Summary
이 연구에서는 CRISPR-Cas12a와 결합된 재조합 중합효소 증폭을 기반으로 하는 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스에 대한 빠르고 민감하며 휴대 가능한 검출 방법이 개발되었습니다.
Abstract
감귤류 재배자에 의한 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스(CLas)의 조기 발견은 조기 개입을 촉진하고 질병의 확산을 예방합니다. 재조합 효소 중합 효소 증폭과 군집된 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복/CRISPR 관련 12a(CRISPR-Cas12a) 시스템의 뉴클레아제 활성을 활용하는 형광 리포터를 결합한 신속하고 휴대 가능한 황룡빙(HLB) 진단을 위한 간단한 방법이 여기에 제시됩니다. 이 기술의 감도는 PCR보다 훨씬 높습니다. 또한, 이 방법은 잎 샘플을 사용했을 때 qPCR과 유사한 결과를 보였다. 기존의 CLas 검출 방법과 비교하여 여기에 제시된 검출 방법은 90 분 안에 완료 할 수 있으며 PCR 기계를 사용할 필요가없는 등온 조건에서 작동합니다. 또한 현장에서 휴대용 형광 검출 장치를 통해 결과를 시각화 할 수 있습니다.
Introduction
황룡빙(HLB)은 전 세계적으로 가장 문제가 되는 감귤류 질병 중 하나입니다1. HLB는 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스(CLas), Ca. L. 아프리카누스 및 Ca. L. 아메리카누스2를 포함하는 체관부 집락화 및 까다로운 박테리아 칸디다투스 리베리박터 종에 의해 발생합니다. 중국과 미국에서 가장 널리 퍼진 HLB 관련 종은 아시아 감귤류 프실라(Diaphorina citri) 또는 접목을 통해 전염되는 CLas입니다.3. CLas에 감염된 후 감귤 나무는 죽을 때까지 성장 감소를 보여줍니다2. CLas에 감염된 감귤류 잎의 일반적인 증상은 얼룩덜룩 한 얼룩, 녹색 섬 (작은 원형 짙은 녹색 점), 두껍고 가죽 같은 잎에 융기 된 코르키 정맥, 불균일 한 황변 싹2입니다. 또한 CLas에 감염된 과일은 작고 편향된 것처럼 보입니다2.
감귤류 품종은 HLB에 내성이 없고 HLB에 대한 치료법이 없기 때문에 HLB를 예방하려면 CLas 양성 감귤류 나무의 격리 및 분리가 필요합니다 2,3. 따라서 CLas의 확산을 방지하고 경제적 손실을 최소화하기 위해 모니터링 및 격리에 조기 발견이 중요합니다3. 또한, 감염 초기 단계에서 식물에서 CLas의 낮은 역가로 인해 민감한 CLas 검출이 필요합니다3. 중국에서 CLas 검출은 일반적으로 인증된 특정 테스트 센터에서 수행됩니다. 그러나 탐지 과정은 일반적으로 최소 1 주일이 걸리며 탐지 수수료가 비쌉니다. 따라서 HLB 발생률을 모니터링하는 데 도움이 됩니다.
HLB 4,5,6,7,8,9를 진단하기 위해 다양한 기술이 적용되었습니다. 중합효소연쇄반응(PCR) 및 정량적 PCR(qPCR)은 높은 감도와특이성으로 인해 CLas 검출에 가장 많이 사용되는 도구입니다4,5. 그러나 이러한 기술은 값비싼 기기와 고도로 숙련된 인력에 크게 의존합니다. 또한, 루프 매개 등온 증폭 (LAMP)과 같은 여러 등온 증폭 방법은 단순성, 신속성 및 저렴한 비용으로 인해 기존 PCR 방법에 대한 매력적인 대안으로 개발되었습니다 8,9,10. 그러나 비특이적 증폭 신호로 인해 CLas를 정확하게 검출하기 위해 이를 적용하는 것은 어렵고 위양성 결과를 유발할 수 있습니다.
RNA 유도 CRISPR/CAS(클러스터링된 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복/CRISPR 관련) 엔도뉴클레아제 기반 핵산 검출은 높은 감도, 특이성 및 신뢰성 11,12,13,14로 인해 차세대 분자 진단 기술로 개발되었습니다. 이러한 CRISPR/Cas 진단 기술은 Cas 단백질의 부수적인 뉴클레아제 활성에 의존하여 올리고뉴클레오티드의 각 말단에 있는 형광 리포터와 형광 소광제로 변형된 단일 가닥 DNA(ssDNA)를 절단하고 방출된 형광 리포터11,12를 캡처하는 형광 검출 장치에 의존합니다. . CRISPR RNA (crRNA) 표적 듀플렉스에 의해 활성화된 몇몇 Cas 이펙터의 뉴클레아제 활성은 주변의 비표적 ssDNA11을 무차별적으로 절단할 수 있다. 클래스 2 유형 V-A CRISPR/CAS 시스템인 CRISPR-Cas12a(Cpf 1이라고도 함)는 Cas9에 비해 낮은 불일치 허용 오차 및 더 큰 특이성13과 같은 몇 가지 이점을 보여줍니다. Cas12a/crRNA 시스템은 인간 병원체 및 식물병원체14,15,16,17,18의 핵산의 민감하고 특이적인 검출을 위해 적용되었습니다. 따라서 Cas12a/crRNA 시스템을 활용하면 CLas 핵산을 정확하고 민감하게 검출할 수 있습니다.
Cas12a 단독은 이론적으로 낮은 수준의 핵산을 검출할 만큼 민감하지 않습니다. 따라서 검출 감도를 향상시키기 위해 CRISPR-Cas12a 검출은 일반적으로 등온 증폭 단계14,15와 결합됩니다. 재조합 중합효소 증폭 (RPA)은 37°C 내지 42°C의 온도 범위에서 민감하고 신속한 등온 DNA 증폭을 가능하게 한다19.
Cas12a의 DNase 활성과 RPA 및 형광 판독을 결합한 DETECTR(DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter)라는 검출 플랫폼이 최근에 고안되었으며12 더 높은 감도의 핵산을 검출하는 것으로 나타났습니다20. 또한 양성 샘플에서 방출된 형광 신호는 현장에서 휴대용 형광 검출 장치를 통해 관찰할 수 있습니다.
RPA로 DNA를 증폭하고, CLas21에 특이적인 5카피 nrdB(리보뉴클레오티드 환원효소 β-서브유닛) 유전자를 표적으로 하는 crRNA를 설계하고, Cas12a 단백질의 DNase 활성을 사용했기 때문에 이를 CLas 검출 방법을 CLas-DETECTR라고 불렀습니다. 기존 CLas 검출 방법과 비교하여 CLas-DETECTR는 빠르고 정확하며 민감하고 배포가 가능합니다.
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Protocol
1. 클라스 탐정의 건설
참고: CLas-DETECTR의 구성은 용액 준비, 감귤류 총 DNA 분리, 등온 DNA 증폭 및 결과 시각화의 4단계 프로세스입니다. CLas-DETECTR 분석의 개략도는 그림 1A에 나와 있습니다.
- 용액 준비
- 완충액 A: 6% PEG 200 중 20 mM NaOH를 준비한다. 100mL의 경우 113mg의 NaOH와 6g의 PEG 200을 병에 80mL의 H2O에 넣습니다. 병을 모든 PEG 200이 용해될 때까지 60°C의 수조에서 인큐베이션한다. 그런 다음 H2O를 100mL의 부피에 첨가하십시오.
- 용액 B 준비: 각 반응에 대해 10μL의 RPA 완충액, 0.8μL의 F-RPA-RNRf, 0.8μL의 R-RPA-RNRr 및 3.9μL의ddH2O를 최종 부피 15.5μL에 추가합니다.
참고: F-RPA-RNRf 및 R-RPA-RNRr은 nrdB 유전자에 대한 분석에 사용되는 프라이머입니다. 순서는 표 1 을 참조하십시오. - 용액 C 준비: 각 반응에 대해 1μL의 ssDNA 리포터, 3μL의 NEB 완충액 3.1, 1μL의 crRNA, 4μL의 Cas12a 및 11μL의ddH2O를 최종 부피 20μL에 첨가합니다.
알림: 검출할 샘플이 많은 경우 많은 양의 용액 B와 용액 C를 만들고 나중에 부분 표본을 만드십시오.
- 감귤류 총 DNA 분리
참고: 시간을 절약하고 이 방법을 현장 CLas 검출에 적합하게 만들기 위해 알칼리성 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 기반 접근 방식을 사용하여 DNA 증폭을 위한 조식물 추출물을 얻었습니다.22,23- 감귤류 잎이이 프로토콜에 사용되었습니다. 먼저 잎에서 5 개의 잎 디스크를 펀칭합니다. 다음으로 잎 디스크를 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 넣고 200μL의 버퍼 A를 추가합니다.
알림: 현장에서 잎을 덮고있는 먼지가있는 경우 먼저 잎을 청소하십시오. 교차 오염을 방지하기 위해 1.5mL 튜브의 뚜껑을 사용하여 잎 디스크를 자를 수 있습니다. 뿌리, 줄기, 과일 및 꽃과 같은 다른 감귤류 조직도 이 프로토콜에 사용될 수 있습니다. - 플라스틱 막대로 부드러워 질 때까지 리프 디스크를 수동으로 연마하십시오.
- 튜브를 10분 동안 그대로 두십시오. 이어서, DNA 증폭을 위해 상청액을 사용한다.
참고 : 여기서 분석을 일시 중지 할 수 있으며 알칼리성 -PEG 방법으로 추출 된 조식물 추출물은 최소 20 년 동안 -1 ° C에서 보관할 수 있습니다. 비디오에 나오는 뉴홀 스위트 오렌지(Citrus sinensis Osbeck var. Newhall) 나무는 9/3/1(v/v/v) 이탄 토양/질석/펄라이트가 혼합된 화분에서 재배되었으며 중국 장시성 간난 사범대학 캠퍼스에 위치한 유리온실에서 관리되었습니다. HLB에 감염된 나무는 CLas 양성 뉴홀 새싹을 접목하여 접종했습니다. HLB 감염 및 HLB 비감염 트리를 PCR로 확인하였다. CLas는 CLas 특이적 마커 유전자 nrdB를 표적으로 하는 프라이머 쌍(F-RPA-RNRf/R-RPA-RNRr)을 사용하여 검출하였다. 반면에 특징적인 HLB 증상, 얼룩덜룩 한 얼룩 및 황변하는 잎은 CLas 양성 나무에서 발견 될 수 있지만 CLas 음성 나무에서는 발견되지 않습니다.
- 감귤류 잎이이 프로토콜에 사용되었습니다. 먼저 잎에서 5 개의 잎 디스크를 펀칭합니다. 다음으로 잎 디스크를 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 넣고 200μL의 버퍼 A를 추가합니다.
- 등온 DNA 증폭
- 단계 1.2.3으로부터의 상청액 1 μL와 MgOAc (14 mM 최종 농도) 1 μL를 용액 B에 첨가하고 잘 혼합한다.
- 실험실에서 37 ° C의 간단한 인큐베이터에서 15 분 동안 배양하십시오.
알림: 현장에서 튜브를 손에 들고 15분 동안 잡습니다. 또한 조건이 허용하는 경우 37 ° C의 간단한 인큐베이터에서 15 분 동안 튜브를 배양하는 것이 좋습니다.
- 결과 시각화
- 단계 1.3.2의 혼합물 10μL를 용액 C에 첨가하고 잘 혼합한다.
- 37 ° C 인큐베이터에서 60 분 동안 배양하십시오.
- 고글을 착용하고 휴대용 형광 검출 장치(여기 파장: 440nm, 발광 파장: 500nm)를 통해 5' 6-Fluorescein at 5'로 표지된 ssDNA 리포터와 3'에서 형광 소광제에서 방출되는 녹색 형광 신호를 관찰합니다.
참고: 녹색 형광 신호는 며칠 동안 지속될 수 있으므로
주의: 형광 검출 장치에서 방출되는 빛은 눈에 해롭습니다. 결과를 관찰하기 전에 고글을 착용하십시오.
2. 특이성 시험
참고: CLas-DETECTR의 특이성을 테스트하기 위해 실험실24에서 분리된 근권 박테리아 아그로박테리움 투메파시엔스 GV3101, 크산토모나스 시트리 아종 시트리(Xcc) 및 부르크홀데리아 스태빌리스 균주 1440을 CLas-DETECTR 테스트를 실시했습니다.
참고: 칸디다투스 리베리박터(CLas)는 배양할 수 없습니다. CLas에 감염된 감귤류 조직에서 게놈 DNA를 추출해야만 CLas DNA를 얻을 수 있습니다. Xcc 는 또 다른 중요한 감귤류 질병 인 감귤류 구내염의 원인 인자입니다. Burkholderia stabilis 균주 1440은 실험실에서 분리 된 항 Xcc 박테리아입니다. 따라서이 세 가지 박테리아 모두에 대한 순수한 균주가 사용되었습니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 박테리아 게놈 DNA 추출 키트를 사용하여 박테리아 게놈 DNA(gDNA)를 추출합니다. 물을 음성 대조군으로 사용하십시오.
- 1 μL의 F-RPA-RNRf, 1 μL의 R-RPA-RNRr, 12.5 μL의 Ex Taq 버전 2.0 플러스 염료, 1 μL의 DNA 주형 및 9.5 μL의 H 2 O를 포함하는 25 μL 반응 혼합물에서 광학 캡이 있는0.2mL PCR 튜브 스트립을 사용하여 PCR을 수행합니다.
- 다음의 열 사이클링 반응 조건을 사용한다: 98°C에서 1분; 98 °C에서 10 초, 55 °C에서 30 초, 72 °C에서 15 초의 35 사이클; 그런 다음 72°C에서 10분; 16 °C에서 유지하십시오.
- PCR 산물을 120V에서 15분 동안 1% 아가로스 겔에서 실행합니다.
- 0.8μL의 F-RPA-RNRf, 0.8μL의 R-RPA-RNRr, 10μL의 2x TB 그린 프리믹스 Ex Taq II(Tli RNaseH Plus), 1μL의 DNA 주형, 및 7.4μL의H2O를 포함하는 20μL 반응 혼합물에서 qPCR을 수행합니다.
- 다음의 열 순환 반응 조건을 사용하십시오: 95°C에서 30초; 95 °C에서 5 초 및 60 °C에서 32 초의 45 사이클; 이어서 95°C에서 15초, 60°C에서 1분, 95°C에서 15초의 용융 곡선 단계를 가한다.
- 각 반복에 세 가지 기술 반복을 포함합니다.
- 1.1–1.4단계에 따라 CLas-DETECTR 방법을 수행합니다.
3. 감도 비교
- CLas DETECTR의 민감도를 테스트하기 위해, 상기 설명된 바와 같이, PCR, CLas-DETECTR 및 qPCR을 사용하여 일련의 CLas DNA 단편 희석물을 검출한다.
- 4 μL의 F-RNR, 4 μL의 R-RNR, 50 μL의 PrimeSTAR Max Premix, 2 μL의 DNA 주형, 및 40 μL의H2O를 함유하는 100 μL 반응 혼합물에서 프라이머 세트 F-RNR 및 R-RNR을 사용하여 nrdB로부터 1,060 bp 길이의 DNA 세그먼트를 증폭시키고, 열 사이클링 반응 조건(98°C에서 30초; 이어서 98°C에서 10초씩 35사이클, 55 °C에서 15 초, 72 °C에서 30 초; 그런 다음 72°C에서 10분; 및 16°C에서 유지).
참고 : nrdB (리보 뉴클레오티드 환원 효소 β- 서브 유닛) 유전자는 CLas21에 특이 적입니다. 프라이머 세트 F-RNR 및 R-RNR을 사용하여 CLas 양성 감귤류 gDNA로부터 nrdB 앰플리콘을 쉽게 얻을 수 있습니다. 프라이머 세트 F-RNR 및 R-RNR은 1,060bp nrdB 단편을 증폭하는 반면, 프라이머 세트 F-RPA-RNR 및 R-RPA-RNR은 1,060bp nrdB 단편의 일부인 nrdB 유전자의 104bp 단편을 증폭한다. - 제조업체 설명서에 따라 DNA 젤 추출 키트로 PCR 제품을 정제합니다.
- nrdB 앰플리콘을 함유하는 PCR 산물을 멸균된ddH2O로 희석한다.
- 시판되는 온라인 DNA 복제 수와 희석 계산기를 사용하여 nrdB 유전자의 복제 수를 계산합니다.
- 2.01 × 106 카피 / μL, 2.01 × 105 카피 / μL, 2.01 × 104 카피 / μL, 2.01 × 103 카피 / μL, 2.01 × 10 2 카피 / μL, 2.01 × 10 1 카피 / μL, 2.01 × 100 카피 / μL 및 2.01 × 10-1 카피 / μL의 CLas DNA 단편을 포함하는 DNA 희석액을 준비합니다.
4. 샘플 검출
참고: 특이성 및 민감도 테스트 후 CLas-DETECTR 방법을 사용하여 중국 장시성 간난 사범 대학교 캠퍼스의 생식질 자원 보육원에서 자란 Newhall 달콤한 오렌지 나무에서 수집된 필드 잎 샘플에서 CLas의 존재를 감지했습니다. 결과를 확인하기 위해 qPCR을 수행하였다.
- 총 15 그루의 나무를 테스트하십시오. 물을 음성 대조군으로 사용하십시오.
- 위에서 설명한 대로 CLas-DETECTR 및 qPCR 방법을 수행합니다.
참고: 감귤류에서 CLas의 고르지 않은 분포 특성으로 인해 HLB 증상을 보이는 잎을 우선적으로 수집했습니다. 나무가 건강해 보이면 잎을 무작위로 수집CLas-DETECTR 시스템이 올바르게 작동합니다.
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Representative Results
여기에서는 RPA와 CRISPR-Cas12a 시스템을 결합하여 현장에서 HLB를 진단하는 휴대용 플랫폼인 CLas-DETECTR에 대해 설명했습니다. CLas-DETECTR의 스키마는 그림 1A에 나와 있습니다.
CLas의 존재가 PCR에 의해 확인 된 HLB 감염 및 HLB에 감염되지 않은 Newhall 트리 (그림 1B)의 잎 샘플 (그림 1C)을 CLas-DETECTR 테스트를 받았을 때, HLB 감염 샘플에서는 녹색 형광 신호가 보였지만 HLB 감염되지 않은 샘플 및 음성 대조군에서는 보이지 않았습니다 (그림 1D).
다른 박테리아에서 추출한 핵산을 사용하여 CLas-DETECTR의 특이성을 결정했습니다. CLas-DETECTR 분석에 사용된 F-RPA-RNRf 및 R-RPA-RNRr의 프라이머 세트는 PCR 및 qPCR에도 사용되었습니다. CLas 양성 감귤류 잎 gDNA를 사용하여 증폭했을 때 아가로스 겔 전기영동에서 밴드를 볼 수 있었지만 PCR 분석에서 다른 박테리아 gDNA는 볼 수 없었습니다(그림 2A). qPCR 분석에서 CLas의 평균 역치 주기 (Ct) 값은 24 ± 0.7인 반면, A. tumefaciens GV3101, Xcc 및 B. 안정화 균주 1440의 평균 Ct 값은 각각 38 ± 0.7, 39 ± 1.4 및 39 ± 0.7 이었습니다(그림 2B). 일반적으로 Ct 값이 38보다 크면 결과가 음수로 간주됩니다. 이러한 결과는 F-RPA-RNRf 및 R-RPA-RNRr 프라이머 쌍이 CLas에 특이적임을 입증한다. CLas-DETECTR 분석에서 CLas gDNA만이 녹색 형광 신호를 나타냈습니다. A. tumefaciens GV3101, Xcc 및 B. stabilis 균주 1440에서 추출한 gDNA는 그렇지 않았으며 (그림 2C), 이는 CLas-DETECTR가 CLas를 특이적으로 검출 할 수 있음을 의미합니다.
또한 일련의 CLas DNA 희석액을 사용하여 CLas-DETECTR의 민감도를 테스트했습니다. PCR은 2.01 × 102 copys / μL를 검출 할 수 있습니다 (그림 3A). 반면에 CLas-DETECTR는 2.01 × 100 copyes/μL를 검출할 수 있었으며, 이는 이것이 민감한 현장 진단으로 실행 가능하다는 것을 시사합니다(그림 3B). qPCR은 2.01 × 10-1 copyes/μL를 검출할 수 있었지만 Ct 값은 36보다 높았습니다(그림 3C). 따라서 CLas-DETECTR은 희석 앰플리콘을 사용할 때 기존 PCR보다 2배 더 민감하고 qPCR보다 1배 덜 민감합니다(그림 3).
마지막으로, 현장 샘플에 대한 CLas-DETECTR의 타당성을 조사하고 그 감도를 확립되고 민감한 핵산 검출 접근법21인 qPCR과 비교했습니다. 일반적으로 qPCR에 의한 CLas 검출의 Ct 값이 36보다 높으면 CLas 농도가 2.01 × 10-1 copyies/μL 미만이며 이는 매우 낮은 농도임을 의미합니다(그림 3C). 15개의 샘플 중 qPCR로 검출된 샘플 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 및 14의 Ct 값은 36 미만이었고 명백한 녹색 형광 신호가 관찰되었습니다(그림 4). 반면, qPCR에 의해 검출된 샘플 6, 7, 9, 12 및 15의 Ct 값이 결정되지 않은 경우, 녹색 형광 신호는 관찰되지 않았습니다(그림 4). 또한 qPCR로 검출된 샘플 5 및 샘플 11의 Ct 값이 36보다 높을 때 약한 녹색 형광 신호가 관찰되었습니다(그림 4). 결과는 우리 플랫폼이 현장에서 HLB 진단을 위한 빠르고 강력하며 민감한 도구임을 시사합니다.
| 아니요 | 이름 | 시퀀스 (5' 내지 3') | ||||||||||||
| 1 | crRNA1-nrdB | rUrArArUrUrUrCrUrArCrUrArGrUrArUrArUrArGrGrUrCrArUrCrCrUrUrCrCrArArUrCrUrT | ||||||||||||
| 2 | 에스에스디엔에이프큐 | FAM-TTTATTT-BHQ1 | ||||||||||||
| 3 | F-RPA-RNRf | AAAAGTCGCACCATGCTCCATGAAGCTACC | ||||||||||||
| 4 | R-RPA-RNRr | TGTTCACATGAGGGAGCATTTAACCACGAA | ||||||||||||
| 5 | F-RNR | ATGGCAAATAACACAGGATTAAGCCC | ||||||||||||
| 6 | R-RNR | TTAATCCCATTTCAACCCTGCTCC | ||||||||||||
표 1: 이 연구에 사용된 핵산. ssDNA-FQ는 5'에서 5' 6-FAM(플루오레세인)으로 표지된 단일 가닥 DNA이고 3'에서 형광 소광제 블랙홀 소광제 1(BHQ1)로 표지된 단일 가닥 DNA입니다. 약어: F = 형광 리포터; Q = 형광 소광제.
그림 1: CLas-DETECTR의 설계 및 검증. (A) CLas-DETECTR 분석의 개략도. 1단계: 빠른 gDNA 추출을 위해 6% PEG 200 중 20mM NaOH를 함유하는 완충액 A를 준비하고; 등온 DNA 증폭을 위한 각각의 반응에서 10 μL의 RPA 완충액, 0.8 μL의 F-RPA-RNRf, 0.8 μL의 F-RPA-RNRr 및 3.9 μL의ddH2O를 함유하는 용액 B; 형광 리포터 방출을 위한 각 반응에서 1μL의 ssDNA 리포터, 3μL의 NEB 완충액 3.1, nrdB를 표적으로 하는 1μL의 crRNA, 4μL의 Cas12a 및 11μL의ddH2O를 포함하는 용액 C. 2단계: 잎에서 펀칭한 5개의 잎 디스크를 사용하여 200μL의 완충액 A로 감귤류 총 DNA를 추출했습니다. 3단계: CLas 특이적 핵산을 용액 B에서 CLas 특이적 마커 유전자 nrdB를 표적으로 하는 프라이머 F-RPA-RNRf 및 R-RPA-RNRr을 사용하여 단계 2의 상청액 1μL 및 MgOAc 1μL를 37°C에서 15분 동안 증폭했습니다. 4단계: 용액 C와 단계 3의 혼합물 10 μL를 37°C에서 60분 동안 인큐베이션하고, 녹색 형광 신호를 휴대용 형광 검출 장치를 통해 관찰하였다. ssDNA-FQ를 5'에서 5' 6-FAM (플루오레세인) 및 3'에서 형광 소광제 블랙홀 소광제 1 (BHQ1)로 표지하였다. 약어: F = 형광 리포터; Q = 형광 소광제. (B) HLB에 감염된 나무 (왼쪽)는 얼룩덜룩 한 얼룩과 노란 잎을 보여 주지만 HLB에 감염되지 않은 나무 (오른쪽)는 녹색으로 보입니다. (c) CLas의 존재는 프라이머 쌍 F-RPA-RNRf 및 R-RPA-RNRr을 이용하여 확인하였다. (D) HLB-감염된 샘플은 녹색 형광 신호를 나타내는 반면, HLB-비감염 및H2O는 CLas-DETECTR 분석에서 그렇지 않다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: CLas-DETECTR의 특이성 테스트. (A) PCR 결과의 아가로스 겔 전기영동 결과, (B) qPCR 결과의 Ct 값, 및 (C) CLas 양성 뉴홀 잎 및 3개의 다른 박테리아로부터 추출한 gDNA를 이용하여 F-RPA-RNRf 및 R-RPA-RNRr의 프라이머 쌍으로 증폭한 CLas-DETECTR 결과. 다시,H2O는 음성 대조군으로서 작용하였다. M : DNA 사다리; CLas 양성 뉴홀 잎(1), 아 그로박테리움 튜메파시엔스 GV3101(2), 크산토모나스 시 트리 아종 시트리 (Xcc, 3) 및 우리 실험실에서 분리된 Burkholderia stabilis 균주 1440에서 추출한 gDNA(4). Ct 값은 표준 오차± 세 가지 기술 반복의 평균 Ct 값을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: CLas-DETECTR과 PCR 및 qPCR의 민감도 비교. (A) PCR, (B) CLas-DETECTR 및 (C) qPCR을 사용한 일련의 특정 CLas DNA 앰플리콘 희석액의 검출 분석. (a) 25 μL의 PCR 산물로부터, 5 μL를 겔에 로딩하였다. (B) 사진은 휴대용 형광 검출 장치 (여기 파장 : 440nm, 발광 파장 : 500nm)에서 방출되는 빛 아래에서 보호 고글을 통해 스마트 폰 카메라로 캡처되었습니다. 동일한 프라이머를 모든 분석에 사용하였다. CLas 특이적 nrdB 유전자를 표적으로 하는 프라이머 세트 F-RNR 및 R-RNR로 증폭된 길이 1,060bp의 정제된 PCR 산물을 H2O를 사용하여 2.01 × 106 카피/μL(1), 2.01 × 105 카피/μL(2), 2.01 × 104 카피/μL(3), 2.01 × 103 카피/μL(4), 2.01 × 102 카피/μL(5), 2.01 × 101 카피/μL(6), 2.01 × 100 부 / μL (7) 및 2.01 × 10-1 부 / μL (8). H2O는 음성 대조군으로 작용했습니다. M : DNA 사다리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 현장 샘플을 사용한 CLas 검출. 뉴홀 스위트 오렌지 나무로부터 수집된 15개의 잎 샘플에서 CLas는 상기 기재된 CLas-DETECTR 및 qPCR 분석에 의해 시험하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구는 RPA와 CRISPR-Cas12a 시스템을 결합한 CLas-DETECTR라는 이름의 CLas를 탐지하는 신속하고 이식 가능한 방법을 제시합니다. 워크플로는 그림 1에 나와 있습니다. CLas-DETECTR는 특이성과 민감도로 CLas를 검출합니다(그림 2 및 그림 3). 또한 CLas-DETECTR은 뉴홀 리프 샘플을 사용하여 qPCR과 동일한 감도로 CLas를 검출합니다(그림 4). 특히, 검출 결과는 실험실 기반 기기와 독립적인 휴대용 휴대용 장치를 통해 직접 시각화할 수 있으며, 이는 실시간 HLB 진단에 매우 중요합니다.
프로토콜에는 몇 가지 중요한 고려 사항이 있습니다. 첫째, CLas-DETECTR은 qPCR만큼 민감하므로 샘플링 과정에서 교차 오염을 엄격히 피해야 합니다. 반응 시약은 강렬한 햇빛에 노출되어서는 안됩니다. 최적의 결과를 얻으려면 모든 단계를 정확하게 따라야합니다. CLas-DETECTR 시스템이 현장에서 올바르게 작동하도록 CLas 특이적 유전자 단편을 포함하는 플라스미드인 양성 대조군을 포함해야 합니다. 마지막으로, 모든 CLas 관련 실험 폐기물은 생물학적 위험으로 처리되고 폐기 전에 오토클레이브되어야 합니다.
양성 대조군에 대한 형광 신호가 검출되지 않으면 반응 혼합물에 억제제가 존재할 수 있으며 시약을 변경해야 합니다. 그렇지 않으면, 형광이 너무 약해서 구별할 수 없는 경우, 배양 시간이 연장될 수 있고 배양 시간이 길어져 위양성을 유발할 수 있다.
기존 CLas 검출 방법에는 고가의 PCR 기계, 고정 작업 현장 및 숙련된 인력이 필요합니다. 그러나 여기에 제시된 방법을 통해 HLB는 감귤류 재배자를 포함한 광범위한 사람들이 현장에서 정확하고 민감하게 진단 할 수 있습니다.
그러나 CLas-DETECTR에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 감귤류 샘플은 프로토콜에서 직접 사용할 수 없으며 감귤류 gDNA를 추출해야합니다. 둘째, 일관된 결과를 위해 RPA와 Cas12a의 뉴클레아제 활성의 활성화를 위한 간단한 인큐베이터가 필요합니다. 셋째, 휴대용 형광 검출 장치를 통해 결과를 시각화해야 합니다. 결과를 직접 보여주기 위해 측면 흐름 스트립을 사용할 수 있지만 이는 증가할 것입니다.
잎 샘플을 이 프로토콜에서 테스트하였다. 미래에는 CLas-DETECTR을 적용하여 대 수리 및 프실라 샘플에서 CLas의 존재를 감지 할 수 있습니다. 또한 crRNA와 프라이머를 변경함으로써이 분자 진단 기술은 감귤류 구내염, 감귤류 부패 바이러스 및 감귤류 잎 단편화 바이러스와 같은 다른 감귤류 질병에도 사용될 수 있습니다. 우리가 CLas-DETECTR에 대해 작업하는 동안, 이 접근법은 또한 다른25에 의해 병렬로 CLas를 검출하는데 사용되었다.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 중국 국가 핵심 R & D 프로그램 (2021YFD1400805), 장시성 주요 과학 기술 R & D 프로그램 (20194ABC28007), 장시 교육부 프로젝트 (GJJ201449) 및 장시성 현대 농업 과학 연구의 공동 혁신 (JXXTCX2015002 (3 + 2) -003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Corning | 09319KE1 | China |
| Bacterial Genomic DNA Extraction Kit | Solarbio | D1600 | China |
| EnGen LbCas12a | TOLOBIO | 32104-01 | China |
| Ex Taq Version 2.0 plus dye | TaKaRa | RR902A | China |
| Handheld fluorescent detection device | LUYOR | 3415RG | China |
| Hole puncher | Deli | 114 | China |
| Magnesium acetate, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
| NaOH | SCR | 10019718 | China |
| NEB buffer 3.1 | NEB | B7203 | USA |
| PCR strip tubes | LABSELECT | PST-0208-FT-C | China |
| PEG 200 | Sigma | P3015 | USA |
| PrimeSTAR Max DNA Polymeras | TaKaRa | R045A | China |
| Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder | New England Biolabs | N0550S | USA |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820B | China |
| TwistAmp Basic | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
References
- Ma, W. X., et al. Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin. Nature Communications. 13 (1), 529 (2022).
- Bové, J. M. Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
- Wang, N., et al. The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control. Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).
- Kim, J. S., Wang, N. Characterization of copy numbers of 16S rDNA and 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus and the implication in detection in planta using quantitative PCR. BMC Research Notes. 2, 37 (2009).
- Maheshwari, Y., Selvaraj, V., Godfrey, K., Hajeri, S., Yokomi, R. Multiplex detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus" and Spiroplasma citri by qPCR and droplet digital PCR. PLoS One. 16 (3), e0242392 (2021).
- Deng, X., Zhou, G., Li, H., Chen, J., Civerolo, E. L. Nested-PCR detection and sequence confirmation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' from Murraya paniculata in Guandong, China. Plant Disease. 91 (8), 1051 (2007).
- Ding, F., Duan, Y., Yuan, Q., Shao, J., Hartung, J. S. Serological detection of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens. Scientific Reports. 6, 29272 (2016).
- Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Candidatus Liberibacter asiaticus, a causal agent of citrus Huanglongbing. The Plant Pathology Journal. 34 (6), 499-505 (2018).
- Ghosh, D. K., et al. Development of a recombinase polymerase based isothermal amplification combined with lateral flow assay (HLB-RPA-LFA) for rapid detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus". PLoS One. 13 (12), e0208530 (2018).
- Ravindran, A., Levy, J., Pierson, E., Gross, D. C. Development of a loop-mediated isothermal amplification procedure as a sensitive and rapid method for detection of 'Candidatus Liberibacter solanacearum' in potatoes and psyllids. Phytopathology. 102 (9), 899-907 (2012).
- Chertow, D. S.
- Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
- Gootenberg, J. S., et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 360 (6387), 439-444 (2018).
- Ding, X., et al. Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay. Nature Communications. 11 (1), 4711 (2020).
- Qian, W., et al. Visual detection of human metapneumovirus using CRISPR-Cas12a diagnostics. Virus Research. 305, 198568 (2021).
- Marques, M. C., et al. Diagnostics of infections produced by the plant viruses TMV, TEV, and PVX with CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13. ACS Synthetic Biology. 11 (7), 2384-2393 (2022).
- Lu, X., et al. A rapid, equipment-free method for detecting Phytophthora infestans in the field using a lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification assay. Plant Disease. 104 (11), 2774-2778 (2020).
- Lobato, I. M., O'Sullivan, C. K. Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances. Trends in Analytical Chemistry. 98, 19-35 (2018).
- Liang, M., et al. A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules. Nature Communications. 10 (1), 3672 (2019).
- Zheng, Z., et al. Unusual five copies and dual forms of nrdB in "Candidatus Liberibacter asiaticus": Biological implications and PCR detection application. Scientific Reports. 6, 39020 (2016).
- Chomczynski, P., Rymaszewski, M. Alkaline polyethylene glycol-based method for direct PCR from bacteria, eukaryotic tissue samples, and whole blood. BioTechniques. 40 (4), 454-458 (2006).
- Yang, Y. G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).
- Long, Y., et al. A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri. Frontiers in Microbiology. 13, 864963 (2022).
- Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen ('Candidatus Liberibacter asiaticus') using Cas12a-based methods. Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).
