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Immunology and Infection

Componentes essenciais de ensaios de transcrição in vitro de Borreliella (Borrelia) burgdorferi

Published: July 22, 2022 doi: 10.3791/64134
Automatic Translation
1, 1, 1
1School of Medicine, Creighton University

Summary

Ensaios de transcrição in vitro podem decifrar os mecanismos de regulação transcricional em Borreliella burgdorferi. Este protocolo descreve as etapas para purificar a RNA polimerase de B. burgdorferi e realizar reações de transcrição in vitro. Abordagens experimentais usando ensaios de transcrição in vitro requerem purificação e armazenamento confiáveis da RNA polimerase ativa.

Abstract

Borreliella burgdorferi é um patógeno bacteriano com repertórios metabólicos e genômicos limitados. B. burgdorferi transita extracelularmente entre vertebrados e carrapatos e remodela dramaticamente seu perfil transcricional para sobreviver em ambientes díspares durante a infecção. Um foco dos estudos de B. burgdorferi é entender claramente como a bactéria responde ao seu ambiente através de mudanças transcricionais. Ensaios de transcrição in vitro permitem dissecar bioquimicamente os mecanismos básicos de regulação transcricional. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado descrevendo purificação e armazenamento da polimerase de RNA de B. burgdorferi , purificação do fator sigma, geração de molde de DNA e ensaios de transcrição in vitro . O protocolo descreve o uso da RNA polimerase purificada de B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC). 5A4-RpoC é uma cepa publicada anteriormente que abriga um 10XHis-tag no gene rpoC que codifica a maior subunidade da RNA polimerase. Os ensaios de transcrição in vitro consistem na RNA polimerase purificada da cepa 5A4-RpoC, uma versão recombinante do fator sigma housekeeping RpoD e um molde de DNA de fita dupla gerado por PCR. Enquanto as técnicas de purificação de proteínas e as abordagens para montagem de ensaios de transcrição in vitro são conceitualmente bem compreendidas e relativamente comuns, as considerações de manuseio para RNA polimerases frequentemente diferem de organismo para organismo. O protocolo aqui apresentado destina-se a estudos enzimáticos da RNA polimerase de B. burgdorferi. O método pode ser adaptado para testar o papel de fatores de transcrição, promotores e modificações pós-traducionais na atividade da RNA polimerase.

Introduction

A doença de Lyme e a febre recidivante são causadas por patógenos espiroquetas dos gêneros Borrelia e Borreliella 1,2,3. A doença de Lyme é uma proeminente doença transmitida por vetores na América do Norte e, consequentemente, a Borreliella burgdorferi é um organismo modelo proeminente para estudar a biologia das espiroquetas 4,5. Investigações sobre os mecanismos de regulação transcricional de B. burgdorferi visam compreender melhor suas adaptações às mudanças no ambiente à medida que circula entre seu carrapato vetor e hospedeiros mamíferos 6,7. Alterações no pH, temperatura, osmolaridade, disponibilidade de nutrientes, ácidos graxos de cadeia curta, ácidos orgânicos e níveis de oxigênio dissolvido e dióxido de carbono modulam a expressão de genes importantes para a sobrevivência de B. burgdorferi em seu artrópodes vetor e infectar animais 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. A ligação dessas respostas a estímulos com mecanismos regulatórios tem sido um aspecto importante na pesquisa com B. burgdorferi19.

Fatores de transcrição e fatores sigma controlam a transcrição de genes que realizam processos celulares. As espiroquetas de Lyme e febre recidivante abrigam um conjunto relativamente escasso de fatores de transcrição e fatores sigma alternativos. Apesar disso, existem complexas alterações transcricionais direcionando as respostas de B. burgdorferi ao ambiente20,21,22. Os mecanismos específicos que conduzem as mudanças transcricionais em B. burgdorferi em resposta a mudanças ambientais permanecem obscuros. Ensaios de transcrição in vitro são ferramentas poderosas para o emprego de uma abordagem bioquímica para testar a função e os mecanismos regulatórios dos fatores de transcrição e fatores sigma23,24,25,26.

Um sistema de ensaio de transcrição in vitro utilizando a RNA polimerase de B. burgdorferi foi recentemente estabelecido24. Como as bactérias frequentemente têm fisiologias celulares únicas, RNA polimerases de diferentes espécies e gêneros respondem diferentemente às condições de purificação enzimática, armazenamento enzimático e tampão de reação27. B. burgdorferi também está geneticamente distante das muitas espécies bacterianas nas quais RNA polimerases têm sidoestudadas20. Aspectos da preparação enzimática, tais como condições de lise, lavagem e tampão de eluição, tampão de armazenamento, tampão de reação de transcrição in vitro e o método de construção do ensaio podem alterar a atividade da RNA polimerase. Neste trabalho, fornecemos um protocolo para a purificação da RNA polimerase e do fator sigma RpoD, a produção de molde linear de DNA de fita dupla e a construção de ensaios de transcrição in vitro para facilitar a reprodutibilidade entre laboratórios que utilizam este sistema. Detalhamos um exemplo de reação para demonstrar a faixa linear para transcrição dependente de RpoD e discutimos limitações e alternativas para essa abordagem.

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Protocol

1. Purificação da RNA polimerase e preparação do estoque de RNA polimerase

  1. Coletar o pellet celular de 2-4 L de B. burgdorferi RpoC-His10X cultivado em meio BSKII em ambiente microaerofílico (34 °C, 5% CO 2, 3% O 2) a uma densidade de2-4 x 107 células/mL utilizando protocolos de coleta celular previamente descritos28,29. Realizar centrifugação a 10.000 x g a 4 °C por 30 min em frascos centrífugos de 500 mL e despejar o sobrenadante.
  2. Ressuspender as células em 30 mL de tampão HN gelado (10 mM HEPES, 10 mM NaCl, pH 8,0). Repita a etapa de centrifugação descrita acima usando um tubo centrífugo de 50 mL e decante o sobrenadante.
    NOTA: Ponto de parada. Congelar a pastilha celular a -80 °C para armazenar células por até 2 semanas ou proceder imediatamente à lise celular.
  3. Manter as células, lisar e proteínas purificadas a 4 °C ou no gelo, a menos que congelem. Manter a RNA polimerase em um ambiente redutor adicionando TDT recém-preparado a uma concentração de 2 mM a cada tampão usado neste protocolo e manter o pH 8,0.
  4. Preparar lisado a partir do pellet de células de B. burgdorferi usando um kit comercial de lise bacteriana seguindo as instruções do kit. Ressuspender o pellet em 10-15 mL de solução de B-PER à temperatura ambiente (TR) sem inibidor de protease e permitir que a lise prossiga por 5 min em gelo. O volume de lise depende do tamanho da pastilha celular, conforme descrito nas instruções do kit.
  5. Adicionar coquetel de inibidor de protease à solução de lise, seguido de três rodadas de sonicação, conforme descrito na seção de resultados representativos.
    NOTA: Alternativamente, lise as células em uma célula de pressão francesa, conforme descrito anteriormente24. Pule a etapa 1.4. e passo 1.5.
  6. Clarificar o lisado celular usando centrifugação e filtração usando um tubo de centrífuga de 50 mL. Encher o volume do tubo até pelo menos 30 ml de volume total adicionando tampão de carregamento da coluna de cobalto (Tabela 1) à solução. Pellet os restos celulares por centrifugação a 20.000 x g por 30 min.
  7. Filtrar o sobrenadante utilizando um filtro de seringa de 0,45 μm.
  8. Diluir o lisado em tampão de carga da coluna de cobalto (quadro 1) utilizando uma relação de diluição final de 1:10.
  9. Realizar cromatografia de afinidade no sobrenadante de lisado celular clarificado usando uma coluna de cobalto ou níquel-resina seguindo as instruções do fabricante. Consulte a seção de resultados representativos para obter um exemplo. Use os buffers listados na Tabela 1. Coletar as amostras de fluxo, lavagem e eluição para análise.
  10. Trocar imediatamente a RNA polimerase na solução tampão de eluição por uma solução tampão de armazenamento de RNA polimerase (Tabela 1) usando uma coluna de troca de tampão seguindo as instruções do fabricante.
  11. Preparar as reservas congeladoras concentrando a RNA polimerase utilizando unidades filtrantes centrífugas de corte de 10 kDa, numa concentração de 0,2-0,4 mg/mL determinada por espectrofotometria (A280nm sem ajuste do coeficiente de extinção [1 abs a 1 cm = 1 mg·mL−1]).
  12. O congelador de RNA polimerase Aliquota armazena em volumes de 20-50 μL em tubos de PCR e armazena a RNA polimerase a -80 °C.
  13. Determinar a qualidade da cromatografia de afinidade por SDS-PAGE e medir o rendimento total de proteínas por espectrofotometria ou ensaio de BCA. Executar as amostras em um gel de poliacrilamida a 7,5% a 120 V por 50 min para uma boa resolução por SDS-PAGE.

2. Purificação de RpoD recombinante e preparação de material de RpoD

  1. Cultivar e induzir a expressão de B. burgdorferi RpoD recombinante marcado com Maltose Binding Protein (MBP-RpoD) em BL21::MBP-RpoDBb, conforme descrito pelo manual de instruções do sistema de purificação e fusão de proteínas listado na Tabela de Materiais, e coletar as células por centrifugação.
    NOTA: Ponto de parada. Congele os pellets de células a -80 °C para armazenar células por até 2 semanas ou proceda imediatamente à lise celular.
  2. Realizar lise usando um kit comercial de lise de células bacterianas ou células de pressão francesas. Veja o exemplo de buffer de lise na Tabela 1.
  3. Clarificar o lisado celular usando centrifugação e filtração. Pellet os restos celulares por centrifugação a 20.000 x g por 30 min. Filtrar o sobrenadante utilizando um filtro de 0,45 μm.
  4. Extrair MBP-RpoD utilizando um protocolo de extração de proteínas para o sistema de expressão. Consulte a seção de resultados representativos para obter detalhes e resultados de implementação.
  5. Determinar a qualidade do processo de cromatografia de afinidade e eluição por SDS-PAGE e medir o rendimento proteico por espectrofotometria (A280nm sem ajuste do coeficiente de extinção [1 abs a 1 cm = 1 mg·mL−1]). Use gel de poliacrilamida a 10% a 200 V por 30 min para separação em SDS-PAGE.
  6. Concentrar a MBP-RpoD utilizando um filtro centrífugo de corte de 10 kDa até uma concentração de >2 mg/mL determinada por espectrofotometria.
  7. Cleave MBP do RpoD no local de clivagem do Fator Xa. Adicionar CaCl 2 às frações de eluição por cromatografia de afinidade contendo MBP-RpoD na concentração de2 mM. Adicionar 200 μg de Fator Xa Protease para cada 30 mg de proteína purificada. Incubar durante a noite no RT.
  8. Confirme a clivagem completa da MBP do RpoD por SDS-PAGE. Use gel de poliacrilamida a 10% a 200 V por 30 min para separação em SDS-PAGE.
  9. Diluir a solução contendo MBP e RpoD na proporção de 1:10 com um tampão de ligação à heparina.
  10. Separe a PAM e a DPOr na coluna de heparina por FPLC. Consulte a Tabela 2 para obter as configurações de FPLC.
  11. Determinar a qualidade dos produtos da cromatografia de afinidade por SDS-PAGE e medir o rendimento proteico por espectrofotometria. Use gel de poliacrilamida a 10% a 200 V por 30 min para separação em SDS-PAGE.
  12. Concentrar as fracções de eluição contendo RpoD utilizando um filtro centrífugo de corte de 10 kDa para um volume final de 2-3 ml.
  13. O tampão troca as frações de eluição concentradas de RpoD para o tampão de armazenamento usando uma coluna de filtração em gel.
  14. Concentrar o estoque de RpoD usando um filtro centrífugo de corte de 10 kDa para uma concentração de 0,2-0,8 mg/mL, determinada por espectrofotometria.
  15. Aliquot RpoD estoque em volumes de 20-50 μL em tubos de PCR e armazenar a -80 °C.

3. Preparação do estoque de modelo de DNA

  1. A PCR amplifica a região de 500 pb ao redor de um sítio promotor impulsionado por RpoD do DNA genômico de B. burgdorferi usando uma reação de 200 μL (Tabela 3).
  2. Purificar os produtos de PCR usando um kit de purificação PCR comercial. Eluir o DNA em biologia molecular grau H2O.
  3. Ajustar a concentração molar dos moldes de DNA gerados pela PCR para 100 nM por diluição em biologia molecular grau H2O.

4. Realizar transcrição in vitro com incorporação de nucleotídeos radiomarcados

  1. Preparar um plano experimental de transcrição in vitro . Determinar as concentrações de RNA polimerase, RpoD e molde de DNA. Determine os volumes de alíquotas e ordens de pipetagem para os tubos de reação. Veja a Tabela 4 e a Figura 1 para obter um exemplo.
    NOTA: Incluir controles no plano experimental, como reações que não contenham RNA polimerase, polimerase alternativa, nenhum modelo ou modelos alternativos.
  2. Calcular o volume de α-32P-ATP necessário para o experimento. Incorpore isso no plano experimental. Tipicamente, incluem 2 μCi de atividade por reação de transcrição in vitro para detecção de tela de fósforo.
  3. Preparar as superfícies de trabalho, incluindo a bancada de radiação, para reduzir o risco de contaminação por radiação.
  4. Descongelar alíquotas frescas de RNA polimerase, Rpo, 5x tampão NTP e soluções estoque modelo no gelo. Misture bem todos os estoques congelados descongelados antes de pipetar.
  5. Preparar uma mistura mestre de reação e uma mistura separada de NTP para nucleotídeos radiomarcados de acordo com o plano experimental.
  6. Dispensar as reações de controle e conjuntos experimentais em tubos de PCR em preparação para adicionar radiomarcação na reação. Distribua suavemente H2O, mistura mestre de reação, RNA polimerase e RpoD em tubos de PCR designados e misture por pipetagem.
  7. Transfira os materiais preparados para uma bancada de radiação.
  8. Adicione α-32P-ATP ao NTP e misture por pipetagem suave.
    CUIDADO: Ao trabalhar com material radioativo, use equipamentos de proteção apropriados e procedimentos de manuseio de isótopos radioativos.
  9. Adicionar NTP aos tubos contendo as misturas de reacções de transcrição in vitro da etapa 4.6.
  10. Iniciar a reação de transcrição in vitro com a adição de um molde de DNA. Misture o volume de reação pipetando suavemente.
  11. Incubar tubos a 37 °C durante 5 min num termociclador ou bloco de calor.
  12. Remova as reações do termociclador ou bloco de calor e adicione o corante de carregamento de RNA 2x contendo formamida a 50% a um volume de reação igual para interromper as reações de transcrição in vitro .
  13. Desnaturar as enzimas incubando reações a 65 °C por 5 min em um termociclador ou bloco de calor.
  14. Separar o RNA na mistura de reação de transcrição in vitro por eletroforese em gel usando géis de poliacrilamida de ureia TBE 10%-15% a 180 V por 30-45 min.
    NOTA: Dependendo das condições de eletroforese em gel, a solução tampão pode estar contaminada com nucleotídeos radiomarcados ou o gel pode conter a maioria ou todos os nucleotídeos radiomarcados. Planejar o armazenamento ou descarte adequado de radioatividade.
  15. Imagem do RNA radiomarcado usando fosfotela após a remoção de qualquer porção do gel contendo ATP radiomarcado não incorporado. Expor o gel à fosfotela durante a noite (16 h) e imagem usando um imageador de fosfotela (resolução de 100 μm, tensão do tubo de 700 V PMT).
  16. Analise os dados por meio de métodos de densitometria24.

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Representative Results

Em uma reação de transcrição in vitro em que a etapa limitante da reação é o início da transcrição mediada pelo fator sigma, a atividade de transcrição deve aumentar linearmente com a quantidade de fator sigma. Apresentamos a preparação de experimentos de transcrição in vitro testando uma faixa de concentrações de RpoD juntamente com duas concentrações de RNA polimerase para observar o sinal variável resultante da incorporação de nucleotídeos radiomarcados em produtos de RNA. Resultados representativos da preparação de RNA polimerase, RpoD e estoques de molde de DNA de fita dupla são mostrados. As reações representativas de transcrição in vitro servem como exemplo dos níveis de atividade da RNA polimerase aceitáveis para análise.

Para a purificação da RNA polimerase, uma cultura de 4 L de B. burgdorferi RpoC-His10X foi cultivada a 34 °C sob condições microaerofílicas (5% CO 2, 3% O2). As culturas foram rigorosamente monitoradas quanto à densidade de espiroquetas usando microscopia de campo escuro e coletadas antes de atingir densidades superiores a 4 x 107 espiroquetas/mL. As células foram ressuspensas em mistura B-PER para lise (Tabela 1). O pellet celular foi homogeneizado por pipetagem, seguido de 5 min de incubação em RT, e subsequentes rodadas de sonicação realizadas por 3 s em triplicata. Os lisados clarificados foram diluídos com tampão de carga de coluna de cobalto e 5 mL de resina de cobalto para um volume total de 180 mL. RpoC-His10X foi permitido ligar-se à resina de cobalto nutando a mistura por 1 h a 4 °C. A mistura foi transferida para uma coluna de fluxo por gravidade e lavada cinco vezes com 40 mL de tampão de lavagem da coluna. A proteína ligada foi liberada pela passagem de 5 mL de tampão de eluição através da coluna, e a eluição foi repetida sete vezes. Amostras das frações flow-through, washes e eluição foram separadas por SDS-PAGE e imageadas por incorporação de corantes (Figura 1). O complexo central da RNA polimerase é composto por RpoC, RpoB e RpoA, com tamanhos de 154 kDa, 129 kDa e 38,5 kDa, respectivamente. O resultado representativo apresentado na Figura 1 mostra três bandas proeminentes nos tamanhos dos três peptídeos que compõem o complexo RNA polimerase. O flow-through da cromatografia de afinidade continha 0,5-1 mg/mL de proteína com uma relação 260/280 entre 1,0 e 1,7, indicando uma maior concentração de ácidos nucléicos. O rendimento da proteína RNA polimerase após a concentração da mistura proteica determinada por espectrofotometria foi de 0,3 mg/mL.

Para preparar os estoques de proteína RpoD, a RpoD recombinante com uma etiqueta C-terminal Maltose Binding Protein foi expressa a partir de um plasmídeo pMAL-C5X em BL21 (DE3) pLysS E. coli. 2 L de E. coli foram cultivados a 32 °C a OD600nm de 0,5. A cultura foi então tratada com IPTG 0,3 mM para induzir a expressão de RpoD por 1 h. As células foram peletizadas por centrifugação e lisadas em B-PER. Os 200 mL de lisado celular diluído resultantes foram filtrados através de 10 mL de resina amilose. A resina foi lavada com 40 mL de tampão de ligação oito vezes para remover o DNA residual e peptídeos. A RpoD marcada com PBM foi eluída com 5 mL de tampão de eluição na coluna de resina cinco vezes. O escoamento das etapas de ligação e lavagem e as frações de eluição foram analisados por SDS-PAGE (Figura 2A). O principal componente na fração de eluição é um peptídeo de ~115 kDa, correspondendo ao tamanho do RpoD recombinante de B. burgdorferi marcado com MBP. As frações de eluição foram combinadas, a concentração de CaCl 2 foi ajustada para2 mM e 100 μg de protease FactorXa foram adicionados a 40 mg de proteína purificada. Após digestão noturna à temperatura ambiente, a reação foi analisada por SDS-PAGE (Figura 2B). Após a clivagem com protease do fator Xa, os dois principais produtos da mistura foram RpoD (73,6 kDa) e MBP (45 kDa). A mistura das proteínas RpoD e MBP foi separada por cromatografia de afinidade à heparina. A mistura foi diluída na proporção de 1:10 em tampão de ligação à heparina e carregada em uma coluna de resina ligada à heparina em uma FPLC. A RpoD foi eluída com um gradiente crescente de NaCl até uma concentração de 1 M. Quando as frações foram analisadas por SDS-PAGE, uma banda maior de 73,6 kDa foi aparente na fração de eluição na faixa de 400-600 mM NaCl (Figura 2C). Alguns fragmentos degradados de RpoD foram co-purificados. As frações contendo RpoD foram combinadas, trocadas em tampão de armazenamento de RpoD e, em seguida, concentradas usando um filtro centrífugo de corte de 10 kDa. A concentração final de RpoD foi de 0,67 mg/mL (9,1 mM), determinada por espectrofotometria.

Um molde de DNA de fita dupla englobando o sítio promotor de B. burgdorferi flgB foi gerado por PCR. O promotor flgB foi amplificado por primers que corresponderam a 250 pb a montante e a jusante do promotor (Tabela 6), utilizando-se uma reação de 200 μL contendo 30 ng de DNA de B. burgdorferi 24,30. O produto da PCR foi analisado por eletroforese em gel de agarose a 1% (Figura 3). O produto da PCR foi de aproximadamente 500 pb de tamanho com aparente homogeneidade. É importante ressaltar que sais e contaminação de componentes celulares podem contribuir para a variabilidade dos resultados das reações de transcrição in vitro; garantimos que o molde de DNA seja completamente dessalinizado na coluna de purificação do PCR.

Um esquema experimental no qual a transcrição é iniciada pela adição de DNA molde pode testar a taxa de reconhecimento do promotor e o início da transcrição. Em nossos experimentos representativos, uma série de diluição da proteína RpoD foi preparada por diluições duplas em água variando de 16 nM-1 μM. Uma mistura mestre foi criada contendo RNA polimerase em um tampão de reação contendo cátions divalentes necessários para a atividade (Tabela 4 e Tabela 5). O RpoD e o master mix foram alicitados juntos no gelo. A mistura mestra contendo RNA polimerase e RpoD foi deixada incubar enquanto outras etapas da transcrição in vitro foram preparadas. Nós incorporamos três reações de controle: uma reação de controle positivo preparada separadamente da mistura mestre, uma reação de controle negativo contendo DNA molde para garantir que o sinal de transcrição in vitro fosse dependente do molde e uma reação de controle negativo sem RNA polimerase para garantir que o sinal fosse dependente de RNA polimerase. Nucleotídeos radiomarcados foram adicionados à reação misturando 5 μL de (α-32P-ATP) a 20 μL de mistura estoque de 10x NTP para criar alíquota suficiente para 20 reações para compensar volumes irrecuperáveis. Finalmente, o DNA molde que codifica o promotor flgB foi introduzido nos tubos de reação por pipetagem seguindo a ordem de pipetagem previamente planejada (Figura 4).

O sinal dos fragmentos de RNA gerados pela transcrição in vitro foi detectado por triagem de fósforo após um período de exposição de 16 h do gel TBE-uréia contendo RNA separado por eletroforese em gel. Um experimento contendo 50 nM de RNA polimerase e RpoD na faixa de 500 nM a 16 nM gerou produtos de RNA de 250 pb (Figura 5). Para cada diluição dupla da concentração de RpoD, houve um menor nível de produto de RNA acumulado. Houve uma série de produtos de pb mais baixos que apareceram abaixo da banda proeminente, indicando fragmentos de RNA incompletos devido à interrupção da transcrição ou molde de DNA fragmentado. Produtos de RNA estavam ausentes do controle no molde, indicando que não havia fragmentos de DNA exógenos contribuindo para o sinal neste ensaio. Nenhum sinal foi detectado no controle da RNA polimerase, indicando que a RNA polimerase de B. burgdorferi foi a única que contribuiu para a produção de RNA neste ensaio.

Em um segundo experimento, utilizou-se uma concentração menor de 25 nM RNA polimerase (Figura 6). Menos produtos de RNA foram detectados em toda a faixa de concentrações de RpoD testadas em comparação com a Figura 5, e a intensidade do sinal de fundo foi maior. Isso é problemático para análise a jusante por densitometria. Quando a imagem de fósforo foi analisada por densitometria (Figura 7), o sinal densitométrico obtido da fosfotela indicou uma relação linear entre a quantidade de RpoD presente na reação em ambos os experimentos. No entanto, no experimento com alto sinal de fundo, a reação contendo 25 nM RNA polimerase e menos de 100 nM de RpoD não foi confiável para comparações relativas do nível de transcrição.

Figure 1
Figura 1: Separação da RNA polimerase de B. burgdorferi purificada por cromatografia de afinidade. A fração flow-through de lisado celular (faixa 1), primeira fração de lavagem (faixa 2), última fração de lavagem (faixa 3) e cinco frações de eluição (faixa 4-8) foram diluídas em tampão de carregamento de amostra 2x, fervidas e separadas por SDS-PAGE em gel de poliacrilamida gradiente a 200 V por 30 min. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Análise da purificação da RpoD por eletroforese em gel. (A) Frações de escoamento agrupadas (faixa 1 e faixa 2), frações de lavagem (faixas 3-5) e frações de eluição (faixas 6-10) da purificação de RpoD marcada com MBP por cromatografia de afinidade com resina de amilose. (B) Mistura proteica após a clivagem de MBP e RpoD utilizando protease de fator Xa. (C) Solução de escoamento (faixa 1) e frações de eluição com gradiente crescente de NaCl (faixas 2-9) da cromatografia de afinidade com heparina para separar MBP e RpoD. Em cada gel apresentado, as amostras foram misturadas com tampão de carga 2x, fervidas e separadas em gel de poliacrilamida gradiente usando SDS-PAGE a 200 V por 30 min. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Geração por PCR de modelos de transcrição in vitro. Amplicon de 500 pb contendo promotor flgB (raia 1 e raia 2) e reações de PCR controle contendo amplicons de outros sítios promotores (raias 3-4) são mostrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Arranjo experimental e plano sequencial de pipetagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Variabilidade dependente de RpoD no sinal da imagem de fósforo do RNA gerado pela transcrição in vitro usando a RNA polimerase de B. burgdorferi. As reações de transcrição in vitro continham 50 nM de RNA polimerase e níveis variáveis de RpoD indicados acima das bandas24. O RNA foi separado por um gel de TBE-uréia a 10%, e uma tela de fósforo foi usada para capturar o sinal do decaimento radioativo ao longo de 16 h. Este valor foi modificado de Boyle et al.24. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Variabilidade RpoD-dependente no sinal de imagem de fósforo do RNA gerado pela transcrição in vitro . A transcrição in vitro continha 25 nM de RNA polimerase e níveis variados de RpoD indicados acima das bandas. O RNA foi separado por um gel de TBE-ureia a 15%, e uma tela de fósforo foi usada para capturar o sinal do decaimento radioativo ao longo de 16 h. A menor concentração de RNA polimerase e o maior sinal de fundo aumentaram a dificuldade de mensuração precisa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Aumento do acúmulo de RNA radiomarcado em reações de transcrição in vitro com o aumento dos níveis de RpoD. Os sinais detectados na tela de fósforo foram analisados por densitometria sem subtração de fundo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Receitas de mídia. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Configurações de FPLC. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 3: Reações de PCR. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 4: Plano experimental e cálculo de volume da RNA polimerase de 50 nM. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 5: Plano experimental e cálculo de volume da RNA polimerase 25 nM. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 6: Cepas e oligonucleotídeos utilizados neste protocolo. Clique aqui para baixar esta tabela.

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Discussion

Ensaios de transcrição in vitro construídos usando o protocolo apresentado foram recentemente utilizados para estudar o papel de um fator de transcrição em B. burgdorferi e podem ser aplicados para construir experimentos semelhantes usando outros fatores de transcrição, fatores sigma e moléculas23. Uma vez que a RNA polimerase ativa de B. burgdorferi tenha sido obtida e sua atividade detectada, componentes e condições dentro dos ensaios de transcrição in vitro podem ser modificados. O ensaio é altamente flexível e modificável. As reações são modulares e construídas a partir de estoques congelados e requerem pouco tempo de execução, uma vez escolhidos os parâmetros experimentais. Dado o estoque suficiente, vários experimentos podem ser realizados em 1 dia.

A obtenção de RNA polimerase ativa é o aspecto mais crítico da preparação da reação de transcrição in vitro . Recomendamos a coleta de RNA polimerase de células cultivadas até a fase logarítmica média de crescimento, conforme descrito neste protocolo. Na purificação da RNA polimerase de qualquer bactéria, a taxa de crescimento tem sido observada como um fator importante na purificação da RNA polimerase ativa. RNA polimerases podem acumular modificações pós-traducionais e podem estar associadas a fatores de transcrição inibitórios na fase estacionária de crescimento31. Não conseguimos purificar altas quantidades de RNA polimerase ativa de culturas de B. burgdorferi cultivadas em fase estacionária. A abordagem por cromatografia de afinidade, comparada à separação física32, também é benéfica para a purificação de B. burgdorferi , pois o organismo atinge baixa densidade em cultura, e o acúmulo de grandes quantidades de cultura celular é relativamente intensivo em material.

Durante purificações de outras RNA polimerases bacterianas, fatores sigma podem copurificar em quantidades significativas, dependendo do método de purificação e das condições33,34,35,36. A co-purificação de fatores sigma pode limitar experimentos a jusante usando fatores sigma alternativos, fatores sigma modificados ou a falta de fatores sigma. Além disso, a suplementação com o fator sigma housekeeping RpoD é benéfica para detectar atividade, independentemente da copurificação inicial do fator sigma37. Devido à flexibilidade de separar o fator sigma do núcleo da RNA polimerase, consideramos vantajoso que os fatores sigma não co-purificem sob as condições de purificação da cromatografia de afinidade de His-afinidade descritas aqui. É possível que as condições de purificação possam ser alteradas para produzir holoenzimas mais intactas e ativas contendo RpoD. Por exemplo, as concentrações de sal provavelmente afetam a estabilidade de múltiplas enzimas de subunidades, e o efeito da concentração de imidazol na estabilidade do complexo RNA polimerase de B. burgdorferi ou sua incorporação de cátions divalentes também é desconhecido.

B. burgdorferi A atividade enzimática da RNA polimerase é sensível ao tipo e quantidade de cátions divalentes presentes24. Descobrimos que o manganês é necessário para a atividade máxima da RNA polimerase, e o magnésio parece contribuir para a atividade em menor grau. Íons contaminantes em água adicionam uma alta quantidade de variabilidade à atividade enzimática da RNA polimerase. Consequentemente, água altamente pura, como grau de biologia molecular, grau de HPLC e grau de análise de metais H2O com poucos íons metálicos presentes é essencial para maior atividade de RNA polimerase no protocolo descrito aqui. As RNA polimerases também são sensíveis ao pH e requerem um ambiente redutor durante a purificação27. O pH alterado ou o uso de BME como agente redutor resultaram em RNA polimerase inativa. Recomendamos o uso da RNA polimerase de E. coli comercialmente disponível como controle para garantir a construção adequada de ensaios de transcrição in vitro 24. E. coli A RNA polimerase permitirá testar a viabilidade dos nucleotídeos, o método de construção do molde, a incorporação de radiomarcação, a separação de RNA e o método de detecção de sinal. No entanto, deve-se notar que a RNA polimerase de B. burgdorferi tem requisitos específicos de cátion, tampão e promotor divalentes em comparação com E. coli.

Existem vários métodos de detecção disponíveis para reações de transcrição in vitro. Ensaios de incorporação de corantes e balizamento molecular são alternativas comuns ao método de detecção de radiomarcados38,39. A incorporação de nucleotídeos radiomarcados é atualmente o método de detecção de RNA mais sensível. Ensaios alternativos requerem mais RNA polimerase para atingir níveis de sinal mensuráveis em comparação com ensaios de radiomarcação. Além disso, os métodos de incorporação de corantes e balizamento molecular normalmente têm mais maneiras de os sinais serem errôneos. Por exemplo, a contaminação por DNase pode fazer com que os faróis moleculares liberem um sinal na ausência de seu alvo. Usando a incorporação de radiomarcadores, a atividade relativa da enzima RNA polimerase de B. burgdorferi pode ser detectada mesmo em níveis baixos, o que se adequa à experimentação inicial com enzimas RNA polimerases.

Enquanto a concentração da enzima RNA polimerase de B. burgdorferi incluída na reação é padronizada por espectrofotometria, esta medida pode ser uma fonte de variabilidade. A atividade específica das RNA polimerases pode depender do número de holoenzimas ativas totalmente formadas, que constituem uma parcela da mistura proteica total40. Por exemplo, a quantidade molar de 50 nM de RNA polimerase relatada em nossos resultados foi determinada por espectrofotometria, mas uma análise das grandezas das subunidades por western blotting quantitativo revelou que a subunidade RpoA foi um componente limitante no número de holoenzimas potenciais de RNA polimerase, e um máximo de apenas 21 nM de RNA polimerase totalmente formada foi possível em nossa mistura24. Experimentos devem sempre ser conduzidos para controlar a variação lote a lote da RNA polimerase e outros componentes da reação de transcrição in vitro .

Em nosso experimento representativo mostrado na Figura 5, os níveis de RpoD foram alterados, e uma relação linear entre a RpoD e o sinal detectado foi demonstrada. A transcrição in vitro é um método versátil que pode ser facilmente alterado utilizando o molde experimental apresentado (Tabela 4). Por exemplo, fatores sigma alternativos ou modelos alternativos de DNA podem ser facilmente testados24. Modelos alternativos podem incluir diferentes regiões promotoras geradas por PCR ou plasmídio purificado de células para introduzir características de DNA superenrolado e metilado. Para um determinado nível de RpoD, RNA polimerase e template, diferentes níveis de um fator de transcrição podem ser adicionados para ver a inibição ou aumento da atividade de um promotor23. A ordem de adição de componentes e razões molares dentro da reação de transcrição in vitro podem ser alteradas de tal forma que complexos de iniciação da transcrição são formados antes do início da reação; Essas reações poderiam medir o alongamento da transcrição em vez do início da transcrição40. O ensaio de transcrição in vitro pode ser alterado para se adequar a uma variedade de investigações sobre a biologia de B. burgdorferi.

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Disclosures

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo Fundo de Investimento Estratégico em Ciências da Saúde Faculty Development Grant da Creighton University. A cepa B. burgdorferi RpoC-His10X foi gentilmente cedida pelo Dr. D. Scott Samuels da Universidade de Montana. A cepa de E. coli que abriga o plasmídeo pMAL-C5X que codifica um alelo rpoD marcado com proteína ligadora de maltose foi gentilmente cedida pelo Dr. Frank Gherardini do Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 micron syringe filter Thermo Scientific 726-2545 Step 1.7 and 2.3
50 mL conical tubes MidSci C50B Step 1.3, and subsequent steps
50 mL high-speed centrifuge tubes Thermo Scientific 3119-0050PK Step 1.2
500 mL Centrifuge bottles Thermo Scientific 3120-9500PK Step 1.1
B-PER and instruction manual Thermo Scientific 78248 Step 1.4 and 2.2
Calcium chloride Fisher Scientific 10035-04-8 Step 2.6
Centrifugal filters 10 Kd cutoff Millipore Sigma UFC8010 Step 1.11 and 2.11
Cobalt resin and instruction manual Thermo Scientific 89969 Step 1.9
Dithiothreitol Acros Organics 426380500 Step 1.4 and subsequent steps
Dnase (Nuclease) Millipore Sigma 70746 Step 1.4 and 2.2
Factor Xa Protease  Haematologic Technologies HCXA-0060 Step 2.6
GE Typhoon 5 Phosphoimager GE lifesciences Multiple Step 4.15
Gel Imager Bio-Rad Mutiple Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
H2O for in vitro transcription Fisher Scientific 7732-18-5 Step 3.2 and 3.3
high fidelity PCR kit New England Biolabs M0530S Step 3.1
High-speed centrifuge Eppendorf Step 1.1, and subsequent steps
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL Cytiva Life Sciences 17040601 Step 2.8
Imidazole Sigma-Aldrich 56750-100G Step 1.9
Lysozyme Thermo Scientific 90082 Step 1.4 and 2.2
Magnesium chloride  Fisher Scientific S25401 Step 4.1
Manganese chloride Fisher Scientific S25418 Step 4.1
Mini protean tetra cell Bio-Rad Mutiple Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
NP-40 Thermo Scientific 85124 Step 4.1
NTP mixture Thermo Scientific R0481 Step 4.1
PCR purification kit Qiagen 28506 Step 3.2
PCR tubes MidSci PR-PCR28ACF Step 1.12
PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual Cytiva 17085101 Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column)
pMAL Protein Fusion
and Purification System Instruction manual		 New England Biolabs E8200S Step 2.1
Polyacrylamide gels AnyKD Bio-Rad 456-8125 Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
Potassium glutamate Sigma-Aldrich G1251 Step 4.1
Protease inhibitor Thermo Scientific 78425 Step 1.4 and 2.2
Radiolabeled ATP Perkin Elmer BLU503H Step 4.2
RNA Loading Dye, (2x) New England Biolabs B0363S Step 4.13
Rnase inhibitor Thermo Scientific EO0381 Step 4.1
Spectrophotometer Biotek Mutiple Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
TBE-Urea gels 10 percent Bio-Rad 4566033 Step 4.14

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Boyle, W. K., Sorensen, H. N., Bourret, T. J. Essential Components of Borreliella (Borrelia) burgdorferi In Vitro Transcription Assays. J. Vis. Exp. (185), e64134, doi:10.3791/64134 (2022).

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