Summary
В настоящем протоколе описана обобщенная и простая в реализации схема наклонного сбора данных об одночастичных частицах в крио-ЭМ-экспериментах. Такая процедура особенно полезна для получения высококачественной ЭМ-карты для образцов, страдающих преимущественным смещением ориентации из-за прилипания к границе раздела воздух-вода.
Abstract
Анализ отдельных частиц (SPA) с помощью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) в настоящее время является основным методом структурной биологии высокого разрешения. Определение структуры с помощью SPA основано на получении нескольких различных изображений макромолекулярного объекта, остеклованного в тонком слое льда. В идеале совокупность равномерно распределенных ориентаций случайной проекции должна составлять все возможные виды объекта, что приводит к реконструкциям, характеризующимся изотропным направленным разрешением. Однако в действительности многие образцы страдают от предпочтительно ориентированных частиц, прилипших к границе раздела воздух-вода. Это приводит к неравномерным распределениям угловой ориентации в наборе данных и неоднородной выборке в пространстве Фурье при реконструкции, что приводит к отображениям, характеризующимся анизотропным разрешением. Наклон ступени образца обеспечивает обобщаемое решение для преодоления анизотропии разрешения за счет улучшения однородности ориентационных распределений и, следовательно, изотропии дискретизации пространства Фурье. Настоящий протокол описывает стратегию автоматизированного сбора данных с наклонной стадией с использованием Leginon, программного обеспечения для автоматического получения изображений. Процедура проста в реализации, не требует какого-либо дополнительного оборудования или программного обеспечения и совместима с большинством стандартных просвечивающих электронных микроскопов (ПЭМ), используемых для визуализации биологических макромолекул.
Introduction
Появление детекторов прямых электронов за последнее десятилетие 1,2,3 стимулировало экспоненциальный рост числа структур высокого разрешения макромолекул и макромолекулярных сборок, решаемых с помощью одночастичных крио-ЭМ 4,5,6. Ожидается, что почти все очищенные макромолекулярные частицы будут поддаваться определению структуры с помощью крио-ЭМ, за исключением мельчайших белков размером ~ 10 кДа или менее7. Количество исходного материала, необходимого для подготовки сетки и определения структуры, по крайней мере, на порядок меньше, чем у других методов определения структуры, таких как спектроскопия ядерного магнитного резонанса и рентгеновская кристаллография 4,5,6.
Тем не менее, основная проблема для определения структуры с помощью крио-ЭМ связана с подходящей подготовкой сетки для визуализации. Обширное исследование, оценивающее различные образцы с использованием различных стратегий и сеток витрификации, показало, что большинство подходов к витрификации образцов на крио-электромагнитных сетках приводят к преимущественному присоединению макромолекул к границе разделавоздух-вода 8. Такая приверженность потенциально может привести к четырем неоптимальным результатам: (1) макромолекулярный образец полностью денатурирует, и в этом случае успешный сбор и обработка данных невозможны; (2) образец частично денатурируется, и в этом случае можно получить структурную информацию из областей макромолекулы, которые не повреждены; (3) образец сохраняет нативную структуру, но на изображениях представлен только один набор ориентаций частиц относительно направления электронного пучка; (4) образец сохраняет нативную структуру, и некоторые, но не все возможные ориентации частиц относительно направления электронного пучка представлены на изображениях. Для случаев (3) и (4) наклонный сбор данных поможет свести к минимуму анизотропию направленного разрешения, влияющую на реконструированную крио-ЭМ-карту, и обеспечит обобщаемое решение для широкого спектра образцов9. С технической точки зрения, наклон также может принести пользу в случае (2), поскольку денатурация, по-видимому, происходит на границе раздела воздух-вода и аналогичным образом ограничивает количество различных ориентаций, представленных в данных. Степень смещения ориентации в наборе данных потенциально может быть изменена путем экспериментов с добавками раствора, но отсутствие широкой применимости препятствует этим подходам методом проб и ошибок. Наклон столика образца на один оптимизированный угол наклона достаточен для улучшения распределения ориентаций за счет изменения геометрии эксперимента9 (рис. 1). Из-за геометрической конфигурации предпочтительно ориентированного образца по отношению к электронному пучку для каждого кластера преимущественных ориентаций наклон сетки создает конус углов освещения по отношению к центроиду кластера. Следовательно, это расширяет представления и, следовательно, улучшает дискретизацию пространства Фурье и изотропию направленного разрешения.
На практике есть некоторые недостатки в наклоне сцены. Наклон предметного столика образца приводит к градиенту фокусировки по всему полю зрения, что может повлиять на точность оценки функции переноса контраста (CTF). Сбор данных под наклоном также может привести к увеличению движения частиц, вызванного пучком, вызванным усилением эффектов зарядки при визуализации наклонных образцов. Наклон сетки также приводит к увеличению кажущейся толщины льда, что, в свою очередь, приводит к более шумным микрофотографиям и может в конечном итоге повлиять на разрешение реконструкций 5,9,10. Эти проблемы можно преодолеть, применяя передовые схемы обработки вычислительных данных, которые кратко описаны в разделах, посвященных протоколу и обсуждению. Наконец, наклон может привести к увеличению перекрытия частиц, что затруднит последующую обработку изображений. Хотя это можно в некоторой степени смягчить, оптимизировав концентрацию частиц на сетке, это, тем не менее, важное соображение. Здесь описан простой в реализации протокол для наклонного сбора данных с использованием программного пакета Leginon (программное обеспечение для автоматического получения изображений), доступного в открытом доступе и совместимого с широким спектром микроскопов11,12,13,14. Для этого метода требуется как минимум версия 3.0 или выше, а версии 3.3 и более поздние версии содержат специальные улучшения для включения наклонного сбора данных. Для этого протокола не требуется никакого дополнительного программного обеспечения или оборудования. Подробные инструкции по вычислительной инфраструктуре и руководства по установке приведены в других разделах15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Пробоподготовка
- Используйте сетки, содержащие золотую фольгу и золотую опору16 сетки (см. Таблицу материалов), поскольку сбор данных под наклоном может усилить движение, вызванное лучом17.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования образцы на решетках были остеклованы с использованием метода ручного погружения и промокания18 в увлажненной (более 80%) холодильной камере (~ 4 ° C). - Избегайте использования решеток, содержащих медную опору и углеродную фольгу, или сплошного слоя аморфного углерода, если в этом нет крайней необходимости, так как эти решетки могут привести к большему движению, вызванномулучом16 , когда ступень образца наклонена.
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативные опорные слои, такие как графен/оксид графена, по-видимому, уменьшают движение, вызванное пучком, по сравнению с аморфным углеродом19,20. - Предварительно просеивайте сетки и выявляйте области, характеризующиеся приемлемой толщиной льда и распределением частиц. Сетки, содержащие слишком плотно упакованные частицы, приведут к перекрытию частиц во время наклонного сбора данных, что может повлиять на последующие этапы обработки данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги субъективны, поскольку идентификация хороших участков льда выполняется путем визуального осмотра расфокусированных изображений для областей, где контраст частиц ясен. Это может быть неосуществимо для всех образцов, поскольку некоторые образцы не будут эффективно распределяться в областях тонкого льда, что приведет к проблемам при сборе данных (описано в разделе «Обсуждение»). - Витризуйте решетки, содержащие образец белка. Здесь, в демонстрационных целях, мы используем белок ДНК-защиты во время голодания (DPS) (см. Таблицу материалов) в диапазоне от 0,1 до 0,5 мг / мл с золотой фольгой и золотыми опорными сетками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Белок очищали, как описано ранее, за исключением того, что расщепление протеазы TEV не проводилось21. Диапазон концентрации белка для интересующего образца должен быть оптимизирован индивидуально, поскольку трудно определить идеальный диапазон, который является универсально применимым и почти наверняка будет варьироваться между различными образцами.
2. Настройка наклонного сбора данных
- Выровняйте микроскоп, чтобы обеспечить параллельное освещение образца и свести к минимуму аберрации комы22.
ПРИМЕЧАНИЕ: Микроскоп должен быть хорошо выровнен для стандартного сбора данных SPA без наклона сцены. Для сбора данных под наклоном не требуется никаких специальных выравниваний, но хорошее выравнивание обеспечит плавное нацеливание и визуализацию. Общая схема, сравнивающая сбор данных под наклоном и без наклона, представлена на рисунке 2. - Запишите атлас сетки без наклона сцены, чтобы определить квадраты, подходящие для сбора данных, или вручную проверьте квадраты с увеличением, используемым в Square Acquisition Node. Ищите квадраты, где фольга не повреждена, не выглядит обезвоженной и имеет идеальную толщину льда.
ПРИМЕЧАНИЕ: Square Acquisition Node — это узел с малым увеличением, используемый для многомасштабной визуализации в Leginon.- Для типичного автоматизированного сбора данных без наклона запишите атлас сетки, который обеспечивает общее качество сетки и первоначальное указание подходящих областей для сбора данных.
- Впоследствии выберите подходящие квадраты через атлас и отправьте их в очередь. Затем, либо с помощью ручного выбора отверстий, либо с помощью автоматизированного ЭМ-искателя отверстий, ставьте в очередь и отправляйте цели для отверстий.
- Наконец, используйте автоматический искатель электромагнитных отверстий для отправки целей экспозиции с большим увеличением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для сбора данных под наклоном может потребоваться поставить квадраты в очередь вручную для получения согласованных результатов, особенно если оптимальный угол наклона не был заранее определен и, вероятно, будет скорректирован во время сбора данных. Атлас сетки можно было бы также регистрировать с использованием заранее определенного наклона сцены, если угол наклона, используемый для сбора данных, был установлен ранее.
- Переместите стадию образца в интересующий квадрат.
- Определите эуцентрическую высоту положения сцены с помощью α-воблера при наклоне сцены ± 15°. Отрегулируйте высоту Z, чтобы довести предметный столик до эуцентрической высоты, используя панель клавиатуры микроскопа. Убедитесь, что сдвиг изображения минимален во время процедуры колебания α.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если эуцентрическая высота не определена должным образом, при наклоне сцены при квадратном увеличении будет наблюдаться большой сдвиг изображения. Это также может произойти, если на сетке есть локальные деформации, например, если сетка сломана или сильно изогнута в непосредственной близости от изображаемой области. Хотя для сбора данных лучше избегать таких регионов, крайне важно точно оценить эуцентрическую высоту, если они представляют собой один из немногих перспективных регионов для сбора данных. На рисунке 3 показано, как нацеливание без правильной идентификации эуцентрической высоты может привести к большим сдвигам изображения в квадратном увеличении. - Найдите более точную высоту Z, используйте узел «Фокусер» и нажмите «Имитировать».
- Как правило, оценивают высоту Z в узле фокусера по увеличению, используемому в узле Square Acquisition Node.
ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность фокусировки узла Focuser также может включать в себя точную оценку фокуса Z на узле Hole Acquisition (инструмент в программном обеспечении Leginon) во время сбора данных. - Отрегулируйте настройки узла «Фокусер » и включите/отключите параметр точной фокусировки Z во время первоначальной очереди квадратов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно убедиться, что эуцентрическая высота точно определена при начале автоматического сбора данных, что может потребовать повторного включения точного фокуса Z (шаг 2.10).
- Как правило, оценивают высоту Z в узле фокусера по увеличению, используемому в узле Square Acquisition Node.
- Наклоните столик образца на желаемый угол наклона для сбора данных на истинной эуцентрической высоте и при необходимости повторно центрируйте столик. Для этого исследования использовались углы наклона 0°, 30° и 60°. Нажмите кнопку Simulate в узле Square Acquisition, чтобы начать постановку в очередь целевых объектов для экспозиции узла Hole Acquisition .
ПРИМЕЧАНИЕ: Как указано в шаге 2.2.1, атлас сетки может быть записан с использованием заранее определенного наклона ступени, что устранит необходимость повторного наклона ступени на этом этапе. Это хорошо работает и ускоряет процесс, если угол наклона, используемый для сбора данных, заранее определен. Текущий протокол написан с учетом новых образцов, в которых пользователь может пожелать протестировать различные углы наклона для сбора данных. - Выберите цель фокусировки по оси Z и области с отверстиями, подходящими для экспозиции с большим увеличением.
- Нажмите кнопку Отправить целевые объекты в очередь для создания образа. Не нажимайте кнопку «Отправить целевые объекты в очереди», пока не завершите постановку в очередь всех квадратов.
- Верните стадию образца в ненаклоненное состояние. Перейдите к следующему квадрату и повторяйте шаги 2.3-2.8 до тех пор, пока не будет поставлено в очередь достаточное количество экспозиций отверстий.
- Перейдите к узлу Hole Targeting и нажмите Submit Queued Targets после того, как все квадраты будут поставлены в очередь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если фокус Z был отключен ранее для экономии времени (шаг 2.5), его необходимо снова включить перед отправкой в очередь. - Вручную проверяйте цели, выбранные узлом сбора экспозиции с большим увеличением, чтобы проверить, может ли автоматический искатель электромагнитных отверстий точно идентифицировать подходящие области для получения изображения при наклоне предметного столика образца.
- Во время этой процедуры выберите «Разрешить пользователю проверку выбранных целей» в настройках узла «Сбор экспозиции ». Как только пользователь будет удовлетворен точностью таргетинга, отмените выбор этого параметра для автоматического сбора данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цели с большим увеличением узла сбора экспозиции обычно визуализируются с использованием стратегии сдвига изображения с наклоном луча, которая одинаково хорошо работает как для наклонного, так и для ненаклонного сбора данных 23,24,25,26. Для точной оценки CTF на последующих этапах обработки данных необходимо выполнить калибровку аберрации объектива-комы для стратегии сбора данных о сдвиге изображения с наклоном луча.
- Во время этой процедуры выберите «Разрешить пользователю проверку выбранных целей» в настройках узла «Сбор экспозиции ». Как только пользователь будет удовлетворен точностью таргетинга, отмените выбор этого параметра для автоматического сбора данных.
3. Обработка данных
- Инициируйте обработку данных «на лету» 10,27,28,29 с коррекцией движения записанных видеороликов, оценкой CTF, отбором частиц и генерацией начальных реконструкций во время сбора данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании для предварительной обработки использовался cryoSPARC Live10 (см. Таблицу материалов). Обработка данных «на лету» обеспечивает начальную крио-ЭМ-реконструкцию и аппроксимацию углового распределения, которая может информировать пользователя о степени анизотропии разрешения. Они, в свою очередь, могут использоваться для информирования пользователя о том, является ли угол наклона, используемый для сбора данных, достаточно высоким. - Визуализируйте реконструированную карту и постройте распределение углов Эйлера, чтобы оценить степень предпочтительной ориентации частиц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Распределения углов Эйлера могут быть преобразованы непосредственно в распределения выборки в пространстве Фурье для определения потенциальной степени анизотропии разрешения. Графический пользовательский интерфейс (GUI) был разработан, чтобы помочь пользователю оценить качество распределения углов Эйлера и определить оптимальный угол наклона30,31. Инструмент можно получить из репозитория Github, https://github.com/LyumkisLab/SamplingGui. - При необходимости отрегулируйте угол наклона сцены, под которым собираются данные, чтобы преодолеть последствия предпочтительной ориентации. Угол может быть увеличен, если предпочтительная ориентация остается проблемой, о чем свидетельствуют карта и распределение Эйлера в 3.2. В качестве альтернативы пользователь может пожелать разделить сбор данных на группы и записать с использованием нескольких различных углов наклона, таких как 20°, 30° и 40°.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что большинство ПЭМ должны иметь возможность наклона ступени до 70°, обычные наклоны ступени образца (которые мы использовали) варьируются от 20° до 40°.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DPS в дозе 0,3 мг/мл использовался для демонстрации визуализации при наклонах 0°, 30° и 60°. Данные с разных углов наклона были собраны на одной и той же сетке в разных областях сетки. Разрешение CTF подходит для более высоких угловых наклонов, как правило, хуже, как это было при сравнении трех наборов данных в этом исследовании. На рисунке 4 показаны сравнительные репрезентативные изображения и средние значения 2D-классификации. Хотя концентрация белка остается неизменной при различных углах наклона, более высокий угол наклона делает изображенную область более переполненной с точки зрения концентрации частиц. Это может быть проблематично для обработки данных, поскольку перекрытие частиц может усложнить 3D-реконструкции и угловые уточнения. Итеративная 2D-классификация обычно создавала чистый стек частиц с наборами данных под углом 0° и 30°, тогда как набор данных под углом 60° требовал тщательной очистки стеков частиц, чтобы гарантировать, что средние значения по классу показывают минимальное перекрытие для соседних частиц. Среднее значение класса на рисунке 4C в красном поле представляет собой пример перекрытия частиц. Хотя повторное центрирование во время классификации может привести к усреднению сигнала от соседних частиц, существенное перекрытие частиц может поставить под угрозу точность параметров выравнивания частиц, что приводит к реконструкциям, характеризующимся более низким разрешением. Лучшим решением, позволяющим избежать перекрытия частиц, является предварительное просеивание сеток с оптимальной толщиной льда и распределением частиц. Всеобъемлющий количественный обзор показателей для оценки улучшений от сбора данных с наклоном описан в другом месте32.
Рисунок 1: Обзор преимуществ и проблем при смене сбора данных. На верхней панели крупным планом показано отверстие сетки. Решетчатые слитки выполнены в золотом, стекловидном ледяном синем цвете и макромолекулярных частицах красного цвета. Стрелки указывают направление пучка электронов. Нижняя панель представляет собой коллекцию отверстий с той же цветовой гаммой, что и в верхней панели. Черная звезда представляет собой цель с тонкой фокусировкой перед получением изображения экспозиции с большим увеличением. Угол наклона обозначается как «α». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Диаграмма рабочего процесса, сравнивающая стратегию сбора данных без наклона и наклона. Пошаговое сравнение сбора данных без наклона и наклона показывает дополнительный шаг ручной оценки эуцентрической высоты и повторного центрирования для каждого наклонного квадрата (2 и 3 для сбора данных под наклоном). Остальная часть рабочего процесса аналогична между двумя стратегиями. К ним относятся выбор подходящего квадрата для визуализации (1 для сбора данных под наклоном и без наклона), инициация схемы очереди путем выбора квадрата для визуализации (называемой имитацией; 2 и 4 для сбора данных без наклона и наклона соответственно), обеспечение цели захвата фокуса по высоте и цели получения увеличения отверстия в очереди (3 и 5 для сбора данных без наклона и наклона, соответственно). и, наконец, отправка очереди выбранных целей экспозиции с большим увеличением (4 и 6 для сбора данных без наклона и наклона соответственно). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные изображения сетки при квадратном увеличении с различными углами наклона. Изображения, собранные вблизи и вдали от эуцентрической Z-высоты, показаны на верхней и нижней панелях соответственно. Оптическая ось луча обозначена центром красных концентрических колец. Зеленая стрелка указывает на интересующий квадрат. Для справки к интересующему квадрату примыкает сломанная сетка. Диафрагма объектива удалена для удобства просмотра. Масштабная линейка = 20 мкМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные экспозиции отверстий и средние значения 2D-класса, собранные под разными углами наклона. Панели (A), (B) и (C) относятся к визуализации, выполняемой с образцом, наклоненным под углом 0° или наклоненным на 30° и 60°. Средние значения 2D-классов, затронутые переполненностью, показаны в красном поле в (C). Масштабная линейка = 100 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Предпочтительная ориентация частиц, обусловленная прилипанием образца к границе раздела воздух-вода, является одним из последних серьезных узких мест для рутинного определения структуры с высоким разрешением с использованием крио-ЭМ SPA 4,5,6. Представленная здесь схема сбора данных обеспечивает простую в реализации стратегию улучшения ориентационного распределения частиц в наборе данных. Отметим, что протокол не требует дополнительного оборудования или программного обеспечения и не влияет на скорость сбора данных. При сборе данных для наклонных образцов важны следующие соображения.
Во-первых, изображенный квадрат должен находиться на эуцентрической высоте для оптимального наведения. Эуцентрическая высота регулируется путем записи изображений с парой наклона при малых углах наклона сцены (обычно 0,5°-2°) и определения фокуса на основе заранее определенного соотношения между сдвигом и расфокусировкой изображения. Если целевой квадрат требует большой регулировки эуцентрической высоты, это приведет к значительному смещению квадратного изображения, так что при повторном наклоне ступени поле зрения может быть заблокировано апертурой объектива.
Во-вторых, обычно круглое отверстие становится все более продолговатым с более высокими наклонами при среднем увеличении (увеличение узла сбора отверстий ). В отсутствие точной калибровки сдвига изображения возможно, что часть фольги может быть изображена вместе с частицами, встроенными в стекловидный лед для заданного увеличения экспозиции. Поэтому в идеале калибровка сдвига изображения должна быть точной. Альтернативой является увеличение увеличения, чтобы площадь изображения относительно размера отверстия уменьшалась. При большем увеличении ошибки в сдвиге изображения, вызванном наклоном луча, окажут меньшее влияние на способность пользователя перемещаться в область стекловидного льда. Однако это происходит за счет уменьшения количества частиц на результирующих микрофотографиях, пропорционального увеличению увеличения.
В-третьих, автофокусировка имеет больше шансов выйти из строя при сборе данных под наклоном из-за увеличения движения, вызванного лучом, и увеличения толщины образца. Таким образом, достижение точной фокусировки может иногда создавать некоторые проблемы для сбора данных под наклоном, особенно если целью фокусировки является золотая фольга в центре четырех отверстий, что является стандартной практикой для сбора данных без наклона. В случае частых сбоев в оценке фокусировки альтернативой является установка края отверстия в качестве цели фокусировки. Это должно обеспечить достаточный сигнал для точной фазовой корреляции между парами изображений, вызванных наклоном луча, и последующей регулировки фокуса. По нашему опыту, фокусировка на краю отверстия редко приводит к сбою автофокуса.
И, наконец, когда изображения с большим увеличением выбираются далеко от центра сетки, разница в фокусе между целевыми изображениями на противоположных сторонах оси наклона может быть значительной. Величина этой разницы зависит от угла наклона и расстояния от точки фокусировки. Например, при угле наклона 30° две мишени, расположенные на расстоянии 6 мкм друг от друга на поверхности сетки и выбранные точно перпендикулярно оси наклона, будут иметь разницу в расфокусировке 3 мкм между ними (соотношение таково: дельта-расфокусировка = грех (угол наклона) * (расстояние от оси наклона)). Цели, выбранные вдоль оси наклона, будут иметь одинаковую расфокусировку, тогда как другие будут находиться где-то посередине. Если ось наклона определена в Leginon во время калибровки, программное обеспечение автоматически компенсирует изменение расфокусировки. Тем не менее, пользователи должны знать, что, тем не менее, существует возможность больших градиентов фокусировки во время изображения с большим увеличением. Большие градиенты фокусировки должны минимально влиять на окончательную реконструкцию33, но может потребоваться использование больших размеров прямоугольников во время обработки данных, чтобы предотвратить эффекты сглаживания. В этих обстоятельствах использование более узкого диапазона расфокусировки во время сбора данных может быть оправдано, а рандомизация расфокусировки происходит естественным образом из-за наклона сцены. Корректировки расфокусировки каждой частицы во время обработки данных могут улучшить разрешение окончательных реконструкций. Однако, поскольку точное моделирование посадок CTF может быть сложной задачей для больших углов наклона сцены, необходимо следить за качеством данных, а CTF подходит во время курирования экспозиции. Как правило, неоптимальная толщина льда приводит к снижению точности при моделировании соответствия оценки CTF. Поэтому необходимо соблюдать осторожность при получении изображений в областях, где лед тонкий, предполагая, что распределение частиц в этих областях достаточно хорошее.
Улучшенное и более равномерное распределение ориентации приводит к соответствующему улучшению разрешения направления реконструированных крио-ЭМ карт. Кроме того, более равномерное распределение ориентации улучшает коэффициент компенсации выборки, что напрямую связано с глобальным разрешением30,31. Таким образом, коллективное улучшение распределения ориентации должно повысить точность атомного моделирования и уточнения 9,30,31. Это, в принципе, послужило бы веским аргументом в пользу рутинного осуществления систематического сбора данных. Однако есть несколько предостережений, о которых пользователь должен знать. Во-первых, увеличенный градиент фокусировки и толщина льда могут влиять на общее глобальное разрешение, предположительно из-за сочетания повышенного фонового шума и увеличенного движения, вызванного лучом, в сочетании с другими косвенными проблемами, возникающими в результате17. Ожидается, что этот эффект будет более выраженным в тех случаях, когда лед по своей природе толще. Однако, поскольку большинство выборок страдают от некоторой степени предпочтительной ориентации, что, в свою очередь, может привести к неоднородности выборки, сбор данных с уклоном может быть в целом полезным при условии сведения к минимуму или смягчения пагубных последствий. Во-вторых, может потребоваться наклон ступени до 60° для некоторых образцов, характеризующихся строгой преференциальной ориентацией. Неофициальные неопубликованные данные из нашей работы и отчетов коллег свидетельствуют о том, что даже наклон ~ 40 ° недостаточен для преодоления анизотропии разрешения для некоторых образцов. В настоящее время предпринимаются усилия по определению оптимального угла наклона для набора распределений, основанные на идеях, изложенных в Baldwin et al.31. Наконец, следует отметить, что, в принципе, реконструкция из выборки, характеризующейся совершенно патологической единственной предпочтительной ориентацией, все равно будет иметь отсутствующий конус 30°, даже если данные собираются под углом наклона 60°. В смоделированных экспериментах отсутствующий конус под углом 30° вряд ли сильно повлияет на экспериментальную интерпретацию. Наклона в 60°, вероятно, достаточно даже для самых патологически предпочтительно ориентированных экземпляров. Однако в тех случаях, когда ступень может быть наклонена на целых 60°, концентрация частиц в поле зрения должна быть тщательно оптимизирована, так как перекрытие частиц усложнит обработку данных. Наклон более чем на 60° (или 70° на отдельных предметах микроскопа) на стандартных ПЭМ невозможен из-за ограничений конструкции столика образца. В таких случаях может потребоваться дополнительная оптимизация с добавками и биохимией образца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Мы благодарим Билла Андерсона, Чарльза Боумана и Жана-Кристофа Дюкома (TSRI) за помощь с микроскопией, установками Leginon и инфраструктурой передачи данных. Мы также благодарим Гордона Луи (Институт Солка) и Йонг Зи Тан (Национальный университет Сингапура) за критическое прочтение рукописи. Мы благодарим Криса Руссо (Chris Russo) из Лаборатории молекулярной биологии MRC, Кембридж) за предоставление нам плазмиды для экспрессии DPS. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения США (U54AI150472, U54 AI170855 и R01AI136680 в DL), Национального научного фонда (NSF MCB-2048095 в DL), Фондов Херста (в DL) и Артура и Джули Вудро Стул (в JPN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryosparc Live v3.1.0+210216 | Structura Biotechnology | ||
| DPS protein | Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098. | ||
| K2 Summit Direct Electron Detector | Gatan | ||
| Leginon software suite | C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60. | ||
| Manual plunging device | Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids | ||
| Talos Arctica | FEI/Thermo Fisher | ||
| UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids | Quantifoil | N1-A14nAu30-01 |
References
- Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, 00461 (2013).
- Li, X. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Chua, E. Y. D., et al. cheaper: recent advances in cryo-electron microscopy. Annual Review of Biochemistry. , (2022).
- Lyumkis, D. Challenges and opportunities in cryo-EM single-particle analysis. Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).
- Wu, M., Lander, G. C. Present and emerging methodologies in Cryo-EM single-particle analysis. Biophysical Journal. 119 (7), 1281-1289 (2020).
- Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. Elife. 7, 34257 (2018).
- Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting. Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Potter, C. S., et al. Leginon: a system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
- Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
- NYSBC.org Homepage. , Available from: https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Homepage (2022).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy. Science. 346, 1377-1380 (2014).
- Russo, C. J., Henderson, R.
- Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (180), e62765 (2022).
- Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
- Naydenova, K., Peet Mathew, J., Russo Christopher J, J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (24), 11718-11724 (2019).
- Naydenova, K., et al. CryoEM at 100 keV: a demonstration and prospects. IUCrJ. 6 (6), 1086-1098 (2019).
- Herzik, M. A. cryoEM: Methods and Protocols. Gonen, T., Nannenga, B. L. , Springer US. 125-144 (2021).
- Cash, J. N., Kearns, S., Li, Y., Cianfrocco, M. A. High-resolution cryo-EM using beam-image shift at 200 keV. IUCrJ. 7 (6), 1179-1187 (2020).
- Peck, J. V., Fay, J. F., Strauss, J. D. High-speed high-resolution data collection on a 200 keV cryo-TEM. IUCrJ. 9 (2), 243-252 (2022).
- Bouvette, J., et al. Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography. Nature Communications. 12 (1), 1957 (1957).
- Cheng, A., et al. High resolution single particle cryo-electron microscopy using beam-image shift. Journal of Structural Biology. 204 (2), 270-275 (2018).
- Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
- Structura Biotechnology Inc. , Available from: https://cryosparc.com/live (2022).
- DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).
- Baldwin, P. R., Lyumkis, D. Non-uniformity of projection distributions attenuates resolution in Cryo-EM. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 150, 160-183 (2020).
- Baldwin, P. R., Lyumkis, D. Tools for visualizing and analyzing Fourier space sampling in Cryo-EM. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 160, 53-65 (2021).
- Aiyer, S., Zhang, C., Baldwin, P. R., Lyumkis, D. cryoEM: Methods and Protocols. Gonen, T., Nannenga, B. L. , Springer US. 161-187 (2021).
- Glaeser, R. M., et al.
