Summary
I detta arbete utvecklades en snabb, känslig och portabel detektionsmetod för Candidatus Liberibacter asiaticus baserad på rekombinaspolymerasförstärkning i kombination med CRISPR-Cas12a.
Abstract
Tidig upptäckt av Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) av citrusodlare underlättar tidigt ingripande och förhindrar spridning av sjukdomar. En enkel metod för snabb och bärbar Huanglongbing (HLB) diagnos presenteras här som kombinerar rekombinaspolymerasförstärkning och en fluorescerande reporter som använder nukleasaktiviteten hos det grupperade regelbundet interspaced korta palindromiska upprepningar / CRISPR-associerade 12a (CRISPR-Cas12a) systemet. Känsligheten hos denna teknik är mycket högre än PCR. Dessutom visade denna metod liknande resultat som qPCR när bladprover användes. Jämfört med konventionella CLas-detektionsmetoder kan detektionsmetoden som presenteras här slutföras på 90 minuter och fungerar i ett isotermiskt tillstånd som inte kräver användning av PCR-maskiner. Dessutom kan resultaten visualiseras genom en handhållen fluorescerande detekteringsanordning i fältet.
Introduction
Huanglongbing (HLB) är en av de mest problematiska citrussjukdomarna i världen1. HLB orsakas av floemkoloniserande och krångliga bakterier Candidatus Liberibacter spp., inklusive Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus, och Ca. L. americanus 2. Den vanligaste HLB-associerade arten i Kina och USA är CLas, som överförs av asiatiska citruspsyllider (Diaphorina citri) eller genom ympning3. Efter att ha smittats av CLas visar citrusträd tillväxtminskning fram till döden2. De vanliga symptomen på citrusblad infekterade med CLas är fläckiga fläckar, gröna öar (små cirkulära mörkgröna prickar), upphöjda korkiga vener på tjockare och läderartade löv och icke-enhetliga gulnande skott2. Dessutom verkar frukter infekterade med CLas små och snedställda2.
Eftersom ingen citrussort är resistent mot HLB och det inte finns något terapeutiskt botemedel mot HLB, kräver förebyggande av HLB karantän och isolering av CLas-positiva citrusträd 2,3. Därför är tidig upptäckt avgörande för övervakning och karantän för att förhindra spridning av CLas och minimera ekonomiska förluster3. Dessutom behövs känslig CLas-detektion på grund av den låga titern av CLas i växter under det tidiga infektionsstadiet3. I Kina utförs CLas-detektering vanligtvis av vissa certifierade testcenter. Identifieringsprocessen tar dock vanligtvis minst 1 vecka och identifieringsavgiften är dyr. Därför, för att hjälpa till att övervaka HLB-incidensen
Olika tekniker har tillämpats för att diagnostisera HLB 4,5,6,7,8,9. Polymeraskedjereaktion (PCR) och kvantitativ PCR (qPCR) är de mest använda verktygen för CLas-detektion på grund av deras höga känslighet och specificitet 4,5. Dessa tekniker är dock starkt beroende av dyra instrument och högkvalificerad personal. Dessutom har flera isotermiska förstärkningsmetoder, såsom loopmedierad isotermisk förstärkning (LAMP), utvecklats som attraktiva alternativ till konventionella PCR-metoder på grund av deras enkelhet, snabbhet och låga kostnad 8,9,10. Det är dock utmanande att tillämpa dem för att exakt upptäcka CLas på grund av de icke-specifika förstärkningssignalerna, vilket kan orsaka falskt positiva resultat.
RNA-styrd CRISPR / Cas (grupperad regelbundet interspaced korta palindromiska upprepningar / CRISPR-associerade) endonukleasbaserad nukleinsyradetektering har utvecklats som nästa generations molekylära diagnostikteknik på grund av dess höga känslighet, specificitet och tillförlitlighet11,12,13,14. Dessa CRISPR/Cas-diagnostiktekniker förlitar sig på säkerhetsnukleasaktiviteten hos Cas-proteiner för att klyva enkelsträngat DNA (ssDNA) modifierat med en fluorescerande reporter och en fluorescenssläckare i varje ände av oligonukleotiderna, samt en fluorescensdetekteringsanordning för att fånga den frigjorda fluorescerande reportern11,12 . Nukleasaktiviteten hos flera Cas-effektorer som aktiveras av CRISPR RNA (crRNA) målduplex kan urskillningslöst klyva den omgivande icke-mål-ssDNA11. CRISPR-Cas12a (även kallat Cpf 1), ett klass 2-klass V-A CRISPR/CAS-SYSTEM, visar på flera fördelar jämfört med Cas9, såsom en lägre missmatchningstolerans och större specificitet13. Cas12a/crRNA-systemet har tillämpats för känslig och specifik detektion av nukleinsyrorna hos humana patogener och fytopatogener 14,15,16,17,18. Därför bör användning av Cas12a / crRNA-systemet möjliggöra noggrann och känslig detektion av nukleinsyran i CLas.
Cas12a ensam är inte teoretiskt känslig nog för att detektera låga nivåer av nukleinsyror. För att förbättra detektionskänsligheten kombineras därför CRISPR-Cas12a-detektion vanligtvis med ett isotermiskt förstärkningssteg14,15. Rekombinaspolymerasförstärkning (RPA) möjliggör känslig och snabb isotermisk DNA-förstärkning i ett temperaturområde från 37 °C till 42 °C19.
En detektionsplattform som heter DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) som kombinerar DNase-aktiviteten hos Cas12a med RPA och en fluorescensavläsning har nyligen utformats12 och har visat sig detektera nukleinsyra med högre känslighet20. Dessutom kan fluorescenssignalen som emitteras från de positiva proverna observeras genom en handhållen fluorescensdetekteringsanordning i fältet.
Eftersom vi förstärkte DNA med RPA, designade crRNA som riktade sig mot den femkopierade nrdB-genen (ribonukleotidreduktas β- subenhet) som är specifik för CLas21 och använde DNas-aktiviteten hos Cas12a-proteinet, kallade vi denna CLas-detektionsmetod CLas-DETECTR. Jämfört med befintliga CLas-detektionsmetoder är CLas-DETECTR snabb, exakt, känslig och distribuerbar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Konstruktion av CLas-DETECTR
OBS: Konstruktionen av CLas-DETECTR är en fyrstegsprocess: lösningsberedning, citrus total DNA-isolering, isotermisk DNA-förstärkning och resultatvisualisering. Schemat för CLas-DETECTR-analysen illustreras i figur 1A.
- Beredning av lösning
- Förbered buffert A: 20 mM NaOH i 6% PEG 200. För 100 ml, tillsätt 113 mg NaOH och 6 g PEG 200 till 80 mlH2Oi en flaska. Inkubera flaskan i ett vattenbad vid 60 °C tills alla PEG 200 är upplösta. Tillsätt sedanH2Otill en volym på 100 ml.
- Förbered lösning B: Tillsätt 10 μL RPA-buffert för varje reaktion, 0,8 μL F-RPA-RNRf, 0,8 μL R-RPA-RNRr och 3,9 μLddH2Otill en slutlig volym av 15,5 μL.
OBS: F-RPA-RNRf och R-RPA-RNRr är de primers som används i analysen mot nrdB-genen . Se tabell 1 för sekvensen. - Bered lösning C: För varje reaktion, tillsätt 1 μL ssDNA-reporter, 3 μL NEB-buffert 3,1, 1 μL crRNA, 4 μL Cas12a och 11 μLddH2Otill en slutlig volym av 20 μL.
OBS: Om det finns många prover att upptäcka, gör en stor volym lösning B och lösning C och alikvotera senare.
- Citrus total DNA-isolering
OBS: För att spara tid och göra denna metod lämplig för fält-CLas-detektion användes den alkaliska polyetylenglykolbaserade metoden (PEG) för att erhålla råa växtextrakt för DNA-amplifiering22,23- Citrusblad användes i detta protokoll. Stansa först fem bladskivor från ett blad. Lägg sedan bladskivorna i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och tillsätt 200 μl buffert A.
OBS: Rengör bladen först på fältet om det finns damm som täcker dem. Bladskivorna kan klippas med locket på 1,5 ml röret för att undvika korskontaminering. Andra citrusvävnader, såsom rötter, stjälkar, frukter och blommor, kan också användas i detta protokoll. - Slipa bladskivorna manuellt tills de är släta med en plaststav.
- Låt röret stå ostört i 10 min. Använd sedan supernatanten för DNA-förstärkning.
OBS: Analysen kan pausas här, och de råa växtextrakt som extraherades med alkalisk-PEG-metoden kan lagras vid −20 ° C i minst 1 år. Newhall söta apelsin (Citrus sinensis Osbeck var. Newhall) träd som visas i videon odlades i en kruka fylld med en blandning av 9/3/1 (v / v / v) torvjord / vermikulit / perlit och underhålls i ett växthus beläget på campus vid Gannan Normal University, Jiangxi, Kina. De HLB-infekterade träden ympades genom ympning med CLas-positiva Newhall-knoppar. De HLB-infekterade och HLB-oinfekterade träden bekräftades av PCR. CLas detekterades med hjälp av primerparet (F-RPA-RNRf/R-RPA-RNRr) riktat mot den CLas-specifika markörgenen nrdB. På andra sidan kan karakteristiska HLB-symtom, fläckig fläck och gulnande löv hittas på CLas-positiva men inte på CLas-negativa träd.
- Citrusblad användes i detta protokoll. Stansa först fem bladskivor från ett blad. Lägg sedan bladskivorna i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och tillsätt 200 μl buffert A.
- Isotermisk DNA-förstärkning
- Tillsätt 1 μl supernatant från steg 1.2.3 och 1 μl MgOAc (14 mM slutlig koncentration) i lösning B och blanda väl.
- I labbet inkuberar du dem i en enkel inkubator vid 37 °C i 15 minuter.
OBS: Håll rören i handen i fältet i 15 minuter. Det föreslås också att man inkuberar rör i en enkel inkubator vid 37 °C i 15 minuter om förhållandena tillåter det.
- Visualisering av resultat
- Tillsätt 10 μl av blandningen från steg 1.3.2 till lösning C och blanda väl.
- Inkubera dem i en 37 °C inkubator i 60 minuter.
- Använd skyddsglasögon och observera den gröna fluorescenssignalen som frigörs från ssDNA-reportern märkt med 5 '6-fluorescein vid 5' och fluorescenssläckaren vid 3' genom en handhållen fluorescerande detektionsanordning (excitationsvåglängd: 440 nm, emissionsvåglängd: 500 nm).
OBS:grön fluorescenssignal kan pågå i flera dagar, det är bättre att
VARNING: Ljuset som avges av fluorescensdetekteringsanordningen är skadligt för ögonen. Se till att bära skyddsglasögon innan du observerar resultaten.
2. Specificitetstest
OBS: För att testa specificiteten hos CLas-DETECTR utsattes rhizosfärbakterien Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) och Burkholderia stabilis stam 1440 isolerad i labb24 för CLas-DETECTR-testet.
OBS: Candidatus Liberibacter (CLas) kan inte odlas. Man kan bara få CLas-DNA från extraktionen av genomiskt DNA från citrusvävnader infekterade med CLas. Xcc är orsakssambandet till en annan viktig citrussjukdom, citrus canker. Burkholderia stabilis stam 1440 är en anti-Xcc-bakterie isolerad i labbet. Därför användes rena stammar för alla dessa tre bakterier
- Extrahera bakteriellt genomiskt DNA (gDNA) med hjälp av ett bakteriellt genomiskt DNA-extraktionssats enligt tillverkarens protokoll. Använd vatten som en negativ kontroll.
- Utför PCR med 0,2 ml PCR-rörremsor med optiska lock i en 25 μL reaktionsblandning innehållande 1 μL F-RPA-RNRf, 1 μL R-RPA-RNRr, 12,5 μL Ex Taq Version 2,0 plus färgämne, 1 μL DNA-mall och 9,5 μLH2O.
- Använd följande termiska cykelreaktionsförhållanden: 1 min vid 98 °C; följt av 35 cykler på 10 s vid 98 °C, 30 s vid 55 °C och 15 s vid 72 °C, därefter 10 min vid 72 °C, och håll vid 16 °C.
- Kör PCR-produkterna på 1% agarosgel vid 120 V i 15 min.
- Utför qPCR i en 20 μL reaktionsblandning innehållande 0,8 μL F-RPA-RNRf, 0,8 μL R-RPA-RNRr, 10 μL 2x TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus), 1 μL av DNA-mallen och 7,4 μL avH2O.
- Använd följande termiska cykelreaktionsbetingelser: 30 s vid 95 °C; följt av 45 cykler på 5 s vid 95 °C och 32 s vid 60 °C, och därefter ett smältkurvsteg på 15 s vid 95 °C, 1 min vid 60 °C och 15 s vid 95 °C.
- Inkludera tre tekniska upprepningar i varje upprepning.
- Utför metoden CLas-DETECTR enligt stegen 1.1–1.4.
3. Jämförelse av känslighet
- För att testa känsligheten hos CLas DETECTR, detektera en serie CLas DNA-fragmentutspädningar med PCR, CLas-DETECTR och qPCR, som beskrivits ovan.
- Förstärka ett DNA-segment med en längd av 1,060 bp från nrdB med hjälp av primeruppsättningen F-RNR och R-RNR i en 100 μL reaktionsblandning innehållande 4 μL F-RNR, 4 μL R-RNR, 50 μL PrimeSTAR Max Premix, 2 μL DNA-mall och 40 μLH2O, efter termiska cykelreaktionsbetingar (30 s vid 98 °C; följt av 35 cykler på 10 s vid 98 °C, 15 s vid 55 °C, 30 s vid 72 °C, därefter 10 min vid 72 °C, och håller vid 16 °C).
OBS: N rdB-genen (ribonukleotidreduktas β- subenhet) är specifik för CLas21. Man kan enkelt få nrdB-amplicon från CLas-positiv citrusgDNA med hjälp av primeruppsättningen F-RNR och R-RNR. Primeruppsättningen F-RNR och R-RNR förstärker ett 1,060 bp nrdB-fragment, medan primeruppsättningen F-RPA-RNR och R-RPA-RNR förstärker ett 104 bp-fragment av nrdB-genen, som är en del av 1,060 bp nrdB-fragmentet . - Rena PCR-produkterna med ett DNA-gelextraktionssats enligt tillverkarens manual.
- Späd PCR-produkterna som innehåller nrdB-amplikonerna med steriliseratddH2O.
- Beräkna kopieringsnumret för nrdB-genen med hjälp av kommersiellt tillgängligt DNA-kopieringsnummer online och utspädningskalkylator.
- Bereda DNA-utspädningar innehållande 2,01 × 106 exemplar/μl, 2,01 × 105 kopior/μl, 2,01 × 104 kopior/μl, 2,01 × 103 kopior/μl, 2,01 × 10 2 kopior/μl, 2,01 × 101 kopior/μl, 2,01 × 100 kopior/μl och2,01 × 10−1 kopior/μl CLas DNA-fragment.
4. Detektering av prover
OBS: Efter specificitets- och känslighetstestet användes CLas-DETECTR-metoden för att detektera närvaron av CLas i fältbladproverna som samlats in från Newhall söta apelsinträd som odlats i bakterieplasmaresursskolan på campus vid Gannan Normal University, Jiangxi, Kina. En qPCR utfördes för att verifiera resultaten.
- Testa totalt 15 träd. Använd vatten som en negativ kontroll.
- Utför metoderna CLas-DETECTR och qPCR enligt beskrivningen ovan.
OBS: På grund av de ojämna fördelningsegenskaperna hos CLas i citrus samlades blad som visar HLB-symtom som en prioritet. Om ett träd såg friskt ut samlades bladen slumpmässigtCLas-DETECTR-systemet fungerar korrekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här har vi beskrivit en portabel plattform, CLas-DETECTR, som kammar RPA- och CRISPR-Cas12a-systemen för att diagnostisera HLB i fält. Schemat för CLas-DETECTR illustreras i figur 1A.
När bladprover från de HLB-infekterade och HLB-oinfekterade Newhall-träden (figur 1B), för vilka förekomsten av CLas bekräftades av PCR (figur 1C), utsattes för CLas-DETECTR-testet, sågs en grön fluorescenssignal i det HLB-infekterade provet men inte i det HLB-oinfekterade provet och negativ kontroll (figur 1D).
Vi bestämde specificiteten hos CLas-DETECTR med hjälp av nukleinsyror extraherade från andra bakterier. Primeruppsättningen av F-RPA-RNRf och R-RPA-RNRr som användes i CLas-DETECTR-analysen användes också i PCR och qPCR. Ett band kunde ses i agarosgelelektroforesen när det förstärktes med hjälp av CLas-positiv citrusbladgDNA men inte annat bakteriellt gDNA i PCR-analyserna (figur 2A). I qPCR-analyserna var det genomsnittliga tröskelvärdet (Ct) för CLas 24 ± 0,7, medan de genomsnittliga Ct-värdena för A. tumefaciens GV3101, Xcc och B. stabilis stam 1440 var 38 ± 0,7, 39 ± 1,4 respektive 39 ± 0,7 (figur 2B). Vanligtvis anses resultatet vara negativt när Ct-värdet är högre än 38. Dessa resultat visar att primerparet F-RPA-RNRf och R-RPA-RNRr är specifika för CLas. I CLas-DETECTR-analysen visade endast CLas gDNA gröna fluorescenssignaler; gDNA extraherad från A. tumefaciens GV3101, Xcc och B. stabilis stam 1440 gjorde det inte (Figur 2C), vilket innebär att CLas-DETECTR kan detektera CLas specifikt.
Vi testade också känsligheten hos CLas-DETECTR med hjälp av en serie CLas DNA-utspädningar. PCR kunde detektera 2,01 × 102 kopior/μL (figur 3A). Å andra sidan kan CLas-DETECTR detektera 2,01 × 100 kopior/μL, vilket tyder på att detta är genomförbart som en känslig fältdiagnostik (figur 3B). qPCR kunde detektera 2,01 × 10−1 kopior/μL, men Ct-värdet var högre än 36 (figur 3C). Därför är CLas-DETECTR två storleksordningar känsligare än traditionell PCR och en storleksordning mindre känslig än qPCR när utspädda amplikoner används (figur 3).
Slutligen undersökte vi genomförbarheten av CLas-DETECTR för fältprover och jämförde dess känslighet med qPCR, en etablerad, känslig nukleinsyradetektionsmetod21. Vanligtvis betyder ett Ct-värde för CLas-detektion med qPCR högre än 36 att CLas-koncentrationen är mindre än 2,01 × 10−1 kopior/μL, vilket är en mycket låg koncentration (figur 3C). Bland de 15 proverna var Ct-värdet för proverna 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 och 14 som detekterades av qPCR mindre än 36, och uppenbara gröna fluorescenssignaler observerades (figur 4). Å andra sidan, när Ct-värdena för proverna 6, 7, 9, 12 och 15 detekterade av qPCR inte var bestämda, observerades inga gröna fluorescenssignaler (figur 4). Dessutom observerades svaga gröna fluorescenssignaler när Ct-värdena för prov 5 och prov 11 detekterade med qPCR var högre än 36 (Figur 4). Resultaten tyder på att vår plattform är ett snabbt, robust och känsligt verktyg för HLB-diagnostik inom området.
| Nej | Namn | Sekvens (5' till 3') | ||||||||||||
| 1 | crRNA1-nrdB | rUrArArUrUrUrCrUrArCrUrArGrUrGrUrArGrArUrUrCrCrArUrGrGrCrArUrUrCrGrArGrArGrArGrArGrArG | ||||||||||||
| 2 | ssDNA-FQ | FAM-TTTATTT-BHQ1 | ||||||||||||
| 3 | F-RPA-RNRf | AAAAGTCGCACCATGCTCCATGAAGCTACC | ||||||||||||
| 4 | R-RPA-RNRr | TGTTCACATGAGGGAGCATTTAACCCCACGAA | ||||||||||||
| 5 | F-RNR | ATGGCAAATAACACAGGATTAAGCCC | ||||||||||||
| 6 | R-RNR | TTAATCCCATTTCAACCCTGCTCC | ||||||||||||
Tabell 1: Nukleinsyra som används i denna studie. ssDNA-FQ är enkelsträngat DNA märkt med 5'6-FAM (Fluorescein) vid 5' och fluorescenssläckaren Black Hole Quencher 1 (BHQ1) vid 3'. Förkortningar: F = fluorescerande reporter; Q = fluorescenssläckare.
Bild 1: Design och validering av CLas-DETECTR. (A) Schematisk för CLas-DETECTR-analysen. Steg 1: Förbered buffert A innehållande 20 mM NaOH i 6% PEG 200 för snabb gDNA-extraktion; lösning B innehållande 10 μL RPA-buffert, 0,8 μL F-RPA-RNRf, 0,8 μL F-RPA-RNRr och 3,9 μLddH2Oi varje reaktion för isotermisk DNA-förstärkning; lösning C innehållande 1 μL ssDNA-reporter, 3 μL NEB-buffert 3.1, 1 μL crRNA riktad mot nrdB, 4 μL Cas12a och 11 μLddH2Oi varje reaktion för fluorescerande reporterfrisättning. Steg 2: Fem bladskivor stansade från blad användes för att extrahera citrusens totala DNA med 200 μL buffert A. Steg 3: De CLas-specifika nukleinsyrorna förstärktes med hjälp av primersna F-RPA-RNRf och R-RPA-RNRr riktade mot den CLas-specifika markörgenen nrdB i lösning B med 1 μL supernatant från steg 2 och 1 μL MgOAc vid 37 °C i 15 minuter. Steg 4: Lösning C med 10 μl av blandningen från steg 3 inkuberades vid 37 °C i 60 minuter, och den gröna fluorescenssignalen observerades genom en handhållen fluorescerande detektionsanordning. SSDNA-FQ märktes med 5' 6-FAM (Fluorescein) vid 5' och en fluorescenssläckare Black Hole Quencher 1 (BHQ1) vid 3'. Förkortningar: F = fluorescerande reporter; Q = fluorescenssläckare. (B) Det HLB-infekterade trädet (vänster) visar fläckiga fläckar och gula löv, men det HLB-oinfekterade trädet (höger) ser grönt ut. (C) Förekomsten av CLas bekräftades med hjälp av primerparet F-RPA-RNRf och R-RPA-RNRr. (D) Det HLB-infekterade provet visar gröna fluorescenssignaler, medan HLB-oinfekterade ochH2Ointe finns i CLas-DETECTR-testet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Testa CLas-DETECTR:s specificitet. (A) Agarosgelelektrofores av PCR-resultaten, (B) Ct-värdet för qPCR-resultaten och (C) CLas-DETECTR-resultaten förstärkta med primerparet F-RPA-RNRf och R-RPA-RNRr med användning av gDNA extraherat från CLas-positiva Newhall-blad och tre andra bakterier. Återigen fungeradeH2Osom en negativ kontroll. M: DNA-stege; gDNA extraherad från CLas-positiva Newhall-blad (1), Agrobacterium tumefaciens GV3101 (2), Xanthomonas citri subsp. Ct-värdet representerar det genomsnittliga Ct-värdet för tre tekniska upprepningar ± standardfel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Känslighetsjämförelse av CLas-DETECTR med PCR och qPCR. Detektionsanalys av en serie specifika CLas DNA-ampliconutspädningar med användning av (A) PCR, (B) CLas-DETECTR och (C) qPCR. (A) Från 25 μl av PCR-produkterna laddades 5 μL i gelén. (B) Bilderna togs med en smarttelefonkamera genom skyddsglasögon under ljuset från en handhållen fluorescerande detekteringsanordning (excitationsvåglängd: 440 nm, emissionsvåglängd: 500 nm). Samma primers användes i alla analyser. De renade PCR-produkterna med en längd av 1 060 bp förstärkta med primeruppsättningen F-RNR och R-RNR riktad mot den CLas-specifika nrdB-genen späddes ut med H2O i koncentrationer på 2,01 × 106 kopior/μl (1), 2,01 × 105 kopior/μl (2), 2,01 × 104 kopior/μl (3), 2,01 × 103 kopior/μl (4), 2,01 × 102 kopior/μl (5), 2,01 × 101 exemplar/μl (6), 2,01 × 100 exemplar/μl (7) och 2,01 × 10−1 exemplar/μl (8). H2O fungerade som en negativ kontroll. M: DNA-stege. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: CLas-detektion med fältprover. CLas i 15 bladprover som samlats in från Newhall söta apelsinträd testades av CLas-DETECTR och qPCR-analyser som beskrivs ovan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna studie presenterar en snabb och bärbar metod för att upptäcka CLas med namnet CLas-DETECTR, som kombinerar RPA- och CRISPR-Cas12a-systemen. Arbetsflödet illustreras i bild 1. CLas-DETECTR detekterar CLas med specificitet och känslighet (figur 2 och figur 3). Dessutom, med hjälp av Newhall-bladprover, detekterar CLas-DETECTR CLas med samma känslighet som qPCR (figur 4). I synnerhet kan detektionsresultaten visualiseras direkt via en handhållen bärbar enhet oberoende av laboratoriebaserade instrument, vilket är avgörande för HLB-diagnos i realtid.
Det finns flera viktiga överväganden till protokollet. För det första bör korskontaminering strikt undvikas i provtagningsprocessen, eftersom CLas-DETECTR är lika känslig som qPCR. Reaktionsreagenserna får inte utsättas för intensivt solljus. Alla steg måste följas exakt för att uppnå optimala resultat. En positiv kontroll, en plasmid som innehåller CLas-specifika genfragment, bör inkluderas för att säkerställa att CLas-DETECTR-systemet fungerar korrekt i fält. Slutligen bör allt CLas-relaterat experimentellt avfall behandlas som en biologisk fara och autoklaviseras före bortskaffande.
Om inga fluorescenssignaler detekteras för den positiva kontrollen kan det finnas hämmare i reaktionsblandningen och reagenserna måste ändras. Annars, om fluorescensen är för svag för att särskilja, kan inkubationstiden förlängas längre inkubationstid kan leda till falska positiva resultat.
De befintliga CLas-detekteringsmetoderna kräver dyra PCR-maskiner, fasta driftsplatser och utbildad personal. Metoden som presenteras här gör det dock möjligt för HLB att diagnostiseras exakt och känsligt i fältet av ett brett spektrum av människor, inklusive citrusodlare.
CLas-DETECTR har dock vissa begränsningar. För det första kan citrusprover inte användas direkt i protokollet, och citrusgDNA måste extraheras. För det andra krävs en enkel inkubator för RPA och aktiveringen av nukleasaktiviteten hos Cas12a för konsekventa resultat. För det tredje måste resultaten visualiseras genom en handhållen fluorescerande detekteringsanordning. Även om laterala flödesremsor kan användas för att visa resultaten direkt, skulle detta öka
Bladprover testades i detta protokoll. I framtiden kan CLas-DETECTR tillämpas för att detektera närvaron av CLas i periwinkles och psyllidprover. Dessutom, genom att ändra crRNA och primers, kan denna molekylära diagnostiska teknik också användas för andra citrussjukdomar, såsom citrus canker, citrus decay virus och citrus leaf fragmentation virus. Medan vi arbetar med CLas-DETECTR har detta tillvägagångssätt också använts för att upptäcka CLas parallellt av andra25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes ekonomiskt av Kinas nationella nyckel FoU-program (2021YFD1400805), Major Science and Technology R & D-programmet i Jiangxi-provinsen (20194ABC28007), Projekt från Jiangxi Education Department (GJJ201449) och Collaborative Innovation of Modern Agricultural Scientific Research i Jiangxi-provinsen (JXXTCX2015002 (3 + 2) -003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Corning | 09319KE1 | China |
| Bacterial Genomic DNA Extraction Kit | Solarbio | D1600 | China |
| EnGen LbCas12a | TOLOBIO | 32104-01 | China |
| Ex Taq Version 2.0 plus dye | TaKaRa | RR902A | China |
| Handheld fluorescent detection device | LUYOR | 3415RG | China |
| Hole puncher | Deli | 114 | China |
| Magnesium acetate, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
| NaOH | SCR | 10019718 | China |
| NEB buffer 3.1 | NEB | B7203 | USA |
| PCR strip tubes | LABSELECT | PST-0208-FT-C | China |
| PEG 200 | Sigma | P3015 | USA |
| PrimeSTAR Max DNA Polymeras | TaKaRa | R045A | China |
| Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder | New England Biolabs | N0550S | USA |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820B | China |
| TwistAmp Basic | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
References
- Ma, W. X., et al. Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin. Nature Communications. 13 (1), 529 (2022).
- Bové, J. M. Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
- Wang, N., et al. The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control. Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).
- Kim, J. S., Wang, N. Characterization of copy numbers of 16S rDNA and 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus and the implication in detection in planta using quantitative PCR. BMC Research Notes. 2, 37 (2009).
- Maheshwari, Y., Selvaraj, V., Godfrey, K., Hajeri, S., Yokomi, R. Multiplex detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus" and Spiroplasma citri by qPCR and droplet digital PCR. PLoS One. 16 (3), e0242392 (2021).
- Deng, X., Zhou, G., Li, H., Chen, J., Civerolo, E. L. Nested-PCR detection and sequence confirmation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' from Murraya paniculata in Guandong, China. Plant Disease. 91 (8), 1051 (2007).
- Ding, F., Duan, Y., Yuan, Q., Shao, J., Hartung, J. S. Serological detection of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens. Scientific Reports. 6, 29272 (2016).
- Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Candidatus Liberibacter asiaticus, a causal agent of citrus Huanglongbing. The Plant Pathology Journal. 34 (6), 499-505 (2018).
- Ghosh, D. K., et al. Development of a recombinase polymerase based isothermal amplification combined with lateral flow assay (HLB-RPA-LFA) for rapid detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus". PLoS One. 13 (12), e0208530 (2018).
- Ravindran, A., Levy, J., Pierson, E., Gross, D. C. Development of a loop-mediated isothermal amplification procedure as a sensitive and rapid method for detection of 'Candidatus Liberibacter solanacearum' in potatoes and psyllids. Phytopathology. 102 (9), 899-907 (2012).
- Chertow, D. S.
- Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
- Gootenberg, J. S., et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 360 (6387), 439-444 (2018).
- Ding, X., et al. Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay. Nature Communications. 11 (1), 4711 (2020).
- Qian, W., et al. Visual detection of human metapneumovirus using CRISPR-Cas12a diagnostics. Virus Research. 305, 198568 (2021).
- Marques, M. C., et al. Diagnostics of infections produced by the plant viruses TMV, TEV, and PVX with CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13. ACS Synthetic Biology. 11 (7), 2384-2393 (2022).
- Lu, X., et al. A rapid, equipment-free method for detecting Phytophthora infestans in the field using a lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification assay. Plant Disease. 104 (11), 2774-2778 (2020).
- Lobato, I. M., O'Sullivan, C. K. Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances. Trends in Analytical Chemistry. 98, 19-35 (2018).
- Liang, M., et al. A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules. Nature Communications. 10 (1), 3672 (2019).
- Zheng, Z., et al. Unusual five copies and dual forms of nrdB in "Candidatus Liberibacter asiaticus": Biological implications and PCR detection application. Scientific Reports. 6, 39020 (2016).
- Chomczynski, P., Rymaszewski, M. Alkaline polyethylene glycol-based method for direct PCR from bacteria, eukaryotic tissue samples, and whole blood. BioTechniques. 40 (4), 454-458 (2006).
- Yang, Y. G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).
- Long, Y., et al. A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri. Frontiers in Microbiology. 13, 864963 (2022).
- Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen ('Candidatus Liberibacter asiaticus') using Cas12a-based methods. Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).
