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Biochemistry

Recopilación de datos crio-EM de una sola partícula con inclinación de la etapa utilizando Leginon

Published: July 1, 2022 doi: 10.3791/64136
Automatic Translation
1, 1, 2, 2,3, 1,4,5
1Laboratory of Genetics, The Salk Institute for Biological Studies, 2Jack H. Skirball Center for Chemical Biology and Proteomics, The Salk Institute for Biological Studies, 3Department of Chemistry and Biochemistry, University of California San Diego, 4Graduate School of Biological Sciences, Section of Molecular Biology, University of California San Diego, 5Department of Integrative Structural and Computational Biology, The Scripps Research Institute

Summary

El presente protocolo describe un esquema generalizado y fácil de implementar para la recopilación de datos inclinados de una sola partícula en experimentos crio-EM. Este procedimiento es especialmente útil para obtener un mapa EM de alta calidad para muestras que sufren un sesgo de orientación preferencial debido a la adherencia a la interfaz aire-agua.

Abstract

El análisis de partículas individuales (SPA) por microscopía crioelectrónica (crio-EM) es ahora una técnica convencional para la biología estructural de alta resolución. La determinación de la estructura por SPA se basa en la obtención de múltiples vistas distintas de un objeto macromolecular vitrificado dentro de una fina capa de hielo. Idealmente, una colección de orientaciones de proyección aleatorias uniformemente distribuidas equivaldría a todas las vistas posibles del objeto, dando lugar a reconstrucciones caracterizadas por una resolución direccional isotrópica. Sin embargo, en realidad, muchas muestras sufren de partículas orientadas preferentemente que se adhieren a la interfaz aire-agua. Esto conduce a distribuciones de orientación angular no uniformes en el conjunto de datos y a un muestreo del espacio de Fourier no homogéneo en la reconstrucción, lo que se traduce en mapas caracterizados por una resolución anisotrópica. La inclinación de la etapa de la muestra proporciona una solución generalizable para superar la anisotropía de resolución en virtud de mejorar la uniformidad de las distribuciones de orientación y, por lo tanto, la isotropía del muestreo del espacio de Fourier. El presente protocolo describe una estrategia de recopilación automatizada de datos de etapa inclinada utilizando Leginon, un software para la adquisición automatizada de imágenes. El procedimiento es simple de implementar, no requiere ningún equipo o software adicional, y es compatible con la mayoría de los microscopios electrónicos de transmisión estándar (TEM) utilizados para obtener imágenes de macromoléculas biológicas.

Introduction

El advenimiento de los detectores directos de electrones en la última década 1,2,3 ha estimulado un aumento exponencial en el número de estructuras de alta resolución de macromoléculas y ensamblajes macromoleculares resueltos utilizando crio-EM 4,5,6 de una sola partícula. Se espera que casi todas las especies macromoleculares purificadas sean susceptibles de determinación de la estructura mediante crio-EM, excepto las proteínas más pequeñas ~ 10 kDa de tamaño o por debajo de7. La cantidad de material de partida necesario para la preparación de la rejilla y la determinación de la estructura es al menos un orden de magnitud menor que otras técnicas de determinación de la estructura, como la espectroscopia de resonancia magnética nuclear y la cristalografía de rayos X 4,5,6.

Sin embargo, un desafío principal para la determinación de la estructura mediante crio-EM implica una preparación adecuada de la rejilla para la obtención de imágenes. Un extenso estudio que evaluó diversas muestras utilizando diferentes estrategias y rejillas de vitrificación sugirió que la mayoría de los enfoques para vitrificar muestras en rejillas crio-EM conducen a la adhesión preferencial de macromoléculas a la interfaz aire-agua8. Tal adherencia puede causar potencialmente cuatro resultados subóptimos: (1) la muestra macromolecular se desnaturaliza por completo, en cuyo caso no es posible una recopilación y procesamiento de datos exitosos; (2) la muestra se desnaturaliza parcialmente, en cuyo caso puede ser posible obtener información estructural de regiones de la macromolécula que no están dañadas; (3) la muestra conserva la estructura nativa, pero solo un conjunto de orientaciones de partículas en relación con la dirección del haz de electrones está representado en las imágenes; (4) La muestra conserva la estructura nativa, y algunas, pero no todas, las posibles orientaciones de partículas en relación con la dirección del haz de electrones están representadas en las imágenes. Para los casos (3) y (4), la recolección de datos inclinados ayudará a minimizar la anisotropía de resolución direccional que afecta al mapa crio-EM reconstruido y proporciona una solución generalizable para una amplia variedad de muestras9. Técnicamente, la inclinación también puede beneficiar el caso (2), ya que la desnaturalización presumiblemente ocurre en la interfaz aire-agua y limita de manera similar el número de orientaciones distintas representadas dentro de los datos. El grado de sesgo de orientación en el conjunto de datos puede alterarse potencialmente experimentando con aditivos de solución, pero la falta de aplicabilidad amplia dificulta estos enfoques de prueba y error. Inclinar la etapa de la muestra en un solo ángulo de inclinación optimizado es suficiente para mejorar la distribución de las orientaciones en virtud de la alteración de la geometría del experimento de imagen9 (Figura 1). Debido a la configuración geométrica de la muestra orientada preferentemente con respecto al haz de electrones, para cada grupo de orientaciones preferenciales, inclinar la rejilla genera un cono de ángulos de iluminación con respecto al centroide del cúmulo. Por lo tanto, esto extiende las vistas y, en consecuencia, mejora el muestreo del espacio de Fourier y la isotropía de la resolución direccional.

Hay, en la práctica, algunos inconvenientes para inclinar el escenario. La inclinación de la etapa de la muestra introduce un gradiente de enfoque en todo el campo de visión, lo que puede afectar a la precisión de las estimaciones de la función de transferencia de contraste (CTF). La recopilación de datos inclinados también puede conducir a un aumento del movimiento de partículas inducido por el haz causado por el aumento de los efectos de carga al obtener imágenes de muestras inclinadas. La inclinación de la rejilla también conduce a un aumento en el espesor aparente del hielo, lo que a su vez conduce a micrografías más ruidosas y, en última instancia, puede afectar la resolución de las reconstrucciones 5,9,10. Puede ser posible superar estos problemas aplicando esquemas avanzados de procesamiento computacional de datos que se describen brevemente en las secciones de protocolo y discusión. Por último, la inclinación puede conducir a una mayor superposición de partículas, lo que dificulta la posterior canalización de procesamiento de imágenes. Aunque esto puede mitigarse hasta cierto punto optimizando la concentración de partículas en la red, no obstante es una consideración importante. Aquí, se describe un protocolo fácil de implementar para la recopilación de datos inclinados utilizando el paquete de software Leginon (un software automatizado de adquisición de imágenes), disponible en acceso abierto y compatible con una amplia gama de microscopios11,12,13,14. El método requiere al menos la versión 3.0 o superior, con las versiones 3.3 en adelante que contienen mejoras dedicadas para permitir la recopilación de datos inclinados. No se necesita software o equipo adicional para este protocolo. En otra parte se proporcionan instrucciones extensas sobre infraestructura computacional y guías de instalación15.

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Protocol

1. Preparación de la muestra

  1. Utilice rejillas que contengan lámina de oro y soporte de rejilla dorada 16 (consulte la Tabla de materiales) porque la recopilación de datos inclinada puede acentuar el movimiento inducido por el haz17.
    NOTA: Para el presente estudio, las muestras en rejillas fueron vitrificadas utilizando la técnica manual de inmersión y secado18 en una cámara frigorífica humidificada (mayor del 80%) (~4 °C).
  2. Evite el uso de rejillas que contengan soporte de cobre y lámina de carbono o una capa continua de carbono amorfo a menos que sea absolutamente necesario, ya que estas rejillas pueden conducir a un mayor movimiento inducido por el haz16 cuando la etapa de la muestra está inclinada.
    NOTA: Las capas de soporte alternativas, como el grafeno/óxido de grafeno, parecen reducir el movimiento inducido por el haz en comparación con el carbono amorfo19,20.
  3. Preseleccionar cuadrículas e identificar regiones caracterizadas por un espesor de hielo aceptable y una distribución de partículas. Las cuadrículas que contienen partículas demasiado compactas darán lugar a la superposición de partículas durante la recopilación de datos inclinados, lo que puede afectar los pasos posteriores al procesamiento de datos.
    NOTA: Estos pasos son subjetivos ya que la identificación de buenas áreas de hielo se realiza mediante la inspección visual de imágenes desenfocadas para regiones donde el contraste de partículas es claro. Esto puede no ser factible para todas las muestras, ya que algunas muestras no se distribuirán de manera eficiente en áreas de hielo delgado, lo que genera desafíos durante la recopilación de datos (descrito en la sección Discusión).
  4. Vitrifique las rejillas que contienen su muestra de proteína. Aquí, para fines de demostración, utilizamos la proteína de protección del ADN durante la inanición (DPS) (consulte la Tabla de materiales) en un rango de 0.1-0.5 mg / ml con lámina de oro y rejillas de soporte de oro.
    NOTA: La proteína fue purificada como se describió anteriormente, excepto que no se realizó escisión de la proteasa TEV21. El rango de concentración de proteínas para una muestra de interés tendrá que optimizarse individualmente, ya que es difícil medir un rango ideal que sea universalmente aplicable y casi seguramente variará entre diferentes muestras.

2. Configuración de la recopilación de datos inclinada

  1. Alinee el microscopio para asegurar la iluminación paralela de la muestra y minimizar las aberraciones de coma22.
    NOTA: El microscopio debe estar bien alineado para la recopilación de datos SPA estándar sin inclinación de la etapa. No se necesitan alineaciones especiales para la recopilación de datos inclinados, pero una buena alineación garantizará que la orientación y la creación de imágenes se realicen sin problemas. En la Figura 2 se proporciona un esquema general que compara la recopilación de datos inclinados y no inclinados.
  2. Grabe un atlas de cuadrícula sin inclinación de escenario para identificar cuadrados adecuados para la recopilación de datos o inspeccione manualmente cuadrados con el aumento utilizado en Nodo de adquisición cuadrado. Busque cuadrados donde la lámina esté intacta, no se vea deshidratada y tenga un grosor de hielo ideal.
    NOTA: El nodo de adquisición cuadrado es el nodo de bajo aumento utilizado para imágenes multiescala en Leginon.
    1. Para la típica recopilación automatizada de datos sin inclinación, registre un atlas de cuadrícula, que proporciona una visión general de la calidad general de la cuadrícula y una indicación inicial de las áreas adecuadas para la recopilación de datos.
    2. Posteriormente, seleccione los cuadrados adecuados a través del atlas y envíelos a la cola. Luego, ya sea a través de la selección manual de agujeros o a través del buscador automático de agujeros EM, ponga en cola y envíe los objetivos de agujeros.
    3. Finalmente, utilice el buscador de orificios EM automatizado para enviar objetivos de exposición de gran aumento.
      NOTA: Para la recopilación de datos inclinados, es posible que los cuadrados deban ponerse en cola manualmente para obtener resultados coherentes, especialmente si el ángulo de inclinación óptimo no se ha predeterminado previamente y es probable que se ajuste durante la recopilación de datos. El atlas de la cuadrícula también podría registrarse utilizando una inclinación de etapa predefinida si se hubiera establecido previamente el ángulo de inclinación utilizado para la recopilación de datos.
  3. Mueva la etapa de muestra a un cuadrado de interés.
  4. Determine la altura eucéntrica para la posición del escenario utilizando α-wobbler en ± inclinación del escenario de 15°. Ajuste la altura Z para llevar el escenario a la altura eucéntrica utilizando el panel del teclado para el microscopio. Asegúrese de que el cambio de imagen sea mínimo durante la rutina de bamboleo α.
    NOTA: Si la altura eucéntrica no se identifica correctamente, se observará un gran desplazamiento de imagen al inclinar el escenario en el aumento cuadrado. Esto también puede suceder si hay deformaciones locales en la cuadrícula, por ejemplo, si la rejilla está rota o severamente doblada en las proximidades del área de la imagen. Aunque es mejor evitar tales regiones para la recopilación de datos, es imperativo estimar con precisión la altura eucéntrica si representan una de las pocas regiones prometedoras para la recopilación de datos. La figura 3 muestra cómo la focalización sin identificar adecuadamente la altura eucéntrica puede causar grandes cambios de imagen en el aumento cuadrado.
  5. Busque una altura Z más precisa, utilice el nodo Enfocador y pulse Simular.
    1. Normalmente, estime la altura Z en el nodo Focuser con el aumento utilizado en el nodo de adquisición cuadrado.
      NOTA: La secuencia de enfoque del nodo Focuser también puede incluir una estimación de enfoque Z fino en el nodo de adquisición de agujeros (una herramienta del software Leginon) durante la recopilación de datos.
    2. Ajuste la configuración del nodo Enfocador y habilite/deshabilite la opción de enfoque Z fino durante la cola inicial de cuadrados.
      NOTA: Es importante asegurarse de que la altura eucéntrica se identifique con precisión cuando comience la recopilación automatizada de datos, lo que puede requerir volver a habilitar el enfoque Z fino (paso 2.10).
  6. Incline la etapa de la muestra al ángulo de inclinación deseado para la recopilación de datos a la altura eucéntrica real y vuelva a centrar la etapa si es necesario. Para este estudio se utilizaron ángulos de inclinación de 0°, 30° y 60°. Pulse Simular en el nodo Adquisición cuadrada para comenzar a poner en cola los objetivos para las exposiciones del nodo Adquisición de agujeros .
    NOTA: Como se indica en el paso 2.2.1, el atlas de cuadrícula se puede grabar utilizando una inclinación de etapa predefinida, lo que evitaría la necesidad de inclinar la etapa nuevamente en este paso. Esto funciona bien y acelera el proceso si el ángulo de inclinación utilizado para la recopilación de datos está predefinido. El protocolo actual está escrito con nuevas muestras en mente, en las que el usuario puede desear probar diferentes ángulos de inclinación para la recopilación de datos.
  7. Seleccione un objetivo de enfoque Z y regiones con orificios adecuados para exposiciones de gran aumento.
  8. Presione Enviar destinos a la cola para obtener imágenes. No presione Enviar destinos en cola hasta que termine de poner en cola todos los cuadrados.
  9. Lleve la etapa de la muestra a su estado no inclinado. Desplácese al siguiente cuadrado y repita los pasos 2.3-2.8 hasta que se haya puesto en cola un número adecuado de exposiciones de orificios.
  10. Vaya al nodo Destino de agujero y pulse Enviar destinos en cola una vez que todos los cuadrados estén en cola.
    NOTA: Si el enfoque Z fino se desactivó anteriormente para ahorrar tiempo (paso 2.5), debe volver a habilitarse antes de enviar la cola.
  11. Inspeccione manualmente los objetivos seleccionados por el nodo de adquisición de exposición de gran aumento para comprobar si el buscador de orificios EM automatizado puede identificar con precisión las regiones adecuadas para la adquisición de imágenes cuando la etapa de la muestra está inclinada.
    1. Durante este procedimiento, seleccione "Permitir la verificación por parte del usuario de los objetivos seleccionados" en la configuración del nodo Adquisición de exposición . Una vez que el usuario esté satisfecho con la precisión de la segmentación, anule la selección de esta opción para la recopilación automatizada de datos.
      NOTA: Los objetivos en el nodo de adquisición de exposición de gran aumento suelen obtener imágenes utilizando una estrategia de desplazamiento de imagen de inclinación del haz, que funciona igualmente bien para la recopilación de datos inclinados y no inclinados23,24,25,26. Para una estimación precisa de CTF en los pasos de procesamiento de datos posteriores, se debe realizar la calibración de la aberración de la coma de la lente para la estrategia de recopilación de datos de desplazamiento de imagen de inclinación del haz.

3. Tratamiento de datos

  1. Iniciar el procesamiento de datos sobre la marcha 10,27,28,29 con corrección de movimiento de películas grabadas, estimación de CTF, selección de partículas y generación de reconstrucciones iniciales durante la recopilación de datos.
    NOTA: Para el presente estudio, cryoSPARC Live10 (ver Tabla de materiales) se ha utilizado para el preprocesamiento. El procesamiento de datos sobre la marcha proporciona una reconstrucción crio-EM inicial y una aproximación para la distribución angular, que puede informar al usuario sobre el alcance de la anisotropía de resolución. Estos, a su vez, se pueden utilizar para guiar al usuario en cuanto a si el ángulo de inclinación utilizado para la recopilación de datos es o no lo suficientemente alto.
  2. Visualice el mapa reconstruido y trace la distribución del ángulo de Euler para medir la extensión de las orientaciones de partículas preferidas.
    NOTA: Las distribuciones de ángulo de Euler se pueden convertir directamente en distribuciones de muestreo del espacio de Fourier para determinar el grado potencial de anisotropía de resolución. Se ha desarrollado una interfaz gráfica de usuario (GUI) para ayudar al usuario a evaluar la calidad de una distribución de ángulo de Euler y determinar un ángulo de inclinación óptimo30,31. La herramienta se puede obtener del repositorio de Github, https://github.com/LyumkisLab/SamplingGui.
  3. Si es necesario, ajuste el ángulo de inclinación del escenario en el que se recopilan los datos para superar los efectos de la orientación preferencial. El ángulo se puede aumentar si la orientación preferencial sigue siendo un problema, como lo demuestra el mapa y la distribución de Euler en 3.2. Alternativamente, el usuario puede desear dividir la recopilación de datos en grupos y grabar utilizando varios ángulos de inclinación diferentes, como 20°, 30° y 40°.
    NOTA: Aunque la mayoría de los TEM deben tener la capacidad de inclinar la plataforma a 70°, las inclinaciones comunes de la etapa de muestra (que hemos utilizado) varían de 20° a 40°.

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Representative Results

Se utilizó DPS a 0,3 mg/ml para demostrar imágenes a 0°, 30° y 60° de inclinación. Los datos de diferentes ángulos de inclinación se recopilaron en la misma cuadrícula en diferentes regiones de la cuadrícula. Los ajustes de resolución CTF para inclinaciones de ángulo más alto tienden a ser más pobres, como fue el caso al comparar los tres conjuntos de datos en este estudio. La Figura 4 muestra imágenes representativas comparativas y promedios de clasificación 2D. Aunque la concentración de proteína no cambia en los diferentes ángulos de inclinación, un ángulo de inclinación más alto hace que el área fotografiada parezca más concurrida en términos de concentración de partículas. Esto puede ser problemático para el procesamiento de datos porque la superposición de partículas puede complicar las reconstrucciones 3D y los refinamientos angulares. La clasificación 2D iterativa producía rutinariamente una pila limpia de partículas con los conjuntos de datos inclinados de 0° y 30°, mientras que el conjunto de datos de 60° requería una limpieza cuidadosa de las pilas de partículas para garantizar que los promedios de clase mostraran una superposición mínima para partículas adyacentes. El promedio de clase de la Figura 4C en el cuadro rojo representa un ejemplo de superposición de partículas. Aunque el recentrado durante la clasificación puede dar como resultado que la señal de las partículas vecinas se promedie, la superposición sustancial de partículas puede comprometer la precisión de los parámetros de alineación de partículas, produciendo reconstrucciones caracterizadas por una resolución más baja. La mejor solución para evitar la superposición de partículas es preseleccionar rejillas con un espesor de hielo y una distribución de partículas óptimos. En otra parte32 se describe una visión general cuantitativa completa de las métricas para evaluar las mejoras de la recopilación de datos inclinados.

Figure 1
Figura 1: Descripción general de las ventajas y desafíos con la recopilación de datos inclinados. El panel superior muestra una vista de primer plano de un agujero de cuadrícula. Las barras de rejilla son doradas, azul hielo vítreo y partículas macromoleculares rojas. Las flechas indican la dirección del haz de electrones. El panel inferior representa una colección de agujeros con el mismo esquema de color que en el panel superior. La estrella negra representa el objetivo de enfoque fino antes de la adquisición de imágenes de exposición con gran aumento. El ángulo de inclinación se indica como 'α'. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Diagrama de flujo de trabajo que compara la estrategia de recopilación de datos inclinada y sin inclinación. La comparación gradual de la recopilación de datos inclinada y sin inclinación muestra el paso adicional de estimar manualmente la altura eucéntrica y volver a centrar para cada cuadrado inclinado (2 y 3 para la recopilación de datos inclinados). El resto del flujo de trabajo es similar entre las dos estrategias. Estos incluyen la selección de un cuadrado adecuado para la obtención de imágenes (1 para la recopilación de datos inclinados y no inclinados), el inicio de un esquema de cola mediante la elección de un cuadrado para la obtención de imágenes (denominado simular; 2 y 4 para la recopilación de datos sin inclinación e inclinación, respectivamente), proporcionando un objetivo de enfoque de altura eucéntrico y objetivos de adquisición de aumento del orificio de cola (3 y 5 para la recopilación de datos no inclinados e inclinados, respectivamente). y, por último, enviar la cola de objetivos de exposición de gran aumento seleccionados (4 y 6 para la recopilación de datos sin inclinación e inclinada, respectivamente). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Imágenes representativas de la cuadrícula con aumento cuadrado con diferentes ángulos de inclinación. Las imágenes recogidas cerca y lejos de la altura Z eucéntrica se muestran en los paneles superior e inferior, respectivamente. El eje óptico del haz está indicado por el centro de los anillos concéntricos rojos. La flecha verde indica el cuadrado de interés. Hay una característica de cuadrícula rota adyacente al cuadrado de interés como referencia. La apertura del objetivo se elimina para facilitar la visualización. Barra de escala = 20 μM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Exposiciones representativas de agujeros y promedios de clase 2D recopilados en diferentes ángulos de inclinación. Los paneles (A), (B) y (C) se refieren a imágenes realizadas con la etapa de la muestra sin inclinar a 0° o inclinada a 30° y 60°. Los promedios de clase 2D afectados por el hacinamiento se muestran en el cuadro rojo en (C). Barra de escala = 100 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La orientación preferida de las partículas causada por la adherencia de la muestra a la interfaz aire-agua es uno de los últimos cuellos de botella importantes para la determinación rutinaria de estructuras de alta resolución utilizando cryo-EM SPA 4,5,6. El esquema de recopilación de datos presentado aquí proporciona una estrategia fácil de implementar para mejorar la distribución de orientación de partículas dentro de un conjunto de datos. Observamos que el protocolo no requiere equipo o software adicional y no afecta la velocidad de recopilación de datos. Las siguientes consideraciones son importantes durante la adquisición de datos para especímenes inclinados.

En primer lugar, el cuadrado fotografiado debe estar a una altura eucéntrica para una orientación óptima. La altura eucéntrica se ajusta grabando imágenes de par de inclinación en ángulos de inclinación de escenario pequeños (generalmente 0.5 ° -2 °) e identificando el enfoque basado en una relación predefinida entre el desplazamiento de imagen y el desenfoque. Si el cuadrado objetivo requiere un gran ajuste en la altura eucéntrica, esto dará como resultado un cambio significativo de la imagen cuadrada, de modo que cuando el escenario se incline nuevamente, el campo de visión puede ser bloqueado por la apertura del objetivo.

En segundo lugar, el orificio normalmente circular se vuelve cada vez más oblongo con inclinaciones más altas a un aumento medio (aumento del nodo de adquisición de agujeros ). En ausencia de calibraciones precisas de desplazamiento de imagen, es posible que parte de la lámina se pueda visualizar junto con partículas incrustadas en hielo vítreo para un aumento de exposición dado. Por lo tanto, idealmente, las calibraciones de desplazamiento de imagen tienen que ser precisas. Una alternativa es aumentar el aumento de tal manera que el área de imagen en relación con el tamaño del agujero disminuya. Con un aumento más alto, los errores en el cambio de imagen inducido por la inclinación del haz tendrían un efecto menor en la capacidad del usuario para navegar a un área de hielo vítreo. Sin embargo, esto se produce a expensas de disminuir el número de partículas en las micrografías resultantes, proporcional a un aumento en la ampliación.

En tercer lugar, el enfoque automático tiene una mayor probabilidad de fallar en la recopilación de datos inclinados debido al aumento del movimiento inducido por el haz y al aumento del grosor de la muestra. Por lo tanto, lograr un enfoque preciso puede, ocasionalmente, presentar algunos desafíos para la recopilación de datos inclinados, especialmente si el objetivo de enfoque es la lámina de oro en el centro de cuatro agujeros, que es una práctica estándar para la recopilación de datos no inclinados. En casos de fallos frecuentes en la estimación del enfoque, una alternativa es establecer el borde de un agujero como objetivo de enfoque. Esto debe proporcionar una señal suficiente para una correlación de fase precisa entre los pares de imágenes inducidos por la inclinación del haz y el posterior ajuste del enfoque. En nuestra experiencia, centrarse en el borde de un agujero rara vez resulta en una falla del enfoque automático.

Y, por último, cuando las imágenes de gran aumento se seleccionan lejos del centro de la cuadrícula, la diferencia de enfoque entre las imágenes específicas en lados opuestos del eje de inclinación puede ser significativa. La magnitud de esta diferencia depende del ángulo de inclinación y de la distancia desde el punto de enfoque. Por ejemplo, en un ángulo de inclinación de 30°, dos objetivos que están separados por 6 μm en la superficie de la cuadrícula y seleccionados exactamente perpendiculares al eje de inclinación tendrán una diferencia de 3 μm en el desenfoque entre ellos (la relación es: desenfoque delta = sin (ángulo de inclinación) * (distancia desde el eje de inclinación)). Los objetivos seleccionados a lo largo del eje de inclinación tendrán el mismo desenfoque, mientras que otros caerán en algún punto intermedio. Si el eje de inclinación se define en Leginon durante la calibración, el software compensa automáticamente el cambio de desenfoque. Sin embargo, los usuarios deben ser conscientes de que existe la posibilidad de tener gradientes de enfoque más grandes durante las imágenes de gran aumento. Los gradientes de enfoque grandes deberían afectar mínimamente a la reconstrucción final33, pero puede ser necesario utilizar tamaños de caja más grandes durante el procesamiento de datos para evitar efectos de aliasing. En estas circunstancias, puede justificarse el uso de un rango de desenfoque más estrecho durante la adquisición de datos, y la aleatorización del desenfoque proviene naturalmente de inclinar el escenario. Los ajustes de desenfoque por partícula durante el procesamiento de datos pueden mejorar las resoluciones de las reconstrucciones finales. Sin embargo, dado que el modelado preciso de los ajustes CTF puede ser un desafío para ángulos de inclinación de escenario altos, se debe tener cuidado para monitorear la calidad de los datos, y el CTF se ajusta durante la curación de la exposición. En general, el espesor de hielo subóptimo da como resultado una precisión más pobre en el modelado de los ajustes de estimación de CTF. Por lo tanto, se debe tener cuidado con la imagen en áreas donde el hielo es delgado, suponiendo que la distribución de partículas sea lo suficientemente buena en estas áreas.

Una distribución de orientación mejorada y más uniforme conduce a una mejora correspondiente en la resolución direccional de los mapas crio-EM reconstruidos. Además, una distribución de orientación más uniforme mejora el factor de compensación del muestreo, que se relaciona directamente con la resolución global30,31. Por lo tanto, la mejora colectiva de la distribución de orientación debería mejorar la precisión del modelado atómico y el refinamiento 9,30,31. Esto, en principio, proporcionaría un caso sólido para la implementación rutinaria de la recopilación de datos sesgados. Sin embargo, hay varias advertencias que el usuario debe tener en cuenta. En primer lugar, el aumento del gradiente de enfoque y el espesor del hielo pueden afectar la resolución global general, presumiblemente debido a una combinación de aumento del ruido de fondo y aumento del movimiento inducido por el haz, combinado con otros problemas indirectos que surgen como resultado17. Se espera que este efecto sea más pronunciado en los casos en que el hielo es inherentemente más grueso. Sin embargo, dado que la mayoría de las muestras sufren de cierta cantidad de orientación preferida, lo que a su vez puede conducir a la falta de uniformidad del muestreo, la recopilación de datos inclinados puede ser generalmente beneficiosa siempre que los efectos perjudiciales se minimicen o mitiguen. En segundo lugar, puede ser necesario inclinar el escenario hasta 60° para algunas muestras caracterizadas por una orientación preferencial severa. La evidencia anecdótica no publicada de nuestro trabajo y los informes de nuestros colegas sugiere que incluso las inclinaciones de ~ 40 ° son insuficientes para superar la anisotropía de resolución para algunos especímenes. Los esfuerzos para identificar un ángulo de inclinación óptimo para un conjunto de distribuciones están en marcha, basados en las ideas expuestas en Baldwin et al.31. Por último, cabe señalar que, en principio, una reconstrucción a partir de una muestra caracterizada por una orientación preferida única perfectamente patológica seguiría teniendo un cono faltante de 30° incluso cuando los datos se recogen en un ángulo de inclinación de 60°. En experimentos simulados, es poco probable que un cono faltante de 30° afecte en gran medida las interpretaciones experimentales. Una inclinación de 60° es probablemente suficiente incluso para los especímenes más orientados patológicamente preferentemente. Sin embargo, en los casos en que la etapa puede tener que inclinarse hasta 60 °, la concentración de partículas en el campo de visión debe optimizarse cuidadosamente, ya que la superposición de partículas complicará el procesamiento de datos. No es posible inclinar a más de 60° (o 70° en etapas de microscopio seleccionadas) en TEMs estándar, debido a limitaciones del diseño de la etapa de muestra. En tales casos, puede ser necesaria una optimización adicional con aditivos y bioquímica de muestras.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Bill Anderson, Charles Bowman y Jean-Christophe Ducom (TSRI) por su ayuda con la microscopía, las instalaciones de Leginon y la infraestructura de transferencia de datos. También agradecemos a Gordon Louie (Instituto Salk) y Yong Zi Tan (Universidad Nacional de Singapur) por la lectura crítica del manuscrito. Agradecemos a Chris Russo (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge) por proporcionarnos el plásmido para la expresión de DPS. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (U54AI150472, U54 AI170855 y R01AI136680 a DL), la Fundación Nacional de Ciencias (NSF MCB-2048095 a DL), las Fundaciones Hearst (a DL) y Arthur y Julie Woodrow Chair (a J. P. N.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryosparc Live v3.1.0+210216 Structura Biotechnology
DPS protein Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098.
K2 Summit Direct Electron Detector Gatan
Leginon software suite C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.
Manual plunging device Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids
Talos Arctica FEI/Thermo Fisher
UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids Quantifoil N1-A14nAu30-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Este mes en JoVE Número 185
Recopilación de datos crio-EM de una sola partícula con inclinación de la etapa utilizando Leginon
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Aiyer, S., Strutzenberg, T. S.,… More

Aiyer, S., Strutzenberg, T. S., Bowman, M. E., Noel, J. P., Lyumkis, D. Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon. J. Vis. Exp. (185), e64136, doi:10.3791/64136 (2022).

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