Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En strategi for undersøgelse af IL-9-producerende lymfoide celler i Nippostrongylus brasiliensis-infektionsmodellen

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/64075
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1
1Departamento de Biología Celular y del Desarrollo, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México
* These authors contributed equally

Summary

IL-9-ekspressive T- og ILC2-celler induceres under N. brasiliensis-infektion , men deres karakterisering er stort set blevet overset i den inficerede tarm på grund af deres lavfrekvente og differentielle kinetik. Denne protokol beskriver isoleringen af disse celler fra forskellige målorganer og bekræftelse af deres identitet via flowcytometri på forskellige infektionsstadier.

Abstract

IL-9 er et pleiotropt cytokin forbundet med forskellige processer, herunder antitumorimmunitet, induktion af allergiske patologier og immunresponset mod helminthinfektioner, hvor det spiller en vigtig rolle i udvisningen af parasitten. I en murinmodel af Nippostrongylus brasiliensis-infektion produceres IL-9 hovedsageligt af CD4 + T-lymfocytter og medfødte lymfoide celler, der findes i lungen, tyndtarmen og drænende lymfeknuder. I betragtning af de tekniske vanskeligheder, der er involveret i intracellulær farvning af IL-9, samt kompleksiteten ved at isolere hæmatopoietiske celler fra tyndtarmen ved infektion, er der et presserende behov for en omfattende, men ligetil protokol til analyse af ekspressionen af IL-9 i forskellige lymfoide og ikke-lymfoide væv i denne model. Protokollen beskrevet her skitserer kinetikken af IL-9 produceret af CD4 + T-celler og medfødte lymfoide celler i lungen og tyndtarmen, de vigtigste organer, der er målrettet mod N. brasiliensis, såvel som i mediastinale og mesenteriske lymfeknuder gennem hele infektionen. Derudover beskriver det antallet af larver, der er nødvendige for infektion, afhængigt af celletype og organ af interesse. Denne protokol har til formål at hjælpe med standardisering af assays for at spare tid og ressourcer ved at give mulighed for at fokusere på de specifikke celler, organer og sygdomsstadier af interesse i N. brasiliensis-infektionsmodellen.

Introduction

Hageorm er tarmparasitter, der inficerer ca. 700 millioner mennesker verden over, hovedsagelig i tropiske områder i underudviklede lande. Højintensive infektioner med Ancylostoma duodenale og Necator americanus, de mest almindelige hageormparasitter hos mennesker, forårsager anæmi og proteinmangel, der kan resultere i forsinket vækst og mental udvikling1. N. americanus og gnaverparasitten Nippostrongylus brasiliensis inducerer et prototypisk type 2-immunrespons i deres vært og deler ligheder i deres livscyklus. Derfor er infektion af mus med N. brasiliensis den mest almindeligt anvendte model for infektioner med hageorm. Trin 3 (L3) N. brasiliensis infektiøse larver bevæger sig fra huden til lungen i de første par timer efter infektion. Når de først er i lungen, bliver de L4 og vandrer op i luftrøret for at blive slugt, passere gennem maven og nå tarmen for at blive voksne (L5) inden for 4-5 dage. I tarmen lægger L5-orme æg, der udskilles i fæces for at genstarte parasittens livscyklus2.

Immunresponset induceret af N. brasiliensis er kendetegnet ved en stigning i flere type 2-cytokiner, herunder IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 og IL-13 sammen med eosinofili, basofili, bæger- og mastcellehyperplasi og øget IgG1- og IgE-produktion. De fleste af de undersøgelser, der forsøger at identificere og definere immunresponserne fremkaldt på N. brasiliensis-infektion , er centreret om rollen som IL-4 eller IL-13 i denne model3. Imidlertid var identifikationen og karakteriseringen af IL-9-ekspressive celler og funktionen af dette cytokin stort set blevet overset, indtil Licona-Limón et al. offentliggjorde den første undersøgelse, der viste en kritisk rolle for IL-9 i immunresponset mod N. brasiliensis. Ved hjælp af reportermus beskrev denne undersøgelse T-celler (for det meste T-hjælper 9) og type 2-medfødte lymfoide celler (ILC2'er) som de vigtigste cellulære undergrupper, der udtrykte IL-9 ved infektion4.

Isolering og karakterisering af immunceller fra helminthinficerede lunger er mulig og er blevet grundigt rapporteret 3,4. På grund af den iboende vævsremodellering og slimproduktion viste det sig imidlertid at være en teknisk udfordring at gøre det i den inficerede tarm, indtil den nylige offentliggørelse af Ferrer-Font et al.5. Gruppen skitserede en protokol til isolering og analyse af enkeltcellesuspensioner af immunundergrupper fra Heligmosomoides polygyrus-inficerede murintarme. Baseret på det har vi nu standardiseret en protokol til isolering og cytometrisk analyse af IL-9-ekspressive lymfoide celler fra N. brasiliensis-inficeret tarm. Derudover har vi etableret IL-9 kinetik fra forskellige cellulære kilder og anatomiske steder gennem hele infektionen.

Karakterisering af de forskellige cellepopulationer, der er involveret i denne infektion, er afgørende for en bredere forståelse af immunresponset på parasitten og dens interaktion med værten. Denne omfattende protokol giver en klar rute til at isolere og analysere IL-9-producerende celler fra ønskede organer på sygdomsstadier af interesse, hvilket giver mulighed for en kraftig forbedring af viden om disse cellers rolle i N. brasiliensis-infektion og parasitinfektioner generelt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg, der er beskrevet her, blev godkendt af Internal Committee for Animal Handling (CICUAL) ved Institute of Cellular Physiology, National Autonomous University of Mexico.

BEMÆRK: Et rutediagram over hele protokollen er vist i figur 1.

1. Opstaldning af mus

  1. Brug 8-10 uger gamle, hun- eller hangrupper af mus, der er anbragt i dyrefaciliteter med konstant temperatur og fugtighed i 12 timers lys/mørke cyklusser, med ad libitum adgang til vand og mad.
    BEMÆRK: Denne protokol bruger en IL-9 reportermusestamme i C57BL/6-baggrund, som tidligere beskrevet4; andre IL-9-reporterstammer kunne dog bruges 6,7,8 såvel som intracellulær IL-9-farvning med variable resultater9.

2. Infektion af mus

  1. Barber musenes ryg fra midten af kroppen til nær bunden af halen 1 dag før infektion. Brug af anæstetika er ikke afgørende.
  2. Hver mus podes subkutant med 200 levedygtige N. brasiliensis-larver i tredje trin (L3) i 100 μL fosfatbufret saltvand (PBS)10 i lænden, som tidligere beskrevet2,11, eller injiceres 100 μL PBS alene som kontrol. Ofre dyrene på dag 4, dag 7 eller dag 10 efter infektion.

3. Isolering af lunge-, tyndtarms-, mediastinale og mesenteriske lymfeknuder

  1. Aflive musen ved cervikal dislokation. Placer musen på ryggen og spray den med 70% ethanol. Lav et midterlinjesnit ved hjælp af en saks og åbn huden for at udsætte abdominale og thoraxområder.
    BEMÆRK: Isofluran kan anvendes som alternativ dødshjælpsmetode12. Kuldioxidkamre anbefales ikke, da CO2 fører til lungevævsskade og blødning13.
  2. Dyrkning af mediastinale lymfeknuder og lunger
    1. Lav et snit ved brystbenet og skær i en "V" form for at fjerne ribben og thoraxmuskler. Når brysthulen er eksponeret, skal du lokalisere mediastinale lymfeknuder ved siden af spiserøret under hjertet (se supplerende figur 1).
    2. Uddrag de mediastinale lymfeknuder og saml dem i 1 ml R-10-medium (tabel 1) i en 12-brønds kulturplade. Opbevares på is, beskyttet mod lys indtil behandling.
      BEMÆRK: Prøverne skal beskyttes mod lys for at undgå at reducere fluorescerende signal fra de reportermus, der anvendes i disse eksperimenter.
    3. Uddrag lungerne og saml dem i 1 ml R-10-medium i en 12-brønds kulturplade pr. Mus. Opbevares på is, beskyttet mod lys indtil behandling.
  3. Isolering af mesenteriske lymfeknudekæder og tyndtarm
    1. Udsæt bughulen, og flyt forsigtigt tyndtarmen til højre for at udsætte mesenteriallymfeknudekæden (MLN) langs tyktarmen.
    2. Brug tang til at fjerne MLN, rul det forsigtigt på et køkkenrulle og træk fedtet af.
    3. MLN overføres til 1 ml R-10-medium i en 12-brønds kulturplade. Opbevares på is, beskyttet mod lys indtil behandling.
    4. Skær tyndtarmen lige under pylorisk lukkemuskel og over cecum. Træk tarmen langsomt ud ved hjælp af tang, fjern det vedhæftede mesenteri og fedtvæv.
    5. Placer tyndtarmen på et køkkenrulle og fugt det generøst med PBS. Fjern Peyers pletter fra tyndtarmen med en saks.
      BEMÆRK: For at opretholde levedygtigheden skal du fjerne det resterende fedtvæv og holde tyndtarmen fugtig med PBS under hele processen.
    6. Skær tyndtarmen i længderetningen ved hjælp af en saks, og skub forsigtigt tangen over den åbne tarm for at fjerne fækalindholdet og slim.
    7. Hold tyndtarmen med tang, og vask den i 5 ml PBS på is ved forsigtigt at nedsænke den et par gange. Gentag to gange.
    8. Skær tyndtarmen i korte stykker (ca. 5 mm), og saml dem i et 50 ml konisk rør med 10 ml HBSS14 med 2% FBS (tabel 1). Fortsæt straks med at isolere intraepitel- og lamina propriaceller.

4. Fremstilling af enkeltcellesuspensioner fra tyndtarmen, lungen og lymfeknuderne

BEMÆRK: Det er ekstremt vigtigt at behandle maksimalt seks mus pr. Person, når man fremstiller enkeltcellesuspensioner fra tyndtarmen, da cellelevedygtigheden falder betydeligt med længere behandlingsperioder. Denne metode blev tilpasset fra Heligmosomoides polygyrus infektion mus model5.

  1. Forvarm rysteinkubatoren, R-20 medium, HBSS og HBSS-2 mM EDTA (tabel 1) ved 37 °C.
  2. Der fremstilles 10 ml tyndtarmsfordøjelsesmedium (tabel 1) pr. prøve.
  3. Ryst tarmstykkerne kraftigt fra trin 3.3.8 i hånden.
  4. Hver prøve filtreres gennem et nylonnet (ca. 10 cm x 10 cm) over en glastragt. Prøven vaskes ved at tilsætte 10 ml forvarmet HBSS over maskerne, og gennemstrømningen kasseres. Gentag endnu en gang.
    BEMÆRK: Brug et nyt net til hver prøve og genbrug det under hele proceduren.
  5. Fjern masken fra tragten, og saml prøven fra masken i et 50 ml konisk rør med 10 ml varm HBSS-2 mM EDTA (trin 4.1). Der inkuberes i 10 minutter ved 37 °C under omrystning ved 200 omdr./min.
  6. Der hvirvel i 10 s ved maksimal hastighed (3.200 o/min.) og filtreres prøven med maskerne over en glastragt, hvorved gennemstrømningen genvindes i et 50 ml konisk rør.
  7. Gentag trin 4.5 og 4.6 to gange, og genvind gennemstrømningen i det samme 50 ml koniske rør. De intraepitelceller er placeret i denne 30 ml fraktion. Gem det resterende væv.
  8. Enkeltcelle suspension præparat fra intraepitelceller
    1. Der centrifugeres 30 ml cellesuspension, genvundet i trin 4.7, ved 450 x g i 5 minutter ved stuetemperatur (RT). Supernatanten kasseres.
    2. Der tilsættes 5 ml PBS og centrifugeres ved 450 x g i 5 minutter ved RT. Supernatanten kasseres.
    3. Resuspender cellepellet i 3 ml RPMI 10% FBS-20 μg / ml DNase (tabel 1). Opbevares på is, beskyttet mod lys indtil cellefarvning.
  9. Enkeltcelle suspension forberedelse fra lamina propria celler
    1. Det resterende tyndtarmsvæv vaskes fra trin 4.7 ved at hælde over 10 ml varm HBSS gennem masken over tragten. Gentag vasken. Opsaml vævet fra masken i et 50 ml konisk rør med 10 ml tyndtarmsfordøjelsesmedium.
    2. Der inkuberes i 30 minutter ved 37 °C under omrystning ved 200 omdr./min. Vortex ved maksimal hastighed i 10 s hvert 5. minut.
    3. Tilsæt 10 ml FACS-EDTA-buffer (tabel 1) for at stoppe fordøjelsesreaktionen, og læg den på is.
    4. Hver prøve filtreres gennem en 100 μm cellesi ved hjælp af en serologisk pipette, og suspensionen genvindes i et 50 ml konisk rør anbragt på is.
    5. Der centrifugeres ved 600 x g i 6 minutter ved 4 °C.
    6. Supernatanten kasseres. Cellepillen vaskes med 5 ml PBS og centrifugeres ved 600 x g i 6 minutter ved 4 °C.
    7. Supernatanten kasseres, og cellepelletsen resuspenderes i 1 ml RPMI 10% FBS-20 μg/ml DNase. Opbevares på is, beskyttet mod lys indtil cellefarvning.
  10. Enkeltcelle suspension forberedelse fra lunge
    BEMÆRK: Hver lunge og tyndtarm skal behandles parallelt af to personer for at undgå forlængede håndteringstider, hvilket resulterer i lav cellelevedygtighed.
    1. Forbered 4 ml lungefordøjelsesmedium (tabel 1) pr. behandlet prøve.
    2. RPMI-substratet fjernes fra brønden indeholdende lungerne fra trin 3.2.3. Skær lungen i små stykker med fin saks.
    3. Overfør lungestykkerne til et 15 ml konisk rør med en spatel. Tilsæt 4 ml lungefordøjelsesmedium (tabel 1).
    4. Der inkuberes i 30 minutter ved 37 °C under omrystning ved 250 omdr./min. Når du er færdig, skal du holde på is, indtil hver prøve er behandlet.
    5. Hver prøve filtreres gennem en 100 μm cellesi, der er placeret i en enkelt brønd i en 6-brønds kulturplade. Dissocier vævet med et sprøjtestempel.
    6. Genvind hver prøve i et 15 ml konisk rør, og tilsæt 4 ml R-2-medium (tabel 1). Opbevares på is, mens de andre prøver behandles.
    7. Der centrifugeres ved 600 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres, og cellepelletsen resuspenderes i 1 ml R-5-substrat (tabel 1).
    8. Under centrifugering fremstilles 4 ml 27,5 % densitetsgradientopløsning (tabel 1) pr. prøve for at berige den hæmatopoietiske cellefraktion15,16. Denne strategi for enkeltcelleseparation er mere effektiv, omkostningseffektiv og mindre giftig sammenlignet med andre lignende densitetsgradientmedier17.
    9. Der tilsættes 4 ml 27,5 % densitetsgradientopløsning til 1 ml cellesuspension fra trin 4.10.7, og omrystes kraftigt.
    10. Tilsæt langsomt 1 ml R-5-medium (tabel 1) oven på den blandede suspension for at skabe to faser.
    11. Centrifuger ved 1.500 x g i 20 minutter ved RT med lav acceleration og bremsen slukket. Overhold ringen dannet mellem de to faser.
    12. Genvind ringen dannet mellem de to faser med en 1 ml mikropipette, og resuspender i 4 ml R-2-medium.
    13. Der centrifugeres ved 450 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres. Resuspender cellepellet i 1 ml ACK-buffer (tabel 1), og inkuber i 1 min ved RT.
    14. Der tilsættes 4 ml R-5-medium og centrifugeres ved 450 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres, og cellepelletsen resuspenderes i 1 ml R-10-medium. Opbevares på is, beskyttet mod lys indtil farvning til flowcytometri.
  11. Enkeltcelle suspension forberedelse fra lymfeknuder
    1. Lymfeknuderne fra trin 3.2.2 eller 3.3.3 anbringes mellem to stykker maske i et hul fra en 6-brønds kulturplade, og der adskilles dem fra et sprøjtestempel.
    2. Cellesuspensionen genvindes i et 1,5 ml konisk rør og centrifugeres ved 450 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    3. Supernatanten kasseres, og cellepelletsen resuspenderes i 1 ml R-10-medium. Opbevares på is, beskyttet mod lys indtil farvning til flowcytometri.
      BEMÆRK: Hvis klumper er synlige, filtreres prøven gennem en 100 μm cellesi.

5. Cellefarvning til flowcytometri (figur 2 og figur 3)

BEMÆRK: Lymfeknudecellesuspensionerne centrifugeres fra trin 4.11.3 ved 450 x g i 5 minutter ved 4 °C, og cellepelleten resuspenderes i 500 μL FACS-buffer (tabel 1).

  1. Cellefarvning til identifikation af ILC2'er (figur 3 og supplerende figur 2)
    BEMÆRK: Denne farvningsprocedure er specifik til identifikation af IL-9-ekspressive ILC2-celler.
    1. Plade 150 μL pr. lungeprøve (ca. 1,8 x 10 6 celler) fra trin 4.10.14 og 50 μL pr. lymfeknudeprøve fra trin 4.11.3 (ca. 0,7 x 106 og 2,2 x 106 celler til henholdsvis mediastinale og mesenteriske lymfeknudeprøver) i en 96-brønds konisk bundkulturplade. Der tilsættes 100 μL FACS-buffer, og centrifugeres ved 450 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    2. Plade 100 μL pr. tyndtarmsprøve (ca. 2,7 x 10 6 og 0,6 x 106 celler til henholdsvis intraepitel- og lamina propria-prøver) fra trin 4.8.3 og 4.9.7 i en 96-brønds konisk bundkulturplade. Der tilsættes 150 μL FACS-buffer og centrifugeres ved 450 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    3. Supernatanten kasseres, og hver cellepellet resuspenderes i 50 μl biotinyleret antistofcocktail (tabel 2) fortyndet i FACS-buffer. Inkuber i 30 minutter ved 4 °C beskyttet mod lys.
      BEMÆRK: Brug FACS-buffer med 20 μg/ml DNase til intraepitel- og lamina propria-prøver.
    4. Der tilsættes 150 μL FACS-buffer. Der centrifugeres ved 450 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    5. Supernatanten kasseres, og cellepelletsen resuspenderes i 200 μl FACS-buffer. Der centrifugeres igen, og supernatanten kasseres.
    6. Cellepillen resuspenderes i 50 μL antistof/pletcocktail (tabel 2), og den inkuberes i 30 minutter ved 4 °C beskyttet mod lys.
    7. Der tilsættes 150 μL FACS-buffer. Der centrifugeres ved 450 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    8. Supernatanten kasseres, og cellepelletsen resuspenderes i 200 μl FACS-buffer. Der centrifugeres igen, og supernatanten kasseres. Gentag vasken (trin 5.1.7), og kassér supernatanten.
    9. Resuspender cellepelleten i 300 μL FACS-buffer, og analyser ved flowcytometri.
    10. Til tyndtarms- og lungeprøverne skal du bruge gating-strategien: lymfocytter, enkeltceller, levende celler, hæmatopoietiske celler, CD90 + afstamningsceller, ST2 + celler og IL-9 + celler (figur 3A, B og supplerende figur 2A). Til lymfeknudeprøverne skal du bruge gating-strategien: levende celler, enkeltceller, CD90+ afstamningsceller, ST2+ celler og IL-9+ celler (supplerende figur 2B,C).
  2. Cellefarvning til identifikation af IL-9-producerende lymfocytter (figur 2 og supplerende figur 3)
    1. Overfør 800 μL pr. lungeprøve fra trin 4.10.14 til et 1,5 ml rør (ca. 14,6 x 106 celler). Der centrifugeres ved 450 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres.
    2. For lymfeknudeprøver, plade 400 μL af cellesuspensionen fra trin 4.11.3 (ca. 5,6 x 10 6 og 17,5 x 106 celler til henholdsvis mediastinale og mesenteriske lymfeknudeprøver) i en 96-brønds konisk bundplade i to trin.
      1. Der overføres først 200 μl, centrifugeres ved 450 x g i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten kasseres.
      2. Overfør yderligere 200 μL til den tilsvarende brønd. Der centrifugeres ved 450 x g i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten kasseres.
    3. Cellepillen resuspenderes i 50-400 μL antistof/pletcocktail (tabel 3), og inkuberes i 30 minutter ved 4 °C beskyttet mod lys.
      BEMÆRK: Lungeprøver skal resuspenderes i 400 μL, mediastinale lymfeknudeprøver i 50 μL og mesenteriallymfeknudeprøver i 100 μL af farvningscocktailen.
    4. Der tilsættes 150 μL FACS-buffer til mediastinale lymfeknudeprøver og 100 μL til prøverne af mesenteriallymfeknuder. Der centrifugeres ved 450 x g i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten kasseres.
    5. Lunge- og lymfeknudeprøverne vaskes ved at resuspendere pellets i henholdsvis 1 ml og 200 μL FACS-buffer. Der centrifugeres ved 450 xg i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres, og vasken gentages.
    6. Resuspender lungeprøverne i 600 μL FACS-buffer, og analyser dem ved flowcytometri. Brug gating-strategien: lymfocytter, enkeltceller, levende celler, hæmatopoietiske celler, CD4 + TCRβ + celler og IL-9 + celler (figur 2A).
    7. Resuspender lymfeknudeprøverne i 300 μL FACS-buffer og analyser ved flowcytometri. Brug gating-strategien: lymfocytter, enkeltceller, levende celler, CD4 + TCRβ + celler og IL-9 + celler (figur 2B og supplerende figur 3A).

6. Bestemmelse af det absolutte antal celler i enkeltcellesuspensioner

  1. Prøverne fra isoleringstrin 4.8.3, 4.9.7, 4.10.14 og 4.11.3 fortyndes med PBS i forholdet 1:20 (10 μL prøve + 190 μL PBS).
  2. 10 μL af hver fortyndet prøve fra trin 6.1 blandes med 10 μl trypanblåt. Læg 10 μL i et hæmocytometer, og tæl de levende celler under hensyntagen til hver fortynding.
  3. Der opnås det absolutte antal celler ved at gange procentdelen af populationen af interesse fra levende celler bestemt ved flowcytometri (levedygtighedsfarvestofnegative celler) med det samlede antal levende celler i enkeltcellesuspensionen efter isolering og dividere dette tal med 100 (supplerende figur 4, supplerende figur 5 og supplerende figur 6).
    Absolut tal = (Procentdel af populationen af interesse fra levende celler bestemt ved flowcytometri x Samlet antal levende celler i enkeltcellesuspensionen)/100

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mus blev subkutant injiceret med 200 L3 fase N. brasiliensis larver eller med PBS til skinkontrol. Antallet af larver, der anvendes i denne protokol, blev justeret for at isolere levedygtige celler fra lungerne, lymfoidt væv og tyndtarmen, i modsætning til tidligere rapporter, hvor højere belastninger af orme kun blev brugt til at detektere celler i lymfoide væv og lunger4. Lunger, mediastinale lymfeknuder, mesenteriske lymfeknuder og tyndtarmen blev høstet på dag 0, 4, 7 og 10 efter infektion til lymfocytisolering og karakterisering af IL-9-producerende populationer. I alt 27 mus blev brugt i to eller flere uafhængige eksperimenter, herunder ni kontroller og fire til seks N. brasiliensis-inficerede mus pr. Tidspunkt analyseret. Sham-inficerede kontroller blev inkluderet i hvert eksperiment for at opnå basale tal. Ved hjælp af denne protokol kan IL-9-producerende CD4 + T-celler (for det meste Th9-celler i denne model) isoleres fra lunge-, mesenteriske og mediastinale lymfeknuder til kvantificering og yderligere analyse.

Efter det naturlige infektionsforløb vurderede vi først frekvenserne af IL-9-producerende CD4+ T-lymfocytter (Th9), der er til stede i lungerne og mediastinale lymfeknuder (gatingstrategi vist i figur 2A og supplerende figur 3A). I begge organer steg Th9-frekvenserne begyndende på dag 4 og nåede et højdepunkt på dag 7 efter infektion (figur 2C), en stigning, der også blev observeret i Th9 absolutte tal (supplerende figur 4A, B). I mesenteriallymfeknuderne (gatingstrategi vist i figur 2B) var der en signifikant stigning i både frekvensen og det absolutte antal Th9-celler på dag 7 og 10 efter infektion (figur 2C og supplerende figur 4C) i overensstemmelse med tidligere rapporter4. Tilstedeværelsen af T-celler og ILC2'er blev bekræftet i intraepitel- og lamina propria-prøverne; Der blev imidlertid ikke observeret Th9-celler i disse tarmrum under hele infektionen (supplerende figur 3B,C).

Vi evaluerede derefter IL-9-ekspressive ILC2-celler i lymfoide og ikke-lymfoide væv hos inficerede mus (gating-strategi vist i figur 3A, B og supplerende figur 2). Vi observerede en signifikant stigning i frekvenserne af ST2+, IL-9- og ST2+, IL-9+, der udtrykte ILC2'er i lungerne på dag 7 efter infektion (figur 3C). Samtidig viste analyse af absolutte tal kun en statistisk signifikant stigning i ST2+ IL-9+ populationen på dag 7 efter infektion (supplerende figur 5A). I de mediastinale lymfeknuder (gatingstrategi vist i supplerende figur 2B) steg antallet af IL-9-ekspressive ILC2-celler (ST2+ IL-9+) signifikant på dag 10 efter infektion, mens det absolutte antal ST2+-celler viste en tendens til at stige, startende på dag 7 og fortsatte indtil dag 10 efter infektion (supplerende figur 6A,C).

IL-9+ ILC2-celler blev også fundet i tyndtarmens lamina propria og intraepitelrum (gatingstrategi vist i figur 3B og supplerende figur 2A). N. brasiliensis-infektion resulterede i en statistisk signifikant stigning i frekvenserne af ST2+ IL-9+ celler på dag 4 og ST2-IL-9+ populationer på dag 7 og 10 i lamina propria. I det intraepitelale rum blev der også observeret en signifikant ændring i frekvenserne af ST2+ IL9+ og ST2- IL-9+ celler på henholdsvis dag 7 og dag 10 efter infektion (figur 3C). Det er vigtigt, at selv med et relativt lavt antal larverbelastning forårsagede infektion med parasitten omfattende skade på tyndtarmen; derfor er analysen af IL-9-udtrykkende ILC2s absolutte tal teknisk umulig, hvilket forhindrer den nøjagtige kvantificering af denne population på grund af lave udbytter af levende celler (supplerende figur 5B, C). På den anden side afslørede analysen af mesenteriske lymfeknuder (gatingstrategi vist i supplerende figur 2C) en signifikant stigning i absolutte antal ST2+ IL-9-, ST2+ IL-9+ og ST2-IL-9+ ILC2-celler på dag 10 efter infektion (supplerende figur 6D), som tidligere rapporteret4. I mellemtiden blev der ikke observeret nogen forskel i hyppigheden af disse populationer under hele infektionen (supplerende figur 6B). Disse forskellige undergrupper af ST2- og IL-9-ekspressive celler er spændende populationer med potentielt forskellige roller in vivo og kan svare til naturlige versus inflammatoriske ILC2'er som for nylig beskrevet 18,19,20,21. Dette skal dog behandles i fremtidige undersøgelser.

Sammenfattende justerede vi denne protokol til genopretning af IL-9-ekspressive celler fra N. brasiliensis-inficeret tarm, mens vi stadig var i stand til at opdage dem i lungen og lymfoidvævet. Hentning af immunceller fra parasitinficerede tarme har vist sig at være teknisk vanskelig. Her resulterede et justeret antal larver, der blev brugt til infektion, i forbedret tarmvævsintegritet, der muliggjorde genopretning af en IL-9+ population. Så vidt vi ved, er dette den første protokol, der er udviklet specifikt til analyse af IL-9-ekspressive celler i tarmen under N. brasiliensis-infektion. Ikke desto mindre kan andre immunceller også isoleres ved at følge disse trin. De data, der præsenteres her, viser, at de fleste vævsresidente IL-9-ekspressive celler i tyndtarmen er ILC2'er.

Figure 1
Figur 1: Rutediagram over den beskrevne protokol. Skematisk diagram med de vigtigste trin, der anvendes til behandling af forskellige organer, og de forventede opnåede IL-9-ekspressive celleundergrupper. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Th9-celler findes i lunger, mediastinale og mesenteriske lymfeknuder i hele N. brasiliensis-infektion. Repræsentativ flowcytometrianalyse og gating-strategi anvendt til Th9-celleidentifikation fra (A) lunger og (B) mesenteriske lymfeknuder. Enkeltcellesuspensioner fra hvert organ blev farvet med et fikserbart levedygtighedsfarvestof, fluorescerende mærket anti-CD45 til identifikation af hæmatopoietiske celler og anti-T-cellereceptor (TCR) β og anti-CD4 til identifikation af CD4 + T-lymfocytter. GFP + -signalet angiver procentdelen af Th9 -celler, der er til stede. Den første port viser sidespredning (SSC)-A/forward scatter (FSC)-A-egenskaber med lymfoide cellers klassiske morfologi. Enkeltcellehændelser blev valgt, efterfulgt af levende celler og derefter CD45+ celler. Inden for denne population fokuserede vi på TCR-β og CD4 dobbeltpositive celler, hvorfra GFP + celler blev identificeret som Th9-celler. Farvningen af lymfeknuder omfattede ikke anti-CD45-antistoffet, da hele befolkningen forventes at være positiv. (C) Frekvenser af Th9-celler fundet i lunger, mediastinale og mesenteriske lymfeknuder på de angivne tidspunkter efter infektion. Data repræsenterer den gennemsnitlige ± SEM for en eller to mus analyseret pr. Gruppe fra tre uafhængige eksperimenter pr. Tidspunkt; Uparret T-test; *p≤ 0,05, **p≤ 0,001, ***p≤ 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: IL-9-producerende ILC2-celler findes i ikke-lymfoide organer. Repræsentativ flowcytometrianalyse og gating-strategi anvendt til identifikation af IL-9 + ILC2-celler fra (A) lunge og (B) tyndtarmlamina propria. Enkeltcellesuspensioner fra hvert organ blev markeret med biotinylerede antistoffer for at identificere afstamningsceller (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 og anti-Ter119) og Fc-Block. Cellesuspensioner blev derefter farvet med fikserbart levedygtighedsfarvestof, fluorkrommærket streptavidin, anti-CD45 til identifikation af hæmatopoietiske celler og anti-CD90 til identifikation af ILC2-celler. Den første port viser scatter (SSC)-A/side scatter (FSC)-A egenskaber med den klassiske morfologi af lymfoide celler. Enkeltcellehændelser blev valgt, efterfulgt af levende celler og derefter CD45+ celler. Inden for denne population fokuserede vi på CD90+ linceller; fra denne gruppe evaluerede vi ST2- og GFP-ekspression for at identificere IL-9+ ILC2-celler. (C) Frekvenser af ILC2-celler fundet i lunger, lamina propria og det intraepitelcellerum på de angivne tidspunkter efter infektion. Data repræsenterer den gennemsnitlige ± SEM for en eller to mus analyseret pr. Gruppe fra tre uafhængige eksperimenter pr. Tidspunkt; uparret T-test; *p ≤ 0,05. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Liste over kemiske opløsninger og deres sammensætninger. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Antistofcocktail til identifikation af IL-9-producerende ILC2-celler. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: Antistofcocktail til identifikation af IL-9-producerende T-lymfocytter. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende figur 1: Skematisk repræsentation af mediastinale lymfeknuders placering. Oprettet i BioRender.com Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Repræsentativ flowcytometri og gating-strategi anvendt til at identificere IL-9+ ILC2'er i intraepitelceller fra tyndtarmen og lymfeknuderne. (A) Enkeltcellesuspensioner fra tyndtarmens intraepitelceller blev først inkuberet med biotinmærkede antistoffer for at vælge afstamningsceller (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 og anti-Ter119) og Fc-Block. Dette blev efterfulgt af farvning med et fikserbart levedygtighedsfarvestof, fluorkrommærket streptavidin, anti-CD45 til identifikation af hæmatopoietiske celler og anti-CD90 til identifikation af ILC2-celler. Den første port viser sidespredning (SSC)-A/forward scatter (FSC)-A-egenskaber med lymfoide cellers klassiske morfologi. Enkeltcellehændelser blev valgt, efterfulgt af levende celler og derefter CD45+ celler. Inden for denne population fokuserede vi på CD90+ linceller; fra denne gruppe blev GFP + celler identificeret som IL-9 + ILC2 celler. (B,C) Repræsentativ flowcytometri og gatingstrategi for (B) mediastinale lymfeknuder og (C) mesenteriske lymfeknuder til identifikation af IL-9 + ILC2-celler. Farvning af lymfeknuder inkluderede ikke anti-CD45-antistoffet, da hele befolkningen forventedes at være positiv. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3: Repræsentativ flowcytometrianalyse og gating-strategi, der anvendes til at identificere Th9-celler i mediastinale lymfeknuder og tyndtarmen. Enkeltcellesuspensioner fra (A) mediastinale lymfeknuder blev farvet med et fikserbart levedygtighedsfarvestof og fluorescerende mærket anti-TCR-β og anti-CD4-antistoffer. Den første port viser sidespredning (SSC)-A/forward scatter (FSC)-A-egenskaber med lymfoide cellers klassiske morfologi. Enkeltcellehændelser blev valgt, efterfulgt af levende celler og derefter TCR-β og CD4 dobbeltpositive celler; fra denne gruppe blev GFP + celler identificeret som Th9-celler. En lignende flowcytometristrategi blev anvendt til (B) lamina propria og (C) intraepitelceller fra tyndtarmen, bortset fra at CD45+ celler blev udvalgt efter de levende celler, efterfulgt af TCR-β og CD4 dobbeltpositive celler, hvorfra GFP + celler blev identificeret som Th9-celler. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 4: Det absolutte antal Th9-celler ændres signifikant gennem infektionen. Absolutte antal IL-9+ celler fra TCR-β og CD4 dobbeltpositive celler blev bestemt på dag 0, 4, 7 og 10 efter infektion i (A) lunge, (B) mediastinale lymfeknuder og (C) mesenteriske lymfeknuder. Data repræsenterer den gennemsnitlige ± SEM for en eller to mus analyseret pr. Gruppe fra tre uafhængige eksperimenter pr. Tidspunkt; uparret T-test *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,001, ***P ≤ 0,0001. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 5: Det absolutte antal IL-9+ ILC2-celler varierer gennem hele infektionen. Absolutte antal IL-9+ ILC2-celler fra lin-CD90+-populationen på dag 0, 4, 7 og 10 efter infektion blev bestemt i (A) lunge, (B) lamina propria og (C) intraepitelceller fra tyndtarmen. Data repræsenterer den gennemsnitlige ± SEM for en eller to mus analyseret pr. Gruppe fra tre uafhængige eksperimenter pr. Tidspunkt; uparret T-test *p ≤ 0,05. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 6: Frekvenser og absolutte antal IL-9+ ILC2-celler i lymfeknuder øges signifikant under infektion. (A) Hyppighed og (C) absolutte antal IL-9+ ILC2-celler fra mediastinale lymfeknuder. (B) Hyppighed og (D) absolutte antal IL-9+ ILC2-celler fra mesenteriske lymfeknuder. Værdier blev bestemt som IL-9+ ILC2-celler i lin-CD90+-populationen på dag 0, 4, 7 og 10 efter infektion. Data repræsenterer den gennemsnitlige ± SEM for en eller to mus analyseret pr. gruppe fra tre uafhængige eksperimenter pr. tidspunkt;uparret T-test *p ≤ 0,05, ***p ≤ 0,0001. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 7: Flowcytometrianalyse af IL-9, der udtrykker ILC2-celler fra N. brasiliensis-inficeret tarm. Repræsentative plots af ILC2-celler isoleret fra tarmen hos IL-9-reportermus på dag 7 efter infektion. IL-9-ekspression blev vurderet i ILC2-celler, der var nyligt isoleret fra de intraepitel- eller lamina propria-rum hos inficerede reportermus (IL-9 REP) versus efter den tidligere beskrevne IL-9 intracellulære farvningsprotokol 9 (IL-9 AB ved anvendelse af en IL-9-antistofklon RM9A4, BioLegend). For at identificere IL-9-udtrykkende ILC2'er blev enkeltcellesuspensioner først inkuberet med biotinmærkede antistoffer for at vælge afstamningsceller (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 og anti-Ter119) og Fc-Block, efterfulgt af farvning med fleksibelt levedygtighedsfarvestof, fluorkrommærket streptavidin, anti-CD45 og anti-CD90. Plottene viser IL-9-ekspressive ILC2-celler gated på lin-CD45 + CD90+ populationen, der er til stede i det intraepitelale (A,B) og lamina propria (C,D) rum, detekteret via reportersignalet fra nyligt isolerede celler (A,C) eller efter intracellulær farvning af IL-9 (B,D). Kontrolmus blev injiceret med PBS. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En fuldstændig forståelse af intestinale parasit-værtsinteraktioner og immunresponser på helminthinfektion kræver identifikation og analyse af de forskellige cellepopulationer og effektormolekyler, der er nøglen til induktion af vævsremodellering og ormudvisning. Jordoverførte helminthinfektioner udgør et stort problem i udviklingslande over hele verden. Indtil for nylig var en protokol, der tillod analyse af sjældne cellepopulationer, der var til stede i tyndtarmen, det vigtigste organ, der var påvirket af denne infektion, imidlertid ikke tilgængelig5. Denne protokol dækker tidligere beskrevne metoder, der tillader flowcytometrisk analyse af IL-9-ekspressive lymfoide celler i lungen, mediastinale og mesenteriske lymfeknuder under N. brasiliensis-infektion med den yderligere fordel ved identifikation af denne population for første gang i tyndtarmen.

Succesen med denne protokol er meget afhængig af vævsbehandlingstider. Det er bydende nødvendigt at behandle maksimalt seks tyndtarmsprøver pr. Person på én gang. Hvis forskellige organer skal behandles, anbefaler vi, at det gøres parallelt af en anden person. Ved at anvende en relativt lav parasitbelastning (200 L3-larver) muliggør denne protokol isolering af lymfoide celler fra den N. brasiliensis-inficerede tarm, samtidig med at evnen til at isolere disse celler fra andre organer opretholdes. Anvendelsen af højere parasitbelastninger bringer kvaliteten og mængden af celler isoleret fra tyndtarmen i fare (data ikke vist); Det kan dog resultere i en signifikant stigning i IL-9-ekspressive lymfoide celler i andre organer4. Ved behandling af tarm og mesenteriske lymfeknuder er det afgørende at fjerne det klæbende fedtvæv, da undladelse af at gøre det resulterer i øget celledød. Dataene understøtter observationen om, at det naturlige infektionsforløb negativt påvirker det absolutte antal lymfoide celler, der genvindes fra tyndtarmen. I de undersøgelser, der er beskrevet her, forbliver frekvenserne af IL-9 + ILC2-celler konsistente, mens absolutte tal viser høj variabilitet i hvert uafhængigt eksperiment. Derfor kan konklusioner fra absolutte tal være unøjagtige og bør undgås. I betragtning af den lave frekvens af IL-9-ekspressive T-celler i væv anbefales erhvervelse og farvning af det højest mulige antal celler.

En begrænsning af denne ILC2-analyse er brugen af en diskret kombination af markører til at definere denne population. Afhængigt af interessevævet og infektionsfasen kan yderligere markører, såsom CD25, Klrg1 og ST2 blandt andre, anvendes til en mere detaljeret fænotypisk karakterisering af ILC2-celler22. Vi anerkender, at den protokol, der præsenteres her, er baseret på INFER reporter-musestamme4 og kan udgøre en fordel for identifikation af IL-9-ekspressive celler. Vi forventer dog, at de resultater, der findes her, kan opnås ved hjælp af alternative strategier, herunder brugen af andre musereporterstammer og intracellulær IL-9-farvning 6,7,8,9. Det er vigtigt at nævne, at brug af konventionelle mus og udførelse af intracellulær farvning af IL-9 i intraepitel- og lamina propria-celler kan resultere i at miste ethvert detekterbart signal og kompromittere de opnåede data (supplerende figur 7). Dette kan skyldes den langsigtede manipulation, der kræves for at plette en delmængde, der allerede er svær at isolere og vedligeholde ex vivo. Derfor anbefaler vi brugen af reportermusestammer for at reducere behandlingstider og sikre en pålidelig analyse af IL-9-ekspression in vivo. Vi anerkender også det faktum, at Th9-celler ikke er de eneste T-celler, der udtrykker IL-923; I denne parasitiske model forventer vi imidlertid ikke, at andre delmængder udtrykker det. Ikke desto mindre er en fuldstændig karakterisering af type 2-cytokiner sammen med anvendelsen af transkriptionelle markører mulig for at kassere tilstedeværelsen af andre IL-9-ekspressive undergrupper i den beskrevne sammenhæng.

Kvantificeringen af IL-9-ekspressive lymfoide celler før dag 5 efter infektion er tidligere rapporteret; Det resulterer dog i meget lave cellefrekvenser4. Protokollen i denne undersøgelse dækker en stor del af N. brasiliensis-infektionskinetik indtil begyndelsen af parasitclearance2. Vi bemærkede imidlertid, at nogle af cellepopulationerne i denne undersøgelse ikke vendte tilbage til basale niveauer inden for den analyserede tidsramme, hvilket tyder på, at undersøgelsen kunne drage fordel af udvidede tidspunkter for at få et fuldt perspektiv på disse cellers adfærd i et mere avanceret stadium af infektionen in vivo. Uanset hvad mener vi, at det arbejde, der præsenteres her, kan tjene som en referencevejledning for forskere, der er interesserede i at studere IL-9-ekspressive lymfoide celler i parasitinfektionsmodeller, så de kan vælge den ideelle infektionsfase til påvisning af de specifikke celletyper fra væv af interesse. Alt i alt vil de metoder, der er beskrevet her, være nyttige til at vurdere fænotypen og funktionen af T-lymfocytter og ILC2-celler, der udtrykker IL-9 under en fysiologisk relevant model af parasitinfektion, udvide vores viden om disse celler og potentielt forbedre vores forståelse af dem under andre patologiske tilstande.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker at anerkende José Luis Ramos-Balderas for hans tekniske støtte. Dette arbejde blev støttet af følgende tilskud til PLL fra CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). OM-P og EO-M modtog et stipendium fra CONACYT (henholdsvis 736162 og 481437). MCM-M modtog et stipendium fra CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACK buffer Homemade
Attune Nxt cytometer Thermofisher
B220 Biolegend 103204
CD11b Biolegend 101204
CD11c  Biolegend 117304
CD19  Biolegend 115504
CD4 Biolegend 100404
CD4 (BV421) Biolegend 100443
CD45.2 Biolegend 109846
CD8  Biolegend 100703
CD90.2 Biolegend 105314
Collagenase D Roche 11088866001
DNAse I Invitrogen 18068015 Specific activity: ≥10 000 units/mg   
Facs ARIA II sorter BD Biosciences
FACS Melody cell sorter BD Biosciences
Fc-Block Biolegend 101320
FcεRI eBioscience 13589885
Fetal bovine serum Gibco 26140079
FlowJo FlowJo Flow cytometry analysis data software
Gr-1 Tonbo 305931
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Homemade
IL-9 biolegend 514103
NK1.1  Biolegend 108704
Nylon mesh  ‎ lba B07HYHHX5V
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556
Phosphate-buffered saline  Homemade
RPMI Gibco 11875093
Siglec F  Biolegend 155512
Streptavidin Biolegend 405206
TCR-β  Biolegend 109203
TCR-β (PE/Cy7) Biolegend 109222
TCR-γδ  Biolegend 118103
Ter119 Biolegend 116204
Tricine buffer  Homemade
Zombie Aqua Fixable Viability Dye Biolegend 423101

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Centers for Disease Control and Prevention. Parasites - Hookworm. , (2022).
  2. Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus. Current Protocols in Immunology. , Chapter 19 (Unit 19.12) (2003).
  3. Mearns, H., et al. Interleukin-4-promoted T helper 2 responses enhance Nippostrongylus brasiliensis-induced pulmonary pathology. Infection and Immunity. 76 (12), 5535-5542 (2008).
  4. Licona-Limon, P., et al. Th9 cells drive host immunity against gastrointestinal worm infection. Immunity. 39 (4), 744-757 (2013).
  5. Ferrer-Font, L., et al. High-dimensional analysis of intestinal immune cells during helminth infection. Elife. 9, 51678 (2020).
  6. Kharwadkar, R., et al. Expression efficiency of multiple IL9 reporter alleles Is determined by cell lineage. Immunohorizons. 4 (5), 282-291 (2020).
  7. Wilhelm, C., et al. An IL-9 fate reporter demonstrates the induction of an innate IL-9 response in lung inflammation. Nature Immunology. 12 (11), 1071-1077 (2011).
  8. Gerlach, K., et al. TH9 cells that express the transcription factor PU.1 drive T cell-mediated colitis via IL-9 receptor signaling in intestinal epithelial cells. Nature Immunology. 15 (7), 676-686 (2014).
  9. Olson, M. R., et al. Paracrine IL-2 is required for optimal type 2 effector cytokine production. Journal of Immunology. 198 (11), 4352-4359 (2017).
  10. Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  11. Pinto, M. E. S., Licona-Limon, P. Th9 cells and parasitic inflammation: Use of Nippostrongylus and Schistosoma models. Methods in Molecular Biology. 1585, 223-245 (2017).
  12. Lawrance, C. C., Lucas, E. A., Clarke, S. L., Smith, B. J., Kuvibidila, S. Differential effects of isoflurane and CO2 inhalation on plasma levels of inflammatory markers associated with collagen-induced arthritis in DBA mice. International Immunopharmacology. 9 (7-8), 807-809 (2009).
  13. Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, behavioral, and histologic responses to various euthanasia methods in C57BL/6Ntac male mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 69-78 (2017).
  14. old Spring Harbor Protocols. Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red. Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  15. Bielecki, P., et al. Skin-resident innate lymphoid cells converge on a pathogenic effector state. Nature. 592 (7852), 128-132 (2021).
  16. Sanjabi, S., Mosaheb, M. M., Flavell, R. A. Opposing effects of TGF-beta and IL-15 cytokines control the number of short-lived effector CD8+ T cells. Immunity. 31 (1), 131-144 (2009).
  17. Liu, H., Li, M., Wang, Y., Piper, J., Jiang, L. Improving single-cell encapsulation efficiency and reliability through neutral buoyancy of suspension. Micromachines. 11 (1), 94 (2020).
  18. Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
  19. Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
  20. Flamar, A. L., et al. Interleukin-33 induces the enzyme Tryptophan hydroxylase 1 to promote inflammatory group 2 innate lymphoid cell-mediated immunity. Immunity. 52 (4), 606-619 (2020).
  21. Olguín-Martínez, E., et al. IL-33 and the PKA pathway regulate ILC2 populations expressing IL-9 and ST2. Frontiers in Immunology. 13, 787713 (2022).
  22. Olguin-Martinez, E., Ruiz-Medina, B. E., Licona-Limon, P. Tissue-specific molecular markers and heterogeneity in type 2 innate lymphoid cells. Frontiers in Immunology. 12, 757967 (2021).
  23. Noelle, R. J., Nowark, E. C. Cellular sources and immune functions of interleukin-9. Nature Reviews. Immunology. 10 (10), 683-687 (2010).

Tags

Immunologi og infektion udgave 193 IL-9 Th9 ILC2 IL-9 lymfoide celler parasit tyndtarm N. brasiliensis
En strategi for undersøgelse af IL-9-producerende lymfoide celler i <em>Nippostrongylus brasiliensis-infektionsmodellen</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Muñoz-Paleta, O.,… More

Muñoz-Paleta, O., Olguín-Martínez, E., Ruiz-Medina, B. E., Alonso-Quintana, A., Marcial-Medina, M. C., Licona-Limón, P. A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model. J. Vis. Exp. (193), e64075, doi:10.3791/64075 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter