Summary
يصف هذا البروتوكول مخططا معمما وسهل التنفيذ لجمع بيانات الجسيمات المفردة المائلة في تجارب cryo-EM. مثل هذا الإجراء مفيد بشكل خاص للحصول على خريطة EM عالية الجودة للعينات التي تعاني من تحيز التوجه التفضيلي بسبب الالتزام بواجهة الهواء والماء.
Abstract
يعد تحليل الجسيمات المفردة (SPA) بواسطة المجهر الإلكتروني بالتبريد (cryo-EM) الآن تقنية سائدة للبيولوجيا الهيكلية عالية الدقة. يعتمد تحديد الهيكل بواسطة SPA على الحصول على مناظر مميزة متعددة لجسم جزيئي كبير مزجج داخل طبقة رقيقة من الجليد. من الناحية المثالية ، فإن مجموعة من اتجاهات الإسقاط العشوائي الموزعة بشكل موحد ستصل إلى جميع المشاهدات الممكنة للكائن ، مما يؤدي إلى عمليات إعادة بناء تتميز بدقة اتجاهية متباينة الخواص. ومع ذلك ، في الواقع ، تعاني العديد من العينات من جزيئات ذات توجه تفضيلي تلتصق بواجهة الهواء والماء. وهذا يؤدي إلى توزيعات اتجاه زاوي غير منتظمة في مجموعة البيانات وأخذ عينات غير متجانسة من فضاء فورييه في إعادة البناء ، مما يترجم إلى خرائط تتميز بدقة متباينة الخواص. يوفر إمالة مرحلة العينة حلا قابلا للتعميم للتغلب على تباين الخواص بفضل تحسين توحيد توزيعات الاتجاه ، وبالتالي الخواص لأخذ عينات فورييه من الفضاء. يصف هذا البروتوكول استراتيجية مؤتمتة لجمع البيانات ذات مرحلة مائلة باستخدام Leginon ، وهو برنامج للحصول على الصور تلقائيا. الإجراء سهل التنفيذ ، ولا يتطلب أي معدات أو برامج إضافية ، ومتوافق مع معظم المجاهر الإلكترونية القياسية (TEMs) المستخدمة لتصوير الجزيئات البيولوجية الكبيرة.
Introduction
أدى ظهور كاشفات الإلكترون المباشرة على مدار العقد الماضي1،2،3 إلى زيادة هائلة في عدد الهياكل عالية الدقة للجزيئات الكبيرة والتجمعات الجزيئية الكبيرة التي تم حلها باستخدام cryo-EM أحادي الجسيم4،5،6. من المتوقع أن تكون جميع الأنواع الجزيئية المنقاة تقريبا قابلة لتحديد الهيكل باستخدام cryo-EM ، باستثناء أصغر البروتينات ~ 10 كيلو دالتون في الحجم أو أقل من7. كمية المواد الأولية اللازمة لإعداد الشبكة وتحديد الهيكل هي على الأقل ترتيب من حيث الحجم أقل من تقنيات تحديد البنية الأخرى ، مثل التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي وعلم البلورات بالأشعة السينية4،5،6.
ومع ذلك ، فإن التحدي الرئيسي لتحديد الهيكل بواسطة cryo-EM ينطوي على إعداد شبكة مناسبة للتصوير. اقترحت دراسة مستفيضة لتقييم عينات متنوعة باستخدام استراتيجيات وشبكات تزجيج مختلفة أن معظم طرق تزجيج العينات على شبكات cryo-EM تؤدي إلى الالتزام التفضيلي للجزيئات الكبيرة بواجهة الهواء والماء8. ويمكن أن يتسبب هذا الالتزام في أربع نتائج دون المستوى الأمثل: (1) أن العينة الجزيئية الكبيرة تتشوه تماما، وفي هذه الحالة لا يمكن جمع البيانات ومعالجتها بنجاح؛ و (2) أن العينة الجزيئية الكبيرة تتشوه تماما، وفي هذه الحالة لا يمكن جمع البيانات ومعالجتها بنجاح؛ و (2) لا يمكن جمع البيانات ومعالجتها بنجاح. (2) تتشوه العينة جزئيا ، وفي هذه الحالة قد يكون من الممكن الحصول على رؤى هيكلية من مناطق الجزيء الكبيرة غير التالفة ؛ (3) تحتفظ العينة بالبنية الأصلية ، ولكن يتم تمثيل مجموعة واحدة فقط من اتجاهات الجسيمات بالنسبة لاتجاه حزمة الإلكترون في الصور ؛ (4) تحتفظ العينة بالبنية الأصلية ، ويتم تمثيل بعض وليس كل اتجاهات الجسيمات الممكنة بالنسبة لاتجاه حزمة الإلكترون في الصور. بالنسبة للحالتين (3) و (4) ، سيساعد جمع البيانات المائل في تقليل تباين الخواص في دقة الاتجاه الذي يؤثر على خريطة cryo-EM المعاد بناؤها ويوفر حلا قابلا للتعميم لمجموعة متنوعة من العينات9. من الناحية الفنية ، يمكن أن يفيد الإمالة أيضا الحالة (2) ، حيث يفترض أن يحدث التمسخ عند السطح البيني بين الهواء والماء ويحد بالمثل من عدد الاتجاهات المميزة الممثلة في البيانات. يمكن تغيير مدى تحيز التوجه في مجموعة البيانات من خلال تجربة إضافات الحلول ، لكن الافتقار إلى قابلية التطبيق الواسعة يعيق مناهج التجربة والخطأ هذه. يكفي إمالة مرحلة العينة بزاوية إمالة محسنة واحدة لتحسين توزيع الاتجاهات بحكم تغيير هندسة تجربة التصوير9 (الشكل 1). نظرا للتكوين الهندسي للعينة ذات التوجه التفضيلي فيما يتعلق بحزمة الإلكترون ، لكل مجموعة من الاتجاهات التفضيلية ، فإن إمالة الشبكة تولد مخروطا من زوايا الإضاءة فيما يتعلق بالسنترويد العنقودي. ومن ثم ، فإن هذا ينشر وجهات النظر وبالتالي يحسن أخذ عينات فضاء فورييه والخواص الخواص في دقة الاتجاه.
هناك ، في الممارسة العملية ، بعض الأضرار لإمالة المسرح. يؤدي إمالة مرحلة العينة إلى إدخال تدرج تركيز عبر مجال الرؤية ، مما قد يؤثر على دقة تقديرات وظيفة نقل التباين (CTF). قد يؤدي جمع البيانات المائل أيضا إلى زيادة حركة الجسيمات التي يسببها الحزمة بسبب زيادة تأثيرات الشحن عند تصوير العينات المائلة. يؤدي إمالة الشبكة أيضا إلى زيادة سمك الجليد الظاهري ، مما يؤدي بدوره إلى صور مجهرية أكثر ضوضاء وقد يؤثر في النهاية على دقة عمليات إعادة البناء5،9،10. وقد يكون من الممكن التغلب على هذه المسائل بتطبيق مخططات متقدمة لمعالجة البيانات الحاسوبية يرد وصفها بإيجاز في قسمي البروتوكول والمناقشة. أخيرا ، يمكن أن يؤدي الإمالة إلى زيادة تداخل الجسيمات ، مما يعيق خط أنابيب معالجة الصور اللاحق. على الرغم من أنه يمكن التخفيف من ذلك إلى حد ما عن طريق تحسين تركيز الجسيمات على الشبكة ، إلا أنه مع ذلك اعتبار مهم. هنا ، يتم وصف بروتوكول سهل التنفيذ لجمع البيانات المائلة باستخدام مجموعة برامج Leginon (برنامج آلي للحصول على الصور) ، متاح للوصول المفتوح ومتوافق مع مجموعة واسعة من المجاهر11،12،13،14. تتطلب الطريقة الإصدار 3.0 على الأقل أو أعلى ، مع الإصدارات 3.3 وما بعده التي تحتوي على تحسينات مخصصة لتمكين جمع البيانات المائلة. لا توجد برامج أو معدات إضافية ضرورية لهذا البروتوكول. يتم توفير تعليمات شاملة حول البنية التحتية الحاسوبية وأدلة التثبيت في مكان آخر15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد العينة
- استخدم الشبكات التي تحتوي على رقائق الذهب ودعم شبكة الذهب16 (انظر جدول المواد) لأن جمع البيانات المائل يمكن أن يبرز الحركة التي يسببها شعاع17.
ملاحظة: بالنسبة للدراسة الحالية ، تم تزجيج العينات الموجودة على الشبكات باستخدام تقنية الغطس والنشاف اليدوية18 في غرفة باردة مرطبة (أكبر من 80٪) (~ 4 درجة مئوية). - تجنب استخدام الشبكات التي تحتوي على دعم النحاس ورقائق الكربون أو طبقة مستمرة من الكربون غير المتبلور ما لم يكن ذلك ضروريا للغاية ، لأن هذه الشبكات قد تؤدي إلى حركة أكبر مستحثةبالشعاع 16 عند إمالة مرحلة العينة.
ملاحظة: يبدو أن طبقات الدعم البديلة ، مثل أكسيد الجرافين / الجرافين ، تقلل من الحركة التي يسببها الحزمة مقارنة بالكربون غير المتبلور19,20. - قم بفحص الشبكات مسبقا وتحديد المناطق التي تتميز بسمك الجليد المقبول وتوزيع الجسيمات. ستؤدي الشبكات التي تحتوي على جزيئات معبأة بإحكام شديد إلى تداخل الجسيمات أثناء جمع البيانات المائلة ، مما قد يؤثر على خطوات معالجة البيانات النهائية.
ملاحظة: هذه الخطوات ذاتية لأن تحديد مناطق جيدة من الجليد يتم عن طريق الفحص البصري للصور غير المركزة للمناطق التي يكون فيها تباين الجسيمات واضحا. قد لا يكون هذا ممكنا لجميع العينات لأن بعض العينات لن توزع بكفاءة في مناطق الجليد الرقيق ، مما يؤدي إلى تحديات أثناء جمع البيانات (الموصوفة في قسم المناقشة). - قم بتزجيج الشبكات التي تحتوي على عينة البروتين الخاصة بك. هنا ، لأغراض العرض التوضيحي ، نستخدم بروتين حماية الحمض النووي أثناء الجوع (DPS) (انظر جدول المواد) في نطاق يتراوح من 0.1-0.5 مجم / مل مع رقائق الذهب وشبكات دعم الذهب.
ملاحظة: تم تنقية البروتين كما هو موضح سابقا ، باستثناء عدم إجراء انقسام الأنزيم البروتيني TEV21. يجب تحسين نطاق تركيز البروتين لعينة ذات أهمية بشكل فردي ، لأنه من الصعب قياس نطاق مثالي قابل للتطبيق عالميا وسيختلف بالتأكيد بين العينات المختلفة.
2. إعداد جمع البيانات المائلة
- قم بمحاذاة المجهر لضمان الإضاءة المتوازية للعينة وتقليل انحرافات الغيبوبة22.
ملاحظة: يجب محاذاة المجهر جيدا لجمع بيانات SPA القياسية دون إمالة المرحلة. لا توجد محاذاة خاصة ضرورية لجمع البيانات المائلة ، ولكن المحاذاة الجيدة ستضمن أن الاستهداف والتصوير يسيران بسلاسة. ويرد مخطط عام يقارن جمع البيانات المائلة وغير المائلة في الشكل 2. - سجل أطلس الشبكة بدون إمالة المرحلة لتحديد المربعات المناسبة لجمع البيانات أو فحص المربعات يدويا عند التكبير المستخدم في عقدة اكتساب المربع. ابحث عن المربعات التي تكون فيها الرقاقة سليمة ، ولا تبدو مجففة ، ولها سمك جليدي مثالي.
ملاحظة: عقدة الاستحواذ المربعة هي عقدة التكبير المنخفضة المستخدمة للتصوير متعدد المقاييس في Leginon.- بالنسبة لجمع البيانات الآلي غير المائل النموذجي ، قم بتسجيل أطلس الشبكة ، والذي يوفر نظرة عامة على الجودة العامة للشبكة ومؤشرا أوليا للمناطق المناسبة لجمع البيانات.
- بعد ذلك ، حدد المربعات المناسبة من خلال الأطلس وأرسلها إلى قائمة الانتظار. بعد ذلك ، إما من خلال الاختيار اليدوي للثقوب أو من خلال مكتشف ثقب EM الآلي ، قم بالانتظار وإرسال أهداف الثقوب.
- أخيرا ، استخدم مكتشف ثقب EM الآلي لتقديم أهداف التعرض للتكبير العالي.
ملاحظة: لجمع البيانات المائلة ، قد يلزم وضع المربعات في قائمة الانتظار يدويا للحصول على نتائج متسقة ، خاصة إذا لم يتم تحديد زاوية الميل المثلى مسبقا ومن المحتمل أن يتم ضبطها أثناء جمع البيانات. ويمكن أيضا تسجيل أطلس الشبكة باستخدام إمالة مرحلة محددة مسبقا إذا كانت زاوية الميل المستخدمة في جمع البيانات قد حددت مسبقا.
- انقل مرحلة العينة إلى مربع الاهتمام.
- حدد الارتفاع المركزي لموضع المسرح باستخدام α المتذبذب عند إمالة المسرح ± 15 درجة. اضبط ارتفاع Z لإحضار المسرح إلى ارتفاع مركزي باستخدام لوحة المفاتيح للمجهر. تأكد من أن إزاحة الصورة ضئيلة أثناء روتين α التذبذب.
ملاحظة: إذا لم يتم تحديد الارتفاع المركزي بشكل صحيح ، ملاحظة إزاحة كبيرة للصورة عند إمالة المسرح عند التكبير المربع. يمكن أن يحدث هذا أيضا إذا كانت هناك تشوهات محلية على الشبكة ، على سبيل المثال ، إذا كانت الشبكة مكسورة أو منحنية بشدة بالقرب من المنطقة المصورة. على الرغم من أنه من الأفضل تجنب مثل هذه المناطق لجمع البيانات ، فمن الضروري تقدير الارتفاع المركزي بدقة إذا كانت تمثل واحدة من المناطق القليلة الواعدة لجمع البيانات. يوضح الشكل 3 كيف يمكن أن يؤدي الاستهداف دون تحديد الارتفاع المركزي بشكل صحيح إلى حدوث تحولات كبيرة في الصورة في تكبير المربع. - ابحث عن ارتفاع Z أكثر دقة ، واستخدم عقدة Focuser ، واضغط على محاكاة.
- عادة ، قم بتقدير ارتفاع Z في عقدة Focuser عند التكبير المستخدم في عقدة الاستحواذ المربعة.
ملاحظة: يمكن أن يتضمن تسلسل تركيز عقدة Focuser أيضا تقديرا دقيقا لتركيز Z عند تكبير عقدة اكتساب الثقب (أداة في برنامج Leginon) أثناء جمع البيانات. - اضبط إعدادات عقدة Focuser وقم بتمكين / تعطيل خيار التركيز Z الدقيق أثناء قائمة الانتظار الأولية للمربعات.
ملاحظة: من المهم التأكد من تحديد الارتفاع المركزي بدقة عند بدء جمع البيانات تلقائيا، الأمر الذي قد يتطلب إعادة تمكين التركيز البؤري الدقيق Z (الخطوة 2.10).
- عادة ، قم بتقدير ارتفاع Z في عقدة Focuser عند التكبير المستخدم في عقدة الاستحواذ المربعة.
- قم بإمالة مرحلة العينة إلى زاوية الميل المطلوبة لجمع البيانات عند الارتفاع المركزي الحقيقي ، وأعد توسيط المرحلة إذا لزم الأمر. تم استخدام زوايا ميل 0 درجة و 30 درجة و 60 درجة لهذه الدراسة. اضغط على محاكاة في عقدة الاستحواذ المربع لبدء وضع الأهداف في قائمة انتظار لتعرض عقدة اكتساب الثقب .
ملاحظة: كما هو مبين في الخطوة 2-2-1، يمكن تسجيل أطلس الشبكة باستخدام إمالة مرحلة محددة مسبقا، مما يغني عن الحاجة إلى إمالة المرحلة مرة أخرى في هذه الخطوة. يعمل هذا بشكل جيد ويسرع العملية إذا كانت زاوية الميل المستخدمة لجمع البيانات محددة مسبقا. تمت كتابة البروتوكول الحالي مع وضع عينات جديدة في الاعتبار ، حيث قد يرغب المستخدم في اختبار زوايا ميل مختلفة لجمع البيانات. - حدد هدف التركيز البؤري Z والمناطق ذات الثقوب المناسبة لدرجات التكبير العالية.
- اضغط على إرسال الأهداف إلى قائمة الانتظار للتصوير. لا تضغط على إرسال الأهداف في قائمة الانتظار حتى تنتهي من وضع جميع المربعات في قائمة الانتظار.
- أعد مرحلة العينة إلى حالتها غير المائلة. انتقل إلى المربع التالي وكرر الخطوات 2.3-2.8 حتى يتم وضع عدد كاف من التعرضات للثقوب في قائمة الانتظار.
- انتقل إلى عقدة استهداف الحفرة واضغط على إرسال الأهداف في قائمة الانتظار بمجرد وضع جميع المربعات في قائمة الانتظار.
ملاحظة: إذا تم تعطيل التركيز الدقيق Z مسبقا لتوفير الوقت (الخطوة 2.5)، فيجب إعادة تمكينه قبل إرسال قائمة الانتظار. - افحص يدويا الأهداف المحددة بواسطة عقدة اكتساب التعريض الضوئي عالية التكبير لاختبار ما إذا كان مكتشف ثقب EM الآلي يمكنه تحديد المناطق المناسبة بدقة للحصول على الصور عند إمالة مرحلة العينة.
- أثناء هذا الإجراء، حدد "السماح بتحقق المستخدم من الأهداف المحددة" في إعدادات عقدة اكتساب التعرض . بمجرد أن يشعر المستخدم بالرضا عن دقة الاستهداف، قم بإلغاء تحديد هذا الخيار لجمع البيانات تلقائيا.
ملاحظة: عادة ما يتم تصوير الأهداف ذات التكبير العالي لعقدة اكتساب التعريض الضوئي باستخدام إستراتيجية إزاحة الصورة بإمالة الحزمة ، والتي تعمل بشكل جيد على حد سواء لجمع البيانات المائلة وغير المائلة23،24،25،26. للحصول على تقدير دقيق ل CTF في خطوات معالجة البيانات النهائية ، يجب إجراء معايرة انحراف غيبوبة العدسة لاستراتيجية جمع بيانات إزاحة الصورة بإمالة الحزمة.
- أثناء هذا الإجراء، حدد "السماح بتحقق المستخدم من الأهداف المحددة" في إعدادات عقدة اكتساب التعرض . بمجرد أن يشعر المستخدم بالرضا عن دقة الاستهداف، قم بإلغاء تحديد هذا الخيار لجمع البيانات تلقائيا.
3. معالجة البيانات
- بدء معالجة البيانات أثناء التنقل10،27،28،29 مع تصحيح حركة الأفلام المسجلة ، وتقدير CTF ، واختيار الجسيمات ، وتوليد عمليات إعادة البناء الأولية أثناء جمع البيانات.
ملاحظة: بالنسبة للدراسة الحالية، تم استخدام cryoSPARC Live10 (انظر جدول المواد) للمعالجة المسبقة. توفر معالجة البيانات أثناء التنقل إعادة بناء أولية ل cryo-EM وتقريب للتوزيع الزاوي ، والذي يمكن أن يبلغ المستخدم بمدى تباين الخواص. ويمكن استخدام هذه بدورها لتوجيه المستخدم بشأن ما إذا كانت زاوية الميل المستخدمة لجمع البيانات عالية بما فيه الكفاية أم لا. - تصور الخريطة المعاد بناؤها وارسم توزيع زاوية أويلر لقياس مدى اتجاهات الجسيمات المفضلة.
ملاحظة: يمكن تحويل توزيعات زاوية أويلر مباشرة إلى توزيعات أخذ عينات فضاء فورييه لتحديد المدى المحتمل لتباين الخواص. تم تطوير واجهة مستخدم رسومية (GUI) لمساعدة المستخدم في تقييم جودة توزيع زاوية أويلر وتحديد زاوية الميل المثلى30,31. يمكن الحصول على الأداة من مستودع Github ، https://github.com/LyumkisLab/SamplingGui. - إذا لزم الأمر ، اضبط زاوية إمالة المرحلة التي يتم فيها جمع البيانات للتغلب على تأثيرات الاتجاه التفضيلي. يمكن زيادة الزاوية إذا ظل الاتجاه التفضيلي يمثل مشكلة ، كما يتضح من الخريطة وتوزيع أويلر في 3.2. بدلا من ذلك ، قد يرغب المستخدم في تقسيم جمع البيانات إلى مجموعات والتسجيل باستخدام عدة زوايا إمالة مختلفة ، مثل 20 درجة و 30 درجة و 40 درجة.
ملاحظة: على الرغم من أن معظم TEMs يجب أن يكون لديها القدرة على إمالة المسرح إلى 70 درجة ، فإن إمالة مرحلة العينات الشائعة (التي استخدمناها) تتراوح من 20 درجة إلى 40 درجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم استخدام DPS عند 0.3 مجم / مل لإظهار التصوير عند إمالة 0 درجة و 30 درجة و 60 درجة. تم جمع البيانات من زوايا ميل مختلفة على نفس الشبكة في مناطق شبكة مختلفة. تميل دقة CTF التي تناسب إمالة الزاوية الأعلى إلى أن تكون أكثر فقرا ، كما كان الحال عند مقارنة مجموعات البيانات الثلاث في هذه الدراسة. يوضح الشكل 4 الصور التمثيلية المقارنة ومتوسطات تصنيف 2D. على الرغم من أن تركيز البروتين لم يتغير عبر زوايا الميل المختلفة ، إلا أن زاوية الميل الأعلى تجعل المنطقة المصورة تبدو أكثر ازدحاما من حيث تركيز الجسيمات. هذا يمكن أن يكون مشكلة لمعالجة البيانات لأن تداخل الجسيمات يمكن أن يعقد إعادة بناء 3D والتحسينات الزاوية. أنتج تصنيف 2D التكراري بشكل روتيني مجموعة نظيفة من الجسيمات مع مجموعات البيانات المائلة 0 درجة و 30 درجة ، في حين أن مجموعة البيانات 60 درجة تتطلب تنظيفا دقيقا لمكدسات الجسيمات لضمان أن متوسطات الفئة تظهر الحد الأدنى من التداخل للجسيمات المجاورة. يمثل متوسط الفصل من الشكل 4C في المربع الأحمر مثالا على تداخل الجسيمات. على الرغم من أن إعادة التمركز أثناء التصنيف يمكن أن تؤدي إلى متوسط الإشارة من الجسيمات المجاورة ، إلا أن التداخل الكبير للجسيمات يمكن أن يضر بدقة معلمات محاذاة الجسيمات ، مما يؤدي إلى إعادة بناء تتميز بدقة أقل. أفضل حل لتجنب تداخل الجسيمات هو الفحص المسبق للشبكات ذات سمك الجليد الأمثل وتوزيع الجسيمات. يتم وصف نظرة عامة كمية شاملة للمقاييس لتقييم التحسينات من جمع البيانات المائلة في مكان آخر32.
الشكل 1: نظرة عامة على المزايا والتحديات مع جمع البيانات المائلة. تعرض اللوحة العلوية منظرا عن قرب لثقب الشبكة. قضبان الشبكة باللون الذهبي ، والأزرق الجليدي الزجاجي ، والجسيمات الجزيئية الكبيرة باللون الأحمر. تشير الأسهم إلى اتجاه حزمة الإلكترونات. تمثل اللوحة السفلية مجموعة من الثقوب بنفس نظام التلوين كما في اللوحة العلوية. تمثل النجمة السوداء هدف التركيز البؤري الدقيق قبل الحصول على صورة التعريض الضوئي عند التكبير العالي. يشار إلى زاوية الميل ب "α". يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: رسم تخطيطي لسير العمل يقارن استراتيجية جمع البيانات غير المائلة والمائلة. تظهر المقارنة التدريجية لجمع البيانات غير المائلة والمائلة الخطوة الإضافية المتمثلة في تقدير الارتفاع المركزي يدويا وإعادة التمركز لكل مربع مائل (2 و 3 لجمع البيانات المائلة). بقية سير العمل متشابه بين الاستراتيجيتين. ويشمل ذلك اختيار مربع مناسب للتصوير (1 لجمع البيانات المائلة وغير المائلة) ، وبدء مخطط قائمة الانتظار عن طريق اختيار مربع للتصوير (يشار إليه باسم المحاكاة ؛ 2 و 4 لجمع البيانات غير المائلة والمائلة ، على التوالي) ، وتوفير هدف تركيز الارتفاع المركزي وأهداف اكتساب تكبير ثقب قائمة الانتظار (3 و 5 لجمع البيانات غير المائلة والمائلة ، على التوالي). وأخيرا تقديم قائمة انتظار أهداف التعرض عالية التكبير المختارة (4 و 6 لجمع البيانات غير المائلة والمائلة ، على التوالي). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صور تمثيلية للشبكة عند التكبير المربع بزوايا إمالة مختلفة. يتم عرض الصور التي تم جمعها بالقرب من ارتفاع Z المركزي والبعيد عنه على اللوحتين العلوية والسفلية ، على التوالي. يشار إلى المحور البصري للحزمة بمركز الحلقات الحمراء متحدة المركز. يشير السهم الأخضر إلى مربع الاهتمام. هناك ميزة شبكة مكسورة مجاورة لمربع الاهتمام كمرجع. تتم إزالة فتحة العدسة الموضوعية لسهولة المشاهدة. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: التعرض للثقب التمثيلي ومتوسطات فئة 2D التي تم جمعها بزوايا إمالة مختلفة. تشير اللوحات (A) و (B) و (C) إلى التصوير الذي يتم إجراؤه مع مرحلة العينة غير المائلة عند 0 درجة أو مائلة إلى 30 درجة و 60 درجة. يتم عرض متوسطات فئة 2D المتأثرة بالاكتظاظ في المربع الأحمر في (C). شريط المقياس = 100 نانومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعد اتجاه الجسيمات المفضل الناجم عن التصاق العينة بواجهة الهواء والماء أحد آخر الاختناقات الرئيسية لتحديد الهيكل الروتيني عالي الدقة باستخدام cryo-EM SPA4،5،6. يوفر مخطط جمع البيانات المعروض هنا استراتيجية سهلة التنفيذ لتحسين توزيع اتجاه الجسيمات داخل مجموعة البيانات. نلاحظ أن البروتوكول لا يتطلب أي معدات أو برامج إضافية ولا يؤثر على سرعة جمع البيانات. الاعتبارات التالية مهمة أثناء الحصول على البيانات للعينات المائلة.
أولا ، يجب أن يكون المربع المصور على ارتفاع مركزي للاستهداف الأمثل. يتم ضبط الارتفاع المركزي عن طريق تسجيل صور مزدوجة الإمالة بزوايا إمالة المرحلة الصغيرة (عادة 0.5 درجة -2 درجة) وتحديد التركيز البؤري بناء على علاقة محددة مسبقا بين إزاحة الصورة وإلغاء التركيز البؤري. إذا كان المربع المستهدف يتطلب تعديلا كبيرا في ارتفاع eucentric ، فسيؤدي ذلك إلى تحول كبير في صورة الصورة المربعة ، بحيث عندما يتم إمالة المرحلة مرة أخرى ، قد يتم حظر مجال الرؤية بواسطة فتحة الكائن.
ثانيا ، يصبح الثقب الدائري عادة مستطيلا بشكل متزايد مع إمالة أعلى عند التكبير المتوسط (تكبير عقدة اكتساب الثقب ). في حالة عدم وجود معايرة دقيقة لإزاحة الصورة ، من الممكن أن يتم تصوير جزء من الرقاقة جنبا إلى جنب مع الجسيمات المضمنة في الجليد الزجاجي لتكبير تعريض معين. لذلك ، من الناحية المثالية ، يجب أن تكون معايرة إزاحة الصورة دقيقة. البديل هو زيادة التكبير بحيث تنخفض المساحة المصورة بالنسبة لحجم الثقب. عند التكبير العالي ، سيكون للأخطاء في إزاحة الصورة الناتجة عن إمالة الحزمة تأثير أقل على قدرة المستخدم على التنقل إلى منطقة من الجليد الزجاجي. ومع ذلك ، فإن هذا يأتي على حساب تقليل عدد الجسيمات في الصور المجهرية الناتجة ، بما يتناسب مع زيادة التكبير.
ثالثا ، يتمتع التركيز البؤري التلقائي بفرصة أكبر للفشل في جمع البيانات المائلة بسبب زيادة الحركة التي يسببها الشعاع وزيادة سمك العينة. وبالتالي ، فإن تحقيق التركيز الدقيق يمكن أن يمثل ، في بعض الأحيان ، بعض التحديات لجمع البيانات المائلة ، خاصة إذا كان هدف التركيز هو رقائق الذهب في وسط أربعة ثقوب ، وهي ممارسة قياسية لجمع البيانات غير المائلة. في حالات فشل تقدير التركيز البؤري المتكرر ، يكون البديل هو تعيين حافة الثقب كهدف للتركيز. يجب أن يوفر هذا إشارة كافية لارتباط الطور الدقيق بين أزواج الصور التي يسببها إمالة الحزمة وضبط التركيز اللاحق. في تجربتنا ، نادرا ما يؤدي التركيز على حافة الثقب إلى فشل التركيز البؤري التلقائي.
وأخيرا، عندما يتم تحديد صور عالية التكبير بعيدا عن مركز الشبكة، قد يكون الفرق في التركيز البؤري بين الصور المستهدفة على الجوانب المتقابلة لمحور الإمالة كبيرا. يعتمد حجم هذا الاختلاف على زاوية الميل والمسافة من نقطة التركيز. على سبيل المثال ، بزاوية إمالة تبلغ 30 درجة ، سيكون لهدفين يفصل بينهما 6 ميكرومتر على سطح الشبكة ويتم اختيارهما بشكل عمودي تماما على محور الميل فرق 3 ميكرومتر في إلغاء التركيز بينهما (العلاقة هي: دلتا إلغاء التركيز = الخطيئة (زاوية الميل) * (المسافة من محور الميل)). سيكون للأهداف المحددة على طول محور الميل نفس إلغاء التركيز البؤري ، بينما يقع الآخرون في مكان ما بينهما. إذا تم تحديد محور الإمالة في Leginon أثناء المعايرة ، فإن البرنامج يعوض تلقائيا عن التغيير في إلغاء التركيز البؤري. ومع ذلك ، يجب أن يدرك المستخدمون أن إمكانية وجود تدرجات تركيز أكبر أثناء التصوير عالي التكبير موجودة. يجب أن تؤثر تدرجات التركيز الكبيرة بشكل ضئيل على إعادة البناء النهائية33 ، ولكن قد يكون من الضروري استخدام أحجام مربعات أكبر أثناء معالجة البيانات لمنع تأثيرات التعرج. في ظل هذه الظروف ، قد يكون هناك ما يبرر استخدام نطاق إلغاء تركيز أضيق أثناء الحصول على البيانات ، ويأتي التوزيع العشوائي لإلغاء التركيز بشكل طبيعي من إمالة المرحلة. يمكن أن تؤدي تعديلات إلغاء التركيز لكل جسيم أثناء معالجة البيانات إلى تحسين دقة عمليات إعادة البناء النهائية. ومع ذلك ، نظرا لأن النمذجة الدقيقة لنوبات CTF قد تكون صعبة بالنسبة لزوايا إمالة المرحلة العالية ، يجب توخي الحذر لمراقبة جودة البيانات ، ويناسب CTF أثناء تنظيم التعرض. بشكل عام ، يؤدي سمك الجليد دون المستوى الأمثل إلى دقة أقل في نمذجة نوبات تقدير CTF. لذلك ، يجب توخي الحذر للتصوير في المناطق التي يكون فيها الجليد رقيقا ، على افتراض أن توزيع الجسيمات جيد بما فيه الكفاية في هذه المناطق.
يؤدي توزيع الاتجاه المحسن والأكثر اتساقا إلى تحسين مماثل في دقة الاتجاه لخرائط cryo-EM المعاد بناؤها. وبالإضافة إلى ذلك، يؤدي التوزيع الأكثر اتساقا للتوجيه إلى تحسين عامل تعويض أخذ العينات، الذي يرتبط مباشرة بالقرارالعالمي 30،31. وبالتالي ، فإن تحسين توزيع الاتجاه بشكل جماعي يجب أن يحسن دقة النمذجة الذرية والصقل9،30،31. ومن شأن ذلك، من حيث المبدأ، أن يوفر حجة قوية للتنفيذ الروتيني لجمع البيانات المائلة. ومع ذلك ، هناك العديد من المحاذير التي يجب أن يكون المستخدم على دراية بها. أولا، يمكن أن تؤثر زيادة تدرج التركيز وسمك الجليد على الدقة العالمية الإجمالية، ويفترض أن ذلك يرجع إلى مزيج من زيادة ضوضاء الخلفية وزيادة الحركة التي يسببها الشعاع، جنبا إلى جنب مع القضايا غير المباشرة الأخرى التي تنشأ نتيجة17. من المتوقع أن يكون هذا التأثير أكثر وضوحا في الحالات التي يكون فيها الجليد أكثر سمكا بطبيعته. ومع ذلك ، نظرا لأن معظم العينات تعاني من قدر من الاتجاه المفضل ، مما قد يؤدي بدوره إلى عدم انتظام أخذ العينات ، فقد يكون جمع البيانات المائل مفيدا بشكل عام طالما تم تقليل الآثار الضارة أو تخفيفها. ثانيا ، قد يكون من الضروري إمالة المرحلة حتى 60 درجة لبعض العينات التي تتميز بتوجه تفضيلي شديد. تشير الأدلة القصصية غير المنشورة من عملنا وتقارير زملائنا إلى أنه حتى الميل ~ 40 درجة غير كاف للتغلب على تباين الخواص لبعض العينات. الجهود المبذولة لتحديد زاوية الميل المثلى لمجموعة من التوزيعات جارية ، بناء على الأفكار الواردة في Baldwin et al.31. أخيرا ، يجب على المرء أن يلاحظ ، من حيث المبدأ ، أن إعادة البناء من عينة تتميز بتوجه مفضل واحد مرضي تماما ستظل تحتوي على مخروط مفقود بمقدار 30 درجة حتى عندما يتم جمع البيانات بزاوية إمالة 60 درجة. في تجارب المحاكاة ، من غير المرجح أن يؤثر مخروط مفقود بزاوية 30 درجة على التفسيرات التجريبية بشكل كبير. ربما يكون الميل بمقدار 60 درجة كافيا حتى للعينات الأكثر تفضيلا من الناحية المرضية. ومع ذلك ، في الحالات التي قد يتعين فيها إمالة المرحلة بمقدار 60 درجة ، يجب تحسين تركيز الجسيمات في مجال الرؤية بعناية ، لأن تداخل الجسيمات سيعقد معالجة البيانات. لا يمكن الإمالة إلى أكثر من 60 درجة (أو 70 درجة في مراحل مجهرية مختارة) على TEMs القياسية ، بسبب قيود تصميم مرحلة العينة. في مثل هذه الحالات ، قد تكون هناك حاجة إلى تحسين إضافي مع المواد المضافة وعينة الكيمياء الحيوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نشكر بيل أندرسون وتشارلز بومان وجان كريستوف دوكوم (TSRI) للمساعدة في الفحص المجهري وتركيبات Leginon والبنية التحتية لنقل البيانات. كما نشكر غوردون لوي (معهد سالك) ويونغ زي تان (جامعة سنغافورة الوطنية) على القراءة النقدية للمخطوطة. نشكر كريس روسو (مختبر MRC للبيولوجيا الجزيئية ، كامبريدج) لتزويدنا بالبلازميد للتعبير عن DPS. تم دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة (U54AI150472 و U54 AI170855 و R01AI136680 إلى DL) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم (NSF MCB-2048095 إلى DL) ، ومؤسسات هيرست (إلى DL) ، وكرسي آرثر وجولي وودرو (إلى JP N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryosparc Live v3.1.0+210216 | Structura Biotechnology | ||
| DPS protein | Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098. | ||
| K2 Summit Direct Electron Detector | Gatan | ||
| Leginon software suite | C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60. | ||
| Manual plunging device | Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids | ||
| Talos Arctica | FEI/Thermo Fisher | ||
| UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids | Quantifoil | N1-A14nAu30-01 |
References
- Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, 00461 (2013).
- Li, X. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Chua, E. Y. D., et al. cheaper: recent advances in cryo-electron microscopy. Annual Review of Biochemistry. , (2022).
- Lyumkis, D. Challenges and opportunities in cryo-EM single-particle analysis. Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).
- Wu, M., Lander, G. C. Present and emerging methodologies in Cryo-EM single-particle analysis. Biophysical Journal. 119 (7), 1281-1289 (2020).
- Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. Elife. 7, 34257 (2018).
- Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting. Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Potter, C. S., et al. Leginon: a system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
- Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
- NYSBC.org Homepage. , Available from: https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Homepage (2022).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy. Science. 346, 1377-1380 (2014).
- Russo, C. J., Henderson, R.
- Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (180), e62765 (2022).
- Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
- Naydenova, K., Peet Mathew, J., Russo Christopher J, J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (24), 11718-11724 (2019).
- Naydenova, K., et al. CryoEM at 100 keV: a demonstration and prospects. IUCrJ. 6 (6), 1086-1098 (2019).
- Herzik, M. A. cryoEM: Methods and Protocols. Gonen, T., Nannenga, B. L. , Springer US. 125-144 (2021).
- Cash, J. N., Kearns, S., Li, Y., Cianfrocco, M. A. High-resolution cryo-EM using beam-image shift at 200 keV. IUCrJ. 7 (6), 1179-1187 (2020).
- Peck, J. V., Fay, J. F., Strauss, J. D. High-speed high-resolution data collection on a 200 keV cryo-TEM. IUCrJ. 9 (2), 243-252 (2022).
- Bouvette, J., et al. Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography. Nature Communications. 12 (1), 1957 (1957).
- Cheng, A., et al. High resolution single particle cryo-electron microscopy using beam-image shift. Journal of Structural Biology. 204 (2), 270-275 (2018).
- Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
- Structura Biotechnology Inc. , Available from: https://cryosparc.com/live (2022).
- DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).
- Baldwin, P. R., Lyumkis, D. Non-uniformity of projection distributions attenuates resolution in Cryo-EM. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 150, 160-183 (2020).
- Baldwin, P. R., Lyumkis, D. Tools for visualizing and analyzing Fourier space sampling in Cryo-EM. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 160, 53-65 (2021).
- Aiyer, S., Zhang, C., Baldwin, P. R., Lyumkis, D. cryoEM: Methods and Protocols. Gonen, T., Nannenga, B. L. , Springer US. 161-187 (2021).
- Glaeser, R. M., et al.
