Summary
Los ensayos de transcripción in vitro pueden descifrar los mecanismos de regulación transcripcional en Borreliella burgdorferi. Este protocolo describe los pasos para purificar la ARN polimerasa de B. burgdorferi y realizar reacciones de transcripción in vitro. Los enfoques experimentales que utilizan ensayos de transcripción in vitro requieren una purificación y almacenamiento confiables de ARN polimerasa activa.
Abstract
Borreliella burgdorferi es un patógeno bacteriano con repertorios metabólicos y genómicos limitados. B. burgdorferi transita extracelularmente entre vertebrados y garrapatas y remodela dramáticamente su perfil transcripcional para sobrevivir en ambientes dispares durante la infección. Un enfoque de los estudios de B. burgdorferi es comprender claramente cómo la bacteria responde a su entorno a través de cambios transcripcionales. Los ensayos de transcripción in vitro permiten diseccionar bioquímicamente los mecanismos básicos de regulación transcripcional. Aquí, presentamos un protocolo detallado que describe la purificación y almacenamiento de la polimerasa de ARN de B. burgdorferi , la purificación del factor sigma, la generación de plantillas de ADN y los ensayos de transcripción in vitro . El protocolo describe el uso de ARN polimerasa purificada de B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC). 5A4-RpoC es una cepa previamente publicada que alberga una etiqueta 10XHis en el gen rpoC que codifica la subunidad más grande de la ARN polimerasa. Los ensayos de transcripción in vitro consisten en la ARN polimerasa purificada de la cepa 5A4-RpoC, una versión recombinante del factor sigma de mantenimiento RpoD y una plantilla de ADN bicatenario generada por PCR. Si bien las técnicas de purificación de proteínas y los enfoques para ensamblar ensayos de transcripción in vitro son conceptualmente bien entendidos y relativamente comunes, las consideraciones de manejo para las ARN polimerasas a menudo difieren de un organismo a otro. El protocolo presentado aquí está diseñado para estudios enzimáticos sobre la ARN polimerasa de B. burgdorferi. El método se puede adaptar para probar el papel de los factores de transcripción, promotores y modificaciones postraduccionales en la actividad de la ARN polimerasa.
Introduction
La enfermedad de Lyme y la fiebre recurrente son causadas por patógenos espiroquetas en los géneros Borrelia y Borreliella 1,2,3. La enfermedad de Lyme es una enfermedad transmitida por vectores prominente en América del Norte y, en consecuencia, Borreliella burgdorferi es un organismo modelo prominente para estudiar la biología de las espiroquetas 4,5. Las investigaciones sobre los mecanismos de regulación transcripcional de B. burgdorferi tienen como objetivo comprender mejor sus adaptaciones a los cambios en el medio ambiente a medida que circula entre su vector garrapata y los huéspedes mamíferos 6,7. Los cambios en el pH, la temperatura, la osmolaridad, la disponibilidad de nutrientes, los ácidos grasos de cadena corta, los ácidos orgánicos y los niveles de oxígeno disuelto y dióxido de carbono modulan la expresión de genes que son importantes para que B. burgdorferi sobreviva en su artrópodo vector e infecte a los animales 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Vincular estas respuestas a estímulos con mecanismos reguladores ha sido un aspecto importante de la investigación de B. burgdorferi 19.
Los factores de transcripción y los factores sigma controlan la transcripción de genes que llevan a cabo procesos celulares. Las espiroquetas de Lyme y fiebre recidivante albergan un conjunto relativamente escaso de factores de transcripción y factores sigma alternativos. A pesar de esto, existen cambios transcripcionales complejos que dirigen las respuestas de B. burgdorferi al medio ambiente20,21,22. Los mecanismos específicos que impulsan los cambios transcripcionales en B. burgdorferi en respuesta a los cambios ambientales siguen sin estar claros. Los ensayos de transcripción in vitro son herramientas poderosas para emplear un enfoque bioquímico para evaluar la función y los mecanismos reguladores de los factores de transcripción y los factores sigma23,24,25,26.
Recientemente se estableció un sistema de ensayo de transcripción in vitro utilizando la ARN polimerasa de B. burgdorferi 24. Como las bacterias a menudo tienen fisiologías celulares únicas, las ARN polimerasas de diferentes especies y géneros responden de manera diferente a la purificación enzimática, el almacenamiento de enzimas y las condiciones de amortiguación de reacción27. B. burgdorferi también está genéticamente distante de las muchas especies bacterianas en las que se han estudiado las ARN polimerasas20. Los aspectos de la preparación enzimática como la lisis, el lavado y las condiciones del tampón de elución, el tampón de almacenamiento, el tampón de reacción de transcripción in vitro y el método de construcción del ensayo pueden alterar la actividad de la ARN polimerasa. En este documento, proporcionamos un protocolo para la purificación de la ARN polimerasa y el factor sigma RpoD, la producción de plantillas lineales de ADN bicatenario y la construcción de ensayos de transcripción in vitro para facilitar la reproducibilidad entre laboratorios que utilizan este sistema. Detallamos un ejemplo de reacción para demostrar el rango lineal para la transcripción dependiente de RpoD y discutimos las limitaciones y alternativas a este enfoque.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Purificación de la ARN polimerasa y preparación del stock de ARN polimerasa
- Recoger el pellet celular de 2-4 L de B. burgdorferi RpoC-His10X cultivado en medio BSKII en un ambiente microaerofílico (34 °C, 5% CO 2, 3%O2) a una densidad de2-4 x 107 células/mL utilizando los protocolos de recolección celular descritos previamente28,29. Realizar la centrifugación a 10.000 g a 4 °C durante 30 min en botellas centrífugas de 500 ml y verter el sobrenadante.
- Resuspender las células en 30 mL de tampón HN helado (10 mM HEPES, 10 mM NaCl, pH 8.0). Repita el paso de centrifugación descrito anteriormente utilizando un tubo de centrífuga de 50 ml y decanta el sobrenadante.
NOTA: Punto de parada. Congele la cápsula celular a -80 °C para almacenar las células durante un máximo de 2 semanas o proceda inmediatamente a la lisis celular. - Mantener las células, el lisado y las proteínas purificadas a 4 °C o en hielo a menos que se congelen. Mantenga la ARN polimerasa en un ambiente reductor agregando TDT recién preparada a una concentración de 2 mM a cada tampón utilizado en este protocolo y mantenga el pH 8.0.
- Prepare el lisado a partir del pellet de células de B. burgdorferi utilizando un kit de lisis bacteriana comercial siguiendo las instrucciones del kit. Resuspender el pellet en 10-15 ml de solución B-PER a temperatura ambiente (RT) sin inhibidor de la proteasa y dejar que la lisis proceda durante 5 minutos en hielo. El volumen de lisis depende del tamaño del pellet de la celda, como se describe en las instrucciones del kit.
- Agregue un cóctel de inhibidores de proteasa a la solución de lisis, seguido de tres rondas de sonicación, como se describe en la sección de resultados representativos.
NOTA: Alternativamente, lisar las celdas en una celda de presión francesa como se describió anteriormente24. Omita el paso 1.4. y paso 1.5. - Aclarar el lisado celular mediante centrifugación y filtración utilizando un tubo de centrífuga de 50 ml. Llene el volumen del tubo hasta al menos 30 ml de volumen total agregando tampón de carga de columna de cobalto (Tabla 1) a la solución. Granular los restos celulares por centrifugación a 20.000 x g durante 30 min.
- Filtrar el sobrenadante con un filtro de jeringa de 0,45 μm.
- Diluir el lisado en tampón de carga de columna de cobalto (Tabla 1) utilizando una relación de dilución final de 1:10.
- Realizar cromatografía de afinidad en el sobrenadante de lisado celular clarificado utilizando una columna de cobalto o resina de níquel siguiendo las instrucciones del fabricante. Consulte la sección de resultados representativos para ver un ejemplo. Utilice los búferes enumerados en la Tabla 1. Recoja las muestras de flujo continuo, lavado y elución para su análisis.
- Cambie inmediatamente la ARN polimerasa en la solución tampón de elución por una solución tampón de almacenamiento de ARN polimerasa (Tabla 1) utilizando una columna de intercambio tampón siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Preparar las existencias de congeladores concentrando la ARN polimerasa utilizando unidades de filtro centrífugas de corte de 10 kDa a una concentración de 0,2-0,4 mg/ml determinada por espectrofotometría (un ajuste de coeficiente de extinción de280 nm sin extinción [1 abs a 1 cm = 1 mg·mL−1]).
- El congelador de ARN polimerasa alícuota almacena volúmenes de 20-50 μL en tubos de PCR y almacena la ARN polimerasa a −80 °C.
- Determinar la calidad de la cromatografía de afinidad mediante SDS-PAGE y medir el rendimiento total de proteínas mediante espectrofotometría o ensayo BCA. Ejecute las muestras en un gel de poliacrilamida al 7,5% a 120 V durante 50 minutos para una buena resolución con SDS-PAGE.
2. Purificación de RpoD recombinante y preparación de existencias de RpoD
- Cultivar e inducir la expresión de B. burgdorferi RpoD recombinante marcada con la proteína de unión a maltosa (MBP-RpoD) en BL21::MBP-RpoDBb, como se describe en el manual de instrucciones del sistema de fusión y purificación de proteínas que figura en la Tabla de materiales, y recoger las células por centrifugación.
NOTA: Punto de parada. Congele los gránulos celulares a -80 °C para almacenar las células durante un máximo de 2 semanas o proceda inmediatamente a la lisis celular. - Realice la lisis utilizando un kit de lisis celular bacteriana comercial o una célula de presión francesa. Vea el ejemplo de búfer de lisis en la Tabla 1.
- Clarificar el lisado celular mediante centrifugación y filtración. Granular los restos celulares por centrifugación a 20.000 x g durante 30 min. Filtrar el sobrenadante con un filtro de 0,45 μm.
- Extraer MBP-RpoD utilizando un protocolo de extracción de proteínas para el sistema de expresión. Consulte la sección de resultados representativos para ver los detalles y resultados de la implementación.
- Determinar la calidad del proceso de cromatografía de afinidad y elución por SDS-PAGE y medir el rendimiento proteico por espectrofotometría (A280nm sin ajuste de coeficiente de extinción [1 abs a 1 cm = 1 mg·mL−1]). Use gel de poliacrilamida al 10% a 200 V durante 30 minutos para la separación en SDS-PAGE.
- Concentrar MBP-RpoD utilizando un filtro centrífugo de corte de 10 kDa hasta una concentración de >2 mg/ml determinada por espectrofotometría.
- Escinde MBP de RpoD en el sitio de escisión de Factor Xa. Añadir CaCl 2 a las fracciones de elución por cromatografía de afinidad que contienen MBP-RpoD a una concentración de2 mM. Añadir 200 μg de Factor Xa proteasa por cada 30 mg de proteína purificada. Incubar durante la noche en RT.
- Confirme la división completa de MBP de RpoD por SDS-PAGE. Use gel de poliacrilamida al 10% a 200 V durante 30 minutos para la separación en SDS-PAGE.
- Diluir la solución que contiene MBP y RpoD en una proporción de 1:10 con un tampón de unión a heparina.
- Separar MBP y RpoD en la columna de heparina por FPLC. Consulte la Tabla 2 para conocer la configuración de FPLC.
- Determinar la calidad de los productos de cromatografía de afinidad mediante SDS-PAGE y medir el rendimiento proteico mediante espectrofotometría. Use gel de poliacrilamida al 10% a 200 V durante 30 minutos para la separación en SDS-PAGE.
- Concentrar las fracciones de elución que contienen RpoD utilizando un filtro centrífugo de corte de 10 kDa hasta un volumen final de 2-3 ml.
- Intercambie las fracciones de elución RpoD concentradas al tampón de almacenamiento utilizando una columna de filtración de gel.
- Concentrar el material RpoD utilizando un filtro centrífugo de corte de 10 kDa hasta una concentración de 0,2-0,8 mg/ml determinada por espectrofotometría.
- Stock de RpoD alícuota a volúmenes de 20-50 μL en tubos de PCR y almacenar a −80 °C.
3. Preparación del stock de plantillas de ADN
- La PCR amplifica la región de 500 pb que rodea un sitio promotor impulsado por RpoD a partir del ADN genómico de B. burgdorferi utilizando una reacción de 200 μL (Tabla 3).
- Purificar los productos de PCR utilizando un kit de purificación de PCR comercial. Eluya el ADN en biología molecular gradoH2O.
- Ajustar la concentración molar de los moldes de ADN generados por PCR a 100 nM por dilución en biología molecular gradoH2O.
4. Realizar transcripción in vitro con la incorporación de nucleótidos radiomarcados
- Preparar un plan experimental de transcripción in vitro . Determine las concentraciones de ARN polimerasa, RpoD y plantilla de ADN. Determinar los volúmenes alícuotas y las órdenes de pipeteo de los tubos de reacción. Consulte la Tabla 4 y la Figura 1 para ver un ejemplo.
NOTA: Incluya controles en el plan experimental, como reacciones que no contengan ARN polimerasa, polimerasa alternativa, ninguna plantilla o plantillas alternativas. - Calcule el volumen de α-32P-ATP requerido para el experimento. Incorpore esto en el plan experimental. Por lo general, incluyen 2 μCi de actividad por reacción de transcripción in vitro para la detección de la pantalla de fósforo.
- Prepare las superficies de trabajo, incluido el banco de radiación, para reducir el riesgo de contaminación por radiación.
- Descongele las alícuotas frescas de ARN polimerasa, Rpo, NTP tampón 5x y soluciones madre plantilla en hielo. Mezcle bien todas las existencias congeladas descongeladas antes del pipeteo.
- Preparar una mezcla de reacción maestra y una mezcla de NTP separada para nucleótidos radiomarcados de acuerdo con el plan experimental.
- Dispensar las reacciones de control y los conjuntos experimentales en tubos de PCR en preparación para agregar radiomarcado en la reacción. Dispensar suavementeH2O, mezcla maestra de reacción, ARN polimerasa y RpoD en tubos de PCR designados y mezclar por pipeteo.
- Transfiera los materiales preparados a un banco de radiación.
- Agregue α-32P-ATP a NTP y mezcle con un pipeteo suave.
PRECAUCIÓN: Mientras trabaje con material radiactivo, utilice el equipo de protección y los procedimientos de manipulación adecuados para los isótopos radiactivos. - Añadir NTP a los tubos que contienen las mezclas de reacción de transcripción in vitro del paso 4.6.
- Comience la reacción de transcripción in vitro con la adición de una plantilla de ADN. Mezclar el volumen de reacción pipeteando suavemente.
- Incubar tubos a 37 °C durante 5 min en un termociclador o bloque térmico.
- Retire las reacciones del termociclador o bloque de calor y agregue el tinte de carga de ARN 2x que contiene 50% de formamida a un volumen de reacción igual para detener las reacciones de transcripción in vitro .
- Desnaturalice las enzimas incubando reacciones a 65 °C durante 5 minutos en un termociclador o bloque de calor.
- Separar el ARN en la mezcla de reacción de transcripción in vitro mediante electroforesis en gel utilizando geles de poliacrilamida de urea TBE al 10%-15% a 180 V durante 30-45 min.
NOTA: Dependiendo de las condiciones de electroforesis en gel, la solución tampón puede estar contaminada con nucleótidos radiomarcados o el gel puede contener la mayoría o todos los nucleótidos radiomarcados. Planifique el almacenamiento o la eliminación adecuados de la radiactividad. - Imagen del ARN radiomarcado usando fosfopantalla después de eliminar cualquier porción del gel que contenga ATP radiomarcado no incorporado. Exponga el gel al fosfopantalla durante la noche (16 h) y la imagen utilizando un generador de imágenes de fosfopantalla (resolución de 100 μm, voltaje del tubo de 700 V PMT).
- Analizar los datos utilizando métodos de densitometría24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En una reacción de transcripción in vitro en la que el paso limitante de la reacción es el inicio de la transcripción mediada por el factor sigma, la actividad de transcripción debe aumentar linealmente con la cantidad de factor sigma. Presentamos la preparación de experimentos de transcripción in vitro que prueban un rango de concentraciones de RpoD junto con dos concentraciones de ARN polimerasa para observar la señal variable resultante de la incorporación de nucleótidos radiomarcados en productos de ARN. Se muestran los resultados representativos de la preparación de ARN polimerasa, RpoD y existencias de plantillas de ADN bicatenario. Las reacciones representativas de transcripción in vitro sirven como ejemplo de niveles de actividad de la ARN polimerasa aceptables para el análisis.
Para la purificación de la ARN polimerasa, se cultivó un cultivo de 4 L de B. burgdorferi RpoC-His10X a 34 °C en condiciones microaerofílicas (5% CO2, 3%O2). Los cultivos fueron monitoreados de cerca para la densidad de espiroquetas utilizando microscopía de campo oscuro y recolectados antes de alcanzar densidades superiores a 4 x 107 espiroquetas/mL. Las células fueron resuspendidas en mezcla B-PER para lisis (Tabla 1). El pellet celular se homogeneizó por pipeteo, seguido de 5 minutos de incubación en RT, y posteriores rondas de sonicación realizadas durante 3 s por triplicado. Los lisados clarificados se diluyeron con tampón de carga de columna de cobalto y 5 mL de resina de cobalto a un volumen total de 180 mL. Se permitió que RpoC-His10X se uniera a la resina de cobalto nutrando la mezcla durante 1 h a 4 °C. La mezcla se transfirió a una columna de flujo por gravedad y se lavó cinco veces con 40 ml de tampón de lavado de columna. La proteína unida se liberó al pasar 5 ml de tampón de elución a través de la columna, y la elución se repitió siete veces. Las muestras de las fracciones de flujo, lavados y elución se separaron mediante SDS-PAGE y se obtuvieron imágenes mediante la incorporación de tinción (Figura 1). El complejo central de ARN polimerasa está compuesto por RpoC, RpoB y RpoA, con tamaños de 154 kDa, 129 kDa y 38,5 kDa, respectivamente. El resultado representativo que se muestra en la Figura 1 muestra tres bandas prominentes en los tamaños de los tres péptidos que componen el complejo ARN polimerasa. El flujo a través de la cromatografía de afinidad contenía 0,5-1 mg/ml de proteína con una relación 260/280 entre 1,0 y 1,7, lo que indica una mayor concentración de ácidos nucleicos. El rendimiento de la proteína ARN polimerasa después de la concentración de la mezcla de proteínas según lo determinado por espectrofotometría fue de 0,3 mg / ml.
Para preparar las reservas de proteínas RpoD, se expresó RpoD recombinante con una etiqueta de proteína de unión a maltosa C-terminal a partir de un plásmido pMAL-C5X en BL21 (DE3) pLysS E. coli. Se cultivaron 2 L de E. coli a 32 °C a un OD600nm de 0,5. El cultivo se trató con 0,3 mM de IPTG para inducir la expresión de RpoD durante 1 h. Las células fueron granuladas por centrifugación y lisadas en B-PER. Los 200 ml resultantes de lisado celular diluido se filtraron a través de 10 ml de resina de amilosa. La resina se lavó con 40 ml de tampón de unión ocho veces para eliminar el ADN residual y los péptidos. La RpoD marcada con MBP se eluyó con 5 ml de tampón de elución en la columna de resina cinco veces. El flujo a través de los pasos de unión y lavado y las fracciones de elución fueron analizados por SDS-PAGE (Figura 2A). El componente principal en la fracción de elución es un péptido de ~115 kDa, que coincide con el tamaño del RpoD recombinante de B. burgdorferi marcado con MBP. Se combinaron las fracciones de elución, se ajustó la concentración de CaCl 2 a2 mM y se agregaron 100 μg de proteasa FactorXa a 40 mg de proteína purificada. Después de la digestión nocturna a temperatura ambiente, la reacción fue analizada por SDS-PAGE (Figura 2B). Después de la escisión con la proteasa Factor Xa, los dos productos principales en la mezcla fueron RpoD (73,6 kDa) y MBP (45 kDa). La mezcla de proteínas RpoD y MBP se separó mediante cromatografía de afinidad de heparina. La mezcla se diluyó en una proporción de 1:10 en tampón de unión a heparina y se cargó en una columna de resina unida a heparina en un FPLC. RpoD se eluyó con un gradiente creciente de NaCl a una concentración de 1 M. Cuando las fracciones fueron analizadas por SDS-PAGE, una banda mayor de 73,6 kDa de tamaño fue evidente en la fracción de elución en el rango de 400-600 mM NaCl (Figura 2C). Algunos fragmentos degradados de RpoD fueron co-purificados. Las fracciones que contenían RpoD se combinaron, el búfer se intercambió en un búfer de almacenamiento RpoD y luego se concentró utilizando un filtro centrífugo de corte de 10 kDa. La concentración final de RpoD fue de 0,67 mg/ml (9,1 mM) determinada por espectrofotometría.
Se generó una plantilla de ADN bicatenario que abarca el sitio promotor de B. burgdorferi flgB mediante PCR. El promotor flgB fue amplificado por cebadores que correspondían a 250 pb aguas arriba y aguas abajo del promotor (Tabla 6) utilizando una reacción de 200 μL que contenía 30 ng de ADN de B. burgdorferi 24,30. El producto de PCR se analizó mediante electroforesis en gel en gel de agarosa al 1% (Figura 3). El producto de PCR tenía un tamaño aproximado de 500 pb con aparente homogeneidad. Es importante destacar que la contaminación de sales y componentes celulares puede contribuir a la variabilidad de los resultados de la reacción de transcripción in vitro; nos aseguramos de que la plantilla de ADN esté completamente desalinizada en la columna de purificación de PCR.
Un esquema experimental en el que la transcripción se inicia mediante la adición de ADN molde puede probar la tasa de reconocimiento del promotor y el inicio de la transcripción. En nuestros experimentos representativos, se preparó una serie de dilución de proteína RpoD mediante diluciones dobles en agua que van desde 16 nM-1 μM. Se creó una mezcla maestra que contenía ARN polimerasa en un tampón de reacción que contenía cationes divalentes necesarios para la actividad (Tabla 4 y Tabla 5). El RpoD y la mezcla maestra fueron alicitados juntos sobre hielo. La mezcla maestra que contenía ARN polimerasa y RpoD se dejó incubar mientras se preparaban otros pasos de la transcripción in vitro . Incorporamos tres reacciones de control: una reacción de control positivo preparada por separado de la mezcla maestra, una reacción de control negativo que no contenía ADN molde para asegurar que la señal de transcripción in vitro dependiera de la plantilla, y una reacción de control negativo sin ARN polimerasa para asegurar que la señal fuera dependiente de la ARN polimerasa. Se añadieron nucleótidos radiomarcados a la reacción mezclando 5 μL de (α-32P-ATP) a 20 μL de mezcla madre de NTP 10x para crear suficiente alícuota para 20 reacciones para compensar volúmenes irrecuperables. Finalmente, el ADN de plantilla que codifica el promotor flgB se introdujo en los tubos de reacción mediante pipeteo siguiendo el orden de pipeteo previamente planificado (Figura 4).
La señal de los fragmentos de ARN generados por la transcripción in vitro se detectó mediante una pantalla de fósforo después de un período de exposición de 16 h del gel TBE-urea que contenía ARN separado por electroforesis en gel. Un experimento que contenía 50 nM de ARN polimerasa y RpoD en el rango de 500 nM a 16 nM generó productos de ARN de 250 pb (Figura 5). Por cada dilución doble de la concentración de RpoD, hubo un nivel más bajo de producto de ARN acumulado. Hubo una serie de productos de pa más baja que aparecieron debajo de la banda prominente, lo que indica fragmentos de ARN incompletos debido a la interrupción de la transcripción o la plantilla de ADN fragmentada. Los productos de ARN estuvieron ausentes del control sin plantilla, lo que indica que no hubo fragmentos de ADN exógeno que contribuyeran a la señal en este ensayo. No se detectó ninguna señal en el control sin ARN polimerasa, lo que indica que la ARN polimerasa de B. burgdorferi fue la única polimerasa que contribuyó a la producción de ARN en este ensayo.
En un segundo experimento, utilizamos una concentración más baja de 25 nM ARN polimerasa (Figura 6). Se detectaron menos productos de ARN en todo el rango de concentraciones de RpoD probadas en comparación con la Figura 5, y la intensidad de la señal de fondo fue mayor. Esto es problemático para el análisis posterior por densitometría. Cuando la imagen de fósforo fue analizada por densitometría (Figura 7), la señal de densitometría obtenida de la fosfopantalla indicó una relación lineal entre la cantidad de RpoD presente en la reacción en ambos experimentos. Sin embargo, en el experimento con señal de fondo alta, la reacción que contenía 25 nM de ARN polimerasa y menos de 100 nM de RpoD no fue confiable para las comparaciones relativas del nivel de transcripción.
Figura 1: Separación de la ARN polimerasa de B. burgdorferi marcada con His, purificada por cromatografía de afinidad. La fracción de flujo continuo del lisado celular (carril 1), la fracción de primer lavado (carril 2), la última fracción de lavado (carril 3) y cinco fracciones de elución (carril 4-8) se diluyeron en 2x tampón de carga de muestra, se hirvieron y se separaron mediante SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida de gradiente a 200 V durante 30 min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis de la purificación de RpoD mediante electroforesis en gel. (A) Fracciones de flujo continuo agrupadas (carril 1 y carril 2), fracciones de lavado (carriles 3-5) y fracciones de elución (carriles 6-10) de la purificación de RpoD marcada con MBP mediante cromatografía de afinidad de resina de amilosa. (B) Mezcla de proteínas después de la escisión de MBP y RpoD utilizando proteasa del factor Xa. (C) Solución de flujo continuo (carril 1) y fracciones de elución con un gradiente creciente de NaCl (carriles 2-9) de cromatografía de afinidad de heparina para separar MBP y RpoD. En cada gel presentado, las muestras se mezclaron con tampón de carga 2x, se hirvieron y se separaron en un gel de poliacrilamida de gradiente utilizando SDS-PAGE a 200 V durante 30 min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Generación por PCR de plantillas de transcripción in vitro. Se muestran el amplicón de 500 pb que contiene el promotor flgB (carril 1 y carril 2) y las reacciones de PCR de control que contienen amplicones de otros sitios promotores (carriles 3-4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Disposición experimental y plan de secuencia de pipeteo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Variabilidad dependiente de RpoD en la señal de imagen de fósforo del ARN generada por transcripción in vitro utilizando ARN polimerasa de B. burgdorferi. Las reacciones de transcripción in vitro contenían 50 nM de ARN polimerasa y niveles variables de RpoD indicados por encima de las bandas24. El ARN se separó mediante un gel de urea TBE al 10%, y se utilizó una pantalla de fósforo para capturar la señal de la desintegración radiactiva durante 16 h. Esta figura ha sido modificada de Boyle et al.24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Variabilidad dependiente de RpoD en la señal de imagen de fósforo del ARN generada por transcripción in vitro . La transcripción in vitro contenía 25 nM de ARN polimerasa y niveles variables de RpoD indicados por encima de las bandas. El ARN se separó mediante un gel de urea TBE al 15%, y se utilizó una pantalla de fósforo para capturar la señal de la desintegración radiactiva durante 16 h. La menor concentración de ARN polimerasa y la mayor señal de fondo aumentaron la dificultad de una medición precisa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Aumento de la acumulación de ARN radiomarcado en reacciones de transcripción in vitro con aumento de los niveles de RpoD. Las señales detectadas en la imagen de la pantalla de fósforo se analizaron mediante densitometría sin sustracción de fondo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Recetas de medios. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Configuración de FPLC. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 3: Reacciones PCR. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 4: Plan experimental de ARN polimerasa de 50 nM y cálculo de volumen. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 5: Plan experimental de ARN polimerasa de 25 nM y cálculo de volumen. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 6: Cepas y oligonucleótidos utilizados en este protocolo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Los ensayos de transcripción in vitro construidos utilizando el protocolo presentado se utilizaron recientemente para estudiar el papel de un factor de transcripción en B. burgdorferi y se pueden aplicar para construir experimentos similares utilizando otros factores de transcripción, factores sigma y moléculas23. Una vez obtenida la ARN polimerasa activa de B. burgdorferi y detectada su actividad, se pueden modificar los componentes y las condiciones dentro de los ensayos de transcripción in vitro. El ensayo es altamente flexible y modificable. Las reacciones son modulares y construidas a partir de existencias congeladas y requieren poco tiempo de espera una vez que se han elegido los parámetros experimentales. Con existencias suficientes, se pueden llevar a cabo múltiples experimentos en 1 día.
La obtención de ARN polimerasa activa es el aspecto más crítico de la preparación de la reacción de transcripción in vitro . Recomendamos recolectar ARN polimerasa de células cultivadas hasta la fase de crecimiento logarítmico medio como se describe en este protocolo. En la purificación de la ARN polimerasa de cualquier bacteria, la tasa de crecimiento se ha observado como un factor importante en la purificación de la ARN polimerasa activa. Las ARN polimerasas pueden acumular modificaciones postraduccionales y pueden estar asociadas a factores de transcripción inhibitorios en la fase estacionaria de crecimiento31. No hemos logrado purificar altas cantidades de ARN polimerasa activa de cultivos de B. burgdorferi cultivados hasta fase estacionaria. El enfoque de cromatografía de afinidad, en comparación con un enfoque de separación física32, también es beneficioso para la purificación de B. burgdorferi porque el organismo alcanza baja densidad en cultivo, y la acumulación de grandes cantidades de cultivo celular es relativamente intensiva en materiales.
Durante las purificaciones de otras ARN polimerasas bacterianas, los factores sigma pueden co-purificarse en cantidades significativas dependiendo del método de purificación y las condiciones33,34,35,36. La co-purificación de factores sigma puede limitar los experimentos posteriores utilizando factores sigma alternativos, factores sigma modificados o falta de factores sigma. Además, la suplementación con el factor sigma RpoD de mantenimiento es beneficiosa para detectar la actividad independientemente de la copurificación inicial del factor sigma37. Debido a la flexibilidad de separar el factor sigma del núcleo de la ARN polimerasa, consideramos ventajoso que los factores sigma no se co-purificen bajo las condiciones de purificación de cromatografía de afinidad de His-afinidad descritas aquí. Es posible que las condiciones de purificación puedan cambiarse para producir holoenzimas más intactas y activas que contengan RpoD. Por ejemplo, es probable que las concentraciones de sal afecten la estabilidad de múltiples enzimas de subunidades, y también se desconoce el efecto de la concentración de imidazol sobre la estabilidad del complejo ARN polimerasa de B. burgdorferi o su incorporación de cationes divalentes.
B. burgdorferi La actividad enzimática de la ARN polimerasa es sensible al tipo y cantidad de cationes divalentes presentes24. Encontramos que el manganeso es necesario para la actividad máxima de la ARN polimerasa, y el magnesio pareció contribuir a la actividad en menor medida. Los iones contaminantes en el agua añaden una gran cantidad de variabilidad a la actividad enzimática de la ARN polimerasa. En consecuencia, el agua altamente pura, como el grado de biología molecular, el grado HPLC y el grado de análisis de metales H2O con pocos iones metálicos presentes, es esencial para una mayor actividad de la ARN polimerasa en el protocolo descrito aquí. Las ARN polimerasas también son sensibles al pH y requieren un ambiente reductor durante la purificación27. El pH alterado o el uso de BME como agente reductor ha dado lugar a una ARN polimerasa inactiva. Recomendamos utilizar la ARN polimerasa de E. coli disponible comercialmente como control para garantizar la construcción adecuada de los ensayos de transcripción in vitro 24. E. coli La ARN polimerasa permitirá probar la viabilidad de los nucleótidos, el método de construcción de plantillas, la incorporación de radiomarcaje, la separación de ARN y el método de detección de señales. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la ARN polimerasa de B. burgdorferi tiene requisitos específicos de catión, tampón y promotor divalente en comparación con E. coli.
Existen varios métodos de detección disponibles para las reacciones de transcripción in vitro. La incorporación de colorante y los ensayos de balizas moleculares son alternativas comunes al método de detección de radiomarcaje38,39. La incorporación de nucleótidos radiomarcados es actualmente el método de detección de ARN más sensible. Los ensayos alternativos requieren más ARN polimerasa para alcanzar niveles de señal medibles en comparación con los ensayos de radiomarcado. Además, la incorporación de tinte y los métodos de baliza molecular suelen tener más formas de que las señales sean erróneas. Por ejemplo, la contaminación por DNasa puede hacer que las balizas moleculares liberen una señal en ausencia de su objetivo. Usando la incorporación de radiomarca, la actividad relativa de la enzima ARN polimerasa de B. burgdorferi se puede detectar incluso a niveles bajos, lo que se adapta a la experimentación inicial con enzimas de ARN polimerasa.
Si bien la concentración de la enzima ARN polimerasa B. burgdorferi incluida en la reacción está estandarizada por espectrofotometría, esta medición puede ser una fuente de variabilidad. La actividad específica de las ARN polimerasas puede depender del número de holoenzimas activas completamente formadas, que son una parte de la mezcla total de proteínas40. Por ejemplo, la cantidad molar de 50 nM de ARN polimerasa reportada en nuestros resultados se determinó mediante espectrofotometría, pero un análisis de las cantidades de subunidades por western blot cuantitativo reveló que la subunidad RpoA era un componente limitante en el número de holoenzimas potenciales de ARN polimerasa, y un máximo de solo 21 nM de ARN polimerasa completamente formada era posible en nuestra mezcla24. Siempre se deben realizar experimentos para controlar la variación de lote a lote en la ARN polimerasa y otros componentes de la reacción de transcripción in vitro .
En nuestro experimento representativo que se muestra en la Figura 5, se alteraron los niveles de RpoD y se demostró una relación lineal entre RpoD y la señal detectada. La transcripción in vitro es un método versátil que puede ser fácilmente alterado utilizando la plantilla experimental presentada (Tabla 4). Por ejemplo, los factores sigma alternativos o las plantillas alternativas de ADN se pueden probar fácilmente24. Las plantillas alternativas podrían incluir diferentes regiones promotoras generadas por PCR o plásmidos purificados de células para introducir características de ADN superenrollado y metilado. Para un nivel dado de RpoD, ARN polimerasa y plantilla, se pueden agregar diferentes niveles de un factor de transcripción para ver la inhibición o mejora de la actividad de un promotor23. El orden de adición de componentes y las relaciones molares dentro de la reacción de transcripción in vitro pueden alterarse de tal manera que se formen complejos de iniciación de la transcripción antes del inicio de la reacción; Estas reacciones podrían medir el alargamiento de la transcripción en lugar del inicio de la transcripción40. El ensayo de transcripción in vitro puede modificarse para adaptarse a una variedad de investigaciones sobre la biología de B. burgdorferi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Inversión Estratégica en Ciencias de la Salud Faculty Development Grant de la Universidad de Creighton. La cepa RpoC-His10X de B. burgdorferi fue amablemente proporcionada por el Dr. D. Scott Samuels de la Universidad de Montana. La cepa de E. coli que alberga el plásmido pMAL-C5X que codifica un alelo rpoD marcado con proteína de unión a maltosa fue amablemente proporcionada por el Dr. Frank Gherardini de Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 micron syringe filter | Thermo Scientific | 726-2545 | Step 1.7 and 2.3 |
| 50 mL conical tubes | MidSci | C50B | Step 1.3, and subsequent steps |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Thermo Scientific | 3119-0050PK | Step 1.2 |
| 500 mL Centrifuge bottles | Thermo Scientific | 3120-9500PK | Step 1.1 |
| B-PER and instruction manual | Thermo Scientific | 78248 | Step 1.4 and 2.2 |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Step 2.6 |
| Centrifugal filters 10 Kd cutoff | Millipore Sigma | UFC8010 | Step 1.11 and 2.11 |
| Cobalt resin and instruction manual | Thermo Scientific | 89969 | Step 1.9 |
| Dithiothreitol | Acros Organics | 426380500 | Step 1.4 and subsequent steps |
| Dnase (Nuclease) | Millipore Sigma | 70746 | Step 1.4 and 2.2 |
| Factor Xa Protease | Haematologic Technologies | HCXA-0060 | Step 2.6 |
| GE Typhoon 5 Phosphoimager | GE lifesciences | Multiple | Step 4.15 |
| Gel Imager | Bio-Rad | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| H2O for in vitro transcription | Fisher Scientific | 7732-18-5 | Step 3.2 and 3.3 |
| high fidelity PCR kit | New England Biolabs | M0530S | Step 3.1 |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | Step 1.1, and subsequent steps | |
| HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL | Cytiva Life Sciences | 17040601 | Step 2.8 |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750-100G | Step 1.9 |
| Lysozyme | Thermo Scientific | 90082 | Step 1.4 and 2.2 |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | S25401 | Step 4.1 |
| Manganese chloride | Fisher Scientific | S25418 | Step 4.1 |
| Mini protean tetra cell | Bio-Rad | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | Step 4.1 |
| NTP mixture | Thermo Scientific | R0481 | Step 4.1 |
| PCR purification kit | Qiagen | 28506 | Step 3.2 |
| PCR tubes | MidSci | PR-PCR28ACF | Step 1.12 |
| PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual | Cytiva | 17085101 | Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column) |
| pMAL Protein Fusion and Purification System Instruction manual |
New England Biolabs | E8200S | Step 2.1 |
| Polyacrylamide gels AnyKD | Bio-Rad | 456-8125 | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| Potassium glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Step 4.1 |
| Protease inhibitor | Thermo Scientific | 78425 | Step 1.4 and 2.2 |
| Radiolabeled ATP | Perkin Elmer | BLU503H | Step 4.2 |
| RNA Loading Dye, (2x) | New England Biolabs | B0363S | Step 4.13 |
| Rnase inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | Step 4.1 |
| Spectrophotometer | Biotek | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| TBE-Urea gels 10 percent | Bio-Rad | 4566033 | Step 4.14 |
References
- Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S.
- Kingry, L. C., et al. Surveillance for and discovery of Borrelia Species in US patients suspected of tickborne illness. Clinical Infectious Diseases. 66 (12), 1864-1871 (2018).
- Cutler, S. J. Relapsing fever Borreliae: A global review. Clinics in Laboratory Medicine. 35 (4), 847-865 (2015).
- Barbour, A. G., Hayes, S. F.
- Tilly, K., Rosa, P. A., Stewart, P. E. Biology of infection with Borrelia burgdorferi. Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 217-234 (2008).
- Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
- Caimano, M. J., Drecktrah, D., Kung, F., Samuels, D. S. Interaction of the Lyme disease spirochete with its tick vector. Cellular Microbiology. 18 (7), 919-927 (2016).
- Dulebohn, D. P., Richards, C. L., Su, H., Lawrence, K. A., Gherardini, F. C. Weak organic acids decrease Borrelia burgdorferi cytoplasmic pH, eliciting an acid stress response and impacting RpoN- and RpoS-dependent gene expression. Frontiers in Microbiology. 8, 1734 (2017).
- Bontemps-Gallo, S., Lawrence, K., Gherardini, F. C. Two different virulence-related regulatory pathways in Borrelia burgdorferi are directly affected by osmotic fluxes in the blood meal of feeding ixodes ticks. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005791 (2016).
- Bugrysheva, J. V., et al. Characterization of the RelBbu Regulon in Borrelia burgdorferi reveals modulation of glycerol metabolism by (p)ppGpp. PLoS One. 10 (2), 0118063 (2015).
- Carroll, J. A., Garon, C. F., Schwan, T. G. Effects of environmental pH on membrane proteins in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 67 (7), 3181-3187 (1999).
- Drecktrah, D., et al. The Borrelia burgdorferi RelA/SpoT homolog and stringent response regulate survival in the tick vector and global gene expression during starvation. PLoS Pathogens. 11 (9), 1005160 (2015).
- Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).
- Lin, Y. H., Chen, Y., Smith, T. C., Karna, S. L. R., Seshu, J. Short-chain fatty acids alter metabolic and virulence attributes of Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 86 (9), 00217-00218 (2018).
- Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).
- Stevenson, B., Schwan, T. G., Rosa, P. A. Temperature-related differential expression of antigens in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 63 (11), 4535-4539 (1995).
- Troxell, B., et al. Manganese and zinc regulate virulence determinants in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 81 (8), 2743-2752 (2013).
- Yang, X., et al. Interdependence of environmental factors influencing reciprocal patterns of gene expression in virulent Borrelia burgdorferi. Molecular Microbiology. 37 (6), 1470-1479 (2000).
- Samuels, D. S., et al.
- Fraser, C. M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).
- Iyer, R., Schwartz, I. Microarray-based comparative genomic and transcriptome analysis of Borrelia burgdorferi. Microarrays. 5 (2), 9 (2016).
- Iyer, R., et al. Stage-specific global alterations in the transcriptomes of Lyme disease spirochetes during tick feeding and following mammalian host adaptation. Molecular Microbiology. 95 (3), 509-538 (2015).
- Boyle, W. K., et al. DksA-dependent regulation of RpoS contributes to Borrelia burgdorferi tick-borne transmission and mammalian infectivity. PLoS Pathogen. 17 (2), 1009072 (2021).
- Boyle, W. K., et al. Establishment of an in vitro RNA polymerase transcription system: a new tool to study transcriptional activation in Borrelia burgdorferi. Scientific Reports. 10 (1), 8246 (2020).
- Silar, R., et al. Use of in vitro transcription system for analysis of Corynebacterium glutamicum promoters recognized by two sigma factors. Current Microbiology. 73 (3), 401-408 (2016).
- Maciag, A., et al. In vitro transcription profiling of the sigmaS subunit of bacterial RNA polymerase: re-definition of the sigmaS regulon and identification of sigmaS-specific promoter sequence elements. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5338-5355 (2011).
- Chang, A., et al. BRENDA, the ELIXIR core data resource in 2021: New developments and updates. Nucleic Acids Research. 49, 498-508 (2021).
- Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S.
- Hyde, J. A., Weening, E. H., Skare, J. T.
- Ge, Y., Old, I. G., Saint Girons, I., Charon, N. W. Molecular characterization of a large Borrelia burgdorferi motility operon which is initiated by a consensus sigma70 promoter. Journal of Bacteriology. 179 (7), 2289-2299 (1997).
- Ozaki, M., Wada, A., Fujita, N., Ishihama, A. Growth phase-dependent modification of RNA polymerase in Escherichia coli. Molecular Genetics and Genomics. 230 (1-2), 17-23 (1991).
- Jasinski, D. L., Schwartz, C. T., Haque, F., Guo, P. Large scale purification of RNA nanoparticles by preparative ultracentrifugation. Methods in Molecular Biology. 1297, 67-82 (2015).
- Gierl, A., Zillig, W., Stetter, K. O. The role of the components sigma and y of the DNA-dependent RNA polymerase of Lactobacillus curvatus in promotor selection. European Journal of Biochemistry. 125 (1), 41-47 (1982).
- Stetter, K. O., Zillig, W. Transcription in lactobacillaceae. DNA-dependent RNA polymerase from Lactobacillus curvatus. European Journal of Biochemistry. 48 (2), 527-540 (1974).
- Borbley, G., Schneider, G.
- Svetlov, V., Artsimovitch, I. Purification of bacterial RNA polymerase: Tools and protocols. Methods in Molecular Biology. 1276, 13-29 (2015).
- Shimada, T., Yamazaki, Y., Tanaka, K., Ishihama, A. The whole set of constitutive promoters recognized by RNA polymerase RpoD holoenzyme of Escherichia coli. PLoS One. 9 (3), 90447 (2014).
- Daubendiek, S. L., Ryan, K., Kool, E. T. Rolling-circle RNA synthesis: Circular oligonucleotides as efficient substrates for T7 RNA polymerase. Journal of the American Chemical Society. 117 (29), 7818-7819 (1995).
- Marras, S. A., Gold, B., Kramer, F. R., Smith, I., Tyagi, S.
- Chamberlin, M. J., Nierman, W. C., Wiggs, J., Neff, N. A quantitative assay for bacterial RNA polymerases. Journal of Biological Chemistry. 254 (20), 10061-10069 (1979).
