Summary
Mevcut protokol, kriyo-EM deneylerinde eğimli tek parçacıklı veri toplama için genelleştirilmiş ve uygulanması kolay bir şemayı açıklamaktadır. Böyle bir prosedür, hava-su arayüzüne bağlılık nedeniyle tercihli oryantasyon yanlılığından muzdarip numuneler için yüksek kaliteli bir EM haritası elde etmek için özellikle yararlıdır.
Abstract
Kriyo-elektron mikroskobu (cryo-EM) ile tek parçacık analizi (SPA) artık yüksek çözünürlüklü yapısal biyoloji için ana akım bir tekniktir. SPA ile yapı belirleme, ince bir buz tabakası içinde vitrifiye edilmiş bir makromoleküler nesnenin birden fazla farklı görünümünü elde etmeye dayanır. İdeal olarak, eşit olarak dağılmış rastgele projeksiyon yönelimlerinin bir koleksiyonu, nesnenin tüm olası görünümlerine karşılık gelir ve izotropik yönlü çözünürlük ile karakterize edilen rekonstrüksiyonlara yol açar. Bununla birlikte, gerçekte, birçok örnek, hava-su arayüzüne yapışan tercihli olarak yönlendirilmiş parçacıklardan muzdariptir. Bu, veri kümesinde düzgün olmayan açısal yönelim dağılımlarına ve rekonstrüksiyonda homojen olmayan Fourier uzayı örneklemesine yol açarak, anizotropik çözünürlük ile karakterize edilen haritalara çevrilir. Numune aşamasının eğilmesi, oryantasyon dağılımlarının homojenliğini ve dolayısıyla Fourier uzay örneklemesinin izotropisini geliştirerek çözünürlük anizotropisinin üstesinden gelmek için genelleştirilebilir bir çözüm sağlar. Mevcut protokol, otomatik görüntü toplama için bir yazılım olan Leginon'u kullanarak eğimli aşamalı bir otomatik veri toplama stratejisini açıklamaktadır. Prosedürün uygulanması basittir, herhangi bir ek ekipman veya yazılım gerektirmez ve biyolojik makromolekülleri görüntülemek için kullanılan çoğu standart iletim elektron mikroskobu (TEM) ile uyumludur.
Introduction
Son on yılda doğrudan elektron dedektörlerinin ortaya çıkışı 1,2,3, tek parçacıklı kriyo-EM 4,5,6 kullanılarak çözülen makromoleküllerin ve makromoleküler montajların yüksek çözünürlüklü yapılarının sayısında üstel bir artışa neden olmuştur. Hemen hemen tüm saflaştırılmış makromoleküler türlerin, ~ 10 kDa boyutunda veya7'nin altındaki en küçük proteinler hariç, kriyo-EM kullanılarak yapı tayinine uygun olması beklenir. Izgara hazırlama ve yapı belirleme için gereken başlangıç malzemesi miktarı, nükleer manyetik rezonans spektroskopisi ve X-ışını kristalografisi 4,5,6 gibi diğer yapı belirleme tekniklerinden en az bir büyüklük sırası daha azdır.
Bununla birlikte, kriyo-EM ile yapı tayini için temel bir zorluk, görüntüleme için uygun ızgara hazırlığını içerir. Farklı vitrifikasyon stratejileri ve ızgaraları kullanarak çeşitli numuneleri değerlendiren kapsamlı bir çalışma, kriyo-EM ızgaralarındaki numuneleri vitrifiye etmek için çoğu yaklaşımın, makromoleküllerin hava-su arayüzüne tercihli olarak yapışmasına yol açtığını göstermiştir8. Bu tür bir bağlılık potansiyel olarak dört optimal olmayan sonuca neden olabilir: (1) makromoleküler numune tamamen denatüre olur, bu durumda başarılı bir veri toplama ve işleme mümkün değildir; (2) numune kısmen denatüre olur, bu durumda makromolekülün zarar görmemiş bölgelerinden yapısal bilgiler elde etmek mümkün olabilir; (3) numune doğal yapıyı korur, ancak görüntülerde elektron ışınının yönüne göre sadece bir parçacık oryantasyonu seti temsil edilir; (4) numune doğal yapısını korur ve elektron ışınının yönüne göre olası parçacık oryantasyonlarının bazıları ancak hepsi değil, bazıları görüntülerde temsil edilir. (3) ve (4) numaralı durumlar için, eğik veri toplama, yeniden yapılandırılmış kriyo-EM haritasını etkileyen yönlü çözünürlüklü anizotropinin en aza indirilmesine yardımcı olacak ve çok çeşitli örnekler için genelleştirilebilir bir çözüm sağlayacaktır9. Teknik olarak, eğme aynı zamanda duruma da fayda sağlayabilir (2), çünkü denatürasyon muhtemelen hava-su arayüzünde meydana gelir ve benzer şekilde verilerde temsil edilen farklı yönelimlerin sayısını sınırlar. Veri kümesindeki oryantasyon yanlılığının kapsamı, çözüm katkı maddeleri ile deneyler yapılarak potansiyel olarak değiştirilebilir, ancak geniş uygulanabilirlik eksikliği bu deneme yanılma yaklaşımlarını engellemektedir. Numune aşamasının optimize edilmiş tek bir eğme açısında eğilmesi, görüntüleme deneyi9'un geometrisini değiştirerek oryantasyonların dağılımını iyileştirmek için yeterlidir (Şekil 1). Tercihli yönelimli numunenin elektron ışınına göre geometrik konfigürasyonu nedeniyle, tercihli yönelimlerin her kümesi için, ızgaranın eğilmesi, küme sentroidine göre bir aydınlatma açıları konisi oluşturur. Bu nedenle, bu görüşleri yayar ve sonuç olarak Fourier uzay örneklemesini ve yönlü çözünürlüğün izotropisini geliştirir.
Pratikte, sahneyi eğmenin bazı zararları vardır. Numune aşamasının eğilmesi, görüş alanı boyunca kontrast aktarım işlevi (CTF) tahminlerinin doğruluğunu etkileyebilecek bir odak gradyanı oluşturur. Eğik veri toplama, eğik örnekleri görüntülerken artan şarj efektlerinin neden olduğu ışın kaynaklı parçacık hareketinin artmasına da neden olabilir. Izgara eğimi ayrıca görünür buz kalınlığında bir artışa yol açar, bu da daha gürültülü mikrograflara yol açar ve sonuçta rekonstrüksiyonların çözünürlüğünü etkileyebilir 5,9,10. Protokol ve tartışma bölümlerinde kısaca açıklanan gelişmiş hesaplamalı veri işleme şemalarını uygulayarak bu sorunların üstesinden gelmek mümkün olabilir. Son olarak, eğme, parçacık üst üste binmesinin artmasına neden olabilir ve sonraki görüntü işleme boru hattını engelleyebilir. Bu, şebeke üzerindeki parçacık konsantrasyonunu optimize ederek bir dereceye kadar azaltılabilse de, yine de önemli bir husustur. Burada, Leginon yazılım paketi (otomatik bir görüntü alma yazılımı), mevcut açık erişim ve çok çeşitli mikroskoplarla uyumlu11,12,13,14 kullanılarak eğimli veri toplama için uygulanması kolay bir protokol açıklanmaktadır. Yöntem, en az sürüm 3.0 veya üstünü gerektirir ve 3.3'ten sonraki sürümler, eğimli veri toplamayı etkinleştirmek için özel iyileştirmeler içerir. Bu protokol için ek bir yazılım veya ekipman gerekmez. Hesaplama altyapısı ve kurulum kılavuzları hakkında kapsamlı talimatlar başka bir yerde verilmiştir15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Numune hazırlama
- Altın folyo ve altın ızgara desteği16 içeren ızgaralar kullanın (bkz. Malzeme Tablosu) çünkü eğimli veri toplama ışın kaynaklı hareketivurgulayabilir 17.
NOT: Bu çalışma için, ızgaralar üzerindeki örnekler, nemlendirilmiş (% 80'den fazla) soğuk bir odada (~ 4 ° C) manuel daldırma ve lekeleme tekniği18 kullanılarak vitrifiye edilmiştir. - Kesinlikle gerekli olmadıkça bakır destek ve karbon folyo içeren ızgaraları veya sürekli bir amorf karbon tabakası kullanmaktan kaçının, çünkü bu ızgaralar numune aşaması eğildiğinde daha büyük ışın kaynaklı harekete yol açabilir16 .
NOT: Grafen/grafen oksit gibi alternatif destek katmanlarının, amorf karbon 19,20'ye kıyasla ışın kaynaklı hareketi azalttığı görülmektedir. - Izgaraları önceden elin ve kabul edilebilir buz kalınlığı ve parçacık dağılımı ile karakterize edilen bölgeleri belirleyin. Çok sıkı paketlenmiş parçacıklar içeren ızgaralar, eğimli veri toplama sırasında parçacık çakışmasına neden olur ve bu da aşağı akış veri işleme adımlarını etkileyebilir.
NOT: Bu adımlar özneldir, çünkü buzun iyi alanlarını tanımlamak, parçacık kontrastının net olduğu bölgeler için bulanıklaştırılmış görüntüleri görsel olarak inceleyerek gerçekleştirilir. Bu, tüm numuneler için uygun olmayabilir, çünkü bazı örnekler ince buzlu alanlarda verimli bir şekilde dağılmaz ve veri toplama sırasında zorluklara yol açar (Tartışma bölümünde açıklanmıştır). - Protein numunenizi içeren ızgaraları vitrifiye edin. Burada, gösterim amacıyla, Açlık Sırasında DNA Koruma (DPS) proteinini (bakınız Malzeme Tablosu) altın folyo ve altın destek ızgaraları ile 0.1-0.5 mg / mL aralığında kullanıyoruz.
NOT: Protein daha önce tarif edildiği gibi saflaştırıldı, ancak TEV proteaz bölünmesi yapılmadı21. İlgilenilen bir numune için protein konsantrasyon aralığının ayrı ayrı optimize edilmesi gerekecektir, çünkü evrensel olarak uygulanabilir ve neredeyse kesinlikle farklı numuneler arasında değişecek ideal bir aralığı ölçmek zordur.
2. Eğimli veri toplamayı ayarlama
- Numunenin paralel aydınlatılmasını sağlamak ve koma anormalliklerini en aza indirmek için mikroskobu hizalayın22.
NOT: Mikroskop, sahne eğimi olmadan standart SPA veri toplama için iyi hizalanmalıdır. Eğimli veri toplama için özel bir hizalama gerekmez, ancak iyi bir hizalama, hedefleme ve görüntülemenin sorunsuz bir şekilde ilerlemesini sağlar. Eğik ve eğik olmayan veri toplamayı karşılaştıran genel bir şema Şekil 2'de verilmiştir. - Veri toplamaya uygun kareleri tanımlamak için sahne alanı eğimi olmayan bir ızgara atlası kaydedin veya Kare Alma Düğümü'nde kullanılan büyütmede kareleri manuel olarak inceleyin. Folyo sağlam olduğu, susuz görünmediği ve ideal buz kalınlığına sahip olduğu kareleri arayın.
NOT: Kare Edinme Düğümü , Leginon'da çok ölçekli görüntüleme için kullanılan düşük büyütmeli düğümdür.- Tipik eğilmemiş otomatik veri toplama için, genel ızgara kalitesine genel bir bakış ve veri toplama için uygun alanların ilk göstergesini sağlayan bir ızgara atlası kaydedin.
- Daha sonra, atlas aracılığıyla uygun kareleri seçin ve bunları kuyruğa gönderin. Ardından, manuel delik seçimi veya otomatik EM delik bulucu aracılığıyla, delik hedeflerini sıraya koyun ve gönderin.
- Son olarak, yüksek büyütmeli pozlama hedefleri göndermek için otomatik EM delik bulucuyu kullanın.
NOT: Eğimli veri toplama için, özellikle optimum eğim açısı önceden belirlenmemişse ve veri toplama sırasında ayarlanması muhtemelse, tutarlı sonuçlar için karelerin manuel olarak sıraya alınması gerekebilir. Izgara atlası, veri toplama için kullanılan eğim açısı daha önce belirlenmişse, önceden tanımlanmış bir sahne alanı eğimi kullanılarak da kaydedilebilir.
- Örnek aşamasını ilgi çekici bir kareye taşıyın.
- 15° sahne eğim±inde α yalpalayıcı kullanarak sahne konumu için ösentrik yüksekliği belirleyin. Mikroskop için tuş takımı panelini kullanarak sahneyi ötesentrik yüksekliğe getirmek için Z yüksekliğini ayarlayın. α yalpalama rutini sırasında görüntü kaymasının minimum düzeyde olduğundan emin olun.
NOT: Ösentrik yükseklik doğru bir şekilde tanımlanmamışsa, sahne alanı kare büyütmede eğildiğinde büyük bir görüntü kayması gözlenecektir. Bu, ızgarada yerel deformasyonlar varsa, örneğin ızgara kırılmışsa veya görüntülenen alanın yakınında ciddi şekilde bükülmüşse de olabilir. Veri toplama için bu tür bölgelerden kaçınmak en iyisi olsa da, bunlar veri toplama için umut verici birkaç bölgeden birini temsil ediyorsa, ösentrik yüksekliği doğru bir şekilde tahmin etmek zorunludur. Şekil 3'te , ösentrik yüksekliği doğru bir şekilde tanımlamadan hedeflemenin kare büyütmede büyük görüntü kaymalarına nasıl neden olabileceği gösterilmektedir. - Daha doğru bir Z yüksekliği bulun, Odaklayıcı düğümünü kullanın ve Simüle Et'e basın.
- Tipik olarak, Odaklayıcı düğümündeki Z yüksekliğini Kare Alma Düğümü'nde kullanılan büyütmede tahmin edin.
NOT: Focuser düğümü odak dizisi, veri toplama sırasında Delik Toplama düğümünde (Leginon yazılımında bir araç) büyütme işleminde ince bir Z odak tahmini de içerebilir. - Focuser düğümünün ayarlarını yapın ve karelerin ilk sıraya alınması sırasında ince Z netleme seçeneğini etkinleştirin/devre dışı bırakın.
NOT: Otomatik veri toplama başladığında ösentrik yüksekliğin doğru bir şekilde tanımlandığından emin olmak önemlidir, bu da ince Z odağının yeniden etkinleştirilmesini gerektirebilir (adım 2.10).
- Tipik olarak, Odaklayıcı düğümündeki Z yüksekliğini Kare Alma Düğümü'nde kullanılan büyütmede tahmin edin.
- Gerçek ötesentrik yükseklikte veri toplamak için numune aşamasını istenen eğim açısına eğin ve gerekirse sahneyi yeniden ortalayın. Bu çalışmada 0°, 30° ve 60° eğim açıları kullanılmıştır. Delik Alma düğümü pozlamaları için hedefleri sıraya almaya başlamak üzere Kare Alma düğümünde Simüle Et düğmesine basın.
NOT: Adım 2.2.1'de belirtildiği gibi, ızgara atlası önceden tanımlanmış bir sahne alanı eğimi kullanılarak kaydedilebilir, bu da bu adımda sahne alanını tekrar eğme ihtiyacını ortadan kaldırır. Bu iyi çalışır ve veri toplama için kullanılan eğim açısı önceden tanımlanmışsa süreci hızlandırır. Mevcut protokol, kullanıcının veri toplama için farklı eğim açılarını test etmek isteyebileceği yeni örnekler göz önünde bulundurularak yazılmıştır. - Bir Z odak hedefi ve yüksek büyütme oranına uygun deliklere sahip bölgeler seçin.
- Hedefleri görüntüleme kuyruğuna gönder'e basın. Tüm kareleri sıraya almayı bitirene kadar Sıraya Alınmış Hedefleri Gönder'e basmayın.
- Numune aşamasını eğilmemiş durumuna geri getirin. Bir sonraki kareye geçin ve yeterli sayıda delik pozlaması sıraya alınana kadar 2.3-2.8 arasındaki adımları tekrarlayın.
- Delik Hedefleme Düğümü'ne gidin ve tüm kareler sıraya alındıktan sonra Sıraya Alınmış Hedefleri Gönder'e basın.
NOT: İnce Z odağı zaman kazanmak için daha önce devre dışı bırakıldıysa (adım 2.5), kuyruğu göndermeden önce yeniden etkinleştirilmesi gerekir. - Otomatik EM delik bulucunun, numune aşaması eğildiğinde görüntü yakalama için uygun bölgeleri doğru bir şekilde tanımlayıp tanımlayamadığını test etmek için yüksek büyütmeli Pozlama Toplama düğümü tarafından seçilen hedefleri manuel olarak inceleyin.
- Bu prosedür sırasında, Maruz Kalma Alma düğümü ayarlarında 'Seçilen hedeflerin kullanıcı tarafından doğrulanmasına izin ver' seçeneğini belirleyin. Kullanıcı hedefleme doğruluğundan memnun kaldığında, otomatik veri toplama için bu seçeneğin işaretini kaldırın.
NOT: Yüksek büyütmeli Pozlama Toplama düğümündeki hedefler tipik olarak, hem eğimli hem de eğik olmayan veri toplama 23,24,25,26 için eşit derecede iyi çalışan bir ışın-eğme görüntü kaydırma stratejisi kullanılarak görüntülenir. Aşağı akış veri işleme adımlarında doğru CTF tahmini için, ışın eğimli görüntü kaydırma veri toplama stratejisi için lens-koma sapması kalibrasyonu gerçekleştirilmelidir.
- Bu prosedür sırasında, Maruz Kalma Alma düğümü ayarlarında 'Seçilen hedeflerin kullanıcı tarafından doğrulanmasına izin ver' seçeneğini belirleyin. Kullanıcı hedefleme doğruluğundan memnun kaldığında, otomatik veri toplama için bu seçeneğin işaretini kaldırın.
3. Veri İşleme
- Kaydedilen filmlerin hareket düzeltmesi, CTF tahmini, parçacık seçimi ve veri toplama sırasında ilk rekonstrüksiyonların oluşturulması ile anında veri işlemeyi başlatın10,27,28,29.
NOT: Bu çalışmada, ön işleme için cryoSPARC Live10 (bakınız Malzeme Tablosu) kullanılmıştır. Anında veri işleme, ilk kriyo-EM rekonstrüksiyonu ve açısal dağılım için bir yaklaşım sağlar, bu da kullanıcıyı çözünürlük anizotropisinin kapsamı hakkında bilgilendirebilir. Bunlar da, veri toplama için kullanılan eğim açısının yeterince yüksek olup olmadığı konusunda kullanıcıyı yönlendirmek için kullanılabilir. - Yeniden yapılandırılmış haritayı görselleştirin ve tercih edilen parçacık oryantasyonlarının kapsamını ölçmek için Euler açı dağılımını çizin.
NOT: Euler açı dağılımları, çözünürlük anizotropisinin potansiyel derecesini belirlemek için doğrudan Fourier uzay örnekleme dağılımlarına dönüştürülebilir. Euler açısı dağılımının kalitesini değerlendirmede ve optimum eğim açısı30,31'i belirlemede kullanıcıya yardımcı olmak için bir grafik kullanıcı arayüzü (GUI) geliştirilmiştir. Araç, Github deposundan https://github.com/LyumkisLab/SamplingGui edinilebilir. - Gerekirse, tercihli yönlendirmenin etkilerinin üstesinden gelmek için verilerin toplandığı sahne alanı eğim açısını ayarlayın. Harita ve 3.2'deki Euler dağılımı ile kanıtlandığı gibi, tercihli yönelim bir sorun olmaya devam ederse açı artırılabilir. Alternatif olarak, kullanıcı veri toplamayı gruplara ayırmak ve 20°, 30° ve 40° gibi birkaç farklı eğim açısı kullanarak kayıt yapmak isteyebilir.
NOT: Çoğu TEM'in sahneyi 70°'ye eğme yeteneğine sahip olması gerekse de, yaygın örnek sahne eğimleri (kullandığımız) 20°-40° arasında değişmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
0.3 mg/mL'de DPS, 0°, 30° ve 60° eğimlerde görüntülemeyi göstermek için kullanıldı. Farklı eğim açılarından elde edilen veriler, farklı ızgara bölgelerinde aynı ızgarada toplanmıştır. CTF çözünürlüğü, bu çalışmada üç veri kümesini karşılaştırırken olduğu gibi, daha yüksek açılı eğimlere uyar ve daha zayıf olma eğilimindedir. Şekil 4 , karşılaştırmalı temsili görüntüleri ve 2B sınıflandırma ortalamalarını göstermektedir. Protein konsantrasyonu farklı eğim açıları boyunca değişmemiş olsa da, daha yüksek bir eğim açısı, görüntülenen alanın parçacık konsantrasyonu açısından daha kalabalık görünmesini sağlar. Bu, veri işleme için sorunlu olabilir, çünkü parçacık çakışması 3B rekonstrüksiyonları ve açısal iyileştirmeleri zorlaştırabilir. Yinelemeli 2B sınıflandırma, rutin olarak 0 ° ve 30 ° eğimli veri kümeleriyle temiz bir parçacık yığını üretirken, 60 ° veri kümesi, sınıf ortalamalarının bitişik parçacıklar için minimum örtüşme göstermesini sağlamak için parçacık yığınlarının dikkatli bir şekilde temizlenmesini gerektiriyordu. Kırmızı kutudaki Şekil 4C'deki sınıf ortalaması, parçacık örtüşmesinin bir örneğini temsil eder. Sınıflandırma sırasında yeniden merkezleme, komşu parçacıklardan gelen sinyalin ortalamasının alınmasına neden olsa da, önemli parçacık örtüşmesi, parçacık hizalama parametrelerinin doğruluğunu tehlikeye atabilir ve daha düşük çözünürlükle karakterize edilen rekonstrüksiyonlar sağlayabilir. Partikül çakışmasını önlemek için en iyi çözüm, optimum buz kalınlığına ve parçacık dağılımına sahip ızgaraları önceden elemektir. Eğimli veri toplamadaki iyileştirmeleri değerlendirmek için ölçümlere kapsamlı bir nicel genel bakış başka bir yerde açıklanmıştır32.
Şekil 1: Eğimli veri toplama ile ilgili avantajlara ve zorluklara genel bakış. Üst panel, bir ızgara deliğinin yakından görünümünü gösterir. Izgara çubukları altın, vitröz buz mavisi ve makromoleküler parçacıklar kırmızıdır. Oklar elektron ışınının yönünü gösterir. Alt panel, üst paneldekiyle aynı renklendirme şemasına sahip bir delik koleksiyonunu temsil eder. Siyah yıldız, yüksek büyütmede pozlama görüntüsü elde etmeden önce ince odak hedefini temsil eder. Eğim açısı 'α' olarak gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Eğilmemiş ve eğik veri toplama stratejisini karşılaştıran iş akışı diyagramı. Eğilmemiş ve eğik veri toplamanın kademeli olarak karşılaştırılması, eğik her kare için ösentrik yüksekliği manuel olarak tahmin etmenin ve yeniden merkezlemenin ek adımını gösterir (eğimli veri toplama için 2 ve 3). İş akışının geri kalanı iki strateji arasında benzerdir. Bunlar arasında görüntüleme için uygun bir kare seçmek (eğimli ve eğik olmayan veri toplama için 1), görüntüleme için bir kare seçerek bir kuyruk şeması başlatmak (sırasıyla simüle etmek; eğilmemiş ve eğilmemiş veri toplama için 2 ve 4), ötesentrik bir yükseklik odak hedefi ve kuyruk deliği büyütme toplama hedefleri sağlamak (eğilmemiş ve eğik veri toplama için 3 ve 5), sırasıyla). ve son olarak, seçilen yüksek büyütmeli pozlama hedeflerinin kuyruğunu gönderme (eğilmemiş ve eğik veri toplama için sırasıyla 4 ve 6). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Farklı eğim açılarına sahip kare büyütmede ızgaranın temsili görüntüleri. Ösentrik Z yüksekliğine yakın ve uzak toplanan görüntüler sırasıyla üst ve alt panellerde gösterilir. Işının optik ekseni, kırmızı eşmerkezli halkaların merkezi ile gösterilir. Yeşil ok, ilgilenilen kareyi gösterir. Referans için ilgi karesine bitişik kırık bir ızgara özelliği vardır. Objektif diyafram açıklığı görüntüleme kolaylığı için kaldırılmıştır. Ölçek çubuğu = 20 μM. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Farklı eğim açılarında toplanan temsili delik pozlamaları ve 2B sınıf ortalamaları. Paneller (A), (B) ve (C), numune aşaması 0°'de eğilmemiş veya 30° ve 60°'ye eğilmiş olarak gerçekleştirilen görüntülemeyi ifade eder. Aşırı kalabalıktan etkilenen 2B sınıf ortalamaları (C)'deki kırmızı kutuda gösterilir. Ölçek çubuğu = 100 nm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Numunenin hava-su arayüzüne yapışmasından kaynaklanan tercih edilen parçacık oryantasyonu, cryo-EM SPA 4,5,6 kullanılarak rutin yüksek çözünürlüklü yapı belirleme işleminin son büyük darboğazlarından biridir. Burada sunulan veri toplama şeması, bir veri kümesi içindeki parçacıkların oryantasyon dağılımını iyileştirmek için uygulanması kolay bir strateji sağlar. Protokolün ek ekipman veya yazılım gerektirmediğini ve veri toplama hızını etkilemediğini unutmayın. Eğik numuneler için veri toplama sırasında aşağıdaki hususlar önemlidir.
İlk olarak, optimum hedefleme için görüntülenen kare ösentrik yükseklikte olmalıdır. Ösentrik yükseklik, eğim çifti görüntülerini küçük sahne eğim açılarında (genellikle 0,5°-2°) kaydederek ve görüntü kaydırma ile bulanıklaştırma arasında önceden tanımlanmış bir ilişkiye dayanarak odağı tanımlayarak ayarlanır. Hedeflenen kare ösentrik yükseklikte büyük bir ayarlama gerektiriyorsa, bu, kare görüntünün önemli bir görüntü kaymasına neden olur, böylece sahne alanı tekrar eğildiğinde, görüş alanı objektif diyafram açıklığı tarafından engellenebilir.
İkincisi, normalde dairesel olan delik, orta büyütmede (Delik Edinme Düğümü büyütme) daha yüksek eğimlerle giderek daha dikdörtgen hale gelir. Doğru görüntü kaydırma kalibrasyonlarının yokluğunda, folyonun bir kısmının, belirli bir pozlama büyütmesi için vitreus buzuna gömülü parçacıklarla birlikte görüntülenmesi mümkündür. Bu nedenle, ideal olarak, görüntü kaydırma kalibrasyonlarının doğru olması gerekir. Bir alternatif, büyütmeyi, görüntülenen alanın delik boyutuna göre azalması için arttırmaktır. Daha yüksek büyütmede, ışın eğimine bağlı görüntü kaydırmadaki hatalar, kullanıcının vitröz buzlu bir alana gitme yeteneği üzerinde daha küçük bir etkiye sahip olacaktır. Bununla birlikte, bu, ortaya çıkan mikrograflardaki parçacık sayısını, büyütmedeki artışla orantılı olarak azaltma pahasına gelir.
Üçüncüsü, otomatik odaklama, ışın kaynaklı hareketin artması ve numune kalınlığının artması nedeniyle eğimli veri toplama için başarısız olma şansına sahiptir. Bu nedenle, doğru odaklanmaya ulaşmak, zaman zaman, özellikle odak hedefi, eğilmemiş veri toplama için standart uygulama olan dört deliğin ortasındaki altın folyo ise, eğimli veri toplama için bazı zorluklar ortaya çıkarabilir. Sık sık odak tahmini başarısızlıkları durumunda, bir alternatif odak hedefi olarak bir deliğin kenarını ayarlamaktır. Bu, ışın eğimine bağlı görüntü çiftleri ve ardından odak ayarı arasında doğru faz korelasyonu için yeterli bir sinyal sağlamalıdır. Deneyimlerimize göre, bir deliğin kenarına odaklanmak nadiren otomatik odaklama arızasına neden olur.
Son olarak, yüksek büyütmeli görüntüler ızgara merkezinden uzakta seçildiğinde, eğim ekseninin zıt taraflarındaki hedeflenen görüntüler arasındaki odak farkı önemli olabilir. Bu farkın büyüklüğü, eğim açısına ve odak noktasından uzaklığa bağlıdır. Örneğin, 30°'lik bir eğim açısında, ızgaranın yüzeyinde birbirinden 6 μm uzakta olan ve eğim eksenine tam olarak dik olarak seçilen iki hedef, aralarında bulanıklaştırmada 3 μm'lik bir farka sahip olacaktır (ilişki: delta defokus = günah (eğim açısı) * (eğim ekseninden uzaklık)). Eğim ekseni boyunca seçilen hedefler aynı bulanıklaştırmaya sahip olurken, diğerleri aralarında bir yere düşecektir. Eğme ekseni kalibrasyon sırasında Leginon'da tanımlanırsa, yazılım bulanıklaştırmadaki değişikliği otomatik olarak telafi eder. Bununla birlikte, kullanıcılar, yüksek büyütmeli görüntüleme sırasında daha büyük odak gradyanlarına sahip olma olasılığının yine de mevcut olduğunun farkında olmalıdır. Büyük odak gradyanları son yeniden yapılandırma33'ü minimum düzeyde etkilemelidir, ancak örtüşme etkilerini önlemek için veri işleme sırasında daha büyük kutu boyutları kullanmak gerekebilir. Bu koşullar altında, veri toplama sırasında daha dar bir bulanıklaştırma aralığının kullanılması garanti edilebilir ve defokusun rastgele hale getirilmesi doğal olarak sahnenin eğilmesinden kaynaklanır. Veri işleme sırasında parçacık başına bulanıklaştırma ayarlamaları, nihai rekonstrüksiyonların çözünürlüklerini iyileştirebilir. Bununla birlikte, CTF uyumlarının doğru modellenmesi yüksek sahne eğim açıları için zor olabileceğinden, verilerin kalitesini izlemek için özen gösterilmelidir ve CTF pozlama kürasyonu sırasında uyum sağlar. Genel olarak, optimal olmayan buz kalınlığı, CTF tahmin uyumlarının modellenmesinde daha düşük doğrulukla sonuçlanır. Bu nedenle, buzun ince olduğu alanlarda, parçacık dağılımının bu alanlarda yeterince iyi olduğu varsayılarak, görüntüye özen gösterilmelidir.
Geliştirilmiş ve daha düzgün bir oryantasyon dağılımı, yeniden yapılandırılmış kriyo-EM haritalarının yön çözünürlüğünde karşılık gelen bir iyileşmeye yol açar. Ek olarak, daha homojen bir oryantasyon dağılımı, doğrudan30,31 küresel çözünürlüğü ile ilişkili olan örnekleme kompanzasyon faktörünü geliştirir. Bu nedenle, oryantasyon dağılımının toplu olarak iyileştirilmesi, atomik modellemenin doğruluğunu ve 9,30,31 arıtılmasını sağlamalıdır. Bu, prensip olarak, eğimli veri toplamanın rutin olarak uygulanması için güçlü bir durum sağlayacaktır. Ancak, kullanıcının bilmesi gereken birkaç uyarı vardır. İlk olarak, artan odak gradyanı ve buz kalınlığı, muhtemelen artan arka plan gürültüsü ve artan ışın kaynaklı hareketin bir kombinasyonu ve bunun sonucunda ortaya çıkan diğer dolaylı sorunlarla birlikte genel küresel çözünürlüğü etkileyebilir17. Bu etkinin, buzun doğası gereği daha kalın olduğu durumlarda daha belirgin olması beklenir. Bununla birlikte, çoğu örnek, bir miktar tercih edilen oryantasyondan muzdarip olduğundan, bu da örneklemenin tekdüzelik olmamasına yol açabileceğinden, zararlı etkiler en aza indirildiği veya hafifletildiği sürece eğimli veri toplama genellikle yararlı olabilir. İkincisi, şiddetli tercihli oryantasyon ile karakterize edilen bazı numuneler için sahneyi 60 ° 'ye kadar eğmek gerekebilir. Çalışmalarımızdan ve meslektaşlarımızın raporlarından elde edilen anekdotsal yayınlanmamış kanıtlar, ~ 40 ° eğimlerin bile bazı örnekler için çözünürlük anizotropisinin üstesinden gelmek için yetersiz olduğunu göstermektedir. Baldwin ve ark.31'de ortaya konan fikirlere dayanarak, bir dizi dağılım için en uygun eğim açısını belirleme çabaları devam etmektedir. Son olarak, prensip olarak, mükemmel patolojik tek tercih edilen bir oryantasyon ile karakterize edilen bir numuneden yapılan bir rekonstrüksiyonun, veriler 60 ° eğim açısında toplansa bile, 30 ° eksik bir koniye sahip olacağı belirtilmelidir. Simüle edilmiş deneylerde, 30 ° eksik bir koninin deneysel yorumları büyük ölçüde etkilemesi olası değildir. 60°'lik bir eğim, patolojik olarak en tercihli yönelimli örnekler için bile muhtemelen yeterlidir. Bununla birlikte, sahnenin 60 ° 'ye kadar eğilmesi gerekebilecek durumlarda, görüş alanındaki parçacıkların konsantrasyonunun dikkatlice optimize edilmesi gerekir, çünkü parçacık çakışması veri işlemeyi zorlaştıracaktır. Numune aşaması tasarımının sınırlamaları nedeniyle standart TEM'lerde 60°'den (veya belirli mikroskop aşamalarında 70°'den) fazla eğilmek mümkün değildir. Bu gibi durumlarda, katkı maddeleri ve numune biyokimyası ile ek optimizasyon gerekebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bill Anderson, Charles Bowman ve Jean-Christophe Ducom'a (TSRI) mikroskopi, Leginon kurulumları ve veri aktarım altyapısı ile ilgili yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca Gordon Louie (Salk Enstitüsü) ve Yong Zi Tan'a (Singapur Ulusal Üniversitesi) el yazmasının eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Chris Russo'ya (MRC Moleküler Biyoloji Laboratuvarı, Cambridge) DPS'nin ekspresyonu için bize plazmid sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (U54AI150472, U54 AI170855 ve R01AI136680'den DL'ye), Ulusal Bilim Vakfı'ndan (NSF MCB-2048095'ten DL'ye), Hearst Vakıfları'ndan (DL'ye) ve Arthur ve Julie Woodrow Kürsüsü'nden (J. P. N.'ye) gelen hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryosparc Live v3.1.0+210216 | Structura Biotechnology | ||
| DPS protein | Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098. | ||
| K2 Summit Direct Electron Detector | Gatan | ||
| Leginon software suite | C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60. | ||
| Manual plunging device | Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids | ||
| Talos Arctica | FEI/Thermo Fisher | ||
| UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids | Quantifoil | N1-A14nAu30-01 |
References
- Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, 00461 (2013).
- Li, X. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Chua, E. Y. D., et al. cheaper: recent advances in cryo-electron microscopy. Annual Review of Biochemistry. , (2022).
- Lyumkis, D. Challenges and opportunities in cryo-EM single-particle analysis. Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).
- Wu, M., Lander, G. C. Present and emerging methodologies in Cryo-EM single-particle analysis. Biophysical Journal. 119 (7), 1281-1289 (2020).
- Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. Elife. 7, 34257 (2018).
- Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting. Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Potter, C. S., et al. Leginon: a system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
- Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
- NYSBC.org Homepage. , Available from: https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Homepage (2022).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy. Science. 346, 1377-1380 (2014).
- Russo, C. J., Henderson, R.
- Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (180), e62765 (2022).
- Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
- Naydenova, K., Peet Mathew, J., Russo Christopher J, J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (24), 11718-11724 (2019).
- Naydenova, K., et al. CryoEM at 100 keV: a demonstration and prospects. IUCrJ. 6 (6), 1086-1098 (2019).
- Herzik, M. A. cryoEM: Methods and Protocols. Gonen, T., Nannenga, B. L. , Springer US. 125-144 (2021).
- Cash, J. N., Kearns, S., Li, Y., Cianfrocco, M. A. High-resolution cryo-EM using beam-image shift at 200 keV. IUCrJ. 7 (6), 1179-1187 (2020).
- Peck, J. V., Fay, J. F., Strauss, J. D. High-speed high-resolution data collection on a 200 keV cryo-TEM. IUCrJ. 9 (2), 243-252 (2022).
- Bouvette, J., et al. Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography. Nature Communications. 12 (1), 1957 (1957).
- Cheng, A., et al. High resolution single particle cryo-electron microscopy using beam-image shift. Journal of Structural Biology. 204 (2), 270-275 (2018).
- Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
- Structura Biotechnology Inc. , Available from: https://cryosparc.com/live (2022).
- DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).
- Baldwin, P. R., Lyumkis, D. Non-uniformity of projection distributions attenuates resolution in Cryo-EM. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 150, 160-183 (2020).
- Baldwin, P. R., Lyumkis, D. Tools for visualizing and analyzing Fourier space sampling in Cryo-EM. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 160, 53-65 (2021).
- Aiyer, S., Zhang, C., Baldwin, P. R., Lyumkis, D. cryoEM: Methods and Protocols. Gonen, T., Nannenga, B. L. , Springer US. 161-187 (2021).
- Glaeser, R. M., et al.
