Summary
インビトロ 転写アッセイは、 ボレリエラ・ブルグドルフェリにおける転写調節のメカニズムを解読することができる。このプロトコルでは、 B. burgdorferi RNAポリメラーゼを精製し、 in vitro 転写反応を実行する手順について説明します。 in vitro 転写アッセイを用いた実験的アプローチでは、活性RNAポリメラーゼの信頼性の高い精製と保存が必要です。
Abstract
ボレリエラ・ブルグドルフェリは、代謝およびゲノムレパートリーが限られている細菌性病原体です。B. burgdorferiは脊椎動物とマダニの間を細胞外に通過し、感染中に異なる環境で生き残るためにその転写プロファイルを劇的に再構築します。B. burgdorferi研究の焦点は、細菌が転写変化を通じてその環境にどのように反応するかを明確に理解することです。in vitro転写アッセイは、転写調節の基本的なメカニズムを生化学的に解剖することを可能にします。ここでは、B. burgdorferi RNAポリメラーゼの精製と保存、シグマ因子の精製、DNAテンプレートの生成、およびin vitro転写アッセイを説明する詳細なプロトコルを紹介します。このプロトコルは、B. burgdorferi 5A4 RpoC-His(5A4-RpoC)から精製されたRNAポリメラーゼの使用を記載している。5A4-RpoCは、RNAポリメラーゼの最大サブユニットをコードするrpoC遺伝子に10XHisタグを有する、以前に発表された株です。インビトロ転写アッセイは、株5A4-RpoCから精製されたRNAポリメラーゼ、ハウスキーピングシグマ因子RpoDの組換えバージョン、およびPCRで生成された二本鎖DNAテンプレートで構成されています。in vitro転写アッセイを組み立てるためのタンパク質精製技術とアプローチは概念的によく理解されており、比較的一般的ですが、RNAポリメラーゼの取り扱いに関する考慮事項は生物ごとに異なることがよくあります。ここで紹介するプロトコルは、B. burgdorferi RNAポリメラーゼの酵素研究用に設計されています。この方法は、RNAポリメラーゼの活性に対する転写因子、プロモーター、および翻訳後修飾の役割を試験するために適合させることができる。
Introduction
ライム病と再発熱は、ボレリア属とボレリエラ属のスピロヘータ病原体によって引き起こされます1,2,3。ライム病は北米で著名なベクター媒介性疾患であり、その結果、ボレリエラ・ブルグドルフェリはスピロヘータ生物学を研究するための著名なモデル生物です4,5。B. burgdorferiの転写調節機構の調査は、ダニベクターと哺乳類宿主の間を循環する際の環境の変化への適応をよりよく理解することを目的としています6,7。pH、温度、浸透圧、栄養素の利用可能性、短鎖脂肪酸、有機酸、溶存酸素および二酸化炭素レベルの変化は、B. burgdorferiがその節足動物ベクターで生存し、動物に感染するために重要な遺伝子の発現を調節します8,9,10,11,12,13,14,15、16、17、18。刺激に対するこれらの反応を調節メカニズムと結びつけることは、B. burgdorferi研究の重要な側面でした19。
転写因子とシグマ因子は、細胞プロセスを実行する遺伝子の転写を制御します。ライムと再発熱のスピロヘータは、比較的まばらな転写因子と代替シグマ因子のセットを持っています。それにもかかわらず、環境に対するB.ブルグドルフェリ応答を指示する複雑な転写変化があります20,21,22。環境変化に応答してB. burgdorferiの転写変化を引き起こす特定のメカニズムは不明のままである。in vitro転写アッセイは、転写因子およびシグマ因子の機能と調節機構をアッセイするための生化学的アプローチを採用するための強力なツールです23、24、25、26。
B. burgdorferi RNAポリメラーゼを用いたin vitro転写アッセイ系が最近確立されました24。細菌はしばしば独特の細胞生理学を持っているので、異なる種と属のRNAポリメラーゼは、酵素精製、酵素貯蔵、および反応緩衝条件に対して異なる反応を示します27。B. burgdorferiはまた、RNAポリメラーゼが研究されている多くの細菌種から遺伝的に離れています20。溶解、洗浄、および溶出バッファー条件、保存バッファー、in vitro転写反応バッファー、およびアッセイ構築方法などの酵素調製の態様はすべて、RNAポリメラーゼ活性を変化させる可能性があります。ここでは、RNAポリメラーゼとシグマ因子RpoDの精製、線状二本鎖DNAテンプレートの作成、およびこのシステムを使用するラボ間の再現性を促進するためのin vitro転写アッセイの構築のためのプロトコルを提供します。RpoD依存性転写の線形範囲を実証するために反応例を詳述し、このアプローチの限界と代替案について説明します。
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Protocol
1. RNAポリメラーゼの精製とRNAポリメラーゼ原液の調製
- 前述の細胞収集プロトコル28,29を使用して、微好気性環境(34°C、5%CO2、3%O2)でBSKII培地で培養した2〜4 LのB.ブルグドルフェリRpoC-His10Xから2〜4 x 107細胞/ mLの密度まで細胞ペレットを収集します。500 mL遠心ボトルで10,000 x g、4°Cで30分間遠心分離を行い、上清を注ぎます。
- 細胞を30 mLの氷冷HNバッファー(10 mM HEPES、10 mM NaCl、pH 8.0)に再懸濁します。50mL遠沈管を用いて上記のような遠心分離工程を繰り返し、上清をデカントする。
注意: 停止点。細胞ペレットを-80°Cで凍結して細胞を最大2週間保存するか、すぐに細胞溶解に進みます。 - 凍結しない限り、細胞、ライセート、および精製タンパク質を4°Cまたは氷上で維持します。このプロトコルで使用するすべてのバッファーに2 mMの濃度で新たに調製したDTTを添加してRNAポリメラーゼを還元環境に保ち、pH 8.0を維持します。
- B. burgdorferi細胞ペレットから、キットの指示に従って市販の細菌溶解キットを使用してライセートを調製します。プロテアーゼ阻害剤を含まない10〜15 mLの室温(RT)B-PER溶液にペレットを再懸濁し、氷上で5分間溶解を進行させます。溶解量は、キットの説明に記載されているように、細胞ペレットのサイズによって異なります。
- プロテアーゼ阻害剤カクテルを溶解溶液に加え、続いて代表的な結果のセクションに記載されているように超音波処理の3ラウンドを行います。
注:あるいは、前述のようにフレンチプレッシャーセルで細胞を溶解します24。手順 1.4 をスキップします。およびステップ1.5。 - 遠心分離および50 mL遠沈管を使用したろ過を使用して細胞ライセートを清澄化します。溶液にコバルトカラムローディングバッファー(表1)を加えて、チューブの容量を少なくとも全容量30 mLまで満たします。細胞残渣を20,000 x g で30分間遠心分離してペレット化します。
- 0.45 μmシリンジフィルターを使用して上清をろ過します。
- ライセートをコバルトカラムローディングバッファー(表1)で1:10の最終希釈比で希釈します。
- 製造元の指示に従って、コバルトまたはニッケル樹脂カラムを使用して、清澄化された細胞ライセート上清に対してアフィニティークロマトグラフィーを実行します。例については、代表的な結果のセクションを参照してください。 表 1 にリストされているバッファーを使用します。分析のためにフロースルー、洗浄、および溶出サンプルを収集します。
- 溶出バッファー溶液中のRNAポリメラーゼを、製造元の指示に従ってバッファー交換カラムを使用して、直ちにRNAポリメラーゼ保存バッファー溶液(表1)に交換します。
- 10 kDaカットオフ遠心フィルターユニットを使用してRNAポリメラーゼを分光光度法で測定された0.2〜0.4 mg / mLの濃度に濃縮することにより、フリーザーストックを準備します(吸光係数調整なしの280nm [1 cm = 1 mg·mL-1で1 abs])。
- RNAポリメラーゼフリーザーは、PCRチューブに20〜50 μLの容量でストックし、RNAポリメラーゼを-80°Cで保存します。
- SDS-PAGEでアフィニティークロマトグラフィーの品質を測定し、分光光度法またはBCAアッセイで総タンパク質収量を測定します。サンプルを7.5%ポリアクリルアミドゲル上で120 Vで50分間実行し、SDS-PAGEによる良好な分離を実現します。
2. 組換えRpoDの精製とRpoDストックの調製
- マルトース結合タンパク質タグ付き組換え B.ブルグドルフェリ RpoD(MBP-RpoD)をBL21::MBP-RpoDBbで培養および発現誘導し、 材料表に記載されているタンパク質融合精製システム取扱説明書に記載されているように、遠心分離により細胞を回収した。
注意: 停止点。細胞ペレットを-80°Cで凍結して細胞を最大2週間保存するか、すぐに細胞溶解に進みます。 - 市販の細菌細胞溶解キットまたはフレンチプレッシャーセルを使用して溶解を行います。 表1の溶解バッファーの例を参照してください。
- 遠心分離とろ過を使用して細胞ライセートを清澄化します。細胞残渣を20,000 x g で30分間遠心分離してペレット化します。0.45 μmのフィルターを用いて上清をろ過します。
- 発現系用のタンパク質抽出プロトコルを用いてMBP-RpoDを抽出します。実装の詳細と結果の例については、代表的な結果のセクションを参照してください。
- SDS-PAGEによるアフィニティークロマトグラフィープロセスおよび溶出の品質を決定し、分光光度法(吸光係数調整なしの280nm [1 cmで1 abs = 1 mg·mL−1])によってタンパク質収量を測定します。SDS-PAGEで分離するために、10%ポリアクリルアミドゲルを200Vで30分間使用します。
- 10 kDaカットオフ遠心フィルターを使用してMBP-RpoDを吸光光度法で測定した>2 mg/mLの濃度に濃縮します。
- 第Xa因子切断部位でRpoDからMBPを切断します。MBP-RpoDを2 mMの濃度で含むアフィニティークロマトグラフィー溶出画分にCaCl2 を添加します。精製タンパク質30 mgごとに200 μgの第Xa因子プロテアーゼを添加します。RTで一晩インキュベートします。
- SDS-PAGEによってRpoDからのMBPの完全な切断を確認します。SDS-PAGEで分離するために、10%ポリアクリルアミドゲルを200Vで30分間使用します。
- MBPおよびRpoD含有溶液をヘパリン結合バッファーで1:10の比率で希釈します。
- ヘパリンカラム上のMBPとRpoDをFPLCで分離します。FPLC の設定については、 表 2 を参照してください。
- SDS-PAGEでアフィニティークロマトグラフィー産物の品質を測定し、分光光度法でタンパク質収量を測定します。SDS-PAGEで分離するために、10%ポリアクリルアミドゲルを200Vで30分間使用します。
- 10 kDaカットオフ遠心フィルターを使用してRpoDを含む溶出画分を最終容量2〜3 mLまで濃縮します。
- 濃縮されたRpoD溶出画分をゲルろ過カラムを用いて保存バッファーに交換するバッファー。
- 10 kDaカットオフ遠心フィルターを使用してRpoDストックを、分光光度法で測定した濃度0.2〜0.8 mg/mLに濃縮します。
- PCRチューブに20〜50 μLの容量でRpoDストックを分注し、-80°Cで保存します。
3. DNAテンプレートストックの調製
- PCRは、200 μLの反応を用いて、 B. burgdorferi ゲノムDNAからRpoD駆動プロモーター部位を囲む500 bp領域を増幅します(表3)。
- 市販のPCR精製キットを用いてPCR産物を精製する。分子生物学グレードH2OでDNAを溶出します。
- PCRで生成されたDNAテンプレートのモル濃度を分子生物学グレードH2Oで希釈して100nMに調整します。
4.放射性標識ヌクレオチドを組み込んだ in vitro 転写を行う
- インビトロ転写実験計画を準備します。RNAポリメラーゼ、RpoD、およびDNAテンプレートの濃度を決定します。反応チューブのアリコート量とピペッティング順序を決定します。例については、表 4 および 図 1 を参照してください。
注:RNAポリメラーゼを含まない反応、代替ポリメラーゼ、テンプレートなし、または代替テンプレートを含む反応など、実験計画にコントロールを含めます。 - 実験に必要なα-32P-ATPの量を計算します。これを実験計画に組み込みます。典型的には、蛍光体スクリーン検出のための in vitro 転写反応あたり2 μCiの活性を含む。
- 放射線汚染のリスクを減らすために、放射線ベンチを含む作業面を準備します。
- RNAポリメラーゼ、Rpo、5xバッファーNTP、およびテンプレートストック溶液の新鮮なアリコートを氷上で解凍します。ピペッティングの前に、解凍したすべての冷凍ストックを完全に混合します。
- 実験計画に従って、放射性標識ヌクレオチド用のマスター反応混合物と別のNTP混合物を調製します。
- コントロール反応と実験セットをPCRチューブに分注し、反応に放射性標識を追加する準備をします。H2O、反応マスターミックス、RNAポリメラーゼ、およびRpoDを指定されたPCRチューブに穏やかに分注し、ピペッティングで混合します。
- 準備した材料を放射線ベンチに移します。
- α-32 P-ATPをNTPに加え、穏やかにピペッティングして混合します。
注意: 放射性物質を取り扱うときは、放射性同位元素の適切な保護具と取り扱い手順を使用してください。 - ステップ4.6の in vitro 転写反応混合物を含むチューブにNTPを追加します。
- DNAテンプレートを添加して in vitro 転写反応を開始します。穏やかにピペッティングして反応量を混合します。
- チューブをサーモサイクラーまたはヒートブロックで37°Cで5分間インキュベートします。
- サーモサイクラーまたはヒートブロックから反応物を取り除き、50%ホルムアミドを含む2x RNAローディング色素を等しい反応量まで添加して、 in vitro 転写反応を停止します。
- サーモサイクラーまたはヒートブロックで65°Cで5分間反応をインキュベートすることにより、酵素を変性させます。
- 10%〜15%TBE尿素ポリアクリルアミドゲルを180Vで30〜45分間使用したゲル電気泳動により、 in vitro 転写反応混合物中のRNAを分離します。
注:ゲル電気泳動条件によっては、緩衝液が放射性標識ヌクレオチドで汚染されているか、ゲルに放射性標識ヌクレオチドのほとんどまたはすべてが含まれている場合があります。適切な放射能の保管または廃棄を計画します。 - 取り込まれていない放射性標識ATPを含むゲルの任意の部分を除去した後にホスホスクリーンを使用して放射性標識RNAを画像化する。ゲルをホスホスクリーンに一晩(16時間)さらし、フォスフォスクリーンイメージャー(解像度100 μm、チューブ電圧700 V PMT)を使用して画像化します。
- デンシトメトリー法を使用してデータを分析します24.
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Representative Results
反応の制限段階がシグマ因子を介した転写開始である in vitro 転写反応では、転写活性はシグマ因子の量とともに直線的に増加するはずです。RNA産物への放射性標識ヌクレオチドの取り込みから生じる変化するシグナルを観察するために、2つの濃度のRNAポリメラーゼとともにさまざまなRpoD濃度をテストする in vitro 転写実験の準備を紹介します。RNAポリメラーゼ、RpoD、および二本鎖DNA鋳型ストックの調製の代表的な結果が示されている。代表的な インビトロ 転写反応は、分析に許容されるRNAポリメラーゼ活性レベルの例として役立ちます。
RNAポリメラーゼの精製のために、B. burgdorferi RpoC-His10Xの4 L培養物を微好気性条件下(5%CO2、3%O2)で34°Cで増殖させた。培養物を暗視野顕微鏡を使用してスピロヘータ密度について綿密に監視し、4 x 107スピロヘータ/ mLを超える密度に達する前に収集しました。細胞を溶解のためにB−PER混合物に再懸濁した(表1)。細胞ペレットをピペッティングによってホモジナイズし、続いてRTで5分間インキュベーションし、その後の超音波処理のラウンドを3回に分けて三重に行った。清澄化ライセートをコバルトカラムローディングバッファーと5 mLのコバルト樹脂で希釈し、総容量を180 mLにしました。RpoC-His10Xは、混合物を4°Cで1時間ニューテーションすることによりコバルト樹脂に結合させた。 混合物を重力流カラムに移し、40 mLのカラム洗浄バッファーで5回洗浄した。5 mLの溶出バッファーをカラムに通すことで結合タンパク質を放出し、溶出を7回繰り返した。フロースルー、洗浄液、および溶出画分のサンプルをSDS-PAGEで分離し、染色剤の取り込みによって画像化しました(図1)。RNAポリメラーゼコア複合体は、RpoC、RpoB、およびRpoAで構成されており、それぞれサイズが154 kDa、129 kDa、および38.5 kDaです。図1に示された代表的な結果は、RNAポリメラーゼ複合体を構成する3つのペプチドのサイズで3つの顕著なバンドを示しています。アフィニティークロマトグラフィーからのフロースルーには、1.0〜1.7の比率が260/280の0.5〜1 mg/mLのタンパク質が含まれており、核酸の濃度が高いことを示しています。分光光度法で測定したタンパク質混合物の濃度に続くRNAポリメラーゼタンパク質収量は0.3 mg/mLでした。
RpoDタンパク質ストックを調製するために、C末端マルトース結合タンパク質タグを有する組換えRpoDを、BL21(DE3)pLysS E.coli中のpMAL-C5Xプラスミドから発現させた。2 Lの 大腸菌 を32°Cで0.5のOD600nm まで増殖させた。次いで、培養物を0.3 mM IPTGで処理して、1時間RpoDの発現を誘導した。細胞を遠心分離によりペレット化し、B-PERで溶解した。得られた200mLの希釈細胞破砕液を10mLのアミロース樹脂で濾過した。樹脂を40mLの結合バッファーで8回洗浄し、残留DNAおよびペプチドを除去した。MBPタグ付きRpoDは、5 mLの溶出バッファーで樹脂カラムに5回溶出しました。結合および洗浄ステップからのフロースルーならびに溶出画分をSDS-PAGEにより分析した(図2A)。溶出画分の主成分は~115 kDaのペプチドで、MBPタグ付き組換え体 B. burgdorferi RpoDのサイズと一致します。溶出画分を合わせ、CaCl2 濃度を2mMに調整し、40mgの精製タンパク質に100μgのFactorXaプロテアーゼを添加した。室温で一晩消化した後、反応をSDS−PAGEで分析した(図2B)。第Xa因子プロテアーゼによる切断に続いて、混合物中の2つの主要な生成物はRpoD(73.6 kDa)とMBP(45 kDa)でした。RpoDおよびMBPタンパク質の混合物を、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーを用いて分離した。混合物をヘパリン結合バッファーで1:10の比率で希釈し、FPLCのヘパリン結合樹脂カラムにロードしました。RpoDは、NaClの勾配を増加させて1 Mの濃度に溶出しました。フラクションをSDS-PAGEで分析したところ、400-600 mM NaClの範囲の溶出フラクションに73.6 kDaサイズのメジャーバンドが明らかでした(図2C)。いくつかの分解されたRpoDフラグメントを共精製した。RpoD含有画分を合わせ、緩衝液をRpoD保存緩衝液に交換し、次いで10kDaカットオフ遠心フィルターを用いて濃縮した。分光光度法で測定した最終RpoD濃度は0.67 mg/mL(9.1 mM)でした。
B. burgdorferi flgBのプロモーター部位を包含する二本鎖DNA鋳型をPCRにより作製した。flgBプロモーターは、30 ngのB. burgdorferi DNA 24,30を含む200 μL反応を用いて、プロモーターの上流および下流の250 bpに対応するプライマーによって増幅されました(表6)。PCR産物を1%アガロースゲル中でゲル電気泳動により分析した(図3)。PCR産物のサイズは約500 bpで、見かけの均一性がありました。重要なことに、塩と細胞成分の汚染は、in vitro転写反応結果の変動性に寄与する可能性があります。DNAテンプレートがPCR精製カラムで完全に脱塩されていることを確認します。
鋳型DNAの添加によって転写が開始される実験スキームは、プロモーター認識および転写開始の速度を試験することができる。我々の代表的な実験では、RpoDタンパク質の一連の希釈を、16 nM-1 μMの範囲の水中で2倍希釈することによって調製した。活性に必要な二価カチオンを含む反応バッファー中にRNAポリメラーゼを含むマスターミックスを作成した(表4 および 表5)。RpoDとマスターミックスを氷上で一緒に分注しました。RNAポリメラーゼおよびRpoDを含むマスターミックスをインキュベートさせ、 インビトロ 転写の他のステップを調製した。マスターミックスとは別に調製したポジティブコントロール反応、 in vitro 転写シグナルが鋳型依存性であることを確認するための鋳型DNAを含まない陰性対照反応、およびシグナルがRNAポリメラーゼ依存性であることを確認するためのRNAポリメラーゼを含まない陰性対照反応の3つの対照反応を取り入れました。放射性標識ヌクレオチドを反応に添加し、5 μL(α-32P-ATP)を20 μLの10x NTPストック混合物に混合して、回復不能な量を補うために20の反応に十分なアリコートを作成しました。最後に、 flgB プロモーターをコードする鋳型DNAを、予め計画したピペッティング順序に従ってピペッティングにより反応チューブに導入した(図4)。
in vitro転写によって生成されたRNA断片からのシグナルを、ゲル電気泳動によって分離されたRNAを含むTBE-尿素ゲルの16時間の曝露期間の後に蛍光体スクリーンによって検出されました。50 nMのRNAポリメラーゼと500 nMから16 nMの範囲のRpoDを含む実験では、250 bpのRNA産物が生成されました(図5)。RpoD濃度の2倍希釈ごとに、蓄積されたRNA産物のレベルが低かった。目立つバンドの下に現れる一連の低いbp産物があり、転写停止または断片化されたDNAテンプレートによる不完全なRNA断片を示しています。RNA産物は鋳型なしコントロールには存在せず、このアッセイではシグナルに寄与する外因性DNA断片がなかったことを示しています。RNAポリメラーゼなしコントロールではシグナルは検出されず、B. burgdorferi RNAポリメラーゼがこのアッセイでRNAの産生に寄与する唯一のポリメラーゼであることを示しています。
2番目の実験では、低濃度の25 nM RNAポリメラーゼを使用しました(図6)。試験したRpoD濃度の範囲全体で検出されたRNA産物は、 図5と比較して少なく、バックグラウンドシグナル強度は高かった。これは、デンシトメトリーによる下流分析には問題があります。蛍光体画像をデンシトメトリー(図7)で解析すると、ホスホスクリーンから得られたデンシトメトリー信号は、両方の実験において反応中に存在するRpoDの量の間に線形関係を示した。しかし、高いバックグラウンドシグナルを用いた実験では、25 nM RNAポリメラーゼと100 nM未満のRpoDを含む反応は、相対的な転写レベルの比較には信頼できませんでした。
図1:アフィニティークロマトグラフィーで精製したHisタグ 付きB.ブルグドルフェリ RNAポリメラーゼの分離。 細胞ライセートのフロースルー画分(レーン1)、最初の洗浄画分(レーン2)、最後の洗浄画分(レーン3)、および5つの溶出画分(レーン4〜8)を2xサンプルローディングバッファーで希釈し、煮沸し、SDS-PAGEによってグラジエントポリアクリルアミドゲル中で200Vで30分間分離 しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ゲル電気泳動によるRpoD精製の分析。 (A)アミロース樹脂アフィニティークロマトグラフィーによるMBPタグ付きRpoDの精製からのプールされたフロースルー画分(レーン1およびレーン2)、洗浄画分(レーン3〜5)、および溶出画分(レーン6〜10)。(B)第Xa因子プロテアーゼを用いたMBPおよびRpoDの切断後のタンパク質混合物。(C)MBPおよびRpoDを分離するためのヘパリンアフィニティークロマトグラフィーからのNaClの勾配が増加するフロースルー溶液(レーン1)および溶出画分(レーン2〜9)。提示された各ゲルにおいて、サンプルを2倍ローディングバッファーと混合し、煮沸し、SDS-PAGEを用いてグラジエントポリアクリルアミドゲル中で200Vで30分間分離 した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3: インビトロ 転写テンプレートのPCR生成 。 flgB プロモーターを含む500 bpサイズのアンプリコン(レーン1およびレーン2)および他のプロモーター部位のアンプリコンを含むコントロールPCR反応(レーン3〜4)が示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:実験的配置およびピペッティングシーケンス計画。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5: B. burgdorferi RNAポリメラーゼを用いたin vitro転写によって生成されたRNAからの蛍光体画像シグナルのRpoD依存的な変動性。 インビトロ 転写反応には、50 nMのRNAポリメラーゼと、バンド24の上に示したさまざまなレベルのRpoDが含まれていました。RNAを10%TBE尿素ゲルで分離し、蛍光体スクリーンを使用して16時間にわたる放射性崩壊からのシグナルを捕捉しました。この図はBoyleらから修正されています。24. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:in vitro転写によって生成されたRNAからのリン脂質シグナルのRpoD依存的な変動性。 in vitro転写には、25 nMのRNAポリメラーゼと、バンドの上で示されるさまざまなレベルのRpoDが含まれていました。RNAを15%TBE尿素ゲルで分離し、蛍光体スクリーンを使用して16時間にわたる放射性崩壊からのシグナルを捕捉しました。RNAポリメラーゼ濃度が低く、バックグラウンドシグナルが高いため、正確な測定が困難になりました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:RpoDレベルの増加に伴う in vitro 転写反応における放射性標識RNA蓄積の増加。 蛍光体スクリーンイメージングで検出されたシグナルは、バックグラウンド減算なしでデンシトメトリーによって分析されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:メディアレシピ。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表 2: FPLC 設定この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表3:PCR反応。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表4:50 nM RNAポリメラーゼの実験計画と体積計算。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表5:25 nM RNAポリメラーゼの実験計画と体積計算。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表6:このプロトコルで使用した株およびオリゴヌクレオチド。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
提示されたプロトコルを使用して構築されたインビトロ転写アッセイは、最近、B. burgdorferiにおける転写因子の役割を研究するために使用され、他の転写因子、シグマ因子、および分子を使用して同様の実験を構築するために適用できます23。B. burgdorferiから活性RNAポリメラーゼが得られ、その活性が検出されると、in vitro転写アッセイ内の成分および条件を変更することができます。アッセイは非常に柔軟で変更可能です。反応はモジュール式で、冷凍ストックから構築されており、実験パラメータが選択されるとリードタイムはほとんど必要ありません。十分なストックがあれば、1日で複数の実験を行うことができます。
活性RNAポリメラーゼを得ることは、 in vitro 転写反応調製の最も重要な側面です。このプロトコルに記載されているように、対数中期増殖期に増殖した細胞からRNAポリメラーゼを採取することをお勧めします。任意の細菌からRNAポリメラーゼを精製する際に、増殖速度は活性RNAポリメラーゼを精製する上で重要な要素として注目されている。RNAポリメラーゼは、翻訳後修飾を蓄積することができ、増殖の定常期において阻害性転写因子と関連し得る31。我々は、 B. burgdorferi 培養物から大量の活性RNAポリメラーゼを精製することに成功していない。アフィニティークロマトグラフィーアプローチは、物理的分離アプローチ32と比較して、生物が培養において低密度に達し、大量の細胞培養物を蓄積することが比較的材料集約的であるため、 B. burgdorferi からの精製にも有益である。
他の細菌RNAポリメラーゼの精製中、シグマ因子は、精製方法および条件に応じてかなりの量で共精製することができる33、34、35、36。シグマ因子の共精製は、代替シグマ因子、修正シグマ因子、またはシグマ因子の欠如を使用した下流実験を制限する可能性があります。さらに、ハウスキーピングシグマ因子RpoDの補充は、シグマ因子37の初期共精製に関係なく活性を検出するのに有益である。RNAポリメラーゼコアからシグマ因子を分離できる柔軟性があるため、ここで概説したHis-アフィニティークロマトグラフィー精製条件下ではシグマ因子が共精製されないことが有利であると考えています。精製条件を変更して、RpoDを含むより無傷で活性なホロ酵素を生成する可能性があります。例えば、塩濃度は複数のサブユニット酵素の安定性に影響を与える可能性が高く、B. burgdorferi RNAポリメラーゼ複合体またはその二価カチオン取り込みの安定性に対するイミダゾール濃度の影響も不明である。
B.ブルグドルフェリ RNAポリメラーゼ酵素活性は、24存在する二価カチオンの種類および量に敏感である。マンガンはRNAポリメラーゼの最大活性に必要であり、マグネシウムは活性への寄与度が低いようであることがわかりました。水中のイオンを汚染すると、RNAポリメラーゼの酵素活性に高い変動性が生じます。したがって、分子生物学グレード、HPLCグレード、および金属イオンがほとんど存在しない金属分析グレードH2Oなどの高純度水は、ここで概説するプロトコルにおいてより高いRNAポリメラーゼ活性に不可欠です。RNAポリメラーゼはpHにも敏感であり、精製中に還元環境を必要とします27。pHの変化または還元剤としてのBMEの使用は、不活性なRNAポリメラーゼをもたらした。市販の 大腸菌 RNAポリメラーゼをコントロールとして使用して、 in vitro 転写アッセイの適切な構築を確実にすることをお勧めします24。 大腸菌 RNAポリメラーゼは、ヌクレオチドの生存率、テンプレート構築法、放射性標識の取り込み、RNA分離、およびシグナル検出法の試験を可能にします。ただし、 B. burgdorferi RNAポリメラーゼは、 大腸菌と比較して、特定の二価カチオン、バッファー、およびプロモーターの要件を有することに留意すべきである。
in vitro転写反応に利用可能ないくつかの検出方法があります。色素取り込みおよび分子ビーコンアッセイは、放射性標識検出法38、39の一般的な代替手段である。放射性標識ヌクレオチドの取り込みは、現在最も感度の高いRNA検出方法です。代替アッセイでは、放射性標識アッセイと比較して、測定可能なシグナルレベルに到達するためにより多くのRNAポリメラーゼが必要です。さらに、色素の取り込みと分子ビーコンの方法は、通常、信号が誤っている方法が多くあります。たとえば、DNase汚染により、分子ビーコンはターゲットが存在しない場合にシグナルを放出する可能性があります。放射性標識の取り込みを使用すると、B. burgdorferi RNAポリメラーゼ酵素の相対活性を低レベルでも検出することができ、RNAポリメラーゼ酵素を用いた初期実験に適しています。
反応に含まれる B. burgdorferi RNAポリメラーゼ酵素の濃度は分光光度法によって標準化されていますが、この測定は変動の原因となる可能性があります。RNAポリメラーゼの比活性は、全タンパク質混合物40の一部である完全に形成された活性ホロ酵素の数に依存し得る。例えば、我々の結果で報告された50 nMのRNAポリメラーゼのモル量は分光光度法によって決定されましたが、定量的ウェスタンブロッティングによるサブユニット量の分析は、RpoAサブユニットが潜在的なRNAポリメラーゼホロ酵素の数の制限成分であり、我々の混合物では最大21 nMの完全に形成されたRNAポリメラーゼのみが可能であったことが明らかになりました24.実験は、RNAポリメラーゼおよび in vitro 転写反応の他の成分のバッチ間の変動を制御するために常に実施する必要があります。
図5に示す代表的な実験では、RpoDレベルを変化させ、RpoDと検出された信号との間に線形関係があることが実証されました。in vitro転写は、提示された実験テンプレートを使用して簡単に変更できる汎用性の高い方法です(表4)。例えば、代替シグマ因子または代替DNAテンプレートは、容易に試験することができる24。代替テンプレートには、スーパーコイル化およびメチル化DNAの特徴を導入するために細胞から精製されたPCRまたはプラスミドによって生成された異なるプロモーター領域を含めることができます。RpoD、RNAポリメラーゼ、および鋳型の所与のレベルに対して、異なるレベルの転写因子を添加して、プロモーター23からの活性の阻害または増強を見てもよい。in vitro転写反応内の成分添加の順序およびモル比は、反応開始前に転写開始複合体が形成されるように変更することができる。これらの反応は、転写開始の代わりに転写伸長を測定することができた40。 in vitro転写アッセイは、B. burgdorferi生物学のさまざまな調査に合わせて変更することができます。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この作業は、クレイトン大学の健康科学戦略的投資基金教員開発助成金によってサポートされました。B. burgdorferi RpoC-His10X株は、モンタナ大学のD. Scott Samuels博士から親切に提供されました。マルトース結合タンパク質タグ付きrpoD対立遺伝子をコードするpMAL-C5Xプラスミドを有する大腸菌株は、NIAID、NIH、ロッキーマウンテンラボラトリーズのフランクゲラルディーニ博士から親切に提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 micron syringe filter | Thermo Scientific | 726-2545 | Step 1.7 and 2.3 |
| 50 mL conical tubes | MidSci | C50B | Step 1.3, and subsequent steps |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Thermo Scientific | 3119-0050PK | Step 1.2 |
| 500 mL Centrifuge bottles | Thermo Scientific | 3120-9500PK | Step 1.1 |
| B-PER and instruction manual | Thermo Scientific | 78248 | Step 1.4 and 2.2 |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Step 2.6 |
| Centrifugal filters 10 Kd cutoff | Millipore Sigma | UFC8010 | Step 1.11 and 2.11 |
| Cobalt resin and instruction manual | Thermo Scientific | 89969 | Step 1.9 |
| Dithiothreitol | Acros Organics | 426380500 | Step 1.4 and subsequent steps |
| Dnase (Nuclease) | Millipore Sigma | 70746 | Step 1.4 and 2.2 |
| Factor Xa Protease | Haematologic Technologies | HCXA-0060 | Step 2.6 |
| GE Typhoon 5 Phosphoimager | GE lifesciences | Multiple | Step 4.15 |
| Gel Imager | Bio-Rad | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| H2O for in vitro transcription | Fisher Scientific | 7732-18-5 | Step 3.2 and 3.3 |
| high fidelity PCR kit | New England Biolabs | M0530S | Step 3.1 |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | Step 1.1, and subsequent steps | |
| HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL | Cytiva Life Sciences | 17040601 | Step 2.8 |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750-100G | Step 1.9 |
| Lysozyme | Thermo Scientific | 90082 | Step 1.4 and 2.2 |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | S25401 | Step 4.1 |
| Manganese chloride | Fisher Scientific | S25418 | Step 4.1 |
| Mini protean tetra cell | Bio-Rad | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | Step 4.1 |
| NTP mixture | Thermo Scientific | R0481 | Step 4.1 |
| PCR purification kit | Qiagen | 28506 | Step 3.2 |
| PCR tubes | MidSci | PR-PCR28ACF | Step 1.12 |
| PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual | Cytiva | 17085101 | Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column) |
| pMAL Protein Fusion and Purification System Instruction manual |
New England Biolabs | E8200S | Step 2.1 |
| Polyacrylamide gels AnyKD | Bio-Rad | 456-8125 | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| Potassium glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Step 4.1 |
| Protease inhibitor | Thermo Scientific | 78425 | Step 1.4 and 2.2 |
| Radiolabeled ATP | Perkin Elmer | BLU503H | Step 4.2 |
| RNA Loading Dye, (2x) | New England Biolabs | B0363S | Step 4.13 |
| Rnase inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | Step 4.1 |
| Spectrophotometer | Biotek | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| TBE-Urea gels 10 percent | Bio-Rad | 4566033 | Step 4.14 |
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