Summary
시험관 내 전사 분석은 Borreliella burgdorferi의 전사 조절 메커니즘을 해독할 수 있습니다. 이 프로토콜은 B. burgdorferi RNA 중합효소를 정제하고 시험관 내 전사 반응을 수행하는 단계를 설명합니다. 시험관 전사 분석을 사용하는 실험적 접근법은 활성 RNA 중합효소의 신뢰할 수 있는 정제 및 보관을 필요로 합니다.
Abstract
Borreliella burgdorferi 는 대사 및 게놈 레퍼토리가 제한된 박테리아 병원체입니다. B. burgdorferi 는 척추동물과 진드기 사이를 세포 외로 이동하며 감염 시 이질적인 환경에서 생존하기 위해 전사 프로필을 극적으로 개조합니다. B. burgdorferi 연구의 초점은 박테리아가 전사 변화를 통해 환경에 어떻게 반응하는지 명확하게 이해하는 것입니다. 시험관 내 전사 분석을 통해 전사 조절의 기본 메커니즘을 생화학적으로 해부할 수 있습니다. 여기에서 우리는 B. burgdorferi RNA 중합효소 정제 및 저장, 시그마 인자 정제, DNA 템플릿 생성 및 시험관 내 전사 분석을 설명하는 자세한 프로토콜을 제시합니다. 상기 프로토콜은 B. burgdorferi 5A4 RpoC-His(5A4-RpoC)로부터 정제된 RNA 중합효소의 사용을 설명한다. 5A4-RpoC는 RNA 중합효소의 가장 큰 서브유닛을 코딩하는 rpoC 유전자에 10XHis-태그를 보유하는 이전에 발표된 균주입니다. 시험관내 전사 분석은 균주 5A4-RpoC로부터 정제된 RNA 중합효소, 하우스키핑 시그마 인자 RpoD의 재조합 버전 및 PCR 생성 이중 가닥 DNA 템플릿으로 구성됩니다. 체외 전사 분석을 조립하기 위한 단백질 정제 기술 및 접근 방식은 개념적으로 잘 알려져 있고 비교적 일반적이지만, RNA 중합효소에 대한 취급 고려 사항은 종종 유기체마다 다릅니다. 여기에 제시된 프로토콜은 B. burgdorferi RNA 중합효소에 대한 효소 연구를 위해 설계되었습니다. 상기 방법은 RNA 중합효소의 활성에 대한 전사 인자, 프로모터 및 번역후 변형의 역할을 시험하기 위해 적응될 수 있다.
Introduction
라임병과 재발열은 Borrelia 및 Borreliella 속의 스피로헤타 병원 균에 의해 발생합니다 1,2,3. 라임병은 북미에서 두드러진 매개체 매개 질병이며, 결과적으로 Borreliella burgdorferi는 스피로헤타 생물학을 연구하는 저명한 모델 유기체입니다 4,5. 전사 조절의 B. burgdorferi 메커니즘에 대한 조사는 진드기 벡터와 포유류 숙주 사이를 순환할 때 환경 변화에 대한 적응을 더 잘 이해하는 것을 목표로 합니다 6,7. pH, 온도, 삼투압, 영양소 가용성, 단쇄 지방산, 유기산, 용존 산소 및 이산화탄소 수준의 변화는 B. burgdorferi가 절지동물 벡터에서 생존하고 동물을 감염시키는 데 중요한 유전자의 발현을 조절합니다 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. 자극에 대한 이러한 반응을 조절 메커니즘과 연결하는 것은 B. burgdorferi 연구19의 중요한 측면이었습니다.
전사 인자와 시그마 인자는 세포 과정을 수행하는 유전자의 전사를 조절합니다. 라임과 재발열 스피로헤타에는 비교적 희박한 전사 인자와 대체 시그마 인자 세트가 있습니다. 그럼에도 불구하고 B. burgdorferi가 환경에 대한 반응을 지시하는 복잡한 전사 변화가 있습니다20,21,22. 환경 변화에 대한 반응으로 B. burgdorferi의 전사 변화를 유도하는 구체적인 메커니즘은 아직 명확하지 않습니다. 시험관 내 전사 분석은 전사 인자 및 시그마 인자23,24,25,26의 기능 및 조절 메커니즘을 분석하기 위해 생화학적 접근법을 사용하기 위한 강력한 도구입니다.
B. burgdorferi RNA 중합효소를 이용한 시험관 전사 분석 시스템이 최근에 확립되었다24. 박테리아는 종종 독특한 세포 생리학을 가지고 있기 때문에 다른 종과 속의 RNA 중합효소는 효소 정제, 효소 저장 및 반응 완충 조건에 다르게 반응합니다27. B. burgdorferi는 또한 RNA 중합효소가 연구된 많은 박테리아 종과 유전적으로 거리가 멀다20. 용해, 세척 및 용출 완충액 조건, 저장 완충액, 시험관내 전사 반응 완충액 및 분석 구축 방법과 같은 효소 준비의 측면은 모두 RNA 중합효소 활성을 변경할 수 있습니다. 여기에서 우리는 RNA 중합효소 및 시그마 인자 RpoD의 정제, 선형 이중 가닥 DNA 템플릿의 생산 및 이 시스템을 사용하는 실험실 간의 재현성을 용이하게 하기 위한 시험관 내 전사 분석의 구축을 위한 프로토콜을 제공합니다. RpoD 의존적 전사의 선형 범위를 보여주기 위한 반응의 예를 자세히 설명하고 이 접근 방식의 한계와 대안에 대해 논의합니다.
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Protocol
1. RNA 중합효소의 정제 및 RNA 중합효소 스톡의 제조
- 미세호기성 환경(34°C, 5% CO 2, 3% O 2)에서 BSKII 배지에서 배양된 B. burgdorferi RpoC-His10X의 2-4L에서 이전에 설명한 세포 수집 프로토콜28,29를 사용하여2-4 x 107 cells/mL의 밀도로 세포 펠릿을 수집합니다. 500mL 원심분리 병에서 4°C에서 10,000 x g에서 30분 동안 원심분리를 수행하고 상층액을 붓습니다.
- 30mL의 빙냉 HN 완충액(10mM HEPES, 10mM NaCl, pH 8.0)에 세포를 재현탁합니다. 50 mL 원심분리 튜브를 이용하여 상기와 같이 원심분리 단계를 반복하고, 상층액을 경사 분리한다.
알림: 정지 지점. 세포 펠릿을 -80°C에서 동결하여 최대 2주 동안 세포를 저장하거나 즉시 세포 용해를 진행합니다. - 세포, 용해물 및 정제된 단백질을 동결되지 않는 한 4°C 또는 얼음 위에 유지한다. 이 프로토콜에 사용된 모든 완충액에 2mM 농도로 새로 제조된 DTT를 첨가하여 RNA 중합효소를 환원 환경에 유지하고 pH 8.0을 유지합니다.
- 키트 지침에 따라 상업용 박테리아 용해 키트를 사용하여 B. burgdorferi 세포 펠릿에서 용해물을 준비합니다. 프로테아제 억제제가 없는 실온(RT) B-PER 용액 10-15mL에 펠릿을 재현탁하고 얼음에서 5분 동안 용해를 진행합니다. 용해 부피는 키트 지침에 설명된 대로 세포 펠릿 크기에 따라 다릅니다.
- 프로테아제 억제제 칵테일을 용해 용액에 첨가한 다음, 대표적인 결과 섹션에 설명된 대로 3라운드의 초음파 처리가 뒤따른다.
알림: 또는 앞서 설명한 대로 프렌치 압력 셀에서 셀을 용해합니다24. 1.4단계를 건너뜁니다. 및 1.5 단계. - 원심분리를 사용하여 세포 용해물을 정화하고 50mL 원심분리기 튜브를 사용하여 여과합니다. 용액에 코발트 컬럼 로딩 완충액(표 1)을 추가하여 튜브의 부피를 총 부피 30mL 이상으로 채웁니다. 세포 파편을 20,000 x g 에서 30분 동안 원심분리하여 펠릿화합니다.
- 0.45μm 주사기 필터를 사용하여 상층액을 여과합니다.
- 용해물을 코발트 컬럼 로딩 완충액(표 1)에서 1:10 최종 희석 비율로 희석합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 코발트 또는 니켈 수지 컬럼을 사용하여 정화된 세포 용해물 상청액에 대해 친화성 크로마토그래피를 수행합니다. 예제는 대표 결과 섹션을 참조하세요. 표 1에 나열된 버퍼를 사용합니다. 분석을 위해 flow-through, wash 및 elution 샘플을 수집합니다.
- 용출 완충 용액의 RNA 중합효소를 제조업체의 지침에 따라 완충액 교환 컬럼을 사용하여 RNA 중합효소 저장 완충용액(표 1)으로 즉시 교환합니다.
- 10kDa 컷오프 원심 필터 장치를 사용하여 RNA 중합효소를 분광광도법으로 측정한 농도 0.2-0.4mg/mL로 농축하여 냉동고 재고를 준비합니다(흡광 계수 조정 없이280nm [1cm에서 1abs = 1mg·mL-1]).
- 분취량 RNA 중합효소 냉동고는 PCR 튜브에 20-50μL 용량으로 보관하고 RNA 중합효소를 -80°C에서 보관합니다.
- SDS-PAGE에 의해 친화성 크로마토그래피의 품질을 결정하고, 분광광도법 또는 BCA 분석에 의해 총 단백질 수율을 측정한다. SDS-PAGE에 의한 우수한 분해능을 위해 120V에서 50분 동안 7.5% 폴리아크릴아미드 겔에서 샘플을 실행합니다.
2. 재조합 RpoD의 정제 및 RpoD 스톡의 제조
- 배양 및 말토스 결합 단백질 태그된 재조합 B. burgdorferi RpoD(MBP-RpoD)의 발현을 BL21::MBP-RpoDBb에 기재된 바와 같이, 표 of Materials에 열거된 단백질 융합 및 정제 시스템 사용 설명서에 기재된 바와 같이, 원심분리를 통해 세포를 수집한다.
알림: 정지 지점. 세포 펠릿을 -80°C에서 동결하여 최대 2주 동안 세포를 저장하거나 즉시 세포 용해를 진행합니다. - 상업용 박테리아 세포 용해 키트 또는 프렌치 압력 셀을 사용하여 용해를 수행합니다. 표 1의 용해 버퍼 예를 참조하십시오.
- 원심분리 및 여과를 사용하여 세포 용해물을 정화합니다. 세포 파편을 20,000 x g 에서 30분 동안 원심분리하여 펠릿화합니다. 0.45 μm 필터를 사용하여 상청액을 여과합니다.
- 발현 시스템에 대한 단백질 추출 프로토콜을 사용하여 MBP-RpoD를 추출합니다. 대표 결과 섹션(예: 구현 세부 정보 및 결과)을 참조하세요.
- SDS-PAGE에 의한 친화성 크로마토그래피 공정 및 용출의 품질을 결정하고 분광광도법으로 단백질 수율을 측정합니다(흡광 계수 조정이 없는280nm [1cm에서 1abs = 1mg·mL-1]). SDS-PAGE에서 분리를 위해 200V에서 30분 동안 10% 폴리아크릴아미드 겔을 사용합니다.
- MBP-RpoD를 10kDa 컷오프 원심 필터를 사용하여 분광 광도계로 측정한 >2mg/mL 농도로 농축합니다.
- Factor Xa 절단 부위의 RpoD에서 MBP를 절단합니다. 2 mM의 농도로 MBP-RpoD를 함유하는 친화성 크로마토그래피 용출 분획에CaCl2 를 첨가한다. 정제된 단백질 30mg당 200μg의 Factor Xa 프로테아제를 추가합니다. RT에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
- SDS-PAGE에 의해 RpoD에서 MBP의 완전한 분할을 확인합니다. SDS-PAGE에서 분리를 위해 200V에서 30분 동안 10% 폴리아크릴아미드 겔을 사용합니다.
- MBP 및 RpoD 함유 용액을 헤파린 결합 완충액으로 1:10의 비율로 희석합니다.
- FPLC에 의해 헤파린 컬럼에서 MBP와 RpoD를 분리합니다. FPLC 설정은 표 2 를 참조하십시오.
- SDS-PAGE로 친화성 크로마토그래피 산물의 품질을 측정하고 분광광도법으로 단백질 수율을 측정한다. SDS-PAGE에서 분리를 위해 200V에서 30분 동안 10% 폴리아크릴아미드 겔을 사용합니다.
- 10kDa-컷오프 원심분리 필터를 사용하여 RpoD를 포함하는 용출 분획을 2-3mL의 최종 부피로 농축합니다.
- 농축된 RpoD 용출 분획을 겔 여과 컬럼을 사용하여 저장 완충액으로 완충액으로 완충액으로 교환한다.
- 분광 광도계에 의해 결정된 바와 같이 10kDa 컷오프 원심 필터를 사용하여 0.2-0.8 mg/mL의 농도로 RpoD 스톡을 농축합니다.
- 분취량 RpoD는 PCR 튜브에 20-50 μL 부피로 저장되며 -80 °C에서 보관됩니다.
3. DNA 주형 스톡 준비
- PCR은 200 μL 반응을 사용하여 B. burgdorferi 게놈 DNA로부터 RpoD 구동 프로모터 부위를 둘러싸고 있는 500 bp 영역을 증폭합니다(표 3).
- 상용 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 산물을 정제합니다. 분자 생물학 등급 H2O에서 DNA를 용출합니다.
- PCR에서 생성된 DNA 주형의 몰 농도를 분자생물학 등급H2O로 희석하여 100 nM로 조정한다.
4. 방사성 표지 된 뉴클레오티드의 혼입으로 시험관 내 전사를 수행하십시오
- 시험관 전사 실험 계획을 준비합니다. RNA 중합효소, RpoD 및 DNA 템플릿 농도를 결정합니다. 반응 튜브에 대한 분취량 부피와 피펫팅 순서를 결정합니다. 예를 들어 표 4와 그림 1을 참조하십시오.
참고: RNA 중합효소, 대체 중합효소, 템플릿 없음 또는 대체 템플릿을 포함하지 않는 반응과 같은 대조군을 실험 계획에 포함합니다. - 실험에 필요한 α-32P-ATP의 부피를 계산합니다. 이것을 실험 계획에 통합하십시오. 전형적으로, 형광체화 검출을 위한 시험관내 전사 반응당 2 μCi의 활성을 포함한다.
- 방사선 오염 위험을 줄이기 위해 방사선 벤치를 포함한 작업 표면을 준비하십시오.
- RNA 중합효소, Rpo, 5x 완충액 NTP 및 템플릿 스톡 용액의 신선한 분취량을 얼음에서 해동합니다. 피펫팅하기 전에 해동된 모든 냉동 육수를 완전히 혼합하십시오.
- 실험 계획에 따라 방사성 동위원소 동위원소 뉴클레오티드에 대한 마스터 반응 혼합물 및 별도의 NTP 혼합물을 제조한다.
- 반응에 방사성 표지를 첨가하기 위해 대조 반응과 실험 세트를 PCR 튜브에 분배합니다. H2O, 반응 마스터 믹스, RNA 중합효소 및 RpoD를 지정된 PCR 튜브에 부드럽게 분주하고 피펫팅으로 혼합합니다.
- 준비된 재료를 방사선 벤치로 옮깁니다.
- α-32P-ATP를 NTP에 넣고 부드러운 피펫팅으로 혼합합니다.
주의 : 방사성 물질로 작업하는 동안 방사성 동위원소에 대한 적절한 보호 장비와 취급 절차를 사용하십시오. - 단계 4.6의 시험관내 전사 반응 혼합물을 포함하는 튜브에 NTP를 추가합니다.
- DNA 주형의 추가로 시험관내 전사 반응을 시작한다. 부드럽게 피펫팅하여 반응 부피를 혼합합니다.
- 37°C에서 5분 동안 열순환기 또는 열 블록에서 튜브를 배양합니다.
- 열순환기 또는 열 블록에서 반응을 제거하고 50% 포름아미드를 함유한 2x RNA 로딩 염료를 동일한 반응 부피에 추가하여 시험관 내 전사 반응을 중지합니다.
- 65°C에서 5분 동안 열순환기 또는 열 블록에서 반응을 배양하여 효소를 변성시킵니다.
- 180V에서 30-45분 동안 10%-15% TBE 요소 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 겔 전기영동에 의해 시험관 내 전사 반응 혼합물에서 RNA를 분리합니다.
참고 : 겔 전기 영동 조건에 따라, 완충 용액은 방사성 표지 된 뉴클레오티드로 오염 될 수 있거나 겔은 방사성 표지 된 뉴클레오티드의 대부분 또는 전부를 함유 할 수있다. 적절한 방사능 저장 또는 폐기를 계획하십시오. - 통합되지 않은 방사성 표지 ATP를 함유하는 겔의 임의의 부분을 제거한 후 포스 포 스크린을 사용하여 방사성 표지 된 RNA를 이미지화한다. 겔을 포스포스크린에 밤새도록(16시간) 노출시키고 포스포스크린 이미저(100μm 분해능, 700V PMT 튜브 전압)를 사용하여 이미지화합니다.
- 밀도 측정 방법24를 사용하여 데이터 분석.
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Representative Results
반응의 제한 단계가 시그마 인자-매개 전사 개시인 시험관내 전사 반응에서, 전사 활성은 시그마 인자의 양에 따라 선형적으로 증가해야 한다. 우리는 RNA 산물에 방사성 표지 된 뉴클레오티드 결합의 결과적인 다양한 신호를 관찰하기 위해 두 가지 농도의 RNA 중합 효소와 함께 다양한 RpoD 농도를 테스트하는 시험관 내 전사 실험의 준비를 제시합니다. RNA 중합효소, RpoD, 및 이중-가닥 DNA 주형 스톡의 제조의 대표적인 결과가 제시되어 있다. 대표적인 시험관내 전사 반응은 분석에 허용가능한 RNA 중합효소 활성 수준의 예로서 작용한다.
RNA 중합효소의 정제를 위해, B. burgdorferi RpoC-His10X의 4 L 배양물을 미세호기성 조건(5% CO2, 3%O2) 하에서 34°C에서 성장시켰다. 배양물은 암시야 현미경을 사용하여 스피로헤타 밀도에 대해 면밀히 모니터링되었으며 4 x 107 스피로헤타/mL보다 높은 밀도에 도달하기 전에 수집되었습니다. 세포를 용해를 위해 B-PER 혼합물에 재현탁시켰다(표 1). 세포 펠릿은 피펫팅에 의해 균질화되었고, 이어서 RT에서 5 분 배양되었고, 후속 초음파 처리 라운드가 3 초 동안 세 번 수행되었다. 정화된 용해물을 코발트 컬럼 로딩 완충액 및 5 mL의 코발트 수지로 총 부피 180 mL로 희석하였다. RpoC-His10X는 4°C에서 1시간 동안 혼합물을 넛화하여 코발트 수지에 결합하도록 하였다. 혼합물을 중력 유동 컬럼으로 옮기고, 40 mL의 컬럼 세척 완충액으로 5회 세척하였다. 결합된 단백질은 5mL의 용출 완충액을 컬럼에 통과시켜 방출하였으며, 용출을 7회 반복하였다. 플로우 스루(flow-through), 세척(washes) 및 용출 분획(elution fraction)의 샘플을 SDS-PAGE로 분리하고 염색 통합(stain incorporation)으로 이미지화했습니다(그림 1). RNA 중합효소 코어 복합체는 각각 154kDa, 129kDa 및 38.5kDa 크기의 RpoC, RpoB 및 RpoA로 구성됩니다. 그림 1에 표시된 대표적인 결과는 RNA 중합효소 복합체를 구성하는 3개의 펩타이드 크기에서 3개의 두드러진 밴드를 보여줍니다. 친화성 크로마토그래피의 플로우 스루에는 0.5-1mg/mL의 단백질이 포함되어 있으며 260/280 비율은 1.0과 1.7 사이로 핵산 농도가 더 높음을 나타냅니다. 분광광도법에 의해 결정된 단백질 혼합물의 농도에 따른 RNA 중합효소 단백질 수율은 0.3mg/mL였습니다.
RpoD 단백질 스톡을 제조하기 위해, BL21 (DE3) pLysS E. coli의 pMAL-C5X 플라스미드로부터 C-말단 말단 결합 단백질 태그를 갖는 재조합 RpoD를 발현시켰다. 2 L의 대장균 을 32°C에서 0.5의 OD600nm 로 성장시켰다. 이어서, 배양물을 0.3 mM IPTG로 처리하여 1시간 동안 RpoD의 발현을 유도하였다. 세포를 원심분리에 의해 펠릿화하고 B-PER에서 용해시켰다. 생성된 200 mL의 희석된 세포 용해물을 10 mL의 아밀로스 수지를 통해 여과하였다. 수지를 40mL의 결합 완충액으로 8회 세척하여 잔류 DNA 및 펩티드를 제거하였다. MBP-tagged RpoD를 5mL의 용출 완충액으로 수지 컬럼에 5회 용출시켰다. 결합 및 세척 단계로부터의 흐름과 용출 분획을 SDS-PAGE로 분석하였다(도 2A). 용출 분획의 주요 성분은 ~115kDa의 펩타이드로, MBP 태그가 부착된 재조합 B. burgdorferi RpoD의 크기와 일치합니다. 용출 분획을 합하고,CaCl2 농도를 2mM로 조정하고, 정제된 단백질 40mg에 FactorXa 프로테아제 100μg을 첨가하였다. 실온에서 밤새 소화한 후, 반응을 SDS-PAGE로 분석하였다(도 2B). 인자 Xa 프로테아제로 절단한 후, 혼합물의 두 가지 주요 생성물은 RpoD(73.6kDa) 및 MBP(45kDa)였습니다. RpoD 및 MBP 단백질의 혼합물을 헤파린 친화성 크로마토그래피를 사용하여 분리하였다. 혼합물을 헤파린 결합 완충액에 1:10 비율로 희석하고 FPLC의 헤파린 결합 수지 컬럼에 로딩했습니다. RpoD는 1 M의 농도까지 NaCl의 증가된 구배로 용리되었다. 분획을 SDS-PAGE로 분석했을 때, 400-600 mM NaCl 범위의 용출 분획에서 73.6 kDa 크기의 주요 밴드가 명백하였다(도 2C). 일부 분해된 RpoD 단편은 공동 정제되었습니다. RpoD-함유 분획을 합하고, 완충액을 RpoD 저장 완충액으로 교환한 다음, 10 kDa-컷오프 원심분리 필터를 사용하여 농축하였다. 최종 RpoD 농도는 분광광도법에 의해 측정된 0.67mg/mL(9.1mM)였습니다.
B. burgdorferi flgB의 프로모터 부위를 포함하는 이중 가닥 DNA 주형을 PCR에 의해 생성하였다. flgB 프로모터는 30 ng의 B. burgdorferi DNA 24,30을 함유하는200 μL 반응을 사용하여 프로모터의 250 bp 상류 및 하류에 해당하는 프라이머에 의해 증폭되었다 (표 6). PCR 산물을 1% 아가로스 겔에서 겔 전기영동으로 분석하였다(도 3). PCR 산물은 크기가 약 500bp였으며 겉보기에 균질했습니다. 중요하게도, 염 및 세포 성분 오염은 시험관 내 전사 반응 결과의 가변성에 기여할 수 있습니다. DNA 템플릿이 PCR 정제 컬럼에서 완전히 탈염되었는지 확인합니다.
주형 DNA의 첨가에 의해 전사가 개시되는 실험 계획은 프로모터 인식 및 전사 개시의 속도를 시험할 수 있다. 우리의 대표적인 실험에서, RpoD 단백질의 희석 시리즈는 16 nM-1 μM 범위의 물에서 2 배 희석하여 제조되었습니다. 활성에 필요한 2가 양이온을 함유하는 반응 완충액에 RNA 중합효소를 함유하는 마스터 믹스를 생성하였다(표 4 및 표 5). RpoD와 마스터 믹스는 얼음 위에서 함께 분배되었습니다. RNA 중합효소 및 RpoD를 함유하는 마스터 믹스를 인큐베이션하는 동안 시험관내 전사의 다른 단계를 준비하였다. 우리는 세 가지 대조 반응을 통합했습니다: 마스터 믹스와 별도로 준비된 양성 대조 반응, 시험관 내 전사 신호가 주형 의존적인지 확인하기 위해 주형 DNA가 없는 음성 대조 반응, 신호가 RNA 중합효소 의존적인지 확인하기 위한 RNA 중합효소가 없는 음성 대조 반응. 방사성 표지 된 뉴클레오티드를 5 μL의 (α-32P-ATP)를 20 μL의 10x NTP 스톡 혼합물에 혼합하여 반응에 첨가하여 회복 불가능한 부피를 보상하기 위해 20 회 반응에 충분한 분취량을 생성했다. 마지막으로, flgB 프로모터를 코딩하는 주형 DNA를 이전에 계획된 피펫팅 순서에 따라 피펫팅하여 반응 튜브에 도입했습니다(그림 4).
시험관내 전사에 의해 생성된 RNA 단편의 신호는 겔 전기영동에 의해 분리된 RNA를 함유하는 TBE-우레아 겔의 16시간 노출 기간 후 형광체 스크리닝에 의해 검출되었습니다. 500 nM 내지 16 nM 범위의 50 nM의 RNA 중합효소 및 RpoD를 포함하는 실험은 250 bp의 RNA 생성물을 생성하였다(도 5). RpoD 농도의 2배 희석 각각에 대해, 축적된 RNA 생성물의 더 낮은 수준이 있었다. 두드러진 밴드 아래에 나타나는 일련의 낮은 bp 생성물이 있었는데, 이는 전사 중단 또는 단편화된 DNA 주형으로 인한 불완전한 RNA 단편을 나타냅니다. RNA 생성물은 주형이 없는 대조군에서 부재했으며, 이는 이 분석에서 신호에 기여하는 외인성 DNA 단편이 없음을 나타냅니다. RNA 중합효소가 없는 대조군에서는 신호가 검출되지 않았으며, 이는 B. burgdorferi RNA 중합효소가 이 분석에서 RNA 생성에 기여하는 유일한 중합효소임을 나타냅니다.
두 번째 실험에서는 더 낮은 농도의 25nM RNA 중합효소를 사용했습니다(그림 6). 그림 5에 비해 테스트된 RpoD 농도 범위에서 더 적은 RNA 생성물이 검출되었으며 배경 신호 강도가 더 높았습니다. 이것은 밀도 측정에 의한 다운스트림 분석에 문제가 됩니다. 형광체 이미지를 밀도계로 분석했을 때(그림 7), 포스포스크린에서 얻은 밀도계 신호는 두 실험에서 반응에 존재하는 RpoD의 양 사이의 선형 관계를 나타냅니다. 그러나, 높은 배경 신호를 갖는 실험에서, 25 nM RNA 중합효소 및 100 nM 미만의 RpoD를 함유하는 반응은 상대적 전사 수준 비교를 위해 신뢰할 수 없었다.
그림 1: 친화성 크로마토그래피로 정제된 His-tagged B. burgdorferi RNA 중합효소의 분리. 세포 용해물의 흐름-통과 분획(레인 1), 첫 번째 세척 분획(레인 2), 마지막 세척 분획(레인 3) 및 5개의 용출 분획(레인 4-8)을 2x 샘플 로딩 완충액에 희석하고, 끓이고, 30분 동안 200V에서 구배 폴리아크릴아미드 겔에서 SDS-PAGE로 분리하였다 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 겔 전기영동에 의한 RpoD 정제 분석. (A) 아밀로스 수지 친화성 크로마토그래피에 의한 MBP 태그 RpoD의 정제에서 풀링된 유동 분획(레인 1 및 레인 2), 세척 분획(레인 3-5) 및 용출 분획(레인 6-10). (B) 인자 Xa 프로테아제를 사용하여 MBP와 RpoD의 절단에 따른 단백질 혼합물. (C) MBP와 RpoD를 분리하기 위해 헤파린 친화성 크로마토그래피에서 NaCl(레인 2-9)의 기울기가 증가하는 플로우스루 용액(레인 1) 및 용출 분획. 제시된 각각의 겔에서, 샘플을 2x 로딩 완충액과 혼합하고, 끓이고, 30분 동안 200V에서 SDS-PAGE를 사용하여 그래디언트 폴리아크릴아미드 겔에서 분리하였다.
그림 3: 시험관내 전사 템플릿의 PCR 생성. flgB 프로모터를 함유하는 500 bp 크기의 앰플리콘 (레인 1 및 레인 2) 및 다른 프로모터 부위의 앰플리콘을 함유하는 대조군 PCR 반응 (레인 3-4)을 나타내었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 실험 배열 및 피펫팅 시퀀스 계획. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: B. burgdorferi RNA 중합효소를 사용한 시험관 내 전사에 의해 생성된 RNA의 형광체 이미지 신호의 RpoD 의존적 가변성. 시험관내 전사 반응은 50nM의 RNA 중합효소와 밴드24 위에 표시된 다양한 수준의 RpoD를 포함했습니다. RNA는 10% TBE-요소 겔로 분리하고 형광체 스크린을 사용하여 16시간 동안 방사성 붕괴 신호를 캡처했습니다. 이 그림은 Boyle et al.에서 수정되었습니다.24. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 시험관 내 전사에 의해 생성된 RNA의 형광체 이미지 신호의 RpoD 의존적 가변성. 시험관내 전사는 25nM의 RNA 중합효소와 밴드 위에 표시된 다양한 수준의 RpoD를 포함했습니다. RNA는 15% TBE-요소 겔로 분리되었고, 형광체 스크린은 16시간 동안 방사성 붕괴로부터 신호를 포착하는 데 사용되었습니다. RNA 중합효소 농도가 낮고 배경 신호가 높을수록 정확한 측정이 어려워졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 : RpoD 수준이 증가함에 따라 시험관 내 전사 반응에서 방사성 표지 된 RNA 축적 증가. 형광체 스크린 이미징에서 감지된 신호는 배경 빼기 없이 밀도계로 분석되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 미디어 레시피. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: FPLC 설정. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: PCR 반응. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 4: 50 nM RNA 중합효소 실험 계획 및 부피 계산. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 5: 25 nM RNA 중합효소 실험 계획 및 부피 계산. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 6: 이 프로토콜에 사용된 균주 및 올리고뉴클레오티드. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
제시된 프로토콜을 사용하여 구성된 시험관 내 전사 분석은 최근 B. burgdorferi에서 전사 인자의 역할을 연구하는 데 사용되었으며 다른 전사 인자, 시그마 인자 및 분자23을 사용하여 유사한 실험을 구축하는 데 적용될 수 있습니다. B. burgdorferi의 활성 RNA 중합효소를 얻고 그 활성이 검출되면 시험관 내 전사 분석 내의 구성 요소 및 조건을 수정할 수 있습니다. 이 분석은 매우 유연하고 수정 가능합니다. 반응은 모듈식이며 냉동 재고로 제작되며 실험 매개변수가 선택되면 리드 타임이 거의 필요하지 않습니다. 충분한 재고가 주어지면 1일 내에 여러 실험을 수행할 수 있습니다.
활성 RNA 중합효소를 얻는 것은 시험관내 전사 반응 준비의 가장 중요한 측면입니다. 이 프로토콜에 설명된 대로 중간 로그 성장 단계로 성장한 세포에서 RNA 중합효소를 수확하는 것이 좋습니다. 임의의 박테리아로부터 RNA 중합효소를 정제할 때, 성장률은 활성 RNA 중합효소를 정제하는 데 중요한 인자로서 주목되어 왔다. RNA 중합효소는 번역후 변형을 축적할 수 있고, 성장의 정지기에서 억제성 전사인자와 연관될 수 있다31. 우리는 고정상으로 성장한 B. burgdorferi 배양물에서 다량의 활성 RNA 중합효소를 정제하는 데 성공하지 못했습니다. 친화성 크로마토그래피 접근법은, 물리적 분리 접근법32과 비교하여, 유기체가 배양에서 낮은 밀도에 도달하고, 다량의 세포 배양물을 축적하는 것이 상대적으로 물질 집약적이기 때문에 B. burgdorferi 로부터의 정제에도 유익하다.
다른 박테리아 RNA 중합효소를 정제하는 동안, 시그마 인자는 정제 방법 및 조건에 따라 상당한 양으로 공동 정제할 수 있다33,34,35,36. 시그마 인자의 공동 정제는 대체 시그마 인자, 수정된 시그마 인자 또는 시그마 인자의 부족을 사용하여 다운스트림 실험을 제한할 수 있습니다. 또한, 하우스키핑 시그마 인자 RpoD를 보충하면 시그마 인자37의 초기 공동 정제에 관계없이 활성을 검출하는 데 도움이 됩니다. RNA 중합효소 코어로부터 시그마 인자를 분리할 수 있는 유연성으로 인해, 본 발명자들은 여기에 설명된 His-친화성 크로마토그래피 정제 조건 하에서 시그마 인자를 공동 정제하지 않는 것이 유리하다고 생각한다. RpoD를 함유하는 더 온전하고 활성인 홀로엔자임을 생성하기 위해 정제 조건을 변경할 수 있습니다. 예를 들어, 염 농도는 다중 서브유닛 효소의 안정성에 영향을 미칠 가능성이 높으며, B. burgdorferi RNA 중합효소 복합체 또는 이의 2가 양이온 혼입의 안정성에 대한 이미다졸 농도의 영향도 알려져 있지 않습니다.
B. 부르그도르페리 RNA 중합효소 활성은 존재하는 2가 양이온의 종류 및 양에 민감하다(24). 우리는 망간이 최대 RNA 중합효소 활성에 필요하고 마그네슘이 활성에 덜 기여하는 것으로 나타났다는 것을 발견했습니다. 물 속의 오염 이온은 RNA 중합효소 효소 활성에 많은 양의 가변성을 추가합니다. 결과적으로, 금속 이온이 거의 존재하지 않는 분자 생물학 등급, HPLC 등급 및 금속 분석 등급H2O와 같은 고순도 물은 여기에 설명된 프로토콜에서 더 높은 RNA 중합효소 활성에 필수적입니다. RNA 중합효소는 또한 pH에 민감하며, 정제 동안 환원 환경을 필요로 한다27. 변경된 pH 또는 환원제로서의 BME의 사용은 비활성 RNA 중합효소를 초래했습니다. 시중에서 판매되는 E. coli RNA 중합효소를 대조군으로 사용하여 시험관 내 전사 분석법의 적절한 구성을 보장할 것을 권장한다24. 대장균 RNA 중합효소는 뉴클레오티드의 생존력, 주형 구성 방법, 방사성 표지 결합, RNA 분리 및 신호 검출 방법의 시험을 허용할 것이다. 그러나 B. burgdorferi RNA 중합효소는 대장균에 비해 특정 2가 양이온, 완충액 및 프로모터 요구 사항을 가지고 있다는 점에 유의해야 합니다.
시험관내 전사 반응에 사용할 수 있는 몇 가지 검출 방법이 있습니다. 염료 혼입 및 분자 표지 분석은 방사성 표지 검출 방법38,39에 대한 일반적인 대안입니다. 방사성 표지 된 뉴클레오티드 혼입은 현재 가장 민감한 RNA 검출 방법입니다. 대체 분석은 방사성 표지 분석에 비해 측정 가능한 신호 수준에 도달하기 위해 더 많은 RNA 중합 효소가 필요합니다. 또한 염료 혼입 및 분자 비콘 방법은 일반적으로 신호가 잘못될 수 있는 더 많은 방법을 가지고 있습니다. 예를 들어, DNase 오염으로 인해 분자 비콘이 표적이 없을 때 신호를 방출할 수 있습니다. 방사성 표지 통합을 사용하면 B. burgdorferi RNA 중합 효소의 상대적 활성을 낮은 수준에서도 검출 할 수 있으며, 이는 RNA 중합 효소 효소의 초기 실험에 적합합니다.
반응에 포함된 B. burgdorferi RNA 중합효소의 농도는 분광광도법에 의해 표준화되지만, 이 측정은 변동성의 원인이 될 수 있습니다. RNA 중합효소의 특이적 활성은 전체 단백질 혼합물(40)의 일부인 완전히 형성된 활성 홀로엔자임의 수에 의존할 수 있다. 예를 들어, 우리의 결과에서 보고된 RNA 중합효소의 50nM의 몰량은 분광광도법에 의해 결정되었지만, 정량적 웨스턴 블로팅에 의한 소단위 수량을 분석한 결과 RpoA 소단위체가 잠재적인 RNA 중합효소 홀로엔자임의 수를 제한하는 성분이었고, 우리의 혼합물에서 최대21nM의 완전히 형성된 RNA 중합효소가 가능했습니다 24. 실험은 항상 RNA 중합효소 및 시험관 내 전사 반응의 다른 구성 요소의 배치 간 변동을 제어하기 위해 수행되어야 합니다.
그림 5에 표시된 대표적인 실험에서 RpoD 레벨이 변경되었으며 RpoD와 감지된 신호 간의 선형 관계가 입증되었습니다. 시험관 내 전사는 제시된 실험 템플릿을 사용하여 쉽게 변경할 수 있는 다용도 방법입니다(표 4). 예를 들어, 대안적인 시그마 인자 또는 대안적인 DNA 주형은 쉽게 시험될 수 있다24. 대안적 주형은 슈퍼코일 및 메틸화된 DNA 특징을 도입하기 위해 세포로부터 정제된 PCR 또는 플라스미드에 의해 생성된 상이한 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 주어진 수준의 RpoD, RNA 중합효소 및 주형에 대해, 상이한 수준의 전사 인자를 프로모터로부터의 활성의 억제 또는 향상을 보기 위해 첨가될 수 있다23. 시험관내 전사 반응 내에서 성분 첨가 및 몰비의 순서는 전사 개시 복합체가 반응 개시 전에 형성되도록 변경될 수 있고; 이러한 반응은 전사 개시 대신에 전사 신장을 측정할 수 있다40. 시험관 내 전사 분석은 B. burgdorferi 생물학에 대한 다양한 조사에 맞게 변경될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작업은 Creighton University의 Health Sciences Strategic Investment Fund Faculty Development Grant의 지원을 받았습니다. B. burgdorferi RpoC-His10X 균주는 몬태나 대학의 D. Scott Samuels 박사가 친절하게 제공했습니다. 맥아당 결합 단백질 태그가 부착된 rpoD 대립유전자를 암호화하는 pMAL-C5X 플라스미드를 보유하는 대장균 균주는 NIH NIAID에 있는 Rocky Mountain Laboratories의 Frank Gherardini 박사가 친절하게 제공했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 micron syringe filter | Thermo Scientific | 726-2545 | Step 1.7 and 2.3 |
| 50 mL conical tubes | MidSci | C50B | Step 1.3, and subsequent steps |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Thermo Scientific | 3119-0050PK | Step 1.2 |
| 500 mL Centrifuge bottles | Thermo Scientific | 3120-9500PK | Step 1.1 |
| B-PER and instruction manual | Thermo Scientific | 78248 | Step 1.4 and 2.2 |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Step 2.6 |
| Centrifugal filters 10 Kd cutoff | Millipore Sigma | UFC8010 | Step 1.11 and 2.11 |
| Cobalt resin and instruction manual | Thermo Scientific | 89969 | Step 1.9 |
| Dithiothreitol | Acros Organics | 426380500 | Step 1.4 and subsequent steps |
| Dnase (Nuclease) | Millipore Sigma | 70746 | Step 1.4 and 2.2 |
| Factor Xa Protease | Haematologic Technologies | HCXA-0060 | Step 2.6 |
| GE Typhoon 5 Phosphoimager | GE lifesciences | Multiple | Step 4.15 |
| Gel Imager | Bio-Rad | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| H2O for in vitro transcription | Fisher Scientific | 7732-18-5 | Step 3.2 and 3.3 |
| high fidelity PCR kit | New England Biolabs | M0530S | Step 3.1 |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | Step 1.1, and subsequent steps | |
| HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL | Cytiva Life Sciences | 17040601 | Step 2.8 |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750-100G | Step 1.9 |
| Lysozyme | Thermo Scientific | 90082 | Step 1.4 and 2.2 |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | S25401 | Step 4.1 |
| Manganese chloride | Fisher Scientific | S25418 | Step 4.1 |
| Mini protean tetra cell | Bio-Rad | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | Step 4.1 |
| NTP mixture | Thermo Scientific | R0481 | Step 4.1 |
| PCR purification kit | Qiagen | 28506 | Step 3.2 |
| PCR tubes | MidSci | PR-PCR28ACF | Step 1.12 |
| PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual | Cytiva | 17085101 | Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column) |
| pMAL Protein Fusion and Purification System Instruction manual |
New England Biolabs | E8200S | Step 2.1 |
| Polyacrylamide gels AnyKD | Bio-Rad | 456-8125 | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| Potassium glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Step 4.1 |
| Protease inhibitor | Thermo Scientific | 78425 | Step 1.4 and 2.2 |
| Radiolabeled ATP | Perkin Elmer | BLU503H | Step 4.2 |
| RNA Loading Dye, (2x) | New England Biolabs | B0363S | Step 4.13 |
| Rnase inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | Step 4.1 |
| Spectrophotometer | Biotek | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| TBE-Urea gels 10 percent | Bio-Rad | 4566033 | Step 4.14 |
References
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