Summary
In vitro transkriptionsanalyser kan dechiffrera mekanismerna för transkriptionell reglering i Borreliella burgdorferi. Detta protokoll beskriver stegen för att rena B. burgdorferi RNA-polymeras och utföra in vitro-transkriptionsreaktioner . Experimentella metoder som använder in vitro-transkriptionsanalyser kräver tillförlitlig rening och lagring av aktivt RNA-polymeras.
Abstract
Borreliella burgdorferi är en bakteriell patogen med begränsade metaboliska och genomiska repertoarer. B. burgdorferi passerar extracellulärt mellan ryggradsdjur och fästingar och omformar dramatiskt sin transkriptionsprofil för att överleva i olika miljöer under infektion. Ett fokus för B. burgdorferi-studier är att tydligt förstå hur bakterierna svarar på sin miljö genom transkriptionsförändringar. In vitro-transkriptionsanalyser gör det möjligt att dissekera de grundläggande mekanismerna för transkriptionell reglering biokemiskt. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll som beskriver B. burgdorferi RNA-polymerasrening och lagring, sigmafaktorrening, DNA-mallgenerering och in vitro-transkriptionsanalyser . Protokollet beskriver användningen av RNA-polymeras renat från B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC). 5A4-RpoC är en tidigare publicerad stam som innehåller en 10XHis-tagg på rpoC-genen som kodar för den största underenheten av RNA-polymeraset. In vitro-transkriptionsanalyser består av RNA-polymeras renat från stam 5A4-RpoC, en rekombinant version av sigmafaktorn RpoD och en PCR-genererad dubbelsträngad DNA-mall. Medan proteinreningsteknikerna och metoderna för att montera in vitro-transkriptionsanalyser är konceptuellt väl förstådda och relativt vanliga, skiljer sig hanteringsöverväganden för RNA-polymeraser ofta från organism till organism. Protokollet som presenteras här är utformat för enzymatiska studier på B. burgdorferi RNA-polymeras. Metoden kan anpassas för att testa rollen av transkriptionsfaktorer, promotorer och posttranslationella modifieringar på RNA-polymerasets aktivitet.
Introduction
Borrelia och återfallsfeber orsakas av spiroketpatogener i släktena Borrelia och Borreliella 1,2,3. Borrelia är en framträdande vektorburen sjukdom i Nordamerika, och följaktligen är Borreliella burgdorferi en framstående modellorganism för att studera spiroketbiologi 4,5. Undersökningar av B. burgdorferi-mekanismerna för transkriptionell reglering syftar till att bättre förstå dess anpassningar till förändringar i miljön när den cyklar mellan sin fästingvektor och däggdjursvärdar 6,7. Förändringar i pH, temperatur, osmolaritet, näringstillgänglighet, kortkedjiga fettsyror, organiska syror och upplöst syre och koldioxidnivåer modulerar uttrycket av gener som är viktiga för B. burgdorferi att överleva i sin leddjursvektor och att infektera djur 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Att koppla dessa svar på stimuli med regleringsmekanismer har varit en viktig aspekt av B. burgdorferi-forskning 19.
Transkriptionsfaktorer och sigmafaktorer styr transkriptionen av gener som utför cellulära processer. Borrelia och skovvis feber spiroketer har en relativt gles uppsättning transkriptionsfaktorer och alternativa sigmafaktorer. Trots detta finns det komplexa transkriptionsförändringar som riktar B. burgdorferi svar på miljön20,21,22. De specifika mekanismerna som driver transkriptionsförändringar i B. burgdorferi som svar på miljöförändringar är fortfarande oklara. In vitro-transkriptionsanalyser är kraftfulla verktyg för att använda ett biokemiskt tillvägagångssätt för att analysera funktionen och regleringsmekanismerna för transkriptionsfaktorer och sigmafaktorer23,24,25,26.
Ett in vitro transkriptionsanalyssystem med användning av B. burgdorferi RNA-polymeras etablerades nyligen24. Eftersom bakterier ofta har unika cellulära fysiologier svarar RNA-polymeraser av olika arter och släkten olika på enzymrening, enzymlagring och reaktionsbuffertförhållanden27. B. burgdorferi är också genetiskt avlägsen från de många bakteriearter där RNA-polymeraser har studerats20. Aspekter av enzymberedning såsom lys, tvätt- och elueringsbuffertförhållanden, lagringsbuffert, in vitro-transkriptionsreaktionsbuffert och metoden för analyskonstruktion kan alla förändra RNA-polymerasaktiviteten. Här tillhandahåller vi ett protokoll för rening av RNA-polymeras och sigmafaktor RpoD, produktion av linjär dubbelsträngad DNA-mall och konstruktion av in vitro-transkriptionsanalyser för att underlätta reproducerbarhet mellan laboratorier som använder detta system. Vi beskriver en exempelreaktion för att demonstrera det linjära intervallet för RpoD-beroende transkription och diskuterar begränsningar och alternativ till detta tillvägagångssätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Rening av RNA-polymeras och beredning av RNA-polymerasstam
- Samla cellpelleten från 2-4 L B. burgdorferi RpoC-His10X odlad i BSKII-medium i en mikroaerofil miljö (34 °C, 5% CO2, 3%O2) till en densitet av 2-4 x 107 celler/ml med hjälp av tidigare beskrivna cellinsamlingsprotokoll28,29. Utför centrifugering vid 10 000 x g vid 4 °C i 30 minuter i 500 ml centrifugalflaskor och häll av supernatanten.
- Resuspendera cellerna i 30 ml iskall HN-buffert (10 mM HEPES, 10 mM NaCl, pH 8,0). Upprepa centrifugeringssteget enligt beskrivningen ovan med ett 50 ml centrifugrör och dekantera supernatanten.
OBS: Stopppunkt. Frys cellpelleten vid -80 ° C för att lagra celler i upp till 2 veckor eller fortsätt omedelbart till celllys. - Håll cellerna, lysatet och de renade proteinerna vid 4 °C eller på is om de inte fryser. Håll RNA-polymeras i en reducerande miljö genom att tillsätta nyberedd DTT i en koncentration av 2 mM till varje buffert som används i detta protokoll och behåll pH 8.0.
- Bered lysat från B. burgdorferi-cellpelleten med hjälp av ett kommersiellt bakterielyskit enligt satsinstruktionerna . Återsuspendera pelleten i 10-15 ml rumstemperatur (RT) B-PER-lösning utan proteashämmare och låt lysen fortsätta i 5 minuter på is. Lysvolymen beror på cellpelletsstorleken, som beskrivs i satsinstruktionerna.
- Lägg till proteashämmare cocktail till lyslösningen, följt av tre omgångar ultraljudsbehandling, som beskrivs i avsnittet representativa resultat.
OBS: Alternativt lysera cellerna i en fransk tryckcell enligt beskrivningen tidigare24. Hoppa över steg 1.4. och steg 1.5. - Klargör celllysatet med centrifugering och filtrering med ett 50 ml centrifugrör. Fyll rörets volym till minst 30 ml total volym genom att tillsätta koboltkolonnbelastningsbuffert (tabell 1) till lösningen. Pellet cellskräpet genom centrifugering vid 20 000 x g i 30 minuter.
- Filtrera supernatanten med ett 0,45 μm sprutfilter.
- Späd lysatet i buffert för laddning av koboltkolonn (tabell 1) med hjälp av ett slutligt utspädningsförhållande på 1:10.
- Utför affinitetskromatografi på supernatanten för klarad celllysat med hjälp av en kobolt- eller nickelhartskolonn enligt tillverkarens anvisningar. Se avsnittet representativa resultat för ett exempel. Använd buffertarna i tabell 1. Samla in genomströmnings-, tvätt- och elueringsproverna för analys.
- Byt omedelbart ut RNA-polymeraset i elueringsbuffertlösningen till RNA-polymeraslagringsbuffertlösning (tabell 1) med hjälp av en buffertbyteskolonn enligt tillverkarens anvisningar.
- Bered frysbestånden genom att koncentrera RNA-polymeraset med 10 kDa-cutoff centrifugalfilterenheter till en koncentration av 0,2-0,4 mg/ml bestämd med spektrofotometri (A280nm utan justering av extinktionskoefficient [1 abs vid 1 cm = 1 mg·ml−1]).
- Alikvot RNA-polymerasfryslager i 20–50 μl-volymer i PCR-rör och lagrar RNA-polymeraset vid −80 °C.
- Bestäm kvaliteten på affinitetskromatografi med SDS-PAGE och mät det totala proteinutbytet med spektrofotometri eller BCA-analys. Kör proverna på en 7,5% polyakrylamidgel vid 120 V i 50 min för god upplösning med SDS-PAGE.
2. Rening av rekombinant RpoD och beredning av RpoD-stam
- Odla och inducera uttrycket av maltosbindande proteinmärkt rekombinant B. burgdorferi RpoD (MBP-RpoD) i BL21::MBP-RpoDBb, enligt beskrivningen i bruksanvisningen för proteinfusions- och reningssystemet som anges i materialtabellen, och samla cellerna genom centrifugering.
OBS: Stopppunkt. Frys cellpelletsen vid −80 °C för att lagra celler i upp till 2 veckor eller fortsätt omedelbart till celllys. - Utför lys med hjälp av ett kommersiellt bakteriecelllyskit eller fransk tryckcell. Se exemplet lysbuffert i tabell 1.
- Klargör celllysatet med centrifugering och filtrering. Pellet cellskräpet genom centrifugering vid 20 000 x g i 30 minuter. Filtrera supernatanten med ett 0,45 μm filter.
- Extrahera MBP-RpoD med hjälp av ett proteinextraktionsprotokoll för expressionssystemet. Se avsnittet representativa resultat för exempel implementeringsinformation och resultat.
- Bestäm kvaliteten på affinitetskromatografiprocessen och elueringen med SDS-PAGE och mät proteinutbytet med spektrofotometri (A280nm utan justering av extinktionskoefficienten [1 abs vid 1 cm = 1 mg · ml − 1]). Använd 10% polyakrylamidgel vid 200 V i 30 min för separation i SDS-PAGE.
- Koncentrera MBP-RpoD med ett 10 kDa-cutoff-centrifugalfilter till en koncentration på >2 mg/ml bestämd med spektrofotometri.
- Klyvning av MBP från RpoD vid klyvningsstället för faktor Xa. TillsättCaCl2 till elueringsfraktionerna för affinitetskromatografi innehållande MBP-RpoD i en koncentration av 2 mM. Tillsätt 200 μg faktor Xa proteas för varje 30 mg renat protein. Inkubera över natten vid RT.
- Bekräfta fullständig klyvning av MBP från RpoD med SDS-PAGE. Använd 10% polyakrylamidgel vid 200 V i 30 min för separation i SDS-PAGE.
- Späd MBP- och RpoD-innehållande lösningen i förhållandet 1:10 med en heparinbindande buffert.
- Separera MBP och RpoD på heparinkolonnen med FPLC. Se tabell 2 för FPLC-inställningar.
- Bestäm kvaliteten på affinitetskromatografiprodukterna med SDS-PAGE och mät proteinutbytet med spektrofotometri. Använd 10% polyakrylamidgel vid 200 V i 30 min för separation i SDS-PAGE.
- Koncentrera elueringsfraktionerna som innehåller RpoD med ett 10 kDa-cutoff-centrifugalfilter till en slutlig volym på 2-3 ml.
- Buffert Byt ut de koncentrerade RpoD-elueringsfraktionerna till lagringsbuffert med hjälp av en gelfiltreringskolonn.
- Koncentrera RpoD-stammen med ett 10 kDa-cutoff-centrifugalfilter till en koncentration på 0,2–0,8 mg/ml bestämd med spektrofotometri.
- Alikvot RpoD-lager i volymer på 20–50 μl i PCR-rör och förvaras vid −80 °C.
3. Beredning av DNA-malllager
- PCR amplifierar 500 bp-regionen som omger ett RpoD-drivet promotorställe från B. burgdorferi genomiskt DNA med hjälp av en 200 μL-reaktion (tabell 3).
- Rena PCR-produkterna med hjälp av ett kommersiellt PCR-reningssats. Eluera DNA i molekylärbiologi klass H2O.
- Justera molkoncentrationen i de PCR-genererade DNA-mallarna till 100 nM genom utspädning i molekylärbiologisk gradH2O.
4. Utför in vitro-transkription med införlivande av radioaktivt märkta nukleotider
- Förbered en experimentell plan för in vitro-transkription . Bestäm RNA-polymeras-, RpoD- och DNA-mallkoncentrationerna. Bestäm alikvotvolymerna och pipetteringsordningarna för reaktionsrören. Se tabell 4 och figur 1 för ett exempel.
OBS: Inkludera kontroller i experimentplanen, såsom reaktioner som inte innehåller RNA-polymeras, alternativt polymeras, ingen mall eller alternativa mallar. - Beräkna volymen av α-32 P-ATPsom krävs för experimentet. Inkorporera detta i experimentplanen. Inkludera vanligtvis 2 μCi aktivitet per in vitro transkriptionsreaktion för fosforskärmdetektering.
- Förbered arbetsytorna, inklusive strålningsbänken, så att risken för strålningskontaminering minskas.
- Tina färska alikvoter av RNA-polymeras, Rpo, 5x buffert NTP och malllösningar på is. Blanda alla tinade frysta lager noggrant före pipettering.
- Bered en masterreaktionsblandning och en separat NTP-blandning för radioaktivt märkta nukleotider enligt experimentplanen.
- Fördela kontrollreaktionerna och experimentuppsättningarna i PCR-rör som förberedelse för tillsats av radioetikett i reaktionen. Fördela försiktigtH2O, reaktionsmasterblandning, RNA-polymeras och RpoD i utsedda PCR-rör och blanda genom pipettering.
- Överför de beredda materialen till en strålningsbänk.
- Tillsätt α-32 P-ATPtill NTP och blanda genom försiktig pipettering.
VARNING: Använd lämplig skyddsutrustning och hanteringsförfaranden för radioaktiva isotoper när du arbetar med radioaktivt material. - Tillsätt NTP till rören som innehåller in vitro-transkriptionsreaktionsblandningarna från steg 4.6.
- Starta transkriptionsreaktionen in vitro med tillägg av en DNA-mall. Blanda reaktionsvolymen genom att försiktigt pipettera.
- Inkubera rör vid 37 °C i 5 minuter i en termocykler eller värmeblock.
- Ta bort reaktionerna från termocykler eller värmeblock och tillsätt 2x RNA-laddningsfärgämnet innehållande 50% formamid till en lika stor reaktionsvolym för att stoppa transkriptionsreaktioner in vitro .
- Denaturera enzymerna genom att inkubera reaktioner vid 65 °C i 5 minuter i en termocykler eller värmeblock.
- Separera RNA i in vitro-transkriptionsreaktionsblandningen genom gelelektrofores med användning av 10%-15% TBE ureapolyakrylamidgeler vid 180 V i 30-45 minuter.
OBS: Beroende på gelelektroforesförhållandena kan buffertlösningen vara förorenad med radioaktivt märkta nukleotider eller gelen kan innehålla de flesta eller alla radioaktivt märkta nukleotider. Planera för korrekt lagring eller bortskaffande av radioaktivitet. - Avbilda det radioaktivt märkta RNA med fosfoscreen efter avlägsnande av någon del av gelén som innehåller icke-inkorporerat radioaktivt märkt ATP. Exponera gelen för fosfoscreenen över natten (16 timmar) och avbilda med en fosfoscreenkamera (100 μm upplösning, 700 V PMT-rörspänning).
- Analysera data med hjälp av densitometrimetoder24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I en in vitro-transkriptionsreaktion där reaktionens begränsande steg är sigmafaktormedierad transkriptionsinitiering bör transkriptionsaktiviteten öka linjärt med mängden sigmafaktor. Vi presenterar beredningen av in vitro-transkriptionsexperiment som testar en rad RpoD-koncentrationer tillsammans med två koncentrationer av RNA-polymeras för att observera den resulterande varierande signalen från radiomärkt nukleotidinkorporering i RNA-produkter. Representativa resultat av beredningen av RNA-polymeras, RpoD och dubbelsträngade DNA-mallbestånd visas. De representativa transkriptionsreaktionerna in vitro fungerar som ett exempel på RNA-polymerasaktivitetsnivåer som är acceptabla för analys.
För rening av RNA-polymeras odlades en 4 L-kultur av B. burgdorferi RpoC-His10X vid 34 °C under mikroaerofila förhållanden (5% CO2, 3%O2). Kulturerna övervakades noggrant för spiroketdensitet med hjälp av mörkfältmikroskopi och samlades in innan de nådde densiteter högre än 4 x 107 spiroketer / ml. Cellerna återsuspenderades i B-PER-blandning för lys (tabell 1). Cellpelleten homogeniserades genom pipettering, följt av 5 min inkubation vid RT, och efterföljande rundor av ultraljudsbehandling utfördes för 3 s i tre exemplar. Klarade lysater späddes med koboltkolonnladdningsbuffert och 5 ml koboltharts till en total volym på 180 ml. RpoC-His10X fick binda till kobolthartset genom att mutera blandningen i 1 timme vid 4 °C. Blandningen överfördes till en gravitationsflödeskolonn och tvättades fem gånger med 40 ml kolonntvättbuffert. Bundet protein frigjordes genom att 5 ml elueringsbuffert passerade genom kolonnen och elueringen upprepades sju gånger. Prover av genomströmnings-, tvätt- och elueringsfraktionerna separerades med SDS-PAGE och avbildades genom fläckinkorporering (figur 1). RNA-polymeraskärnkomplexet består av RpoC, RpoB och RpoA, storlek 154 kDa, 129 kDa respektive 38,5 kDa. Det representativa resultatet som visas i figur 1 visar tre framträdande band vid storlekarna på de tre peptider som utgör RNA-polymeraskomplexet. Genomströmningen från affinitetskromatografi innehöll 0,5-1 mg / ml protein med ett 260/280-förhållande mellan 1,0 och 1,7, vilket indikerar en högre koncentration av nukleinsyror. RNA-polymerasproteinutbytet efter koncentrationen av proteinblandningen bestämd med spektrofotometri var 0,3 mg/ml.
För att förbereda RpoD-proteinlager uttrycktes rekombinant RpoD med en C-terminal maltosbindande proteintagg från en pMAL-C5X-plasmid i BL21 (DE3) pLysS E. coli. 2 liter E. coli odlades vid 32 °C till en OD600nm på 0,5. Kulturen behandlades sedan med 0,3 mM IPTG för att inducera uttrycket av RpoD i 1 h. Cellerna pelleterades genom centrifugering och lyserades i B-PER. De resulterande 200 ml utspädda celllysatet filtrerades genom 10 ml amylosharts. Hartset tvättades med 40 ml bindande buffert åtta gånger för att avlägsna kvarvarande DNA och peptider. MBP-märkt RpoD eluerades med 5 ml elueringsbuffert i hartskolonnen fem gånger. Genomströmningen från bindnings- och tvättstegen och elueringsfraktionerna analyserades med SDS-PAGE (figur 2A). Huvudkomponenten i elueringsfraktionen är en peptid på ~ 115 kDa, som matchar storleken på den MBP-märkta rekombinanta B. burgdorferi RpoD. Elueringsfraktionerna kombinerades,CaCl2-koncentrationen justerades till 2 mM och 100 μg FactorXa-proteas tillsattes till 40 mg renat protein. Efter natts matsmältning vid rumstemperatur analyserades reaktionen med SDS-PAGE (figur 2B). Efter klyvning med faktor Xa-proteas var de två huvudprodukterna i blandningen RpoD (73,6 kDa) och MBP (45 kDa). Blandningen av RpoD- och MBP-proteiner separerades med användning av heparinaffinitetskromatografi. Blandningen späddes i förhållandet 1:10 i heparinbindande buffert och laddades i en heparinbunden hartskolonn i en FPLC. RpoD eluerades med en ökande gradient av NaCl till en koncentration av 1 M. När fraktionerna analyserades med SDS-PAGE framgick ett huvudband med 73,6 kDa-storlek i elueringsfraktionen i intervallet 400-600 mM NaCl (figur 2C). Vissa nedbrutna RpoD-fragment samrenades. RpoD-innehållande fraktioner kombinerades, buffert utbyttes till RpoD-lagringsbuffert och koncentrerades sedan med ett 10 kDa-cutoff-centrifugalfilter. Den slutliga RpoD-koncentrationen var 0,67 mg/ml (9,1 mM) bestämd med spektrofotometri.
En dubbelsträngad DNA-mall som omfattar promotorstället för B. burgdorferi flgB genererades av PCR. FLGB-promotorn amplifierades med primrar som motsvarade 250 bp uppströms och nedströms promotorn (tabell 6) med användning av en 200 μl-reaktion innehållande 30 ng B. burgdorferi-DNA 24,30. PCR-produkten analyserades med gelelektrofores i en 1% agarosgel (figur 3). PCR-produkten var ungefär 500 bp stor med uppenbar homogenitet. Det är viktigt att salter och cellkomponentkontaminering kan bidra till variationen i in vitro-transkriptionsreaktionsresultat; vi ser till att DNA-mallen avsaltas noggrant på PCR-reningskolonnen.
Ett experimentellt schema där transkription initieras genom tillsats av mall-DNA kan testa graden av promotorigenkänning och transkriptionsinitiering. I våra representativa experiment framställdes en utspädningsserie av RpoD-protein genom tvåfaldiga utspädningar i vatten från 16 nM-1 μM. En mastermix skapades innehållande RNA-polymeras i en reaktionsbuffert innehållande tvåvärda katjoner som krävs för aktivitet (tabell 4 och tabell 5). RpoD och mastermixen alikvoterades tillsammans på is. Masterblandningen innehållande RNA-polymeras och RpoD tilläts inkubera medan andra steg i in vitro-transkriptionen framställdes. Vi införlivade tre kontrollreaktioner: en positiv kontrollreaktion framställd separat från masterblandningen, en negativ kontrollreaktion som inte innehöll något mall-DNA för att säkerställa att in vitro-transkriptionssignalen var mallberoende och en negativ kontrollreaktion utan RNA-polymeras för att säkerställa att signalen var RNA-polymerasberoende. Radiomärkta nukleotider tillsattes till reaktionen genom att blanda 5 μL (α-32P-ATP) till 20 μL 10x NTP-stamblandning för att skapa tillräckligt med alikvot för 20 reaktioner för att kompensera för oåtervinnbara volymer. Slutligen infördes mall-DNA som kodar för flgB-promotorn till reaktionsrören genom pipettering enligt den tidigare planerade pipetteringsordningen (figur 4).
Signalen från RNA-fragmenten genererade genom in vitro-transkription detekterades genom fosforskärm efter en exponeringsperiod på 16 timmar för TBE-ureagelen innehållande RNA separerad med gelelektrofores. Ett experiment innehållande 50 nM RNA-polymeras och RpoD i intervallet 500 nM till 16 nM genererade RNA-produkter med 250 bp (figur 5). För varje tvåfaldig utspädning av RpoD-koncentrationen fanns en lägre nivå av ackumulerad RNA-produkt. Det fanns en serie lägre bp-produkter som dök upp under det framträdande bandet, vilket indikerar ofullständiga RNA-fragment på grund av transkriptionsstopp eller fragmenterad DNA-mall. RNA-produkter saknades i kontrollen utan mall, vilket indikerar att det inte fanns några exogena DNA-fragment som bidrog till signalen i denna analys. Ingen signal detekterades i ingen RNA-polymeraskontroll, vilket indikerar att B. burgdorferi RNA-polymeras var det enda polymeraset som bidrog till produktionen av RNA i denna analys.
I ett andra experiment använde vi en lägre koncentration av 25 nM RNA-polymeras (figur 6). Färre RNA-produkter detekterades över intervallet av testade RpoD-koncentrationer jämfört med figur 5, och bakgrundssignalintensiteten var högre. Detta är problematiskt för nedströmsanalys med densitometri. När fosforbilden analyserades med densitometri (figur 7) indikerade densitometrisignalen erhållen från fosfoscreenen ett linjärt förhållande mellan mängden RpoD närvarande i reaktionen i båda experimenten. I experimentet med hög bakgrundssignal var emellertid reaktionen innehållande 25 nM RNA-polymeras och mindre än 100 nM RpoD opålitlig för jämförelser av relativ transkriptionsnivå.
Figur 1: Separation av HIS-märkt B. burgdorferi RNA-polymeras renat genom affinitetskromatografi. Genomströmningsfraktionen av celllysat (bana 1), första tvättfraktion (bana 2), sista tvättfraktion (bana 3) och fem elueringsfraktioner (bana 4-8) späddes i 2x provladdningsbuffert, kokades och separerades med SDS-PAGE i en gradientpolyakrylamidgel vid 200 V i 30 minuter. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Analys av RpoD-rening med gelelektrofores. (A) Poolade genomströmningsfraktioner (bana 1 och bana 2), tvättfraktioner (banorna 3–5) och elueringsfraktioner (körfält 6–10) från rening av MBP-märkt RpoD genom amyloshartsaffinitetskromatografi. B) Proteinblandning efter klyvning av MBP och RpoD med användning av faktor Xa-proteas. (C) Genomströmningslösning (bana 1) och elueringsfraktioner med en ökande gradient av NaCl (bana 2–9) från heparinaffinitetskromatografi för att separera MBP och RpoD. I varje gel som presenterades blandades proverna med 2x laddningsbuffert, kokades och separerades i en gradientpolyakrylamidgel med SDS-PAGE vid 200 V i 30 minuter. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: PCR-generering av in vitro-transkriptionsmallar. 500 bp amplikon innehållande flgB-promotor (bana 1 och körfält 2) och kontroll-PCR-reaktioner innehållande amplicons från andra promotorställen (körfält 3–4) visas. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Experimentell arrangemang och pipettering sekvensplan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: RpoD-beroende variabilitet i fosforbildsignal från RNA genererad genom in vitro-transkription med användning av B. burgdorferi RNA-polymeras. Transkriptionsreaktioner in vitro innehöll 50 nM RNA-polymeras och varierande nivåer av RpoD indikerade ovanför banden24. RNA separerades av en 10% TBE-ureagel, och en fosforskärm användes för att fånga signalen från radioaktivt sönderfall över 16 timmar. Denna siffra har modifierats från Boyle et al.24. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: RpoD-beroende variabilitet i fosforbildsignal från RNA genererad genom in vitro-transkription. In vitro-transkription innehöll 25 nM RNA-polymeras och varierande nivåer av RpoD indikerade ovanför banden. RNA separerades av en 15% TBE-ureagel, och en fosforskärm användes för att fånga signalen från radioaktivt sönderfall över 16 timmar. Den lägre RNA-polymeraskoncentrationen och högre bakgrundssignal ökade svårigheten att noggrant mäta. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Ökande radioaktivt märkt RNA-ackumulering i in vitro-transkriptionsreaktioner med ökande RpoD-nivåer. Signalerna som detekterades i fosforskärmavbildningen analyserades med densitometri utan bakgrundssubtraktion. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Media recept. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: FPLC-inställningar. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 3: PCR-reaktioner. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 4: 50 nM RNA-polymeras experimentell plan och volymberäkning. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 5: 25 nM RNA-polymeras experimentell plan och volymberäkning. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 6: Stammar och oligonukleotider som används i detta protokoll. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro-transkriptionsanalyser konstruerade med det presenterade protokollet användes nyligen för att studera rollen av en transkriptionsfaktor i B. burgdorferi och kan tillämpas för att bygga liknande experiment med andra transkriptionsfaktorer, sigmafaktorer och molekyler23. När aktivt RNA-polymeras från B. burgdorferi har erhållits och dess aktivitet detekterats kan komponenter och förhållanden inom in vitro-transkriptionsanalyserna modifieras. Analysen är mycket flexibel och modifierbar. Reaktionerna är modulära och byggda av frysta lager och kräver lite ledtid när de experimentella parametrarna har valts. Med tanke på tillräckligt med lager kan flera experiment utföras på 1 dag.
Att erhålla aktivt RNA-polymeras är den mest kritiska aspekten av in vitro-transkriptionsreaktionsberedning. Vi rekommenderar att RNA-polymeras skördas från celler som odlats till den mellersta logaritmiska tillväxtfasen enligt beskrivningen i detta protokoll. Vid rening av RNA-polymeras från alla bakterier har tillväxthastigheten noterats som en viktig faktor för att rena aktivt RNA-polymeras. RNA-polymeraser kan ackumulera posttranslationella modifieringar och kan associeras med hämmande transkriptionsfaktorer vid den stationära tillväxtfasen31. Vi har inte lyckats rena stora mängder aktivt RNA-polymeras från B. burgdorferi-kulturer odlade till stationär fas. Affinitetskromatografimetoden, jämfört med en fysikalisk separationsmetod32, är också fördelaktig för rening från B. burgdorferi eftersom organismen når låg densitet i kulturen och ackumulering av stora mängder cellodling är relativt materialintensiv.
Under reningar av andra bakteriella RNA-polymeraser kan sigmafaktorer samrena i betydande mängder beroende på reningsmetod och betingelser33,34,35,36. Samrening av sigmafaktorer kan begränsa nedströms experiment med alternativa sigmafaktorer, modifierade sigmafaktorer eller brist på sigmafaktorer. Dessutom är tillskott med hushållning sigmafaktor RpoD fördelaktigt för att detektera aktivitet oavsett initial samrening av sigmafaktorn37. På grund av flexibiliteten att separera sigmafaktorn från RNA-polymeraskärnan anser vi att det är fördelaktigt att sigmafaktorer inte samrenar under reningsförhållandena för His-affinitetskromatografi som beskrivs här. Det är möjligt att reningsbetingelserna kan ändras för att ge mer intakta och aktiva holoenzymer innehållande RpoD. Exempelvis påverkar saltkoncentrationerna sannolikt stabiliteten hos flera subenhetsenzymer, och effekten av imidazolkoncentration på stabiliteten hos B. burgdorferi RNA-polymeraskomplexet eller dess divalenta katjoninkorporering är också okänd.
B. burgdorferi RNA-polymeras enzymatisk aktivitet är känslig för typen och mängden av tvåvärda katjoner närvarande24. Vi fann att mangan krävs för maximal RNA-polymerasaktivitet, och magnesium tycktes bidra till aktivitet i mindre utsträckning. Kontaminerande joner i vatten ger en hög mängd variation till RNA-polymeras enzymatisk aktivitet. Följaktligen är mycket rent vatten såsom molekylärbiologisk kvalitet, HPLC-kvalitet och metallanalyskvalitetH2Omed få metalljoner närvarande avgörande för högre RNA-polymerasaktivitet i protokollet som beskrivs här. RNA-polymeraser är också känsliga för pH och kräver en reducerande miljö under rening27. Förändrat pH eller användning av BME som reduktionsmedel har resulterat i inaktivt RNA-polymeras. Vi rekommenderar att kommersiellt tillgängligt E. coli-RNA-polymeras används som kontroll för att säkerställa korrekt konstruktion av in vitro-transkriptionsanalyser 24. E. coli RNA-polymeras möjliggör testning av nukleotidernas livskraft, mallkonstruktionsmetoden, radioetikettinkorporering, RNA-separation och signaldetekteringsmetoden. Det bör dock noteras att B. burgdorferi RNA-polymeras har specifika tvåvärda katjon-, buffert- och promotorkrav jämfört med E. coli.
Det finns flera detektionsmetoder tillgängliga för transkriptionsreaktioner in vitro. Färginkorporering och molekylära fyranalyser är vanliga alternativ till radiomärkningsdetektionsmetoden38,39. Radiomärkt nukleotidinkorporering är för närvarande den känsligaste RNA-detektionsmetoden. Alternativa analyser kräver mer RNA-polymeras för att nå mätbara signalnivåer jämfört med radioaktiva test. Dessutom, färginkorporering och molekylära fyrmetoder har vanligtvis fler sätt för signaler att vara felaktiga. Till exempel, DNase-kontaminering kan orsaka att molekylära fyrar släpper ut en signal i frånvaro av deras mål. Med hjälp av radiolabel-inkorporering kan den relativa aktiviteten hos B. burgdorferi RNA-polymerasenzymet detekteras även vid låga nivåer, vilket passar initiala experiment med RNA-polymerasenzymer.
Medan koncentrationen av B. burgdorferi RNA-polymerasenzym som ingår i reaktionen standardiseras genom spektrofotometri, kan denna mätning vara en källa till variabilitet. Den specifika aktiviteten hos RNA-polymeraser kan bero på antalet fullbildade aktiva holoenzymer, vilka är en del av den totala proteinblandningen40. Till exempel bestämdes den molära kvantiteten av 50 nM RNA-polymeras som rapporterades i våra resultat genom spektrofotometri, men en analys av subenhetskvantiteterna genom kvantitativ western blotting avslöjade att RpoA-subenheten var en begränsande komponent i antalet potentiella RNA-polymerasholoenzymer, och maximalt endast 21 nM fullbildat RNA-polymeras var möjligt i vår blandning24. Experiment bör alltid utföras för att kontrollera batch-till-batch-variation i RNA-polymeras och andra komponenter i in vitro-transkriptionsreaktionen.
I vårt representativa experiment som visas i figur 5 ändrades RpoD-nivåerna och ett linjärt förhållande mellan RpoD och den detekterade signalen visades. In vitro-transkription är en mångsidig metod som enkelt kan ändras med hjälp av den experimentella mallen som presenteras (tabell 4). Till exempel kan alternativa sigmafaktorer eller alternativa DNA-mallar enkelt testas24. Alternativa mallar kan inkludera olika promotorregioner genererade av PCR eller plasmider renade från celler för att införa superlindade och metylerade DNA-egenskaper. För en given nivå av RpoD, RNA-polymeras och mall kan olika nivåer av en transkriptionsfaktor läggas till för att se hämning eller förbättring av aktiviteten från en promotor23. Ordningen på komponentaddition och molförhållanden inom transkriptionsreaktionen in vitro kan ändras så att transkriptionsinitieringskomplex bildas före reaktionsinitiering; Dessa reaktioner kunde mäta transkriptionsförlängning istället för transkriptionsinitiering40. Transkriptionsanalysen in vitro kan ändras för att passa en mängd olika undersökningar av B. burgdorferi-biologin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Health Sciences Strategic Investment Fund Faculty Development Grant från Creighton University. B. burgdorferi RpoC-His10X-stammen tillhandahölls vänligen av Dr. D. Scott Samuels vid University of Montana. E. coli-stammen som innehåller pMAL-C5X-plasmiden som kodar för en maltosbindande proteinmärkt rpoD-allel tillhandahölls vänligen av Dr. Frank Gherardini från Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 micron syringe filter | Thermo Scientific | 726-2545 | Step 1.7 and 2.3 |
| 50 mL conical tubes | MidSci | C50B | Step 1.3, and subsequent steps |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Thermo Scientific | 3119-0050PK | Step 1.2 |
| 500 mL Centrifuge bottles | Thermo Scientific | 3120-9500PK | Step 1.1 |
| B-PER and instruction manual | Thermo Scientific | 78248 | Step 1.4 and 2.2 |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Step 2.6 |
| Centrifugal filters 10 Kd cutoff | Millipore Sigma | UFC8010 | Step 1.11 and 2.11 |
| Cobalt resin and instruction manual | Thermo Scientific | 89969 | Step 1.9 |
| Dithiothreitol | Acros Organics | 426380500 | Step 1.4 and subsequent steps |
| Dnase (Nuclease) | Millipore Sigma | 70746 | Step 1.4 and 2.2 |
| Factor Xa Protease | Haematologic Technologies | HCXA-0060 | Step 2.6 |
| GE Typhoon 5 Phosphoimager | GE lifesciences | Multiple | Step 4.15 |
| Gel Imager | Bio-Rad | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| H2O for in vitro transcription | Fisher Scientific | 7732-18-5 | Step 3.2 and 3.3 |
| high fidelity PCR kit | New England Biolabs | M0530S | Step 3.1 |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | Step 1.1, and subsequent steps | |
| HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL | Cytiva Life Sciences | 17040601 | Step 2.8 |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750-100G | Step 1.9 |
| Lysozyme | Thermo Scientific | 90082 | Step 1.4 and 2.2 |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | S25401 | Step 4.1 |
| Manganese chloride | Fisher Scientific | S25418 | Step 4.1 |
| Mini protean tetra cell | Bio-Rad | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | Step 4.1 |
| NTP mixture | Thermo Scientific | R0481 | Step 4.1 |
| PCR purification kit | Qiagen | 28506 | Step 3.2 |
| PCR tubes | MidSci | PR-PCR28ACF | Step 1.12 |
| PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual | Cytiva | 17085101 | Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column) |
| pMAL Protein Fusion and Purification System Instruction manual |
New England Biolabs | E8200S | Step 2.1 |
| Polyacrylamide gels AnyKD | Bio-Rad | 456-8125 | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| Potassium glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Step 4.1 |
| Protease inhibitor | Thermo Scientific | 78425 | Step 1.4 and 2.2 |
| Radiolabeled ATP | Perkin Elmer | BLU503H | Step 4.2 |
| RNA Loading Dye, (2x) | New England Biolabs | B0363S | Step 4.13 |
| Rnase inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | Step 4.1 |
| Spectrophotometer | Biotek | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| TBE-Urea gels 10 percent | Bio-Rad | 4566033 | Step 4.14 |
References
- Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S.
- Kingry, L. C., et al. Surveillance for and discovery of Borrelia Species in US patients suspected of tickborne illness. Clinical Infectious Diseases. 66 (12), 1864-1871 (2018).
- Cutler, S. J. Relapsing fever Borreliae: A global review. Clinics in Laboratory Medicine. 35 (4), 847-865 (2015).
- Barbour, A. G., Hayes, S. F.
- Tilly, K., Rosa, P. A., Stewart, P. E. Biology of infection with Borrelia burgdorferi. Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 217-234 (2008).
- Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
- Caimano, M. J., Drecktrah, D., Kung, F., Samuels, D. S. Interaction of the Lyme disease spirochete with its tick vector. Cellular Microbiology. 18 (7), 919-927 (2016).
- Dulebohn, D. P., Richards, C. L., Su, H., Lawrence, K. A., Gherardini, F. C. Weak organic acids decrease Borrelia burgdorferi cytoplasmic pH, eliciting an acid stress response and impacting RpoN- and RpoS-dependent gene expression. Frontiers in Microbiology. 8, 1734 (2017).
- Bontemps-Gallo, S., Lawrence, K., Gherardini, F. C. Two different virulence-related regulatory pathways in Borrelia burgdorferi are directly affected by osmotic fluxes in the blood meal of feeding ixodes ticks. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005791 (2016).
- Bugrysheva, J. V., et al. Characterization of the RelBbu Regulon in Borrelia burgdorferi reveals modulation of glycerol metabolism by (p)ppGpp. PLoS One. 10 (2), 0118063 (2015).
- Carroll, J. A., Garon, C. F., Schwan, T. G. Effects of environmental pH on membrane proteins in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 67 (7), 3181-3187 (1999).
- Drecktrah, D., et al. The Borrelia burgdorferi RelA/SpoT homolog and stringent response regulate survival in the tick vector and global gene expression during starvation. PLoS Pathogens. 11 (9), 1005160 (2015).
- Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).
- Lin, Y. H., Chen, Y., Smith, T. C., Karna, S. L. R., Seshu, J. Short-chain fatty acids alter metabolic and virulence attributes of Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 86 (9), 00217-00218 (2018).
- Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).
- Stevenson, B., Schwan, T. G., Rosa, P. A. Temperature-related differential expression of antigens in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 63 (11), 4535-4539 (1995).
- Troxell, B., et al. Manganese and zinc regulate virulence determinants in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 81 (8), 2743-2752 (2013).
- Yang, X., et al. Interdependence of environmental factors influencing reciprocal patterns of gene expression in virulent Borrelia burgdorferi. Molecular Microbiology. 37 (6), 1470-1479 (2000).
- Samuels, D. S., et al.
- Fraser, C. M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).
- Iyer, R., Schwartz, I. Microarray-based comparative genomic and transcriptome analysis of Borrelia burgdorferi. Microarrays. 5 (2), 9 (2016).
- Iyer, R., et al. Stage-specific global alterations in the transcriptomes of Lyme disease spirochetes during tick feeding and following mammalian host adaptation. Molecular Microbiology. 95 (3), 509-538 (2015).
- Boyle, W. K., et al. DksA-dependent regulation of RpoS contributes to Borrelia burgdorferi tick-borne transmission and mammalian infectivity. PLoS Pathogen. 17 (2), 1009072 (2021).
- Boyle, W. K., et al. Establishment of an in vitro RNA polymerase transcription system: a new tool to study transcriptional activation in Borrelia burgdorferi. Scientific Reports. 10 (1), 8246 (2020).
- Silar, R., et al. Use of in vitro transcription system for analysis of Corynebacterium glutamicum promoters recognized by two sigma factors. Current Microbiology. 73 (3), 401-408 (2016).
- Maciag, A., et al. In vitro transcription profiling of the sigmaS subunit of bacterial RNA polymerase: re-definition of the sigmaS regulon and identification of sigmaS-specific promoter sequence elements. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5338-5355 (2011).
- Chang, A., et al. BRENDA, the ELIXIR core data resource in 2021: New developments and updates. Nucleic Acids Research. 49, 498-508 (2021).
- Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S.
- Hyde, J. A., Weening, E. H., Skare, J. T.
- Ge, Y., Old, I. G., Saint Girons, I., Charon, N. W. Molecular characterization of a large Borrelia burgdorferi motility operon which is initiated by a consensus sigma70 promoter. Journal of Bacteriology. 179 (7), 2289-2299 (1997).
- Ozaki, M., Wada, A., Fujita, N., Ishihama, A. Growth phase-dependent modification of RNA polymerase in Escherichia coli. Molecular Genetics and Genomics. 230 (1-2), 17-23 (1991).
- Jasinski, D. L., Schwartz, C. T., Haque, F., Guo, P. Large scale purification of RNA nanoparticles by preparative ultracentrifugation. Methods in Molecular Biology. 1297, 67-82 (2015).
- Gierl, A., Zillig, W., Stetter, K. O. The role of the components sigma and y of the DNA-dependent RNA polymerase of Lactobacillus curvatus in promotor selection. European Journal of Biochemistry. 125 (1), 41-47 (1982).
- Stetter, K. O., Zillig, W. Transcription in lactobacillaceae. DNA-dependent RNA polymerase from Lactobacillus curvatus. European Journal of Biochemistry. 48 (2), 527-540 (1974).
- Borbley, G., Schneider, G.
- Svetlov, V., Artsimovitch, I. Purification of bacterial RNA polymerase: Tools and protocols. Methods in Molecular Biology. 1276, 13-29 (2015).
- Shimada, T., Yamazaki, Y., Tanaka, K., Ishihama, A. The whole set of constitutive promoters recognized by RNA polymerase RpoD holoenzyme of Escherichia coli. PLoS One. 9 (3), 90447 (2014).
- Daubendiek, S. L., Ryan, K., Kool, E. T. Rolling-circle RNA synthesis: Circular oligonucleotides as efficient substrates for T7 RNA polymerase. Journal of the American Chemical Society. 117 (29), 7818-7819 (1995).
- Marras, S. A., Gold, B., Kramer, F. R., Smith, I., Tyagi, S.
- Chamberlin, M. J., Nierman, W. C., Wiggs, J., Neff, N. A quantitative assay for bacterial RNA polymerases. Journal of Biological Chemistry. 254 (20), 10061-10069 (1979).
