Summary
I dette arbejde blev der udviklet en hurtig, følsom og bærbar detektionsmetode til Candidatus Liberibacter asiaticus baseret på rekombinasepolymeraseforstærkning kombineret med CRISPR-Cas12a.
Abstract
Citrusavlernes tidlige påvisning af Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) letter tidlig indgriben og forhindrer spredning af sygdomme. En simpel metode til hurtig og bærbar Huanglongbing (HLB) diagnose præsenteres her, der kombinerer rekombinasepolymeraseforstærkning og en fluorescerende reporter ved hjælp af nukleaseaktiviteten af det grupperede regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser / CRISPR-associerede 12a (CRISPR-Cas12a) system. Følsomheden af denne teknik er meget højere end PCR. Desuden viste denne metode lignende resultater som qPCR, når bladprøver blev brugt. Sammenlignet med konventionelle CLas-detektionsmetoder kan detektionsmetoden, der præsenteres her, afsluttes på 90 minutter og fungerer i en isotermisk tilstand, der ikke kræver brug af PCR-maskiner. Derudover kan resultaterne visualiseres gennem en håndholdt fluorescerende detektionsanordning i marken.
Introduction
Huanglongbing (HLB) er en af de mest problematiske citrussygdomme på verdensplan1. HLB er forårsaget af de phloem-koloniserende og kræsne bakterier Candidatus Liberibacter spp., herunder Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus og Ca. L. americanus 2. Den mest udbredte HLB-associerede art i Kina og USA er CLas, som overføres af asiatiske citruspsyllider (Diaphorina citri) eller gennem podning3. Efter at være blevet inficeret af CLas viser citrustræer vækstfald indtil døden2. De almindelige symptomer på citrusblade inficeret med CLas er plettet mottle, grønne øer (små cirkulære mørkegrønne prikker), hævede korkede vener på tykkere og læderagtige blade og ikke-ensartede gulningsskud2. Derudover forekommer frugter inficeret med CLas små og skæve2.
Da ingen citrussort er resistent over for HLB, og der ikke findes nogen terapeutisk kur mod HLB, kræver forebyggelse af HLB karantæne og isolering af CLas-positive citrustræer 2,3. Derfor er tidlig påvisning afgørende for overvågning og karantæne for at forhindre spredning af CLas og minimere økonomiske tab3. Derudover er følsom CLas-detektion nødvendig på grund af den lave titer af CLas i planter i det tidlige stadium af infektion3. I Kina udføres CLas-detektion normalt af visse certificerede testcentre. Detektionsprocessen tager dog normalt mindst 1 uge, og detektionsgebyret er dyrt. Derfor for at hjælpe med at overvåge HLB-forekomsten
Forskellige teknologier er blevet anvendt til at diagnosticere HLB 4,5,6,7,8,9. Polymerasekædereaktion (PCR) og kvantitativ PCR (qPCR) er de mest anvendte værktøjer til CLas-detektion på grund af deres høje følsomhed og specificitet 4,5. Disse teknologier er imidlertid stærkt afhængige af dyre instrumenter og højt kvalificeret personale. Derudover er flere isotermiske forstærkningsmetoder, såsom loop-medieret isotermisk forstærkning (LAMP), blevet udviklet som attraktive alternativer til konventionelle PCR-metoder på grund af deres enkelhed, hurtighed og lave omkostninger 8,9,10. Det er dog udfordrende at anvende dem til nøjagtigt at detektere CLas på grund af de ikke-specifikke forstærkningssignaler, hvilket kan forårsage falske positive resultater.
RNA-guidet CRISPR / Cas (grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser / CRISPR-associerede) endonukleasebaseret nukleinsyredetektion er udviklet som en næste generations molekylær diagnostikteknologi på grund af dens høje følsomhed, specificitet og pålidelighed11,12,13,14. Disse CRISPR/Cas-diagnosticeringsteknologier er afhængige af cas-proteiners sikkerhedsnukleaseaktivitet til at spalte enkeltstrenget DNA (ssDNA) modificeret med en fluorescerende reporter og en fluorescensquencher i hver ende af oligonukleotiderne samt en fluorescensdetekteringsanordning til at fange den frigivne fluorescerende reporter11,12 . Nukleaseaktiviteten af flere Cas-effektorer aktiveret af CRISPR RNA (crRNA) target duplex kan vilkårligt spalte det omgivende ikke-mål ssDNA11. CRISPR-Cas12a (også kaldet Cpf 1), et klasse 2 type V-A CRISPR/CAS-system, viser flere fordele sammenlignet med Cas9, såsom en lavere mismatchtolerance og større specificitet13. Cas12a /crRNA-systemet er blevet anvendt til følsom og specifik påvisning af nukleinsyrer af humane patogener og phytopathogener 14,15,16,17,18. Derfor bør anvendelse af Cas12a / crRNA-systemet muliggøre nøjagtig og følsom påvisning af nukleinsyren af CLas.
Cas12a alene er ikke teoretisk følsom nok til at detektere lave niveauer af nukleinsyrer. For at forbedre detektionsfølsomheden kombineres CRISPR-Cas12a-detektion derfor typisk med et isotermisk forstærkningstrin14,15. Rekombinasepolymeraseamplifikation (RPA) muliggør følsom og hurtig isotermisk DNA-amplifikation i et temperaturområde fra 37 °C til 42 °C19.
En detektionsplatform kaldet DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter), der kombinerer DNase-aktiviteten af Cas12a med RPA og en fluorescensaflæsning, er for nylig blevet udtænkt12 og har vist sig at detektere nukleinsyre med højere følsomhed20. Desuden kan fluorescenssignalet, der udsendes fra de positive prøver, observeres gennem en håndholdt fluorescensdetektionsanordning i marken.
Da vi amplificerede DNA med RPA, designede crRNA rettet mod det fem-kopierede nrdB (ribonukleotidreduktase β- underenhed) gen, der er specifikt for CLas21, og anvendte DNase-aktiviteten af Cas12a-proteinet, kaldte vi denne CLas-detektionsmetode CLas-DETECTR. Sammenlignet med eksisterende CLas-detektionsmetoder er CLas-DETECTR hurtig, præcis, følsom og kan implementeres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Konstruktion af CLas-DETECTR
BEMÆRK: Konstruktionen af CLas-DETECTR er en fire-trins proces: opløsningsforberedelse, citrus total DNA-isolering, isotermisk DNA-amplifikation og resultatvisualisering. Skemaet for CLas-DETECTR-analysen er illustreret i figur 1A.
- Forberedelse af opløsning
- Forbered buffer A: 20 mM NaOH i 6% PEG 200. Til 100 ml tilsættes 113 mg NaOH og 6 g PEG 200 i 80 ml H2O i en flaske. Inkuber flasken i et vandbad ved 60 °C, indtil hele PEG 200 er opløst. Tilføj derefter H2O til et volumen på 100 ml.
- Opløsning B: For hver reaktion tilsættes 10 μL RPA-buffer, 0,8 μL F-RPA-RNRf, 0,8 μL R-RPA-RNRr og 3,9 μL ddH2O til et endeligt volumen på 15,5 μL.
BEMÆRK: F-RPA-RNRf og R-RPA-RNRr er de primere, der anvendes i analysen mod nrdB-genet . Se sekvensen i tabel 1 . - Opløsning C: For hver reaktion tilsættes 1 μL ssDNA-reporter, 3 μL NEB-buffer 3,1, 1 μL crRNA, 4 μL Cas12a og 11 μL ddH2O, til et slutvolumen på 20 μL.
BEMÆRK: Hvis der er mange prøver at detektere, skal du lave et stort volumen opløsning B og opløsning C og aliquot senere.
- Citrus total DNA-isolering
BEMÆRK: For at spare tid og gøre denne metode egnet til felt-CLas-detektion blev den alkaliske polyethylenglycol (PEG)-baserede tilgang brugt til at opnå rå planteekstrakter til DNA-amplifikation22,23- Citrusblade blev brugt i denne protokol. Først skal du slå fem bladskiver fra et blad. Sæt derefter bladskiverne i et 1,5 ml mikrocentrifugerør, og tilsæt 200 μL buffer A.
BEMÆRK: Rengør bladene først i marken, hvis der er støv, der dækker dem. Bladskiverne kan klippes ved hjælp af låget på 1,5 ml røret for at undgå krydskontaminering. Andre citrusvæv, såsom rødder, stilke, frugter og blomster, kan også bruges i denne protokol. - Slib bladskiverne manuelt, indtil de er glatte med en plastikstang.
- Lad røret stå uforstyrret i 10 min. Brug derefter supernatanten til DNA-amplifikation.
BEMÆRK: Analysen kan sættes på pause her, og de rå planteekstrakter, der blev ekstraheret ved den alkaliske PEG-metode, kan opbevares ved -20 ° C i mindst 1 år. Newhall søde appelsin (Citrus sinensis Osbeck var. Newhall) træer vist i videoen blev dyrket i en gryde fyldt med en blanding af 9/3/1 (v / v / v) tørvjord / vermikulit / perlit og vedligeholdt i et drivhus beliggende på campus i Gannan Normal University, Jiangxi, Kina. De HLB-inficerede træer blev podet ved podning med CLas-positive Newhall-knopper. De HLB-inficerede og HLB-uinficerede træer blev bekræftet af PCR. CLas blev detekteret ved hjælp af primerparret (F-RPA-RNRf/R-RPA-RNRr) rettet mod det CLas-specifikke markørgen nrdB. På den anden side kan karakteristiske HLB-symptomer, plettet plet og gulnende blade findes på CLas-positive, men ikke på CLas-negative træer.
- Citrusblade blev brugt i denne protokol. Først skal du slå fem bladskiver fra et blad. Sæt derefter bladskiverne i et 1,5 ml mikrocentrifugerør, og tilsæt 200 μL buffer A.
- Isotermisk DNA-amplifikation
- Der tilsættes 1 μL supernatant fra trin 1.2.3 og 1 μL MgOAc (14 mM slutkoncentration) i opløsning B og blandes godt.
- I laboratoriet inkuberes dem i en simpel inkubator ved 37 °C i 15 min.
BEMÆRK: Hold rørene i hånden i 15 min. Det foreslås også at inkubere rør i en simpel inkubator ved 37 °C i 15 minutter, hvis forholdene tillader det.
- Visualisering af resultater
- Der tilsættes 10 μL af blandingen fra trin 1.3.2 til opløsning C og blandes godt.
- Inkuber dem i en 37 °C inkubator i 60 min.
- Brug beskyttelsesbriller og observer det grønne fluorescenssignal, der frigives fra ssDNA-reporteren mærket med 5 '6-fluorescein ved 5' og fluorescensdæmperen ved 3' gennem en håndholdt fluorescerende detektionsanordning (excitationsbølgelængde: 440 nm, emissionsbølgelængde: 500 nm).
BEMÆRK: grønt fluorescenssignal kan vare flere dage, det er bedre at
FORSIGTIG: Det lys, der udsendes af fluorescensdetekteringsanordningen, er skadeligt for øjnene. Sørg for at bære beskyttelsesbriller, før du observerer resultaterne.
2. Specificitetstest
BEMÆRK: For at teste specificiteten af CLas-DETECTR blev rhizosfærebakterien Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) og Burkholderia stabilis stamme 1440 isoleret i laboratoriet24 udsat for CLas-DETECTR-testen.
BEMÆRK: Candidatus Liberibacter (CLas) kan ikke dyrkes. Man kan kun få CLas-DNA fra ekstraktion af genomisk DNA fra citrusvæv inficeret med CLas. Xcc er årsagsmidlet til en anden vigtig citrussygdom, citrus canker. Burkholderia stabilis stamme 1440 er en anti-Xcc bakterie isoleret i laboratoriet. Derfor blev der anvendt rene stammer til alle disse tre bakterier.
- Ekstrahers det bakterielle genomiske DNA (gDNA) ved hjælp af et bakterielt genomisk DNA-ekstraktionssæt efter producentens protokol. Brug vand som en negativ kontrol.
- Udfør PCR ved hjælp af 0,2 ml PCR-rørstrimler med optiske hætter i en 25 μL reaktionsblanding indeholdende 1 μL F-RPA-RNRf, 1 μL R-RPA-RNRr, 12,5 μL Ex Taq Version 2.0 plus farvestof, 1 μL DNA-skabelon og 9,5 μL H2O.
- Brug følgende termiske cyklusreaktionsbetingelser: 1 min ved 98 °C; efterfulgt af 35 cyklusser på 10 s ved 98 °C, 30 s ved 55 °C, 15 s ved 72 °C derefter 10 minutter ved 72 °C; og hold ved 16 °C.
- Kør PCR-produkterne på 1% agarosegel ved 120 V i 15 min.
- Udfør qPCR i en 20 μL reaktionsblanding indeholdende 0,8 μL F-RPA-RNRf, 0,8 μL R-RPA-RNRr, 10 μL 2x TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus), 1 μL af DNA-skabelonen og 7,4 μL H2O.
- Brug følgende termiske cyklusreaktionsbetingelser: 30 s ved 95 °C; efterfulgt af 45 cyklusser på 5 s ved 95 °C og 32 s ved 60 °C og derefter et smeltekurvetrin på 15 s ved 95 °C, 1 minut ved 60 °C og 15 s ved 95 °C.
- Medtag tre tekniske gentagelser i hver gentagelse.
- Udfør CLas-DETECTR-metoden ved at følge trin 1.1–1.4.
3. Sammenligning af følsomhed
- For at teste følsomheden af CLas DETECTR skal du detektere en række CLas DNA-fragmentfortyndinger ved hjælp af PCR, CLas-DETECTR og qPCR som beskrevet ovenfor.
- Forstærk et DNA-segment med en længde på 1.060 bp fra nrdB ved hjælp af primersættet F-RNR og R-RNR i en 100 μL reaktionsblanding indeholdende 4 μL F-RNR, 4 μL R-RNR, 50 μL PrimeSTAR Max Premix, 2 μL DNA-skabelon og 40 μL H2O efterreaktionsbetingelserne for termisk cykling (30 s ved 98 °C; efterfulgt af 35 cyklusser på 10 s ved 98 °C, 15 s ved 55 °C, 30 s ved 72 °C derefter 10 minutter ved 72 °C; og hold ved 16 °C).
BEMÆRK: NrdB (ribonukleotidreduktase β- underenhed) genet er specifikt for CLas21. Man kan nemt få nrdB-ampliconen fra CLas-positiv citrus-gDNA ved hjælp af primersættet F-RNR og R-RNR. Primersættet F-RNR og R-RNR forstærker et 1.060 bp nrdB-fragment, mens primersættet F-RPA-RNR og R-RPA-RNR forstærker et 104 bp-fragment af nrdB-genet, som er den del af 1.060 bp nrdB-fragmentet . - Rens PCR-produkterne med et DNA-gelekstraktionssæt efter producentens manual.
- Fortynd PCR-produkterne indeholdende nrdB-ampliconerne med steriliseret ddH2O.
- Beregn kopinummeret på nrdB-genet ved hjælp af kommercielt tilgængeligt online DNA-kopinummer og fortyndingsberegner.
- Der foretages DNA-fortyndinger indeholdende 2,01 × 106 kopier/μL, 2,01 × 105 kopier/μL, 2,01 × 104 kopier/μL, 2,01 × 103 kopier/μL, 2,01 × 10 2 eksemplarer/μL, 2,01 × 101 kopier/μL, 2,01 × 100 kopier/μLog 2,01 × 10−1 kopier/μL af CLas DNA-fragment.
4. Påvisning af prøver
BEMÆRK: Efter specificitets- og følsomhedstesten blev CLas-DETECTR-metoden brugt til at detektere tilstedeværelsen af CLas i markbladprøverne indsamlet fra Newhall søde appelsintræer dyrket i germplasmressourceplanteskolen på campus ved Gannan Normal University, Jiangxi, Kina. En qPCR blev udført for at verificere resultaterne.
- Test i alt 15 træer. Brug vand som en negativ kontrol.
- Udfør CLas-DETECTR- og qPCR-metoderne som beskrevet ovenfor.
BEMÆRK: På grund af de ujævne fordelingsegenskaber for CLas i citrus blev blade, der viste HLB-symptomer, indsamlet som en prioritet. Hvis et træ så sundt ud, blev bladene indsamlet tilfældigtCLas-DETECTR-systemet fungerer korrekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her har vi beskrevet en bærbar platform, CLas-DETECTR, der finkæmmer RPA- og CRISPR-Cas12a-systemerne for at diagnosticere HLB i marken. Skemaet for CLas-DETECTR er illustreret i figur 1A.
Da bladprøver fra de HLB-inficerede og HLB-uinficerede Newhall-træer (figur 1B), for hvilke tilstedeværelsen af CLas blev bekræftet af PCR (figur 1C), blev udsat for CLas-DETECTR-testen, blev der set et grønt fluorescenssignal i den HLB-inficerede prøve, men ikke i den HLB-uinficerede prøve og negativ kontrol (figur 1D).
Vi bestemte specificiteten af CLas-DETECTR ved hjælp af nukleinsyrer ekstraheret fra andre bakterier. Primersættet af F-RPA-RNRf og R-RPA-RNRr, der blev brugt i CLas-DETECTR-assayet, blev også brugt i PCR og qPCR. Et bånd kunne ses i agarosegelelektroforesen, når det blev amplificeret ved hjælp af CLas-positiv citrusblad gDNA, men ikke andet bakterielt gDNA i PCR-assays (figur 2A). I qPCR-assays var den gennemsnitlige tærskelcyklusværdi (Ct) for CLas 24 ± 0,7, mens de gennemsnitlige Ct-værdier for A. tumefaciens GV3101, Xcc og B. stabilis stamme 1440 var henholdsvis 38 ± 0,7, 39 ± 1,4 og 39 ± 0,7 (figur 2B). Normalt betragtes resultatet som negativt, når Ct-værdien er højere end 38. Disse resultater viser, at F-RPA-RNRf og R-RPA-RNRr primerpar er specifikke for CLas. I CLas-DETECTR-analysen viste kun CLas gDNA grønne fluorescenssignaler; gDNA ekstraheret fra A. tumefaciens GV3101, Xcc og B. stabilis stamme 1440 gjorde det ikke (figur 2C), hvilket betyder, at CLas-DETECTR kan detektere CLas specifikt.
Vi testede også følsomheden af CLas-DETECTR ved hjælp af en række CLas DNA-fortyndinger. PCR kunne detektere 2,01 × 102 eksemplarer/μL (figur 3A). På den anden side kunne CLas-DETECTR detektere 2,01 × 100 eksemplarer/μL, hvilket tyder på, at dette er levedygtigt som en følsom feltdiagnostik (figur 3B). qPCR kunne detektere 2,01 × 10-1 kopier / μL, men Ct-værdien var højere end 36 (figur 3C). Derfor er CLas-DETECTR to størrelsesordener mere følsom end traditionel PCR og en størrelsesorden mindre følsom end qPCR, når der anvendes fortyndede ampliconer (figur 3).
Endelig undersøgte vi gennemførligheden af CLas-DETECTR for feltprøver og sammenlignede dens følsomhed med qPCR, en etableret, følsom nukleinsyredetektionsmetode21. Normalt betyder en Ct-værdi af CLas-detektion ved qPCR højere end 36, at CLas-koncentrationen er mindre end 2,01 × 10-1 kopier / μL, hvilket er en meget lav koncentration (figur 3C). Blandt de 15 prøver var Ct-værdien af prøve 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 og 14 detekteret ved qPCR mindre end 36, og tilsyneladende grønne fluorescenssignaler blev observeret (figur 4). På den anden side, da Ct-værdierne for prøve 6, 7, 9, 12 og 15 detekteret ved qPCR ikke var bestemt, blev der ikke observeret grønne fluorescenssignaler (figur 4). Desuden blev der observeret svage grønne fluorescenssignaler, når Ct-værdierne for prøve 5 og prøve 11 detekteret ved qPCR var højere end 36 (figur 4). Resultaterne tyder på, at vores platform er et hurtigt, robust og følsomt værktøj til HLB-diagnose på området.
| Nej | Navn | Sekvens (5' til 3') | ||||||||||||
| 1 | crRNA1-nrdB | rUrArArUrCrUrArArArGrUrGrUrArGrArUrCrSGr | ||||||||||||
| 2 | ssDNA-FQ | FAM-TTTATTT-BHQ1 | ||||||||||||
| 3 | F-RPA-RNRf | AAAAGTCGCACCATGCTCCATGAAGCTACC | ||||||||||||
| 4 | R-RPA-RNRr | TGTTCACATGAGGGAGCATTTAACCCCACGAA | ||||||||||||
| 5 | F-RNR | ATGGCAAATAACACAGGATTAAGCCC | ||||||||||||
| 6 | R-RNR | TTAATCCCATTTCAACCCTGCTCC | ||||||||||||
Tabel 1: Nukleinsyre anvendt i denne undersøgelse. ssDNA-FQ er enkeltstrenget DNA mærket med 5'6-FAM (Fluorescein) ved 5' og fluorescensquencher Black Hole Quencher 1 (BHQ1) ved 3'. Forkortelser: F = fluorescerende reporter; Q = fluorescensdæmper.
Figur 1: Design og validering af CLas-DETECTR. (A) Skematisk af CLas-DETECTR-analysen. Trin 1: Forbered buffer A indeholdende 20 mM NaOH i 6% PEG 200 til hurtig gDNA-ekstraktion; opløsning B indeholdende 10 μL RPA-buffer, 0,8 μL F-RPA-RNRf, 0,8 μL F-RPA-RNRr og 3,9 μL ddH2O-reaktion ved isotermisk DNA-amplifikation; opløsning C indeholdende 1 μL ssDNA-reporter, 3 μL NEB-buffer 3,1, 1 μL crRNA-målretning nrdB, 4 μL Cas12a og 11 μL ddH2O-reaktion i hver reaktion for fluorescerende reporterfrigivelse. Trin 2: Fem bladskiver stanset fra blade blev brugt til at ekstrahere citrus total DNA med 200 μL buffer A. Trin 3: De CLas-specifikke nukleinsyrer blev forstærket ved hjælp af primerne F-RPA-RNRf og R-RPA-RNRr rettet mod det CLas-specifikke markørgen nrdB i opløsning B med 1 μL supernatant fra trin 2 og 1 μL MgOAc ved 37 °C i 15 min. Trin 4: Opløsning C med 10 μL af blandingen fra trin 3 blev inkuberet ved 37 °C i 60 min., og det grønne fluorescenssignal blev observeret gennem en håndholdt fluorescerende detektionsanordning. ssDNA-FQ blev mærket med 5'6-FAM (Fluorescein) ved 5' og en fluorescensquencher Black Hole Quencher 1 (BHQ1) ved 3'. Forkortelser: F = fluorescerende reporter; Q = fluorescensdæmper. (B) Det HLB-inficerede træ (til venstre) viser plettet plet og gule blade, men det HLB-uinficerede træ (højre) ser grønt ud. (C) Tilstedeværelsen af CLas blev bekræftet ved anvendelse af primerparret F-RPA-RNRf og R-RPA-RNRr. (D) Den HLB-inficerede prøve viser grønne fluorescenssignaler, mens HLB-uinficeret ogH2O ikke gør det i CLas-DETECTR-assayet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Test af CLas-DETECTR's specificitet. (A) Agarosegelelektroforese af PCR-resultaterne, (B) Ct-værdien af qPCR-resultaterne og (C) CLas-DETECTR-resultaterne forstærket med primerparret F-RPA-RNRf og R-RPA-RNRr ved hjælp af gDNA ekstraheret fra CLas-positive Newhall-blade og tre andre bakterier. Igen tjente H2O som en negativ kontrol. M: DNA-stige; gDNA ekstraheret fra CLas-positive Newhall blade (1), Agrobacterium tumefaciens GV3101 (2), Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc, 3) og Burkholderia stabilis stamme 1440 isoleret i vores laboratorium (4). Ct-værdien repræsenterer den gennemsnitlige Ct-værdi for tre tekniske gentagelser ± standardfejl. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Følsomhedssammenligning af CLas-DETECTR med PCR og qPCR. Detektionsanalyse af en række specifikke CLas DNA-ampliconfortyndinger ved hjælp af (A) PCR, (B) CLas-DETECTR og (C) qPCR. (A) Fra 25 μL af PCR-produkterne blev 5 μL lagt i gelen. (B) Billederne blev taget med et smartphone-kamera gennem beskyttelsesbriller under lyset udsendt af en håndholdt fluorescerende detektionsanordning (excitationsbølgelængde: 440 nm, emissionsbølgelængde: 500 nm). De samme primere blev brugt i alle assays. De oprensede PCR-produkter med en længde på 1.060 bp forstærket med grundsættet F-RNR og R-RNR rettet mod det CLas-specifikke nrdB-gen blev fortyndet ved hjælp af H2O i koncentrationer på 2,01 × 106 kopier/μL (1), 2,01 × 105 eksemplarer/μL (2), 2,01 × 104 eksemplarer/μL (3), 2,01 × 103 eksemplarer/μL (4), 2,01 × 102 eksemplarer/μL (5), 2,01 × 101 eksemplarer/μL (6), 2.01 × 100 eksemplarer/μL (7) og 2,01 × 10−1 eksemplarer/μL (8). H2O fungerede som en negativ kontrol. M: DNA-stige. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: CLas-detektion ved hjælp af feltprøver. CLas i 15 bladprøver indsamlet fra Newhall søde appelsintræer blev testet af CLas-DETECTR og qPCR assays beskrevet ovenfor. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne undersøgelse præsenterer en hurtig og bærbar metode til at detektere CLas ved navn CLas-DETECTR, som kombinerer RPA- og CRISPR-Cas12a-systemerne. Arbejdsgangen er illustreret i figur 1. CLas-DETECTR registrerer CLas med specificitet og følsomhed (figur 2 og figur 3). Ved hjælp af Newhall-bladprøver registrerer CLas-DETECTR desuden CLas med samme følsomhed som qPCR (figur 4). Især kan detektionsresultaterne visualiseres direkte gennem en håndholdt bærbar enhed uafhængig af laboratoriebaserede instrumenter, hvilket er afgørende for HLB-diagnose i realtid.
Der er flere vigtige overvejelser i protokollen. For det første bør krydskontaminering strengt undgås i prøveudtagningsprocessen, da CLas-DETECTR er lige så følsom som qPCR. Reaktionsreagenserne må ikke udsættes for intenst sollys. Alle trin skal følges nøjagtigt for at opnå optimale resultater. En positiv kontrol, et plasmid indeholdende CLas-specifikke genfragmenter, bør inkluderes for at sikre, at CLas-DETECTR-systemet fungerer korrekt i marken. Endelig bør alt CLas-relateret forsøgsaffald behandles som en biohazard og autoklaveres inden bortskaffelse.
Hvis der ikke detekteres fluorescenssignaler for den positive kontrol, kan der være hæmmere i reaktionsblandingen, og reagenserne skal ændres. Ellers, hvis fluorescensen er for svag til at skelne, kan inkubationstiden forlænges længere inkubationstid kan føre til falske positiver.
De eksisterende CLas-detektionsmetoder kræver dyre PCR-maskiner, faste driftssteder og uddannet personale. Den metode, der præsenteres her, gør det imidlertid muligt at diagnosticere HLB nøjagtigt og følsomt i marken af en bred vifte af mennesker, herunder citrusavlere.
CLas-DETECTR har dog nogle begrænsninger. For det første kan citrusprøver ikke bruges direkte i protokollen, og citrus-gDNA'et skal ekstraheres. For det andet kræves en simpel inkubator til RPA og aktiveringen af Cas12a's nukleaseaktivitet for ensartede resultater. For det tredje skal resultaterne visualiseres gennem en håndholdt fluorescerende detektionsanordning. Selvom laterale flowstrimler kunne anvendes til at vise resultaterne direkte, ville dette øge
Bladprøver blev testet i denne protokol. I fremtiden kan CLas-DETECTR anvendes til at detektere tilstedeværelsen af CLas i periwinkles og psyllidprøver. Derudover kan denne molekylære diagnostiske teknologi ved at ændre crRNA og primere også bruges til andre citrussygdomme, såsom citrus canker, citrus decay virus og citrus blade fragmentering virus. Mens vi arbejder på CLas-DETECTR, er denne tilgang også blevet brugt til at detektere CLas parallelt af andre25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet økonomisk af Kinas nationale centrale F & U-program (2021YFD1400805), det store F & U-program for videnskab og teknologi i Jiangxi-provinsen (20194ABC28007), projekter fra Jiangxi Education Department (GJJ201449) og samarbejdsinnovation inden for moderne landbrugsvidenskabelig forskning i Jiangxi-provinsen (JXXTCX2015002 (3 + 2) -003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Corning | 09319KE1 | China |
| Bacterial Genomic DNA Extraction Kit | Solarbio | D1600 | China |
| EnGen LbCas12a | TOLOBIO | 32104-01 | China |
| Ex Taq Version 2.0 plus dye | TaKaRa | RR902A | China |
| Handheld fluorescent detection device | LUYOR | 3415RG | China |
| Hole puncher | Deli | 114 | China |
| Magnesium acetate, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
| NaOH | SCR | 10019718 | China |
| NEB buffer 3.1 | NEB | B7203 | USA |
| PCR strip tubes | LABSELECT | PST-0208-FT-C | China |
| PEG 200 | Sigma | P3015 | USA |
| PrimeSTAR Max DNA Polymeras | TaKaRa | R045A | China |
| Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder | New England Biolabs | N0550S | USA |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820B | China |
| TwistAmp Basic | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
References
- Ma, W. X., et al. Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin. Nature Communications. 13 (1), 529 (2022).
- Bové, J. M. Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
- Wang, N., et al. The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control. Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).
- Kim, J. S., Wang, N. Characterization of copy numbers of 16S rDNA and 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus and the implication in detection in planta using quantitative PCR. BMC Research Notes. 2, 37 (2009).
- Maheshwari, Y., Selvaraj, V., Godfrey, K., Hajeri, S., Yokomi, R. Multiplex detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus" and Spiroplasma citri by qPCR and droplet digital PCR. PLoS One. 16 (3), e0242392 (2021).
- Deng, X., Zhou, G., Li, H., Chen, J., Civerolo, E. L. Nested-PCR detection and sequence confirmation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' from Murraya paniculata in Guandong, China. Plant Disease. 91 (8), 1051 (2007).
- Ding, F., Duan, Y., Yuan, Q., Shao, J., Hartung, J. S. Serological detection of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens. Scientific Reports. 6, 29272 (2016).
- Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Candidatus Liberibacter asiaticus, a causal agent of citrus Huanglongbing. The Plant Pathology Journal. 34 (6), 499-505 (2018).
- Ghosh, D. K., et al. Development of a recombinase polymerase based isothermal amplification combined with lateral flow assay (HLB-RPA-LFA) for rapid detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus". PLoS One. 13 (12), e0208530 (2018).
- Ravindran, A., Levy, J., Pierson, E., Gross, D. C. Development of a loop-mediated isothermal amplification procedure as a sensitive and rapid method for detection of 'Candidatus Liberibacter solanacearum' in potatoes and psyllids. Phytopathology. 102 (9), 899-907 (2012).
- Chertow, D. S.
- Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
- Gootenberg, J. S., et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 360 (6387), 439-444 (2018).
- Ding, X., et al. Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay. Nature Communications. 11 (1), 4711 (2020).
- Qian, W., et al. Visual detection of human metapneumovirus using CRISPR-Cas12a diagnostics. Virus Research. 305, 198568 (2021).
- Marques, M. C., et al. Diagnostics of infections produced by the plant viruses TMV, TEV, and PVX with CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13. ACS Synthetic Biology. 11 (7), 2384-2393 (2022).
- Lu, X., et al. A rapid, equipment-free method for detecting Phytophthora infestans in the field using a lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification assay. Plant Disease. 104 (11), 2774-2778 (2020).
- Lobato, I. M., O'Sullivan, C. K. Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances. Trends in Analytical Chemistry. 98, 19-35 (2018).
- Liang, M., et al. A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules. Nature Communications. 10 (1), 3672 (2019).
- Zheng, Z., et al. Unusual five copies and dual forms of nrdB in "Candidatus Liberibacter asiaticus": Biological implications and PCR detection application. Scientific Reports. 6, 39020 (2016).
- Chomczynski, P., Rymaszewski, M. Alkaline polyethylene glycol-based method for direct PCR from bacteria, eukaryotic tissue samples, and whole blood. BioTechniques. 40 (4), 454-458 (2006).
- Yang, Y. G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).
- Long, Y., et al. A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri. Frontiers in Microbiology. 13, 864963 (2022).
- Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen ('Candidatus Liberibacter asiaticus') using Cas12a-based methods. Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).
