Summary
본 프로토콜은 통합 조직 보존 시스템을 갖춘 최소 침습적 접근법을 통해 설치류에서 뇌종양의 표준화 된 절제술을 설명합니다. 이 기술은 설치류 및 기타 동물 모델의 치료 표준을 정확하게 반영하는 데 의미가 있습니다.
Abstract
본 프로토콜은 설치류 뇌종양 절제술 및 조직 보존을 위한 표준화된 패러다임을 기술한다. 임상 실습에서 최대 종양 절제술은 대부분의 뇌종양에 대한 표준 치료 치료법입니다. 그러나 현재 이용 가능한 대부분의 전임상 뇌종양 모델은 절제를 포함하지 않거나 시간이 많이 걸리고 상당한 수술 후 이환율, 사망률 또는 실험적 변동성을 유발하는 외과적 절제 모델을 활용합니다. 또한 설치류에서 절제를 수행하는 것은 임상적으로 비교할 수 있는 수술 도구 또는 프로토콜의 부족과 표준화된 조직 수집을 위한 확립된 플랫폼의 부재를 포함하여 여러 가지 이유로 어려울 수 있습니다. 이 프로토콜은 다기능, 비 절제 장치 및 장치의 임상 버전에서 채택 된 통합 조직 보존 시스템의 사용을 강조합니다. 본 연구에 적용된 장치는 조정 가능한 흡입과 조리개에 원통형 블레이드를 결합하여 조직을 정밀하게 조사, 절단 및 흡입합니다. 최소 침습 절제 장치는 초기 종양 이식에 사용 된 것과 동일한 버 구멍을 통해 기능을 수행합니다. 이 접근법은 생검 또는 절제 수술 중 국소 해부학의 변경을 최소화하고 심각한 혈액 손실 위험을 줄입니다. 이러한 요인들은 수술 시간(<2분/동물)을 크게 단축하고, 수술 후 동물 생존을 개선하고, 실험 그룹의 변동성을 낮추고, 향후 분석을 위해 절제된 조직과 세포의 높은 생존력을 초래합니다. 이 과정은 ~ 1,400 사이클 / 분의 블레이드 속도로 촉진되며, 이는 선택한 생리 학적 용액으로 채워질 수있는 멸균 폐쇄 시스템으로 조직을 수확 할 수있게합니다. 수술의 영향, 지역화된 종양 절제술 표본의 보존 및 엄격한 비교 분석, 공동 내 전달 치료제를 연구하고 정확하게 모델링하는 것의 중요성이 커짐에 따라 이 독특한 프로토콜은 뇌종양 환자를 위한 수술 전후 관리 및 치료 발견에 대한 답이 없는 질문을 탐구할 기회를 확대할 것입니다.
Introduction
교모세포종(GBM)은 성인에서 가장 흔하고 공격적인 원발성 뇌종양입니다. 최근 신경외과, 표적 약물 개발 및 방사선 요법의 발전에도 불구하고 GBM 환자의 5년 생존율은 5% 미만으로 30년 이상 크게 개선되지 않은 통계입니다1. 따라서보다 효과적인 치료 전략이 필요합니다.
새로운 치료법을 개발하기 위해 연구 프로토콜은 (1) 종양 이질성과 미세 환경을 정확하게 요약하는 번역 가능한 전임상 모델을 활용하고, (2) 현재 수술, 방사선 요법 및 화학 요법을 포함하는 GBM 환자에게 사용되는 표준 치료 요법을 반영하고, (3) 절제 된 코어와 잔여 코어의 차이를 설명해야한다는 것이 점점 더 분명 해지고 있습니다. 침윤성 종양 조직 2,3,4,5. 그러나 현재 이용 가능한 대부분의 전임상 뇌종양 모델은 외과적 절제를 시행하지 않거나 상대적으로 시간이 많이 소요되는 외과적 절제모델을 활용하여 상당한 양의 출혈을 초래하거나 표준화가 부족합니다. 또한, 설치류 뇌종양의 절제를 수행하는 것은 임상적으로 비교 가능한 수술 도구 또는 프로토콜이 부족하고 체계적인 조직 수집을 위한 확립된 플랫폼6의 부재로 인해 어려울 수 있습니다(표 1).
본 프로토콜은 다기능 비절제 최소 침습 절제 시스템(MIRS) 및 통합 조직 보존 시스템(TPS)을 사용하여 설치류 뇌종양 절제 및 조직 보존을 위한 표준화된 패러다임을 설명하는 것을 목표로 합니다(그림 1). 이 독특한 기술은 GBM 및 기타 유형의 뇌종양 모델에 대한 전임상 연구의 다양한 연구에 활용할 수있는 표준화 된 플랫폼을 제공 할 것으로 기대됩니다. 뇌종양에 대한 치료 또는 진단 양식을 조사하는 연구원은 이 프로토콜을 구현하여 연구에서 표준화된 절제를 달성할 수 있습니다.
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Protocol
모든 동물 연구는 메릴랜드 대학과 존스 홉킨스 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. C57BL/6 암컷 마우스, 6-8주령을 본 연구에 사용하였다. 마우스는 상업적 출처로부터 수득하였다( 재료 표 참조). 마스크, 장갑 및 가운 사용을 포함한 모든 생물안전 레벨 2(BSL-2) 규정을 준수했습니다.
1. 초기 두개내 종양 이식
- 연구의 초기 단계에서, 이전에 발표된 보고서7에 이어 4μL의 인산염 완충 식염수(1x PBS)에 현탁된 100,000개의 세포(GL261 뮤린 신경교종 세포주)를 2.5mm 깊이까지 각 마우스에 두개내 주사합니다.
- 종양 이식후 8일 9일에 생체내 영상화 시스템을 사용하여 각각의 마우스에서 종양 신호를 정량화한다.
참고: 필요한 경우 종양 부담에 따라 마우스를 두 그룹으로 계층화합니다. 본 연구에서, 두 그룹은 (1) 상대적으로 작은 종양 부담을 가진 마우스 (평균 생체 발광 신호 = 5.5e + 006 ± 0.1e + 006 광자 / s, n = 10) 및 (2) 상대적으로 큰 종양 부담을 가진 마우스 (평균 생체 발광 신호 = 1.69e + 007 ± 0.2e + 007 광자 / s, n = 10), (p < 0.05, Mann-Whitney 테스트) 9. - 각 그룹을 두 개의 비교 가능한 하위 그룹으로 나눕니다.
참고: 이 연구에서, 두 개의 하위군은 다음과 같다: 미처리 마우스 (n=5) 및 MIRS를 사용하여 외과적 절제술을 받는 종양이 있는 마우스(n=5), (p > 0.05, Mann-Whitney test)9. - 절제 당일부터 시작하여, 종양 성장 패턴에 기초한 빈도로 생체내 영상화 시스템을 사용하여 종양 진행을 추적한다.
참고: GL261 세포주의 경우 절제 당일과 3-6일마다 종양 진행을 추적합니다.
2. MIRS를 이용한 종양 절제술
- 유도 챔버에서 이소플루란-O2 가스 혼합물을 사용하거나 자일라진/케타민 용액을 복강내 주사하여 마우스를 마취합니다.
- 가스 마취제를 사용하는 경우 마취 유도를 위해 가스 유속을 1.0mL/min으로 설정하고 기화기를 2.0%로 설정하며 일반적으로 챔버에서 3-5분이 필요합니다( 재료 표 참조).
- 주사 가능한 마취제를 사용하는 경우 0.2mL의 마취액(80-100mg/kg의 케타민 및 10-12.5mg/kg의 자일라진, 재료 표 참조)을 복강 주사하여 마우스를 마취합니다.
- 발가락을 꼬집어 적절한 진정 작용을 위해 동물을 평가하십시오. 각막의 건조를 피하기 위해 눈에 안과 연고를 바르십시오. 시술 전에 진통제 (0.03-0.06 mg / kg 부 프레 노르 핀을 피하 투여하십시오).
- 완전한 진정이 확인되면 입체 프레임( 재료 표 참조)에 마우스를 놓습니다.
알림: 가스 마취제를 사용하는 경우 마우스의 코를 코 원뿔에 넣어 절차 중에 이소 플루 란 -O2 혼합물을 계속받을 수 있습니다 (1.5 %). - 이전 스테이플을 제거한 다음 탈모 크림이나 면도로 머리카락을 제거하십시오. 클로르헥시딘/베타딘 기반 스크럽과 알코올을 번갈아 가며 피부를 소독하십시오. 그런 다음 멸균 메스를 사용하여 이전 수술 흉터를 따라 1cm 세로 정중선 절개를 만듭니다.
- MIRS 핸드피스를 스테이지 어댑터/핸드피스 홀더를 통해 스테레오택틱 암에 부착하여 안정성과 정밀도를 높입니다.
- 다음 설정을 사용하여 MIRS 기계( 재료 표 참조)를 설정합니다(그림 1).
- 후면 패널에 설정된 전원 코드를 전원 코드 콘센트에 삽입합니다. 토글(1 = ON, 0 = OFF)하여 시스템의 전원을 켜거나 끕니다.
- 질소 호스의 한쪽 끝(콘솔과 함께 제공됨)을 콘솔 후면 패널의 수 피팅에 삽입합니다. 연결 너트를 시계 방향으로 돌려 연결을 조입니다.
알림: 호스의 반대쪽 끝을 질소 공급 장치에 연결해야 합니다. - 호스를 질소 공급 장치에 연결하기 전에 공급 압력이 콘솔에 권장되는 입력 공급 압력인 100psig를 초과하지 않는지 확인하십시오.
알림: 콘솔은 질소가 콘솔에 공급되면 풋 페달로 활성화될 때 자체 흡인을 생성합니다. - 진공 포트의 뚜껑을 고정하고 밀봉하여 진공 시스템의 누출을 방지하십시오. 흡인 시스템의 누출은 MIRS 콘솔의 성능에 영향을 미칩니다.
- 설정 또는 프라이밍 중에 흡인이 17 미만이면 콘솔 전면의 흡인 손잡이가 최대 수준(100)으로 설정되어 있는지 확인하고 흡인 시스템에 누출이 없는지 확인하고 질소 입력 공급 압력이 올바른지 확인하십시오.
- 풋 페달을 콘솔에 연결하려면 딸깍 소리가 나고 제자리에 맞을 때까지 회색 풋 페달 커넥터를 회색 콘센트에 삽입합니다.
알림: 풋 페달 커넥터는 한 방향으로 콘솔에 연결되며 홈이 있습니다. - 핸드피스를 콘솔에 연결하려면 파란색 핸드피스 커넥터가 딸깍 소리를 내며 제자리에 맞을 때까지 파란색 콘센트에 삽입합니다.
주: 핸드피스 커넥터는 한 방향으로 콘솔에 연결되며 홈이 있습니다. - 시스템을 사용하기 전에 멸균 유체를 조리개로, 튜브 및 핸드피스를 통해 캐니스터로 흡입하여 각 핸드피스를 프라이밍하여 튜브와 핸드피스 내부가 윤활되어 조직 폐색을 줄이도록 합니다.
- 콘솔의 전면 패널에서 적절한 모드를 선택하여 단독 또는 절단으로 포부를 준비하십시오. 풋 페달을 사용하여 시작하십시오.
- 23G MIRS 캐뉼러를 2.5mm 깊이의 버 구멍에 삽입합니다.
- 캐뉼러에 연결된 풋 페달을 밟아 절제 과정을 시작하십시오. 핸드피스의 컨트롤 노브를 사용하여 한 번의 전체 사이클(360°) 이상의 절제를 수행합니다.
참고: 더 많은 사이클을 수행할수록 더 많은 양의 종양 조직이 절제됩니다. - 절제 과정이 완료되면 버 구멍에서 23G MIRS 캐뉼러를 빼내고 5mL의 1x PBS를 사용하여 튜브를 세척하고 잔류 파편을 제거합니다.
- 입체 프레임에서 마우스를 제거하고 스테이플러 또는 4-0 봉합 재료로 상처를 닫습니다 ( 재료 표 참조).
- 마우스를 케이지로 되돌리기 전에 마취에서 회복하는 동안 가열 패드 또는 따뜻한 빛 아래에 마우스를 놓습니다.
- 실험이 완료되면 플러싱 을 통해 캐뉼러를 퍼지합니다. 식힌 배지와 공기를 번갈아 가며 절제된 모든 조직을 수집 용기로 다시 "밀어내십시오". 시스템에서 수집 캐니스터를 제거하고 제공된 캡으로 캡을 닫으십시오.
- 2.12 단계를 완료 한 후 캐뉼러의 말단 팁을 3 % H 2 O2에 넣고Hg 24-25에서 흡입을 적용하여 흡입 라인을 흡입 수집 캐니스터에 다시 채우고 60-90 초 동안 그대로 두십시오. 공기와 매체가 간헐적으로 펄싱되는 멸균 매체로 플러시하십시오.
- 시술 후 신경학적 징후(비정상적인 불규칙한 움직임 또는 발작)가 있는지 마우스를 모니터링합니다.
- 심각한 신경 장애가있는 생쥐를 안락사시킵니다 (무기력 해지거나, 수척해 보이거나, 뒤로 구부러 지거나, 불규칙한 움직임이 있음).
참고: 본 연구에서는 시판되는 안락사 용액 200mg/kg( 재료 표 참조)을 사용하여 각 마우스를 안락사시켰습니다.
3. TPS를 통한 조직 수집
- 종양 샘플을 RBC 용해 배지( 재료 표 참조)가 포함된 조직 배양 접시에 실온에서 5분 동안 담그십시오.
참고: MIRS에서 TPS로 수확된 조직은 주로 조직의 작은 덩어리와 함께 단일 세포 형태입니다. - 50mL 원뿔형 튜브에 70μm 필터( 재료 표 참조)를 놓고 5mL 주사기의 플런저를 사용하여 종양 샘플을 필터를 통과시킵니다.
- 전사 피펫을 사용하여 RPMI-1640 배지를 사용하여 필터를 통해 세포 및 조직 덩어리를 쉽게 통과시킬 수 있습니다.
- 4 °C에서 5분 동안 428 x g 로 원심분리합니다. 피펫으로 상청액을 버립니다.
- 준비된 RPMI-1640 배지 5mL에 각 샘플을 재현탁합니다.
- 조직 생존력을 높이려면, 특히 큰 조직 덩어리가 첫인상으로 시각화되는 경우 필요한 양의 효소 칵테일(DNAse I, 콜라게나제 IV, 디스파스, 파파인 및 EDTA 함유, 재료 표 참조)을 각 샘플에 추가합니다. 와류를 사용하여 용액을 혼합하십시오.
참고: 3.6단계는 선택 사항입니다. 효소 칵테일의 조성(총 부피 5mL/샘플): DNAse I 등급 II 300μL, 콜라게나제/디스파아제 150μL(피브로넥틴, 콜라게나제 IV, I 및 비극성 아미노산 절단), 파파인(비특이적 프로테아제) 250μL, 0.5M EDTA 6μL. - 샘플을 200 rpm, 37 ° C로 설정된 셰이커 인큐베이터에 20 분 동안 놓습니다.
- 20분 후, 샘플을 428 x g 에서 4°C에서 5분 동안 회전시킨다. 상청액을 폐기하십시오.
- 70μm 세포 스트레이너를 통해 단일 세포를 여과하고 4°C에서 3분 동안 274 x g 로 스핀다운합니다. Trypan Blue 및 혈구계를 사용하여 세포 생존율 분석10 을 수행합니다( 재료 표 참조).
알림: Day 0 생존율은 30%-70% 범위이며 2-3일 이내에 크게 증가합니다. - 필요한 생존력 테스트에 따라 4, 5 또는 6단계로 진행합니다.
4. 부착 배양에서 성장하는 세포
- 인증된 층류 후드에서 펠릿을 혈청 함유 부착 배지(예: DMEM, 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S) 용액)에 재현탁하고 부착 세포 플라스크에 세포를 플레이트합니다.
- 세포를 조절된 인큐베이션 환경 (37°C, 5%CO2)에 유지한다.
5. 현탁 배양에서 성장하는 세포 (신경구)
- 인증된 층류 후드에서 펠릿을 무혈청 완전 줄기세포 배지11 에 재현탁하고 현탁 플라스크에 플레이트합니다.
- 신경권 형성을 허용하기 위해 세포를 2-3일 동안 조절된 배양 환경(37°C, 5%CO2)에 유지한다.
- 배양 배지에서 신경구를 시각화 한 후 트립신 -EDTA 또는 Accutase ( 재료 표 참조)를 사용하여 계대 배양을위한 단일 세포 현탁액을 얻습니다.
참고 : 수확 중에 특별한주의를 기울이고 신경 줄기 세포를지지하는 적절한 배지를 사용하는 한, 수확 된 조직의 줄기 세포는 며칠 내에 신경구를 형성해야합니다.
6. 재 이식을위한 세포 준비
- 펠릿을 1x PBS 4μL당 100,000개의 살아있는 세포 농도로 재현탁합니다.
- 즉시 두개내 종양 이식법을 이용하여 나이브 마우스에 주사한다(단계 1).
7. 조직 학적 분석
- 절제술 직후, 뇌를 추출하여 4% 파라포름알데히드(PFA)로 24시간12분 동안 고정합니다.
- 뇌가 자당으로 포화 될 때까지 30 % 자당 용액으로 옮깁니다 (용기 바닥까지 가라 앉음).
- 뇌를 70 % 에탄올 용액으로 옮깁니다.
- 파라핀 블록 임베딩, 절편 및 표준 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색을 이전에 공개된 보고서13에 따라 수행한다.
참고: 염색을 위해 취한 각 섹션의 두께는 10μm였습니다.
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Representative Results
MIRS를 이용한 외과적 절제술은 종양 부담의 현저한 감소를 초래한다.
종양 부담이 더 작은 그룹에서 평균 기준선 생체 발광 신호는 절제술을받은 하위 그룹에서 5.5e + 006 광자 / s ± 0.2e + 006이었습니다. 절제술 후 평균 생체 발광 신호는 0.3e + 006 ± 3.09e + 006 광자 / s로 감소했습니다 (p <0.0001, Mann-Whitney 테스트) 9 (그림 2)). 생체발광 신호는 마우스를 안락사시킬 때까지 다음 며칠 동안 증가하였다. 유사하게, 종양 부담이 더 큰 그룹에서 평균 기준선 생체 발광 신호는 절제술을받은 하위 그룹에서 1.68e + 007 광자 / s ± 0.1e + 007이었습니다. 절제술 후, 평균 생체발광 신호는 0.2e+006± 5.19e+006 광자/초로 감소하였다(p <0.0001, Mann-Whitney test)9. 생체발광 신호는 마우스를 안락사시킬 때까지 다음 며칠 동안 증가하였다.
MERS를 사용한 절제술은 원하는 절제량에 맞게 조정할 수 있습니다.
동종 CT2A 종양의 절제 전 영상에서 종양은 일반적으로 T2 가중 (T2w) 저강도 및 고강도의 이질적인 영역으로 나타나는 실질 조직 구조 및 종양 주위 부종 및 출혈이있는 접종 부위에서 이질적인 종괴로 식별 될 수 있습니다. 정위 종양 세포 주입에 사용되는 바늘 트랙은 T2w MRI 스캔(14) 상에서 확인될 수 있다.
절제술 공동은 절제 후 T2w MRI 스캔에서 종양 접종 부위의 큰 원형 저강도 영역으로 식별할 수 있습니다(그림 3). 절제 절차는 심각한 혈액 손실이나 주변 뇌 구조의 붕괴를 일으키지 않았습니다. 어떤 경우에는 유체가 절제 공동에 축적되었습니다. 그림 4에서 볼 수 있듯이 절제술 부피는 절단 개구의 한 번의 회전에 대해 9.4mm3에서 두 번의 회전을 위한 23.2mm3로 크게 증가하여(p = 0.0117) 알려진 종양 부담에 최적화하기 위해 부피 절제술을 조정할 수 있었습니다.
MIRS를 이용한 종양 절제술은 신경학적 징후를 유도하지 않고 종양 보유 마우스의 생존율 중앙값을 7일간 연장시킨다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 작은 (6 일) 및 큰 (7 일) 종양이있는 두 그룹 모두에서 외과 적 절제를받은 마우스의 생존이 연장되었다. 종양 부담이 작은 그룹에서 대조군 하위 그룹의 생존 중앙값은 16 일이었고 절제술을받은 하위 그룹의 생존 중앙값은 22 일이었습니다 (p = 0.0044). 유사하게, 종양 부담이 더 큰 그룹에서 대조군 하위 그룹의 생존 중앙값은 12일인 반면 절제술을 받은 하위 그룹의 생존 중앙값은 19일이었습니다(p = 0.0043). 또한, MIRS를 사용하여 절제를받은 마우스 중 어느 것도 시술 후 신경 학적 손상의 징후를 보이지 않았다. 이는 MIRS가 안전한 절제를 달성할 수 있음을 나타냅니다.
MIRS를 사용하여 절제된 조직은 높은 시험관 내 및 생체 내 생존력을 가지고 있습니다.
절제된 조직에서 추출한 세포를 시험관내 또는 생체내 생존력 실험을 수행하기 전에 적절한 배지(그림 6)에 여과, 정량 및 재현탁시켰다. 세포의 시험관내 생존율을 검사하고 정상 뇌 실질이 아닌 종양의 절제를 확인하기 위해, 세포를 현탁 배양에서 성장시켰다. 종양 시작 가능성에 대한 지표인 신경권 형성은 절제술 후 최소한의 조직 처리로 발생했습니다. 이것은 MIRS 플랫폼이 잘 해리 된 조직을 수확하고 절제 된 조직의 건강과 생존력에 최소한의 영향을 미친다는 것을 시사했습니다. TPS에서 광학 현미경으로 직접 채취한 샘플은 주로 몇 개의 작은 조직 덩어리의 존재와 함께 단일 세포 형태로 나타났습니다. 0일째 생존율은 30%-70% 범위였습니다(이는 샘플을 70μm 필터를 통과시킨 후 및 도금 전의 생존율을 나타냄). 절제 장치에는 절제 프로브의 축에서 360° 회전할 수 있는 절단 조리개가 있어 동심 조직 부피를 절제할 수 있습니다. 평균적으로 절단 조리개를 360 ° 한 번 돌리면 2-3 백만 개의 세포를 수확 할 수 있고, 두 바퀴로 약 700 만 개의 세포를 수확 할 수 있으며, 절단 조리개를 세 번 3 번 돌리면 총 12-14 백만 개의 세포를 얻을 수 있습니다. 무혈청 완전 줄기세포 배지가 들어 있는 현탁 플라스크에 플레이팅한 후, 2일째에는 광학 현미경으로, 7일째에는 육안으로 신경구를 볼 수 있었습니다(그림 7).
생체내 생존력을 조사하기 위해, 추출된 세포를 나이브 C57BL/6 마우스(n=8 마우스, 100,000 생세포/마우스)에 두개 내 이식하였다. 종양 성장은 생체내 영상화 시스템을 이용하여 확인하였다. 종양 신호는 모든 동물이 종양 이식 후 14일째에 안락사될 때까지 계속 증가하였다(생존 11일의 중앙값).
대표적인 H & E 조직 섹션 (그림 3B)에는 혈액 제제 (진한 분홍색), 염증 및 잔류 종양 세포 (진한 보라색 세포)의 테두리가있는 투명한 원형 절제 캐비티가 있습니다. 거시적으로 잔류 종양 세포는 본질적으로 중간엽이며 침윤성이며 광범위한 혈관 주위 침범 및 증식을 나타냅니다. 현미경으로 표시된 핵 이형성과 유사 분열 수치가 확인되었습니다. 종양 관련 대식세포는 또한 경색 조직 및 미세 출혈 영역 주변에서 확인되었습니다. 주변 뇌 실질의 조직 구조는 방해받지 않는 것으로 보였다.
그림 1: MIRS 시스템 설정. (A) 조직 보존 시스템이 통합된 설치류 모델의 뇌종양에 대한 최소 침습 절제 시스템(MIRS). (B) MIRS 콘솔의 전면 패널. 1 = 시스템 전원, 2 = 풋 페달, 3 = 프라임 버튼, 4 = 흡인, 5 = 흡인 레벨 조절 다이얼, 6 = 흡인 레벨 표시기, 7 = 핸드피스, 8 = 커터 활성화 버튼. (C) MIRS 콘솔의 후면 패널. 1 = 전원 코드 콘센트, 2 = 회로 차단기, 3 = 질소 공급 입력. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: MIRS에 의한 종양 절제술을 받은 마우스와 치료되지 않은 종양이 있는 마우스의 평균 종양 부담도의 변화. (A) 기준선 종양 부담이 작은 마우스 및 (B) 기준선 종양 부담이 큰 마우스(p < 0.0001, SD ≤0.3e+006, 각 시점에서 모든 그룹에서 그래프에 표시하기에는 너무 작음). 동물들은 종양 부담에 굴복하거나 안락사되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : MRI 및 H & E 분석. (A) 절제전 및 절제후 T2 강조 뇌 MRI 이미지 및 (B) 혈액 제품 (진한 분홍색), 염증 및 잔류 종양 세포 (진한 보라색 세포)의 테두리가있는 투명한 원형 절제소를 보여주는 대표적인 H & E 염색 관상 동맥 뇌 섹션. MRI 이미지와 H & E 절편은 절제 직후에 획득되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 종양 절제술 부피 측정. 1 대 1로 생성된 절제술 공동의 MRI 이미지에서 계산된 평균 부피. 절단 조리개를 두 번 회전, 그룹당 n = 4. p = 0.01, 양측 T-검정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 미처리 종양이 있는 마우스 대 MIRS에 의한 종양 절제술을 받는 마우스의 카플란-마이어 곡선 . (A) 기준선 종양 부담이 작은 마우스. (b) 기준선 종양 부담이 큰 마우스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 절제된 종양 세포의 생존율 테스트. (A) 20x에서 0일째에 MIRS로 수확한 조직의 대표적인 광학 현미경 이미지. (B) 절제된 조직으로부터 채취한 세포의 두개내 이식 후 마우스의 생존을 설명하는 카플란-마이어 곡선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 : 신경구의 형성. 절제 후 2일째 (A) 20x 및 (B) 10x에서, 7일째 절제 후 (C) 20x 및 (D) 10x에서 절제된 조직에서 생성된 신경구의 대표적인 광학 현미경 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 최소 침습 절제술 시스템 | 역사적 절제술 | |||
| 수술 시간 및 기술 | 최소 수술 시간 (각 동물에 대해 <2 분). 최소한의 기술이 필요합니다. | 수술 시간은 표준화되지 않았으며 작은 동물과 미세 수술에 대한 수술 경험이 유익합니다. | ||
| 혈액 손실 | 최소 | 예측할 수 없는 | ||
| 표준화된 절제량 | 절제 도구의 회전 수에 의해 결정/조정된 절제량 | 볼륨은 주제마다 크게 다릅니다. | ||
표 1: 최소 침습 절제 시스템(MIRS)과 과거 외과적 절제 모델 간의 비교.
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Discussion
종양 절제술은 저등급 및 고급 뇌종양 모두에 대한 신경외과 종양 치료 계획의 초석입니다. 종양의 세포 감소 및 용적 축소는 뇌종양 환자의 신경 기능 개선 및 전체 생존과 상관관계가 있습니다 1,2,5,6. 외과적 절제를 위한 프로토콜이 이전에 설치류 모델에서 기술되었지만, 이러한 프로토콜은 생성된 결과와 전임상 모델의 전반적인 번역 가능성을 혼란스럽게 할 수 있는 몇 가지 제한 사항을 겪었습니다. 예를 들어, 이전에 보고된 외과적 절제 프로토콜에는 뼈 피판을 만들기 위해 3-4개의 작은 버 구멍이 있는 개두술이 포함되었으며, 그런 다음 정상뇌 조직과 비교하여 종양의 착색 및 일관성을 능숙하게 구별하고 구별하는 것이 포함되었습니다6. 이러한 프로토콜은 시간이 많이 걸리며 연구 인력이 수술 현미경 활용, 수술 도구 취급, 주변 정상 뇌 조직과 관련된 종양 경계 식별 및 적절한 항상성 달성에 대한 고급 기술을 갖추어야 합니다. 이러한 절차는 종종 심각한 혈액 손실과 동물 사망으로 이어집니다. 또한 동일한 실험에서 서로 다른 동물에 걸쳐 비슷한 부피의 종양 조직을 절제하여 표준화된 절제를 달성하는 것이 어려울 수 있습니다. 이러한 연속성과 균일성은 여러 직원이 절차를 수행함에 따라 더욱 어려워집니다.
대조적으로, 여기에 설명된 MIRS 프로토콜은 이러한 제한을 제거합니다(표 1). 본 프로토콜은 초기 종양 이식에 사용되는 동일한 버 구멍을 통한 최소 침습적 접근을 필요로 한다. 프로토콜 섹션에 자세히 설명 된대로 절제 도구는 캐뉼러를 종양 공동에 정확하게 삽입 할 수있는 정위 프레임에 설치할 수 있습니다. 블레이드의 속도와 수행되는 절제주기 횟수는 상당한 양의 혈액 손실을 일으키지 않고 표준화 된 방식으로 절제되는 종양의 양을 제어하기 위해 연구 인력이 사용하는 핸드 피스를 통해 쉽게 조정할 수 있습니다.
결과에서 언급했듯이, MIRS 장치로 절제술을받은 마우스는 절제되지 않은 종양이있는 마우스 코호트에 비해 연장 된 생존을 보였다. 이것은 데이터와 함께 절제되지 않은 대조군에 비해 절제된 그룹에서 종양 부담이 유의하게 감소했음을 보여주며, 이는 MIRS 장치가 주변의 건강한 뇌 조직에 대한 최소한의 방해로 종양을 효과적으로 부피를 축소한다는 것을 나타냅니다. 또한, 절제술 후 며칠 동안, 잔류 종양의 존재 및 CT-2A 종양 세포주의 침윤성 특성으로 인해 종양 부담이 꾸준히 진행되었습니다. 따라서, MIRS 모델은 침윤성 종양 유형의 디벌커화 과정을 복제할 수 있으며, 이는 인간 뇌종양 치료 프로토콜15,16,17에서 치료 요법을 보다 밀접하게 반영하기 위해 화학요법 또는 방사선 요법과 함께 뒤따를 수 있다.
모든 흡입 장치의 경우와 마찬가지로 흡인 튜브의 막힘은 MIRS 시스템의 한계 중 하나 일 수 있습니다. 이는 기계 사용 중 또는 사용 후에 건조한 조직이나 혈액이 축적되어 발생할 수 있습니다. 이를 피하기 위해 절제술의 각 세션이 끝날 때 즉시 핸드피스 캐뉼러를 퍼지하는 것이 좋습니다 공기와 번갈아 가며 냉각 된 매체로 플러싱하여 절제 된 모든 조직을 수집 용기로 "밀어 넣은"다음 3 % H 2 O2로 플러싱합니다. 이렇게 하면 절제술 중에 획득한 모든 조직이 캡처되고 캐뉼라나 튜브에 아무것도 남지 않습니다. 또한 시스템이 흡인/절단되지 않는 경우 핸드피스가 연결되어 있지 않거나, 절제술 캐뉼라 커터가 켜져 있지 않거나, 콘솔의 흡인 라인이 캐니스터에 연결되어 있지 않거나, 캐니스터 덮개가 조이지 않거나, 풋 페달이 연결되어 있지 않기 때문일 수 있습니다.
또한, 우리는 MIRS가 절제 된 조직의 높은 체외 및 생체 내 생존력으로 효과적이고 표준화 된 절제에 사용될 수 있음을 보여 주었지만, 향후 연구는 뇌종양 연구에서 이러한 시스템을 구현하는 다른 측면을 추가로 조사하는 것이 좋습니다. 여기에는 종양 덩어리의 분자 및 세포 구성 요소와 종양 미세 환경에 대한 절제 과정의 영향을 조사하는 것이 포함됩니다. 또한, MIRS 장치를 사용하여 절제된 조직이 모 종양(15)을 요약한다는 것을 확인하기 위한 연구가 필요하다.
결론적으로, 최소 침습적 접근법의 프로토콜은 통합되고 자동화 된 조직 보존 시스템과 결합 된 설치류 뇌종양 모델에서 표준화 된 외과 적 절제술에 대해 설명된다. 이 프로토콜은 고도로 번역되고 예측적인 전임상 뇌종양 연구 모델을 확립하기 위한 길을 열어줍니다. 이 프로토콜의 향후 응용 프로그램에는 표준화된 절제를 달성하기 위해 이 프로토콜을 구현할 수 있는 뇌종양에 대한 다양한 치료 또는 진단 양식을 조사하는 전임상 연구가 잠재적으로 포함될 수 있습니다.
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Disclosures
BT는 NIH로부터 연구 자금을 지원받으며 Accelerating Combination Therapies *의 공동 소유자이며 Ashvattha Therapeutics Inc.는 그녀의 특허 중 하나를 라이센스했습니다. GW에는 NIH 자금(R01NS107813)이 있습니다. HB는 Insightec의 유료 컨설턴트이자 회사의 의료 자문위원회 의장입니다. 이 협정은 존스 홉킨스 대학의 이해 상충 정책에 따라 검토 및 승인되었습니다. HB는 NIH, 존스 홉킨스 대학 및 자선 단체로부터 연구 자금을 지원받으며 CraniUS, Candel Therepeutics, Inc., Accelerating Combination Therapies *, Catalio Nexus Fund II, LLC *, LikeMinds, Inc *, Galen Robotics, Inc. * 및 Nurami Medical*의 컨설턴트입니다. (*주식 또는 옵션 포함).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD | 309628 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430052 | |
| 200 proof ethanol | PharmCo | 111000200 | |
| 5 mL pipettes | CoStar | 4487 | |
| 70 micron filter | Fisher | 08-771-2 | |
| Accutase | Millipore Sigma | SIG-SCR005 | |
| Anased (Xylazine injection, 100 mg/mL) | Covetrus | 33198 | |
| Anesthesia System | Patterson Scientific | 78935903 | |
| Anesthesic Gas Waste Container | Patterson Scientific | 78909457 | |
| Bench protector underpad | Covidien | 10328 | |
| C57Bl/6, 6-8 week old mice | Charles River Laboratories | Strain Code 027 | |
| ChroMini Pro | Moser | Type 1591-Q | |
| Collagenase-Dispase | Roche | #10269638001 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher | ||
| Countess II FL Hemacytometer | Thermo Fisher | A25750 | |
| Debris Removal Solution | Miltenyi Biotech | #130-109-398 | |
| D-Luciferin | Goldbio | LUCK-1G | |
| DMEM F12 media | Corning | 10-090-CV | |
| DMEM media | Corning | 10-013-CV | |
| DNAse I | Sigma Aldrich | #10104159001 | |
| Eppendorf tubes | Posi-Click | 1149K01 | |
| Euthanasia solution | Henry Schein | 71073 | |
| FBS | Millipore Sigma | F4135 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10437-028 | |
| Formalin | Invitrogen | INV-28906 | |
| Gauze | Henry Schein | 101-4336 | |
| hEGF | PeproTech EC | 100-15 | |
| Heparin | Sigma | H-3149 | |
| hFGF-b | PeproTech EC | 1001-18B | |
| Induction Chamber | Patterson Scientific | 78933388 | |
| Isoflurane | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Isoflurane Vaporizer | Patterson Scientific | 78916954 | |
| Ketamine | Covetrus | 11695-0703-1 | |
| Kopf Stereotactic frame | Kopf Instruments | 5001 | |
| Lightfield Microscope | BioTek | Cytation 5 | |
| Microinjection Unit | Kopf | 5001 | |
| Micromotor drill | Foredom | F210418 | |
| MRI system | Bruker | 7T Biospec Avance III MRI Scanner | |
| NICO Myriad System | NICO Corporation | ||
| Ophthalmic ointment | Puralube vet ointment | ||
| Papain | Sigma Aldrich | #P4762 | |
| PBS | Invitrogen | #14190250 | |
| PenStrep | Millipore Sigma | N1638 | |
| Percoll solution | Sigma Aldrich | #P4937 | |
| Pipette controller | Falcon | A07260 | |
| Povidone-iodine solution | Aplicare | 52380-1905-08 | |
| Progesterone | Sigma | P-8783 | |
| Putrescine | Sigma | P-5780 | |
| RPMI Media | Invitrogen | INV-72400120 | |
| Scalpel blade | Covetrus | 7319 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Skin marker | Time Out | D538,851 | |
| Staple remover | MikRon | ACR9MM | |
| Stapler | MikRon | ACA9MM | |
| Staples | Clay Adams | 427631 | |
| Stereotactic Frame | Kopf Instruments | 5000 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Suture, vicryl 4-0 | Ethicon | J494H | |
| T-75 culture flask | Sarstedt | 83-3911-002 | |
| TheraPEAKTM ACK Lysing Buffer (1x) | Lonza | BP10-548E | |
| Trypsin-EDTA | Corning | MDT-25-053-CI |
References
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