Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल क्रायो-ईएम प्रयोगों में झुके हुए एकल-कण डेटा संग्रह के लिए एक सामान्यीकृत और आसानी से लागू होने वाली योजना का वर्णन करता है। इस तरह की प्रक्रिया विशेष रूप से वायु-जल इंटरफ़ेस के पालन के कारण अधिमान्य अभिविन्यास पूर्वाग्रह से पीड़ित नमूनों के लिए उच्च गुणवत्ता वाले ईएम मानचित्र प्राप्त करने के लिए उपयोगी है।
Abstract
क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) द्वारा एकल-कण विश्लेषण (एसपीए) अब उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनात्मक जीव विज्ञान के लिए एक मुख्यधारा की तकनीक है। एसपीए द्वारा संरचना निर्धारण बर्फ की एक पतली परत के भीतर विट्रीफाइड मैक्रोमोलेक्यूलर ऑब्जेक्ट के कई अलग-अलग दृश्यों को प्राप्त करने पर निर्भर करता है। आदर्श रूप से, समान रूप से वितरित यादृच्छिक प्रक्षेपण उन्मुखता का एक संग्रह वस्तु के सभी संभावित दृश्यों के बराबर होगा, जो आइसोट्रोपिक दिशात्मक संकल्प की विशेषता वाले पुनर्निर्माण को जन्म देगा। हालांकि, वास्तव में, कई नमूने वायु-जल इंटरफ़ेस का पालन करने वाले अधिमान्य रूप से उन्मुख कणों से पीड़ित हैं। यह डेटासेट में गैर-समान कोणीय अभिविन्यास वितरण और पुनर्निर्माण में असंगत फूरियर-स्पेस नमूनाकरण की ओर जाता है, जो अनिसोट्रोपिक रिज़ॉल्यूशन की विशेषता वाले मानचित्रों में अनुवाद करता है। नमूना चरण को झुकाना अभिविन्यास वितरण की एकरूपता में सुधार के आधार पर रिज़ॉल्यूशन अनिसोट्रॉपी पर काबू पाने के लिए एक सामान्य समाधान प्रदान करता है, और इस प्रकार फूरियर स्पेस सैंपलिंग की आइसोट्रोपी। वर्तमान प्रोटोकॉल स्वचालित छवि अधिग्रहण के लिए एक सॉफ्टवेयर लेगिनन का उपयोग करके एक झुके हुए चरण स्वचालित डेटा संग्रह रणनीति का वर्णन करता है। प्रक्रिया को लागू करना सरल है, किसी भी अतिरिक्त उपकरण या सॉफ्टवेयर की आवश्यकता नहीं है, और इमेजिंग जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स के लिए उपयोग किए जाने वाले अधिकांश मानक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम) के साथ संगत है।
Introduction
पिछले दशक 1,2,3 में प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टरों के आगमन ने एकल-कण क्रायो-ईएम 4,5,6 का उपयोग करके हल किए गए मैक्रोमोलेक्यूल्स और मैक्रोमोलेक्यूलर असेंबली की उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं की संख्या में घातीय वृद्धि को प्रेरित किया है। आकार में या7 से नीचे के सबसे छोटे प्रोटीन ~ 10 केडीए को छोड़कर, लगभग सभी शुद्ध मैक्रोमोलेक्यूलर प्रजातियों को क्रायो-ईएम का उपयोग करके संरचना निर्धारण के लिए उत्तरदायी होने की उम्मीद है। ग्रिड तैयारी और संरचना निर्धारण के लिए आवश्यक प्रारंभिक सामग्री की मात्रा कम से कम अन्य संरचना निर्धारण तकनीकों की तुलना में कम परिमाण का एक क्रम है, जैसे कि परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी और एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी 4,5,6।
हालांकि, क्रायो-ईएम द्वारा संरचना निर्धारण के लिए एक प्रमुख चुनौती में इमेजिंग के लिए उपयुक्त ग्रिड तैयारी शामिल है। विभिन्न विटिफिकेशन रणनीतियों और ग्रिडों का उपयोग करके विविध नमूनों का मूल्यांकन करने वाले एक व्यापक अध्ययन ने सुझाव दिया कि क्रायो-ईएम ग्रिड पर विट्रीफाइंग नमूनों के लिए अधिकांश दृष्टिकोण वायु-जल इंटरफ़ेस8 के मैक्रोमोलेक्यूल्स के अधिमान्य पालन का कारण बनते हैं। इस तरह के पालन से संभावित रूप से चार उप-मानक परिणाम हो सकते हैं: (1) मैक्रोमोलेक्यूलर नमूना पूरी तरह से विकृत हो जाता है, इस मामले में कोई सफल डेटा संग्रह और प्रसंस्करण संभव नहीं है; (2) नमूना आंशिक रूप से विकृत होता है, इस स्थिति में मैक्रोमोलेक्यूल के क्षेत्रों से संरचनात्मक अंतर्दृष्टि प्राप्त करना संभव हो सकता है जो क्षतिग्रस्त नहीं हैं; (3) नमूना मूल संरचना को बरकरार रखता है, लेकिन इलेक्ट्रॉन बीम की दिशा के सापेक्ष कण उन्मुखता का केवल एक सेट छवियों में दर्शाया गया है; (4) नमूना मूल संरचना को बरकरार रखता है, और इलेक्ट्रॉन बीम की दिशा के सापेक्ष कुछ लेकिन सभी संभावित कण झुकाव छवियों में दर्शाए जाते हैं। मामलों (3) और (4) के लिए, झुका हुआ डेटा संग्रह पुनर्निर्मित क्रायो-ईएम मानचित्र को प्रभावित करने वाले दिशात्मक रिज़ॉल्यूशन अनिसोट्रॉपी को कम करने में मदद करेगा और विभिन्न प्रकार के नमूनोंके लिए एक सामान्य समाधान प्रदान करेगा। तकनीकी रूप से, झुकाव भी मामले (2) को लाभ पहुंचा सकता है, क्योंकि विकृतीकरण संभवतः हवा-पानी इंटरफ़ेस पर होता है और इसी तरह डेटा के भीतर प्रतिनिधित्व किए गए अलग-अलग झुकावों की संख्या को सीमित करता है। डेटासेट में अभिविन्यास पूर्वाग्रह की सीमा को संभावित रूप से समाधान योजक के साथ प्रयोग करके बदला जा सकता है, लेकिन व्यापक प्रयोज्यता की कमी इन परीक्षण-और-त्रुटि दृष्टिकोणों को बाधित करती है। नमूना चरण को एकल अनुकूलित झुकाव कोण पर झुकाना इमेजिंग प्रयोग9 (चित्रा 1) की ज्यामिति को बदलने के आधार पर अभिविन्यास के वितरण में सुधार करने के लिए पर्याप्त है। इलेक्ट्रॉन बीम के संबंध में अधिमान्य-उन्मुख नमूने के ज्यामितीय विन्यास के कारण, अधिमान्य झुकाव के प्रत्येक क्लस्टर के लिए, ग्रिड को झुकाने से क्लस्टर केन्द्रक के संबंध में रोशनी कोणों का एक शंकु उत्पन्न होता है। इसलिए, यह विचारों को फैलाता है और परिणामस्वरूप फूरियर स्पेस सैंपलिंग और दिशात्मक रिज़ॉल्यूशन की आइसोट्रोपी में सुधार होता है।
व्यवहार में, मंच को झुकाने के लिए कुछ नुकसान हैं। नमूना चरण को झुकाना दृश्य के क्षेत्र में एक फोकस ढाल का परिचय देता है, जो कंट्रास्ट ट्रांसफर फ़ंक्शन (सीटीएफ) अनुमानों की सटीकता को प्रभावित कर सकता है। झुके हुए डेटा संग्रह से इमेजिंग झुके हुए नमूनों की इमेजिंग करते समय चार्जिंग प्रभाव में वृद्धि के कारण बीम-प्रेरित कण आंदोलन में वृद्धि हो सकती है। ग्रिड झुकाव से स्पष्ट बर्फ की मोटाई में भी वृद्धि होती है, जो बदले में शोर माइक्रोग्राफ की ओर जाता है और अंततः पुनर्निर्माण 5,9,10 के संकल्प को प्रभावित कर सकता है। प्रोटोकॉल और चर्चा अनुभागों में संक्षेप में वर्णित उन्नत कम्प्यूटेशनल डेटा-प्रोसेसिंग योजनाओं को लागू करके इन मुद्दों को दूर करना संभव हो सकता है। अंत में, झुकाव से कण ओवरलैप में वृद्धि हो सकती है, जिससे बाद की छवि प्रसंस्करण पाइपलाइन में बाधा आ सकती है। हालांकि इसे ऑन-ग्रिड कण एकाग्रता को अनुकूलित करके कुछ हद तक कम किया जा सकता है, फिर भी यह एक महत्वपूर्ण विचार है। यहां, लेगिनन सॉफ्टवेयर सूट (एक स्वचालित छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर) का उपयोग करके झुके हुए डेटा संग्रह के लिए एक सरल-से-कार्यान्वित प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, जो खुली पहुंच उपलब्ध है और माइक्रोस्कोप 11,12,13,14 की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ संगत है। इस विधि के लिए कम से कम संस्करण 3.0 या उच्चतर की आवश्यकता होती है, जिसमें 3.3 से आगे झुके हुए डेटा संग्रह को सक्षम करने के लिए समर्पित सुधार होते हैं। इस प्रोटोकॉल के लिए कोई अतिरिक्त सॉफ़्टवेयर या उपकरण आवश्यक नहीं है। कम्प्यूटेशनल बुनियादी ढांचे और स्थापना गाइड पर व्यापक निर्देश कहीं और प्रदान किएजाते हैं।
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Protocol
1. नमूना तैयार करना
- सोने की पन्नी और गोल्ड ग्रिड समर्थन16 ( सामग्री की तालिका देखें) वाले ग्रिड का उपयोग करें क्योंकि झुका हुआ डेटा संग्रह बीम-प्रेरित गति17 को बढ़ा सकता है।
नोट: वर्तमान अध्ययन के लिए, ग्रिड पर नमूने एक ह्यूमिडिफाइड (80% से अधिक) ठंडे कमरे (~ 4 डिग्री सेल्सियस) में मैनुअल प्लंजिंग और ब्लॉटिंग तकनीक18 का उपयोग करके विट्रीफाइड किए गए थे। - कॉपर सपोर्ट और कार्बन फॉइल या अनाकार कार्बन की एक निरंतर परत वाले ग्रिड का उपयोग करने से बचें, जब तक कि बिल्कुल आवश्यक न हो, क्योंकि नमूना चरण झुकने पर इन ग्रिडों से अधिक बीम-प्रेरित गतिहो सकती है।
ग्रेफेन ऑक्साइड जैसे वैकल्पिक समर्थन परतें, अनाकार कार्बन19,20 की तुलना में बीम-प्रेरित आंदोलन को कम करती हैं। - प्री-स्क्रीन ग्रिड और स्वीकार्य बर्फ मोटाई और कण वितरण की विशेषता वाले क्षेत्रों की पहचान करें। बहुत कसकर पैक किए गए कणों वाले ग्रिड झुके हुए डेटा संग्रह के दौरान कण ओवरलैप का कारण बनेंगे, जो डाउनस्ट्रीम डेटा-प्रोसेसिंग चरणों को प्रभावित कर सकता है।
नोट: ये चरण व्यक्तिपरक हैं क्योंकि बर्फ के अच्छे क्षेत्रों की पहचान उन क्षेत्रों के लिए विफोकस छवियों का निरीक्षण करके की जाती है जहां कण कंट्रास्ट स्पष्ट है। यह सभी नमूनों के लिए संभव नहीं हो सकता है क्योंकि कुछ नमूने पतली बर्फ के क्षेत्रों में कुशलता से वितरित नहीं होंगे, जिससे डेटा संग्रह (चर्चा अनुभाग में वर्णित) के दौरान चुनौतियां होंगी। - अपने प्रोटीन नमूने वाले ग्रिड को विट्रीफाई करें। यहां, प्रदर्शन उद्देश्यों के लिए, हम सोने की पन्नी और सोने के समर्थन ग्रिड के साथ 0.1-0.5 मिलीग्राम / एमएल की सीमा पर भुखमरी (डीपीएस) प्रोटीन ( सामग्री की तालिका देखें) के दौरान डीएनए संरक्षण का उपयोग करते हैं।
नोट: प्रोटीन को पहले वर्णित के रूप में शुद्ध किया गया था, सिवाय इसके कि कोई टीईवी प्रोटीज क्लीवेजनहीं किया गया था। रुचि के नमूने के लिए प्रोटीन एकाग्रता सीमा को व्यक्तिगत रूप से अनुकूलित करना होगा, क्योंकि एक आदर्श सीमा को मापना कठिन है जो सार्वभौमिक रूप से लागू है और लगभग निश्चित रूप से विभिन्न नमूनों के बीच भिन्न होगा।
2. झुका हुआ डेटा संग्रह सेट करना
- नमूने की समानांतर रोशनी सुनिश्चित करने और कोमा विपथन को कम करने के लिएमाइक्रोस्कोप को संरेखित करें।
नोट: माइक्रोस्कोप को चरण झुकाव के बिना मानक एसपीए डेटा संग्रह के लिए अच्छी तरह से संरेखित किया जाना चाहिए। झुके हुए डेटा संग्रह के लिए कोई विशेष संरेखण आवश्यक नहीं है, लेकिन एक अच्छा संरेखण यह सुनिश्चित करेगा कि लक्ष्यीकरण और इमेजिंग सुचारू रूप से आगे बढ़े। झुके हुए और जुताए गए डेटा संग्रह की तुलना करने वाली एक सामान्य योजना चित्रा 2 में प्रदान की गई है। - डेटा संग्रह के लिए उपयुक्त वर्गों की पहचान करने के लिए चरण झुकाव के बिना एक ग्रिड एटलस रिकॉर्ड करें या स्क्वायर अधिग्रहण नोड में उपयोग किए जाने वाले आवर्धन पर वर्गों का मैन्युअल रूप से निरीक्षण करें। उन वर्गों की तलाश करें जहां पन्नी बरकरार है, निर्जलित नहीं दिखती है, और इसमें आदर्श बर्फ की मोटाई है।
नोट: स्क्वायर अधिग्रहण नोड लेगिनन में बहु-स्तरीय इमेजिंग के लिए उपयोग किया जाने वाला कम-आवर्धन नोड है।- विशिष्ट स्वचालित डेटा संग्रह के लिए, एक ग्रिड एटलस रिकॉर्ड करें, जो समग्र ग्रिड गुणवत्ता का अवलोकन और डेटा संग्रह के लिए उपयुक्त क्षेत्रों का प्रारंभिक संकेत प्रदान करता है।
- इसके बाद, एटलस के माध्यम से उपयुक्त वर्गों का चयन करें और उन्हें कतार में जमा करें। फिर, या तो छेद के मैन्युअल चयन के माध्यम से या स्वचालित ईएम छेद खोजक के माध्यम से, छेद लक्ष्यों को कतार में रखें और सबमिट करें।
- अंत में, उच्च आवर्धन जोखिम लक्ष्य प्रस्तुत करने के लिए स्वचालित ईएम छेद खोजक का उपयोग करें।
नोट: झुके हुए डेटा संग्रह के लिए, वर्गों को सुसंगत परिणामों के लिए मैन्युअल रूप से पंक्तिबद्ध करने की आवश्यकता हो सकती है, खासकर यदि इष्टतम झुकाव कोण पूर्व-निर्धारित नहीं किया गया है और डेटा संग्रह के दौरान समायोजित होने की संभावना है। ग्रिड एटलस को पूर्व-परिभाषित चरण झुकाव का उपयोग करके भी दर्ज किया जा सकता है यदि डेटा संग्रह के लिए उपयोग किया जाने वाला झुकाव कोण पहले स्थापित किया गया था।
- नमूना चरण को रुचि के वर्ग में ले जाएं।
- 15° चरण झुकाव पर α-वॉबलर का उपयोग करके चरण की स्थिति के लिए यूसेंट्रिक ऊंचाई ± निर्धारण करें। माइक्रोस्कोप के लिए कीपैड पैनल का उपयोग करके मंच को यूसेंट्रिक ऊंचाई पर लाने के लिए जेड-ऊंचाई समायोजित करें। सुनिश्चित करें कि α-लड़खड़ाहट दिनचर्या के दौरान छवि बदलाव न्यूनतम है।
नोट: यदि यूसेंट्रिक ऊंचाई को ठीक से पहचाना नहीं जाता है, तो वर्ग आवर्धन पर मंच को झुकाने पर एक बड़ी छवि बदलाव देखा जाएगा। यह तब भी हो सकता है जब ग्रिड पर स्थानीय विकृतियां हों, उदाहरण के लिए, यदि ग्रिड टूट गया है या छवि वाले क्षेत्र के आसपास के क्षेत्र में गंभीर रूप से झुका हुआ है। यद्यपि डेटा संग्रह के लिए ऐसे क्षेत्रों से बचना सबसे अच्छा है, लेकिन यूसेंट्रिक ऊंचाई का सटीक अनुमान लगाना अनिवार्य है यदि ये डेटा संग्रह के लिए कुछ आशाजनक क्षेत्रों में से एक का प्रतिनिधित्व करते हैं। चित्रा 3 दिखाता है कि यूसेंट्रिक ऊंचाई की ठीक से पहचान किए बिना लक्ष्यीकरण वर्ग आवर्धन में बड़ी छवि बदलाव का कारण बन सकता है। - अधिक सटीक जेड-ऊंचाई खोजें, फोकसर नोड का उपयोग करें, और सिम्युलेट दबाएं।
- आमतौर पर, स्क्वायर अधिग्रहण नोड में उपयोग किए जाने वाले आवर्धन पर फोकसर नोड में जेड-ऊंचाई का अनुमान लगाएं।
नोट: फोकसर नोड फोकस अनुक्रम में डेटा संग्रह के दौरान होल अधिग्रहण नोड (लेगिनॉन सॉफ्टवेयर में एक उपकरण) आवर्धन पर एक अच्छा जेड फोकस अनुमान भी शामिल हो सकता है। - फ़ोकसर नोड के लिए सेटिंग्स समायोजित करें और वर्गों की प्रारंभिक पंक्ति के दौरान ठीक जेड फ़ोकस विकल्प को सक्षम / अक्षम करें।
नोट: यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि स्वचालित डेटा संग्रह शुरू होने पर यूसेंट्रिक ऊंचाई की सटीक पहचान की जाती है, जिसके लिए ठीक जेड फोकस (चरण 2.10) को फिर से सक्षम करने की आवश्यकता हो सकती है।
- आमतौर पर, स्क्वायर अधिग्रहण नोड में उपयोग किए जाने वाले आवर्धन पर फोकसर नोड में जेड-ऊंचाई का अनुमान लगाएं।
- नमूना चरण को वास्तविक यूसेंट्रिक ऊंचाई पर डेटा संग्रह के लिए वांछित झुकाव कोण पर झुकाएं, और यदि आवश्यक हो तो चरण को फिर से केंद्रित करें। इस अध्ययन के लिए 0 °, 30 ° और 60 ° झुकाव कोण का उपयोग किया गया था। होल अधिग्रहण नोड एक्सपोज़र के लिए लक्ष्यों को पंक्तिबद्ध करना शुरू करने के लिए स्क्वायर अधिग्रहण नोड में अनुकरण दबाएं।
नोट: जैसा कि चरण 2.2.1 में दर्शाया गया है, ग्रिड एटलस को पूर्व-परिभाषित चरण झुकाव का उपयोग करके दर्ज किया जा सकता है, जो इस चरण में चरण को फिर से झुकाने की आवश्यकता को कम कर देगा। यह अच्छी तरह से काम करता है और प्रक्रिया को गति देता है यदि डेटा संग्रह के लिए उपयोग किया जाने वाला झुकाव कोण पूर्व-परिभाषित है। वर्तमान प्रोटोकॉल नए नमूनों को ध्यान में रखते हुए लिखा गया है, जिसमें उपयोगकर्ता डेटा संग्रह के लिए विभिन्न झुकाव कोणों का परीक्षण करना चाह सकता है। - उच्च आवर्धन एक्सपोजर के लिए उपयुक्त छेद वाले जेड फोकस लक्ष्य और क्षेत्रों का चयन करें।
- इमेजिंग के लिए कतार में लक्ष्य सबमिट करें दबाएँ . सभी वर्गों को कतारबद्ध करने के लिए समाप्त होने तक सबमिट कतारबद्ध लक्ष्य न दबाएं.
- नमूना चरण को उसकी जुताई हुई स्थिति में वापस लाएं। अगले वर्ग पर जाएं और चरण 2.3-2.8 को तब तक दोहराएं जब तक कि पर्याप्त संख्या में छेद एक्सपोजर कतार में न लग जाएं।
- होल टारगेटिंग नोड पर जाएं और सभी वर्गों के कतारबद्ध होने के बाद सबमिट क्यूड टारगेट दबाएं।
नोट: यदि समय बचाने के लिए पहले फाइन जेड फ़ोकस अक्षम किया गया था (चरण 2.5), तो इसे कतार जमा करने से पहले फिर से सक्षम करने की आवश्यकता है। - मैन्युअल रूप से उच्च आवर्धन एक्सपोजर अधिग्रहण नोड द्वारा चुने गए लक्ष्यों का निरीक्षण करें ताकि यह परीक्षण किया जा सके कि क्या स्वचालित ईएम छेद खोजक नमूना चरण झुकने पर छवि अधिग्रहण के लिए उपयुक्त क्षेत्रों की सटीक पहचान कर सकता है।
- इस कार्यविधि के दौरान, एक्सपोजर अधिग्रहण नोड सेटिंग्स में 'चयनित लक्ष्यों के उपयोगकर्ता सत्यापन की अनुमति दें' का चयन करें. एक बार जब उपयोगकर्ता लक्ष्यीकरण सटीकता से संतुष्ट हो जाता है, तो स्वचालित डेटा संग्रह के लिए इस विकल्प को डीसिलेक्ट करें।
नोट: उच्च आवर्धन एक्सपोजर अधिग्रहण नोड में लक्ष्य आमतौर पर बीम-झुकाव छवि शिफ्ट रणनीति का उपयोग करके चित्रित किए जाते हैं, जो झुके हुए और जुताए गए डेटा संग्रह23,24,25,26 दोनों के लिए समान रूप से अच्छी तरह से काम करता है। डाउनस्ट्रीम डेटा प्रोसेसिंग चरणों में सटीक सीटीएफ आकलन के लिए, बीम-टिल्ट इमेज शिफ्ट डेटा संग्रह रणनीति के लिए लेंस-कोमा विपथन अंशांकन किया जाना चाहिए।
- इस कार्यविधि के दौरान, एक्सपोजर अधिग्रहण नोड सेटिंग्स में 'चयनित लक्ष्यों के उपयोगकर्ता सत्यापन की अनुमति दें' का चयन करें. एक बार जब उपयोगकर्ता लक्ष्यीकरण सटीकता से संतुष्ट हो जाता है, तो स्वचालित डेटा संग्रह के लिए इस विकल्प को डीसिलेक्ट करें।
3. डेटा प्रोसेसिंग
- रिकॉर्ड की गई फिल्मों के गति-सुधार, सीटीएफ आकलन, कण चयन और डेटा संग्रह के दौरान प्रारंभिक पुनर्निर्माण के उत्पादन के साथ ऑन-द-फ्लाई डेटा प्रोसेसिंग 10,27,28,29 शुरू करें।
नोट: वर्तमान अध्ययन के लिए, क्रायोस्पार्क लाइव10 ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग पूर्व प्रसंस्करण के लिए किया गया है। ऑन-द-फ्लाई डेटा प्रोसेसिंग एक प्रारंभिक क्रायो-ईएम पुनर्निर्माण और कोणीय वितरण के लिए एक अनुमान प्रदान करता है, जो उपयोगकर्ता को रिज़ॉल्यूशन अनिसोट्रॉपी की सीमा के बारे में सूचित कर सकता है। बदले में, इनका उपयोग उपयोगकर्ता को मार्गदर्शन करने के लिए किया जा सकता है कि डेटा संग्रह के लिए उपयोग किया जाने वाला झुकाव कोण पर्याप्त रूप से अधिक है या नहीं। - पुनर्निर्मित मानचित्र की कल्पना करें और पसंदीदा कण उन्मुखता की सीमा को मापने के लिए यूलर कोण वितरण को प्लॉट करें।
नोट: रिज़ॉल्यूशन अनिसोट्रॉपी की संभावित सीमा निर्धारित करने के लिए यूलर कोण वितरण को सीधे फूरियर स्पेस सैंपलिंग वितरण में परिवर्तित किया जा सकता है। यूलर कोण वितरण की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने और इष्टतम झुकाव कोण30,31 निर्धारित करने में उपयोगकर्ता की सहायता के लिए एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) विकसित किया गया है। उपकरण गिथुब रिपॉजिटरी, https://github.com/LyumkisLab/SamplingGui से प्राप्त किया जा सकता है। - यदि आवश्यक हो, तो अधिमान्य अभिविन्यास के प्रभावों को दूर करने के लिए चरण झुकाव कोण को समायोजित करें जिस पर डेटा एकत्र किया जाता है। यदि अधिमान्य अभिविन्यास एक समस्या बनी हुई है, तो कोण बढ़ाया जा सकता है, जैसा कि मानचित्र और यूलर वितरण द्वारा 3.2 में स्पष्ट है। वैकल्पिक रूप से, उपयोगकर्ता डेटा संग्रह को समूहों में विभाजित करना चाह सकता है और कई अलग-अलग झुकाव कोणों का उपयोग करके रिकॉर्ड कर सकता है, जैसे कि 20 °, 30 °, और 40 °।
नोट: यद्यपि अधिकांश टीईएम में चरण को 70 ° तक झुकाने की क्षमता होनी चाहिए, सामान्य नमूना चरण झुकाव (जिसका हमने उपयोग किया है) 20 ° -40 ° तक होता है।
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Representative Results
0.3 मिलीग्राम / एमएल पर डीपीएस का उपयोग 0 ° , 30 ° और 60 ° झुकाव पर इमेजिंग प्रदर्शित करने के लिए किया गया था। विभिन्न झुकाव कोणों से डेटा विभिन्न ग्रिड क्षेत्रों में एक ही ग्रिड पर एकत्र किया गया था। सीटीएफ रिज़ॉल्यूशन उच्च कोण झुकाव के लिए फिट बैठता है, जैसा कि इस अध्ययन में तीन डेटासेट की तुलना करते समय हुआ था। चित्रा 4 तुलनात्मक प्रतिनिधि छवियों और 2 डी वर्गीकरण औसत को प्रदर्शित करता है। यद्यपि प्रोटीन एकाग्रता विभिन्न झुकाव कोणों में अपरिवर्तित है, एक उच्च झुकाव कोण कण एकाग्रता के संदर्भ में छवि क्षेत्र को अधिक भीड़ दिखाई देता है। यह डेटा प्रोसेसिंग के लिए समस्याग्रस्त हो सकता है क्योंकि कण ओवरलैप 3 डी पुनर्निर्माण और कोणीय शोधन को जटिल कर सकता है। पुनरावृत्ति 2 डी वर्गीकरण ने नियमित रूप से 0 ° और 30 ° झुके हुए डेटासेट के साथ कणों का एक साफ ढेर उत्पन्न किया, जबकि 60 ° डेटासेट को कण ढेर की सावधानीपूर्वक सफाई की आवश्यकता थी ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि वर्ग औसत आसन्न कणों के लिए न्यूनतम ओवरलैप दिखाते हैं। लाल बॉक्स में चित्रा 4 सी से वर्ग औसत कण ओवरलैप का एक उदाहरण दर्शाता है। यद्यपि वर्गीकरण के दौरान पुन: केंद्रीकरण के परिणामस्वरूप पड़ोसी कणों से सिग्नल औसत हो सकता है, पर्याप्त कण ओवरलैप कण संरेखण मापदंडों की सटीकता से समझौता कर सकता है, जिससे कम रिज़ॉल्यूशन की विशेषता वाले पुनर्निर्माण हो सकते हैं। कण ओवरलैप से बचने का सबसे अच्छा समाधान इष्टतम बर्फ मोटाई और कण वितरण के साथ प्री-स्क्रीन ग्रिड है। झुके हुए डेटा संग्रह से सुधार का मूल्यांकन करने के लिएमैट्रिक्स का एक व्यापक मात्रात्मक अवलोकन कहीं और वर्णित है।
चित्रा 1: झुके हुए डेटा संग्रह के साथ फायदे और चुनौतियों का अवलोकन। शीर्ष पैनल एक ग्रिड छेद का क्लोज-अप दृश्य दिखाता है। ग्रिड बार सोने में होते हैं, विट्रीयस आइस ब्लू, और मैक्रोमोलेक्यूलर कण लाल होते हैं। तीर इलेक्ट्रॉन बीम की दिशा को इंगित करते हैं। निचला पैनल शीर्ष पैनल के समान रंग योजना के साथ छेद के संग्रह का प्रतिनिधित्व करता है। काला तारा उच्च आवर्धन पर एक्सपोज़र छवि अधिग्रहण से पहले ठीक फोकस लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करता है। झुकाव कोण को 'α' के रूप में दर्शाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: वर्कफ़्लो आरेख जो झुके हुए और झुके हुए डेटा संग्रह रणनीति की तुलना करता है। जुताई और झुके हुए डेटा संग्रह की चरणवार तुलना प्रत्येक झुके हुए वर्ग (झुके हुए डेटा संग्रह के लिए 2 और 3) के लिए यूसेंट्रिक ऊंचाई और पुन: केंद्रीकरण का मैन्युअल रूप से अनुमान लगाने के अतिरिक्त चरण को दर्शाती है। बाकी वर्कफ़्लो दो रणनीतियों के बीच समान है। इनमें इमेजिंग के लिए एक उपयुक्त वर्ग का चयन करना (झुके हुए और झुके हुए डेटा संग्रह के लिए 1), इमेजिंग के लिए एक वर्ग चुनकर एक कतार योजना शुरू करना (जिसे क्रमशः स्टिटेड और झुका हुआ डेटा संग्रह के लिए अनुकरण के रूप में जाना जाता है; 2 और 4), एक यूसेंट्रिक ऊंचाई फोकस लक्ष्य और कतार छेद आवर्धन अधिग्रहण लक्ष्य (3 और 5) प्रदान करना शामिल है। क्रमशः)। और अंत में चयनित उच्च आवर्धन जोखिम लक्ष्यों की कतार प्रस्तुत करना (क्रमशः जुताई और झुके हुए डेटा संग्रह के लिए 4 और 6)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: विभिन्न झुकाव कोणों के साथ वर्ग आवर्धन पर ग्रिड की प्रतिनिधि छवियां। यूसेंट्रिक जेड-ऊंचाई के पास और दूर एकत्र की गई छवियों को क्रमशः शीर्ष और निचले पैनलों पर दिखाया गया है। बीम की ऑप्टिकल धुरी को लाल संकेंद्रित छल्ले के केंद्र द्वारा इंगित किया जाता है। हरा तीर रुचि के वर्ग को इंगित करता है। संदर्भ के लिए ब्याज के वर्ग से सटे एक टूटी हुई ग्रिड सुविधा है। देखने में आसानी के लिए ऑब्जेक्टिव एपर्चर को हटा दिया गया है। स्केल बार = 20 μM. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: प्रतिनिधि छेद एक्सपोजर और 2 डी वर्ग औसत विभिन्न झुकाव कोणों पर एकत्र किए गए। पैनल (ए), (बी), और (सी) नमूना चरण के साथ किए गए इमेजिंग को संदर्भित करते हैं जो 0 ° पर या 30 ° और 60 ° तक झुके हुए होते हैं। भीड़भाड़ से प्रभावित 2 डी वर्ग औसत (सी) में लाल बॉक्स में दिखाए गए हैं। स्केल बार = 100 एनएम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
वायु-जल इंटरफ़ेस के नमूना पालन के कारण पसंदीदा कण अभिविन्यास क्रायो-ईएम एसपीए 4,5,6 का उपयोग करके नियमित उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण के लिए अंतिम प्रमुख बाधाओं में से एक है। यहां प्रस्तुत डेटा संग्रह योजना एक डेटासेट के भीतर कणों के अभिविन्यास वितरण में सुधार के लिए एक आसान-से-लागू रणनीति प्रदान करती है। हम ध्यान दें कि प्रोटोकॉल को कोई अतिरिक्त उपकरण या सॉफ़्टवेयर की आवश्यकता नहीं है और डेटा संग्रह की गति को प्रभावित नहीं करता है। झुके हुए नमूनों के लिए डेटा अधिग्रहण के दौरान निम्नलिखित विचार महत्वपूर्ण हैं।
सबसे पहले, छवि वर्ग इष्टतम लक्ष्यीकरण के लिए यूसेंट्रिक ऊंचाई पर होना चाहिए। यूसेंट्रिक ऊंचाई को छोटे चरण झुकाव कोणों (आमतौर पर 0.5 ° -2 ° ) पर झुकाव-जोड़ी छवियों को रिकॉर्ड करके और छवि शिफ्ट और डीफोकस के बीच पूर्व-परिभाषित संबंध के आधार पर फोकस की पहचान करके समायोजित किया जाता है। यदि लक्षित वर्ग को यूसेंट्रिक ऊंचाई में एक बड़े समायोजन की आवश्यकता होती है, तो इसके परिणामस्वरूप वर्ग छवि की एक महत्वपूर्ण छवि बदलाव होगा, जैसे कि जब मंच फिर से झुका होता है, तो दृश्य का क्षेत्र उद्देश्य एपर्चर द्वारा अवरुद्ध हो सकता है।
दूसरे, सामान्य रूप से गोलाकार छेद मध्यम आवर्धन (होल अधिग्रहण नोड आवर्धन) पर उच्च झुकाव के साथ तेजी से अंडाकार हो जाता है। सटीक छवि-शिफ्ट अंशांकन की अनुपस्थिति में, यह संभव है कि पन्नी के हिस्से को किसी दिए गए एक्सपोजर आवर्धन के लिए विट्रियस बर्फ में एम्बेडेड कणों के साथ चित्रित किया जा सकता है। इसलिए, आदर्श रूप से, छवि-शिफ्ट अंशांकन सटीक होना चाहिए। एक विकल्प आवर्धन को बढ़ाना है ताकि छेद के आकार के सापेक्ष छवि क्षेत्र कम हो जाए। उच्च आवर्धन पर, बीम झुकाव-प्रेरित छवि-बदलाव में त्रुटियों का उपयोगकर्ता की विट्रियस बर्फ के क्षेत्र में नेविगेट करने की क्षमता पर एक छोटा प्रभाव पड़ेगा। हालांकि, यह परिणामी माइक्रोग्राफ में कणों की संख्या को कम करने की कीमत पर आता है, जो आवर्धन में वृद्धि के आनुपातिक है।
तीसरा, ऑटोफोकस में बीम-प्रेरित गति में वृद्धि और नमूना मोटाई में वृद्धि के कारण झुके हुए डेटा संग्रह के लिए विफल होने की अधिक संभावना है। इस प्रकार, सटीक फ़ोकस प्राप्त करना, कभी-कभी, झुके हुए डेटा संग्रह के लिए कुछ चुनौतियां पेश कर सकता है, खासकर अगर फोकस लक्ष्य चार छेदों के केंद्र में सोने की पन्नी है, जो कि जुताई किए गए डेटा संग्रह के लिए मानक अभ्यास है। लगातार फोकस अनुमान विफलताओं के मामलों में, एक विकल्प एक छेद के किनारे को फोकस लक्ष्य के रूप में सेट करना है। यह बीम झुकाव-प्रेरित छवि जोड़े और बाद में फोकस समायोजन के बीच सटीक चरण सहसंबंध के लिए पर्याप्त संकेत प्रदान करना चाहिए। हमारे अनुभव में, एक छेद के किनारे पर ध्यान केंद्रित करने से शायद ही कभी ऑटोफोकस विफलता होती है।
और अंत में, जब उच्च-आवर्धन छवियों को ग्रिड केंद्र से दूर चुना जाता है, तो झुकाव अक्ष के विपरीत किनारों पर लक्षित छवियों के बीच फोकस में अंतर महत्वपूर्ण हो सकता है। इस अंतर का परिमाण झुकाव कोण और फोकस के बिंदु से दूरी पर निर्भर है। उदाहरण के लिए, 30° के झुकाव कोण पर, दो लक्ष्य जो ग्रिड की सतह पर 6 μm अलग हैं और झुकाव अक्ष के ठीक लंबवत चुने गए हैं, उनके बीच डिफोकस में 3 μm का अंतर होगा (संबंध है: डेल्टा डीफोकस = sin (झुकाव कोण) * (झुकाव अक्ष से दूरी))। झुकाव अक्ष के साथ चुने गए लक्ष्यों में एक ही डिफोकस होगा, जबकि अन्य बीच में कहीं गिरेंगे। यदि अंशांकन के दौरान लेगिनन में झुकाव अक्ष को परिभाषित किया जाता है, तो सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से डीफोकस में परिवर्तन की भरपाई करता है। हालांकि, उपयोगकर्ताओं को पता होना चाहिए कि उच्च-आवर्धन इमेजिंग के दौरान बड़े फोकस ग्रेडिएंट होने की संभावना अभी भी मौजूद है। बड़े फोकस ग्रेडिएंट को अंतिम पुनर्निर्माण 33 को कम से कम प्रभावित करना चाहिए, लेकिन उपनामप्रभावों को रोकने के लिए डेटा प्रोसेसिंग के दौरान बड़े बॉक्स आकार का उपयोग करना आवश्यक हो सकता है। इन परिस्थितियों में, डेटा अधिग्रहण के दौरान एक संकीर्ण डीफोकस रेंज का उपयोग करना आवश्यक हो सकता है, और डिफोकस का यादृच्छिककरण स्वाभाविक रूप से चरण को झुकाने से आता है। डेटा प्रोसेसिंग के दौरान प्रति-कण डीफोकस समायोजन अंतिम पुनर्निर्माण के संकल्प में सुधार कर सकता है। हालांकि, चूंकि सीटीएफ फिट्स का सटीक मॉडलिंग उच्च चरण-झुकाव कोणों के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, इसलिए डेटा की गुणवत्ता की निगरानी के लिए देखभाल की जानी चाहिए, और सीटीएफ एक्सपोजर क्यूरेशन के दौरान फिट बैठता है। आम तौर पर, उप-इष्टतम बर्फ मोटाई के परिणामस्वरूप सीटीएफ आकलन फिट मॉडलिंग में खराब सटीकता होती है। इसलिए, उन क्षेत्रों में छवि बनाने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए जहां बर्फ पतली है, यह मानते हुए कि कण वितरण इन क्षेत्रों में पर्याप्त रूप से अच्छा है।
एक बेहतर और अधिक समान अभिविन्यास वितरण पुनर्निर्मित क्रायो-ईएम मानचित्रों के दिशात्मक संकल्प में इसी सुधार की ओर जाता है। इसके अलावा, एक अधिक समान अभिविन्यास वितरण नमूना मुआवजा कारक में सुधार करता है, जो सीधे वैश्विक संकल्प30,31 से संबंधित है। इस प्रकार, सामूहिक रूप से अभिविन्यास वितरण में सुधार करने से परमाणु मॉडलिंग और शोधन 9,30,31 की सटीकता में सुधार होना चाहिए। यह सिद्धांत रूप में, झुके हुए डेटा संग्रह के नियमित कार्यान्वयन के लिए एक मजबूत मामला प्रदान करेगा। हालांकि, कई चेतावनियां हैं जिनके बारे में उपयोगकर्ता को पता होना चाहिए। सबसे पहले, बढ़ी हुई फोकस ढाल और बर्फ की मोटाई समग्र वैश्विक संकल्प को प्रभावित कर सकती है, संभवतः पृष्ठभूमि शोर में वृद्धि और बीम-प्रेरित गति में वृद्धि के संयोजन के कारण, परिणामस्वरूप उत्पन्न होने वाले अन्य अप्रत्यक्ष मुद्दों के साथ संयुक्त। यह प्रभाव उन मामलों में अधिक स्पष्ट होने की उम्मीद है जहां बर्फ स्वाभाविक रूप से मोटी है। हालांकि, चूंकि अधिकांश नमूने कुछ मात्रा में पसंदीदा अभिविन्यास से पीड़ित हैं, जो बदले में नमूना गैर-एकरूपता का कारण बन सकता है, झुका हुआ डेटा संग्रह आम तौर पर फायदेमंद हो सकता है जब तक कि हानिकारक प्रभाव कम से कम या कम हो जाते हैं। दूसरा, गंभीर अधिमान्य अभिविन्यास की विशेषता वाले कुछ नमूनों के लिए चरण को 60 ° तक झुकाना आवश्यक हो सकता है। हमारे काम और सहकर्मियों की रिपोर्टों से उपाख्यानात्मक अप्रकाशित साक्ष्य बताते हैं कि कुछ नमूनों के लिए रिज़ॉल्यूशन अनिसोट्रॉपी को दूर करने के लिए ~ 40 ° झुकाव भी अपर्याप्त हैं। बाल्डविन एट अल.31 में रखे गए विचारों के आधार पर वितरण के एक सेट के लिए एक इष्टतम झुकाव कोण की पहचान करने की दिशा में प्रयास चल रहे हैं। अंत में, किसी को ध्यान देना चाहिए कि, सिद्धांत रूप में, पूरी तरह से पैथोलॉजिकल एकल पसंदीदा अभिविन्यास की विशेषता वाले नमूने से पुनर्निर्माण में अभी भी 30 डिग्री गायब शंकु होगा, भले ही डेटा 60 डिग्री झुकाव कोण पर एकत्र किया जाए। नकली प्रयोगों में, एक 30 ° लापता शंकु प्रयोगात्मक व्याख्याओं को बहुत प्रभावित करने की संभावना नहीं है। एक 60 ° झुकाव शायद सबसे पैथोलॉजिकल रूप से उन्मुख नमूनों के लिए भी पर्याप्त है। हालांकि, ऐसे मामलों में जहां चरण को 60 ° तक झुकना पड़ सकता है, दृश्य के क्षेत्र में कणों की एकाग्रता को सावधानीपूर्वक अनुकूलित करने की आवश्यकता है, क्योंकि कण ओवरलैप डेटा प्रसंस्करण को जटिल करेगा। नमूना चरण डिजाइन की सीमाओं के कारण, मानक टीईएम पर 60 ° (या चुनिंदा माइक्रोस्कोप चरणों पर 70° से अधिक झुकना संभव नहीं है)। ऐसे मामलों में, एडिटिव्स और नमूना जैव रसायन के साथ अतिरिक्त अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम माइक्रोस्कोपी, लेगिनन इंस्टॉलेशन और डेटा ट्रांसफर इंफ्रास्ट्रक्चर के साथ मदद के लिए बिल एंडरसन, चार्ल्स बोमन और जीन-क्रिस्टोफ़ डुकॉम (टीएसआरआई) को धन्यवाद देते हैं। हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पठन के लिए गॉर्डन लुई (साल्क इंस्टीट्यूट) और योंग ज़ी टैन (नेशनल यूनिवर्सिटी ऑफ सिंगापुर) को भी धन्यवाद देते हैं। हम डीपीएस की अभिव्यक्ति के लिए प्लास्मिड प्रदान करने के लिए क्रिस रूसो (एमआरसी लेबोरेटरी ऑफ मॉलिक्यूलर बायोलॉजी, कैम्ब्रिज) को धन्यवाद देते हैं। इस काम को यूएस नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (U54AI150472, U54 AI170855, और R01AI136680 से डीएल), नेशनल साइंस फाउंडेशन (NSF MCB-2048095 से डीएल), हर्स्ट फाउंडेशन (डीएल को), और आर्थर और जूली वुडरो चेयर (J.P.N.) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryosparc Live v3.1.0+210216 | Structura Biotechnology | ||
| DPS protein | Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098. | ||
| K2 Summit Direct Electron Detector | Gatan | ||
| Leginon software suite | C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60. | ||
| Manual plunging device | Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids | ||
| Talos Arctica | FEI/Thermo Fisher | ||
| UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids | Quantifoil | N1-A14nAu30-01 |
References
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