति के कारण ट्यूमर का बोझ लगातार बढ़ गया। एमआईआरएस मॉडल इस प्रकार घुसपैठ ट्यूमर प्रकारों की डीबल्किंग प्रक्रिया को दोहरा सकता है, जिसका पालन मानव मस्तिष्क ट्यूमर उपचार प्रोटोकॉल15,16,17 में उपचार आहार को अधिक बारीकी से दर्पण करने के लिए कीमोथेरेप्यूटिक्स या विकिरण चिकित्सा के साथ किया जा सकता है।
जैसा कि किसी भी चूषण उपकरण के मामले में होता है, आकांक्षा ट्यूबिंग का क्लॉगिंग एमआईआरएस प्रणाली की सीमाओं में से एक हो सकता है। यह मशीन का उपयोग करने के दौरान या बाद में शुष्क ऊतक या रक्त के संचय के कारण हो सकता है। इससे बचने के लिए, रीसेक्शन के प्रत्येक सत्र के अंत में तुरंत, हैंडपीस प्रवेशनी को शुद्ध करने की सिफारिश की जाती है ठंडा मीडिया के साथ फ्लशिंग हवा के साथ बारी-बारी से संग्रह कनस्तर के लिए सभी विच्छेदित ऊतक को "धक्का" देने के लिए, इसके बाद 3% एच2हे2 के साथ निस्तब्धता। यह लकीर के दौरान अधिग्रहित सभी ऊतकों को पकड़ लेगा और यह सुनिश्चित करेगा कि प्रवेशनी या ट्यूबिंग में कोई भी न रहे। इसके अलावा, यदि सिस्टम एस्पिरेटिंग /कटिंग नहीं कर रहा है, तो ऐसा इसलिए हो सकता है क्योंकि हैंडपीस प्लग इन नहीं है, लकीर प्रवेशनी कटर चालू नहीं है, कंसोल से आकांक्षा रेखा कनस्तर से जुड़ी नहीं है, कनस्तर ढक्कन तंग नहीं है, या पैर पेडल प्लग इन नहीं है।
इसके अलावा, जबकि हमने दिखाया है कि एमआईआरएस का उपयोग उच्च इन विट्रो और विवो व्यवहार्यता के साथ प्रभावी और मानकीकृत लकीर के लिए किया जा सकता है, भविष्य के अध्ययनों को मस्तिष्क ट्यूमर अनुसंधान में ऐसी प्रणालियों को लागू करने के अन्य पहलुओं की जांच करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है। इनमें ट्यूमर द्रव्यमान और ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के आणविक और सेलुलर घटकों पर लकीर प्रक्रिया के प्रभाव की जांच करना शामिल है। इसके अलावा, यह पुष्टि करने के लिए अध्ययन की आवश्यकता है कि एमआईआरएस डिवाइस का उपयोग करके विच्छेदित ऊतक माता-पिता के ट्यूमर15 को दोहराता है।
अंत में, एक कृंतक मस्तिष्क ट्यूमर मॉडल में मानकीकृत सर्जिकल लकीर के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव दृष्टिकोण का एक प्रोटोकॉल वर्णित है जो एक एकीकृत और स्वचालित ऊतक संरक्षण प्रणाली के साथ युग्मित है। यह प्रोटोकॉल अत्यधिक अनुवादक और भविष्य कहनेवाला प्रीक्लिनिकल मस्तिष्क ट्यूमर अनुसंधान मॉडल स्थापित करने की दिशा में मार्ग प्रशस्त करता है। इस प्रोटोकॉल के भविष्य के अनुप्रयोगों में संभावित रूप से मस्तिष्क ट्यूमर के लिए विभिन्न चिकित्सीय या नैदानिक तौर-तरीकों की जांच करने वाले प्रीक्लिनिकल अध्ययन शामिल हो सकते हैं जो मानकीकृत लकीर प्राप्त करने के लिए इस प्रोटोकॉल को लागू कर सकते हैं।
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Disclosures
बीटी के पास एनआईएच से अनुसंधान वित्त पोषण है और संयोजन चिकित्सा * को तेज करने के लिए एक सह-मालिक है, और अश्वत्था चिकित्सीय इंक ने अपने पेटेंट में से एक को लाइसेंस दिया है। जीडब्ल्यू के पास एनआईएच फंडिंग (आर01एनएस107813) है। एचबी इनसाइटेक के लिए एक भुगतान सलाहकार और कंपनी के चिकित्सा सलाहकार बोर्ड के अध्यक्ष हैं। इस व्यवस्था की समीक्षा की गई है और जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय द्वारा अपनी हितों के टकराव की नीतियों के बाद अनुमोदित किया गया है। एचबी के पास एनआईएच, जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय और परोपकार से अनुसंधान वित्त पोषण है और क्रैनियस, कैंडेल थेरप्यूटिक्स, इंक, एक्सीलरिंग कॉम्बिनेशन थेरेपी *, कैटालियो नेक्सस फंड द्वितीय, एलएलसी *, लाइकमाइंड्स, इंक *, गैलेन रोबोटिक्स, इंक * और नुरामी मेडिकल * के लिए एक सलाहकार है। (* इक्विटी या विकल्प शामिल हैं)।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD | 309628 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430052 | |
| 200 proof ethanol | PharmCo | 111000200 | |
| 5 mL pipettes | CoStar | 4487 | |
| 70 micron filter | Fisher | 08-771-2 | |
| Accutase | Millipore Sigma | SIG-SCR005 | |
| Anased (Xylazine injection, 100 mg/mL) | Covetrus | 33198 | |
| Anesthesia System | Patterson Scientific | 78935903 | |
| Anesthesic Gas Waste Container | Patterson Scientific | 78909457 | |
| Bench protector underpad | Covidien | 10328 | |
| C57Bl/6, 6-8 week old mice | Charles River Laboratories | Strain Code 027 | |
| ChroMini Pro | Moser | Type 1591-Q | |
| Collagenase-Dispase | Roche | #10269638001 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher | ||
| Countess II FL Hemacytometer | Thermo Fisher | A25750 | |
| Debris Removal Solution | Miltenyi Biotech | #130-109-398 | |
| D-Luciferin | Goldbio | LUCK-1G | |
| DMEM F12 media | Corning | 10-090-CV | |
| DMEM media | Corning | 10-013-CV | |
| DNAse I | Sigma Aldrich | #10104159001 | |
| Eppendorf tubes | Posi-Click | 1149K01 | |
| Euthanasia solution | Henry Schein | 71073 | |
| FBS | Millipore Sigma | F4135 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10437-028 | |
| Formalin | Invitrogen | INV-28906 | |
| Gauze | Henry Schein | 101-4336 | |
| hEGF | PeproTech EC | 100-15 | |
| Heparin | Sigma | H-3149 | |
| hFGF-b | PeproTech EC | 1001-18B | |
| Induction Chamber | Patterson Scientific | 78933388 | |
| Isoflurane | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Isoflurane Vaporizer | Patterson Scientific | 78916954 | |
| Ketamine | Covetrus | 11695-0703-1 | |
| Kopf Stereotactic frame | Kopf Instruments | 5001 | |
| Lightfield Microscope | BioTek | Cytation 5 | |
| Microinjection Unit | Kopf | 5001 | |
| Micromotor drill | Foredom | F210418 | |
| MRI system | Bruker | 7T Biospec Avance III MRI Scanner | |
| NICO Myriad System | NICO Corporation | ||
| Ophthalmic ointment | Puralube vet ointment | ||
| Papain | Sigma Aldrich | #P4762 | |
| PBS | Invitrogen | #14190250 | |
| PenStrep | Millipore Sigma | N1638 | |
| Percoll solution | Sigma Aldrich | #P4937 | |
| Pipette controller | Falcon | A07260 | |
| Povidone-iodine solution | Aplicare | 52380-1905-08 | |
| Progesterone | Sigma | P-8783 | |
| Putrescine | Sigma | P-5780 | |
| RPMI Media | Invitrogen | INV-72400120 | |
| Scalpel blade | Covetrus | 7319 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Skin marker | Time Out | D538,851 | |
| Staple remover | MikRon | ACR9MM | |
| Stapler | MikRon | ACA9MM | |
| Staples | Clay Adams | 427631 | |
| Stereotactic Frame | Kopf Instruments | 5000 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Suture, vicryl 4-0 | Ethicon | J494H | |
| T-75 culture flask | Sarstedt | 83-3911-002 | |
| TheraPEAKTM ACK Lysing Buffer (1x) | Lonza | BP10-548E | |
| Trypsin-EDTA | Corning | MDT-25-053-CI |
References
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