Summary
Il presente protocollo descrive uno schema generalizzato e facile da implementare per la raccolta di dati a singola particella inclinata in esperimenti crio-EM. Tale procedura è particolarmente utile per ottenere una mappa EM di alta qualità per campioni che soffrono di distorsione di orientamento preferenziale a causa dell'aderenza all'interfaccia aria-acqua.
Abstract
L'analisi a singola particella (SPA) mediante crio-microscopia elettronica (cryo-EM) è ora una tecnica mainstream per la biologia strutturale ad alta risoluzione. La determinazione della struttura da parte della SPA si basa sull'ottenimento di più viste distinte di un oggetto macromolecolare vetrificato all'interno di un sottile strato di ghiaccio. Idealmente, una raccolta di orientamenti di proiezione casuali uniformemente distribuiti equivarrebbe a tutte le possibili viste dell'oggetto, dando origine a ricostruzioni caratterizzate da risoluzione direzionale isotropa. Tuttavia, in realtà, molti campioni soffrono di particelle orientate preferenzialmente che aderiscono all'interfaccia aria-acqua. Ciò porta a distribuzioni di orientamento angolare non uniformi nel set di dati e a campionamenti disomogenei nello spazio di Fourier nella ricostruzione, traducendosi in mappe caratterizzate da risoluzione anisotropa. L'inclinazione dello stadio del campione fornisce una soluzione generalizzabile per superare l'anisotropia di risoluzione in virtù del miglioramento dell'uniformità delle distribuzioni di orientamento, e quindi dell'isotropia del campionamento dello spazio di Fourier. Il presente protocollo descrive una strategia di raccolta dati automatizzata a stadio inclinato utilizzando Leginon, un software per l'acquisizione automatica delle immagini. La procedura è semplice da implementare, non richiede alcuna attrezzatura o software aggiuntivo ed è compatibile con la maggior parte dei microscopi elettronici a trasmissione standard (TEM) utilizzati per l'imaging di macromolecole biologiche.
Introduction
L'avvento dei rivelatori di elettroni diretti nell'ultimo decennio 1,2,3 ha stimolato un aumento esponenziale del numero di strutture ad alta risoluzione di macromolecole e assemblaggi macromolecolari risolti utilizzando crio-EM 4,5,6 a singola particella. Ci si aspetta che quasi tutte le specie macromolecolari purificate siano suscettibili di determinazione della struttura utilizzando la crio-EM, ad eccezione delle proteine più piccole di dimensioni ~ 10 kDa o inferiori a7. La quantità di materiale di partenza necessaria per la preparazione della griglia e la determinazione della struttura è almeno un ordine di grandezza inferiore rispetto ad altre tecniche di determinazione della struttura, come la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare e la cristallografia a raggi X 4,5,6.
Tuttavia, una delle principali sfide per la determinazione della struttura da parte della crio-EM riguarda un'adeguata preparazione della griglia per l'imaging. Uno studio approfondito che ha valutato diversi campioni utilizzando diverse strategie e griglie di vetrificazione ha suggerito che la maggior parte degli approcci per la vetrificazione dei campioni su griglie crio-EM porta ad un'aderenza preferenziale delle macromolecole all'interfaccia aria-acqua8. Tale aderenza può potenzialmente causare quattro risultati subottimali: (1) il campione macromolecolare si denatura completamente, nel qual caso non è possibile una raccolta e un'elaborazione dei dati di successo; (2) il campione si denatura parzialmente, nel qual caso può essere possibile ottenere informazioni strutturali da regioni della macromolecola che non sono danneggiate; (3) il campione mantiene la struttura nativa, ma solo una serie di orientamenti delle particelle rispetto alla direzione del fascio di elettroni sono rappresentati nelle immagini; (4) Il campione mantiene la struttura nativa, e alcuni ma non tutti i possibili orientamenti delle particelle rispetto alla direzione del fascio di elettroni sono rappresentati nelle immagini. Per i casi (3) e (4), la raccolta di dati inclinata aiuterà a ridurre al minimo l'anisotropia della risoluzione direzionale che influisce sulla mappa crio-EM ricostruita e fornisce una soluzione generalizzabile per un'ampia varietà di campioni9. Tecnicamente, l'inclinazione può anche avvantaggiare il caso (2), poiché la denaturazione si verifica presumibilmente all'interfaccia aria-acqua e limita allo stesso modo il numero di orientamenti distinti rappresentati all'interno dei dati. L'estensione della distorsione dell'orientamento nel set di dati può potenzialmente essere alterata sperimentando additivi per soluzioni, ma la mancanza di un'ampia applicabilità ostacola questi approcci di prova ed errore. L'inclinazione dello stadio del campione con un singolo angolo di inclinazione ottimizzato è sufficiente per migliorare la distribuzione degli orientamenti in virtù dell'alterazione della geometria dell'esperimento di imaging9 (Figura 1). A causa della configurazione geometrica del campione orientato preferenzialmente rispetto al fascio di elettroni, per ogni gruppo di orientamenti preferenziali, l'inclinazione della griglia genera un cono di angoli di illuminazione rispetto al centroide del cluster. Quindi, questo diffonde le viste e di conseguenza migliora il campionamento dello spazio di Fourier e l'isotropia della risoluzione direzionale.
Ci sono, in pratica, alcuni svantaggi nell'inclinare il palcoscenico. L'inclinazione dello stadio del campione introduce un gradiente di messa a fuoco attraverso il campo visivo, che può influire sull'accuratezza delle stime della funzione di trasferimento del contrasto (CTF). La raccolta di dati inclinati può anche portare a un aumento del movimento delle particelle indotto dal fascio causato da maggiori effetti di carica durante l'imaging di campioni inclinati. L'inclinazione della griglia porta anche ad un aumento dello spessore apparente del ghiaccio, che a sua volta porta a micrografie più rumorose e può in definitiva influire sulla risoluzione delle ricostruzioni 5,9,10. Potrebbe essere possibile superare questi problemi applicando schemi avanzati di elaborazione dei dati computazionali che sono brevemente descritti nelle sezioni protocollo e discussione. Infine, l'inclinazione può portare a una maggiore sovrapposizione delle particelle, ostacolando la successiva pipeline di elaborazione delle immagini. Sebbene questo possa essere mitigato in una certa misura ottimizzando la concentrazione di particelle sulla griglia, è comunque una considerazione importante. Qui viene descritto un protocollo semplice da implementare per la raccolta di dati inclinati utilizzando la suite software Leginon (un software di acquisizione automatica delle immagini), accessibile ad accesso aperto e compatibile con un'ampia gamma di microscopi11,12,13,14. Il metodo richiede almeno la versione 3.0 o successiva, con le versioni dalla 3.3 in poi contenenti miglioramenti dedicati per consentire la raccolta dei dati inclinata. Non è necessario alcun software o apparecchiatura aggiuntiva per questo protocollo. Istruzioni dettagliate sull'infrastruttura computazionale e sulle guide all'installazione sono fornite altrove15.
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Protocol
1. Preparazione del campione
- Utilizzare griglie contenenti lamina d'oro e supporto griglia d'oro 16 (vedi Tabella dei materiali) perché la raccolta dei dati inclinata può accentuare il movimento indotto dal fascio17.
NOTA: Per il presente studio, i campioni su griglie sono stati vetrificati utilizzando la tecnica manuale di immersione e tamponamento18 in una cella frigorifera umidificata (superiore all'80%) (~4 °C). - Evitare l'uso di griglie contenenti supporto di rame e foglio di carbonio o uno strato continuo di carbonio amorfo a meno che non sia assolutamente necessario, poiché queste griglie possono portare a un maggiore movimento indotto dal fascio16 quando lo stadio del campione è inclinato.
NOTA: Strati di supporto alternativi, come l'ossido di grafene/grafene, sembrano ridurre il movimento indotto dal fascio rispetto al carbonio amorfo19,20. - Pre-vagliare le griglie e identificare le regioni caratterizzate da uno spessore accettabile del ghiaccio e distribuzione delle particelle. Le griglie contenenti particelle troppo strette porteranno alla sovrapposizione delle particelle durante la raccolta dei dati inclinata, che potrebbe influire sulle fasi di elaborazione dei dati a valle.
NOTA: Questi passaggi sono soggettivi poiché l'identificazione di aree buone di ghiaccio viene eseguita ispezionando visivamente le immagini sfocate per le regioni in cui il contrasto delle particelle è chiaro. Questo potrebbe non essere fattibile per tutti i campioni poiché alcuni campioni non si distribuiranno in modo efficiente nelle aree di ghiaccio sottile, portando a problemi durante la raccolta dei dati (descritti nella sezione Discussione). - Vitrificare le griglie contenenti il campione proteico. Qui, a scopo dimostrativo, usiamo la proteina DPS (DNA Protection during Starvation) (vedi Tabella dei materiali) in un intervallo da 0,1-0,5 mg / ml con lamina d'oro e griglie di supporto d'oro.
NOTA: La proteina è stata purificata come descritto in precedenza, tranne che non è stata eseguita alcuna scissione della proteasi TEV21. L'intervallo di concentrazione proteica per un campione di interesse dovrà essere ottimizzato individualmente, poiché è difficile valutare un intervallo ideale che sia universalmente applicabile e quasi certamente varierà tra i diversi campioni.
2. Impostazione della raccolta dati inclinata
- Allineare il microscopio per garantire un'illuminazione parallela del campione e ridurre al minimo le aberrazioni del coma22.
NOTA: Il microscopio deve essere ben allineato per la raccolta di dati SPA standard senza inclinazione dello stadio. Non sono necessari allineamenti speciali per la raccolta dei dati inclinati, ma un buon allineamento garantirà che il targeting e l'imaging procedano senza intoppi. Uno schema generale che confronta la raccolta dei dati inclinati e non inclinati è fornito nella Figura 2. - Registra un atlante della griglia senza inclinazione dello stadio per identificare i quadrati adatti alla raccolta dei dati o ispeziona manualmente i quadrati all'ingrandimento utilizzato nel nodo di acquisizione quadrato. Cerca quadrati in cui la lamina è intatta, non sembra disidratata e ha uno spessore di ghiaccio ideale.
NOTA: Square Acquisition Node è il nodo a basso ingrandimento utilizzato per l'imaging multiscala in Leginon.- Per la tipica raccolta automatica dei dati non inclinata, registrare un atlante della griglia, che fornisce una panoramica della qualità complessiva della griglia e un'indicazione iniziale delle aree adatte per la raccolta dei dati.
- Successivamente, selezionare i quadrati adatti attraverso l'atlante e inviarli alla coda. Quindi, tramite la selezione manuale dei fori o tramite il cercatore automatico di fori EM, accodare e inviare i target dei fori.
- Infine, utilizzare il cercatore automatico di fori EM per inviare obiettivi di esposizione ad alto ingrandimento.
NOTA: per la raccolta dei dati inclinati, potrebbe essere necessario accodare manualmente i quadrati per ottenere risultati coerenti, soprattutto se l'angolo di inclinazione ottimale non è stato predeterminato ed è probabile che venga regolato durante la raccolta dei dati. L'atlante della griglia potrebbe anche essere registrato utilizzando un'inclinazione dello stadio predefinita se l'angolo di inclinazione utilizzato per la raccolta dei dati fosse stato precedentemente stabilito.
- Spostare lo stadio campione in un quadrato di interesse.
- Determinare l'altezza eucentrica per la posizione del palco utilizzando α-wobbler a ± inclinazione del palco di 15°. Regolare l'altezza Z per portare il palco all'altezza eucentrica utilizzando il pannello della tastiera per il microscopio. Assicurati che lo spostamento dell'immagine sia minimo durante la routine di oscillazione α.
NOTA: Se l'altezza eucentrica non è correttamente identificata, si osserverà un grande spostamento dell'immagine inclinando il palco all'ingrandimento quadrato. Ciò può accadere anche se ci sono deformazioni locali sulla griglia, ad esempio, se la griglia è rotta o gravemente piegata in prossimità dell'area ripresa. Sebbene sia meglio evitare tali regioni per la raccolta dei dati, è imperativo stimare con precisione l'altezza eucentrica se queste rappresentano una delle poche regioni promettenti per la raccolta dei dati. La Figura 3 mostra come il targeting senza identificare correttamente l'altezza eucentrica può causare grandi spostamenti dell'immagine nell'ingrandimento del quadrato. - Trova un'altezza Z più precisa, usa il nodo Focheggiatore e premi Simula.
- In genere, stimare l'altezza Z nel nodo Focheggiatore all'ingrandimento utilizzato nel nodo di acquisizione quadrato.
NOTA: La sequenza di messa a fuoco del nodo Focuser può anche includere una stima fine della messa a fuoco Z all'ingrandimento del nodo Hole Acquisition (uno strumento nel software Leginon) durante la raccolta dei dati. - Regolare le impostazioni per il nodo Focheggiatore e abilitare/disabilitare l'opzione di messa a fuoco Z fine durante l'accodamento iniziale dei quadrati.
NOTA: è importante assicurarsi che l'altezza eucentrica sia identificata con precisione quando inizia la raccolta automatica dei dati, il che potrebbe richiedere la riattivazione della messa a fuoco Z fine (passaggio 2.10).
- In genere, stimare l'altezza Z nel nodo Focheggiatore all'ingrandimento utilizzato nel nodo di acquisizione quadrato.
- Inclinare lo stadio del campione all'angolo di inclinazione desiderato per la raccolta dei dati alla vera altezza eucentrica e, se necessario, ricentrare lo stadio. Per questo studio sono stati utilizzati angoli di inclinazione di 0°, 30° e 60°. Premere Simula nel nodo Acquisizione quadrata per iniziare ad accodare le destinazioni per le esposizioni del nodo Acquisizione fori .
NOTA: Come indicato al punto 2.2.1, l'atlante della griglia può essere registrato utilizzando un'inclinazione predefinita dello stadio, che eviterebbe la necessità di inclinare nuovamente lo stadio in questa fase. Questo funziona bene e accelera il processo se l'angolo di inclinazione utilizzato per la raccolta dei dati è predefinito. Il protocollo attuale è scritto pensando a nuovi campioni, in cui l'utente potrebbe voler testare diversi angoli di inclinazione per la raccolta dei dati. - Selezionare un target di messa a fuoco Z e regioni con fori adatti per esposizioni ad alto ingrandimento.
- Premere Invia destinazioni per mettere in coda per l'imaging. Non premere Invia destinazioni in coda fino a quando non hai finito di mettere in coda tutti i quadrati.
- Riportare lo stadio del campione allo stato non inclinato. Passate al quadrato successivo e ripetete i passaggi 2.3-2.8 fino a quando non è stato messo in coda un numero adeguato di esposizioni dei fori.
- Vai al nodo Hole Targeting e premi Submit Queued Targets una volta che tutti i quadrati sono in coda.
NOTA: se la messa a fuoco Z fine è stata disabilitata in precedenza per risparmiare tempo (passaggio 2.5), deve essere riattivata prima di inviare la coda. - Ispezionare manualmente i target selezionati dal nodo di acquisizione dell'esposizione ad alto ingrandimento per verificare se il cercatore automatico di fori EM è in grado di identificare con precisione le regioni adatte per l'acquisizione delle immagini quando lo stadio del campione è inclinato.
- Durante questa procedura, selezionare "Consenti la verifica utente dei target selezionati" nelle impostazioni del nodo Acquisizione esposizione . Una volta che l'utente è soddisfatto della precisione del targeting, deseleziona questa opzione per la raccolta automatica dei dati.
NOTA: I target nel nodo di acquisizione dell'esposizione ad alto ingrandimento vengono in genere ripresi utilizzando una strategia di spostamento dell'immagine beam-tilt, che funziona ugualmente bene sia per la raccolta di dati inclinati che non inclinati23,24,25,26. Per una stima accurata del CTF nelle fasi di elaborazione dei dati a valle, è necessario eseguire la calibrazione dell'aberrazione della chioma dell'obiettivo per la strategia di raccolta dei dati di spostamento dell'immagine beam-tilt.
- Durante questa procedura, selezionare "Consenti la verifica utente dei target selezionati" nelle impostazioni del nodo Acquisizione esposizione . Una volta che l'utente è soddisfatto della precisione del targeting, deseleziona questa opzione per la raccolta automatica dei dati.
3. Trattamento dei dati
- Avvia l'elaborazione dei dati al volo 10,27,28,29 con la correzione del movimento dei filmati registrati, la stima CTF, la selezione delle particelle e la generazione di ricostruzioni iniziali durante la raccolta dei dati.
NOTA: Per il presente studio, cryoSPARC Live10 (vedi Tabella dei materiali) è stato utilizzato per la pre-elaborazione. L'elaborazione dei dati al volo fornisce una ricostruzione crio-EM iniziale e un'approssimazione per la distribuzione angolare, che può informare l'utente sull'estensione dell'anisotropia di risoluzione. Questi possono, a loro volta, essere utilizzati per guidare l'utente sul fatto che l'angolo di inclinazione utilizzato per la raccolta dei dati sia sufficientemente elevato. - Visualizza la mappa ricostruita e traccia la distribuzione dell'angolo di Eulero per valutare l'estensione degli orientamenti delle particelle preferiti.
NOTA: Le distribuzioni degli angoli di Eulero possono essere convertite direttamente in distribuzioni campionarie dello spazio di Fourier per determinare la potenziale estensione dell'anisotropia di risoluzione. È stata sviluppata un'interfaccia utente grafica (GUI) per aiutare l'utente a valutare la qualità di una distribuzione dell'angolo di Eulero e determinare un angolo di inclinazione ottimale30,31. Lo strumento può essere ottenuto dal repository Github, https://github.com/LyumkisLab/SamplingGui. - Se necessario, regolare l'angolo di inclinazione dello stage al quale vengono raccolti i dati per superare gli effetti dell'orientamento preferenziale. L'angolo può essere aumentato se l'orientamento preferenziale rimane un problema, come evidenziato dalla mappa e dalla distribuzione di Eulero in 3.2. In alternativa, l'utente potrebbe voler dividere la raccolta dati in gruppi e registrare utilizzando diversi angoli di inclinazione, ad esempio 20°, 30° e 40°.
NOTA: Sebbene la maggior parte dei TEM debba avere la capacità di inclinare lo stadio a 70°, le inclinazioni dello stadio dei campioni comuni (che abbiamo usato) vanno da 20° a 40°.
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Representative Results
DPS a 0,3 mg/ml è stato utilizzato per dimostrare l'imaging a inclinazioni di 0°, 30° e 60°. I dati provenienti da diversi angoli di inclinazione sono stati raccolti sulla stessa griglia in diverse regioni della griglia. La risoluzione CTF si adatta alle inclinazioni angolari più elevate tendono ad essere più scarse, come nel caso del confronto dei tre set di dati in questo studio. La Figura 4 mostra immagini rappresentative comparative e medie di classificazione 2D. Sebbene la concentrazione proteica sia invariata tra i diversi angoli di inclinazione, un angolo di inclinazione più elevato rende l'area ripresa più affollata in termini di concentrazione di particelle. Questo può essere problematico per l'elaborazione dei dati perché la sovrapposizione delle particelle può complicare le ricostruzioni 3D e i perfezionamenti angolari. La classificazione 2D iterativa produceva regolarmente una pila pulita di particelle con set di dati inclinati di 0° e 30°, mentre il set di dati di 60° richiedeva un'attenta pulizia delle pile di particelle per garantire che le medie di classe mostrassero una sovrapposizione minima per le particelle adiacenti. La media della classe della Figura 4C nel riquadro rosso rappresenta un esempio di sovrapposizione di particelle. Sebbene la ricentratura durante la classificazione possa comportare la media del segnale proveniente dalle particelle vicine, una sostanziale sovrapposizione di particelle può compromettere l'accuratezza dei parametri di allineamento delle particelle, producendo ricostruzioni caratterizzate da una risoluzione inferiore. La soluzione migliore per evitare la sovrapposizione delle particelle è quella di pre-vagliare le griglie con uno spessore del ghiaccio e una distribuzione delle particelle ottimali. Una panoramica quantitativa completa delle metriche per valutare i miglioramenti derivanti dalla raccolta di dati inclinati è descritta altrove32.
Figura 1: Panoramica dei vantaggi e delle sfide della raccolta dati inclinata. Il pannello superiore mostra una vista ravvicinata di un foro della griglia. Le barre della griglia sono in oro, blu ghiaccio vetroso e particelle macromolecolari rosse. Le frecce indicano la direzione del fascio di elettroni. Il pannello inferiore rappresenta una raccolta di fori con lo stesso schema di colorazione del pannello superiore. La stella nera rappresenta l'obiettivo di messa a fuoco fine prima dell'acquisizione dell'immagine di esposizione ad alto ingrandimento. L'angolo di inclinazione è indicato come "α". Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Diagramma del flusso di lavoro che confronta la strategia di raccolta dei dati non inclinata e inclinata. Il confronto graduale della raccolta dati non inclinata e inclinata mostra il passaggio aggiuntivo della stima manuale dell'altezza eucentrica e della ricentratura per ciascun quadrato inclinato (2 e 3 per la raccolta dei dati inclinati). Il resto del flusso di lavoro è simile tra le due strategie. Questi includono la selezione di un quadrato adatto per l'imaging (1 per la raccolta di dati inclinati e non inclinati), l'avvio di uno schema di accodamento scegliendo un quadrato per l'imaging (indicato come simulate; 2 e 4 per la raccolta di dati non inclinati e inclinati, rispettivamente), fornendo un target di messa a fuoco dell'altezza eucentrica e obiettivi di acquisizione dell'ingrandimento del foro della coda (3 e 5 per la raccolta di dati non inclinati e inclinati, rispettivamente). e infine l'invio della coda di target di esposizione ad alto ingrandimento selezionati (4 e 6 per la raccolta di dati non inclinati e inclinati, rispettivamente). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Immagini rappresentative della griglia a ingrandimento quadrato con diversi angoli di inclinazione. Le immagini raccolte vicino e lontano dall'altezza Z eucentrica sono mostrate rispettivamente sui pannelli superiore e inferiore. L'asse ottico del fascio è indicato dal centro degli anelli concentrici rossi. La freccia verde indica il quadrato di interesse. C'è una caratteristica griglia interrotta adiacente al quadrato di interesse per riferimento. L'apertura dell'obiettivo viene rimossa per facilitare la visualizzazione. Barra di scala = 20 μM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Esposizioni rappresentative dei fori e medie di classe 2D raccolte a diversi angoli di inclinazione. I pannelli (A), (B) e (C) si riferiscono all'imaging eseguito con lo stadio del campione non inclinato a 0° o inclinato a 30° e 60°. Le medie delle classi 2D interessate dal sovraffollamento sono mostrate nel riquadro rosso in (C). Barra di scala = 100 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
L'orientamento preferito delle particelle causato dall'aderenza del campione all'interfaccia aria-acqua è uno degli ultimi principali colli di bottiglia per la determinazione di routine della struttura ad alta risoluzione utilizzando cryo-EM SPA 4,5,6. Lo schema di raccolta dei dati qui presentato fornisce una strategia facile da implementare per migliorare la distribuzione di orientamento delle particelle all'interno di un set di dati. Notiamo che il protocollo non richiede apparecchiature o software aggiuntivi e non influisce sulla velocità di raccolta dei dati. Le seguenti considerazioni sono importanti durante l'acquisizione dei dati per i campioni inclinati.
In primo luogo, il quadrato ripreso deve essere all'altezza eucentrica per un targeting ottimale. L'altezza eucentrica viene regolata registrando le immagini della coppia di inclinazione a piccoli angoli di inclinazione del palcoscenico (di solito 0,5 ° -2 °) e identificando la messa a fuoco in base a una relazione predefinita tra spostamento dell'immagine e sfocatura. Se il quadrato di destinazione richiede una grande regolazione dell'altezza eucentrica, ciò comporterà un significativo spostamento dell'immagine dell'immagine quadrata, in modo tale che quando il palcoscenico viene nuovamente inclinato, il campo visivo può essere bloccato dall'apertura dell'obiettivo.
In secondo luogo, il foro normalmente circolare diventa sempre più oblungo con inclinazioni più elevate a medio ingrandimento (ingrandimento del nodo di acquisizione del foro ). In assenza di accurate calibrazioni dello spostamento dell'immagine, è possibile che parte della pellicola possa essere ripresa insieme a particelle incorporate nel ghiaccio vitreo per un dato ingrandimento dell'esposizione. Pertanto, idealmente, le calibrazioni dello spostamento dell'immagine devono essere accurate. Un'alternativa consiste nell'aumentare l'ingrandimento in modo tale che l'area visualizzata rispetto alla dimensione del foro diminuisca. A un ingrandimento più elevato, gli errori nello spostamento dell'immagine indotto dall'inclinazione del fascio avrebbero un effetto minore sulla capacità di un utente di navigare verso un'area di ghiaccio vitreo. Tuttavia, ciò avviene a scapito della diminuzione del numero di particelle nelle micrografie risultanti, proporzionale ad un aumento dell'ingrandimento.
In terzo luogo, l'autofocus ha una maggiore probabilità di fallire per la raccolta dei dati inclinati a causa dell'aumento del movimento indotto dal fascio e dell'aumento dello spessore del campione. Pertanto, ottenere una messa a fuoco accurata può, occasionalmente, presentare alcune sfide per la raccolta di dati inclinati, specialmente se l'obiettivo di messa a fuoco è la lamina d'oro al centro di quattro fori, che è una pratica standard per la raccolta di dati non inclinati. In caso di frequenti fallimenti nella stima della messa a fuoco, un'alternativa consiste nell'impostare il bordo di un foro come destinazione di messa a fuoco. Ciò deve fornire un segnale sufficiente per un'accurata correlazione di fase tra le coppie di immagini indotte dall'inclinazione del fascio e la successiva regolazione della messa a fuoco. Nella nostra esperienza, la messa a fuoco sul bordo di un foro raramente provoca un fallimento della messa a fuoco automatica.
Infine, quando le immagini ad alto ingrandimento vengono selezionate lontano dal centro della griglia, la differenza di messa a fuoco tra le immagini mirate sui lati opposti dell'asse di inclinazione può essere significativa. L'entità di questa differenza dipende dall'angolo di inclinazione e dalla distanza dal punto di messa a fuoco. Ad esempio, con un angolo di inclinazione di 30°, due bersagli che si trovano a 6 μm di distanza sulla superficie della griglia e selezionati esattamente perpendicolarmente all'asse di inclinazione avranno una differenza di 3 μm nella sfocatura tra loro (la relazione è: delta defocus = sin (angolo di inclinazione) * (distanza dall'asse di inclinazione)). I bersagli selezionati lungo l'asse di inclinazione avranno lo stesso sfocamento, mentre altri cadranno da qualche parte nel mezzo. Se l'asse di inclinazione è definito in Leginon durante la calibrazione, il software compensa automaticamente la variazione della sfocatura. Tuttavia, gli utenti devono essere consapevoli del fatto che esiste comunque la possibilità di avere gradienti di messa a fuoco più ampi durante l'imaging ad alto ingrandimento. Grandi gradienti di messa a fuoco dovrebbero influire minimamente sulla ricostruzione finale33, ma potrebbe essere necessario utilizzare caselle di dimensioni maggiori durante l'elaborazione dei dati per evitare effetti di aliasing. In queste circostanze, l'utilizzo di un intervallo di sfocatura più ristretto durante l'acquisizione dei dati può essere giustificato e la randomizzazione della sfocatura deriva naturalmente dall'inclinazione dello stage. Le regolazioni della sfocatura per particella durante l'elaborazione dei dati possono migliorare le risoluzioni delle ricostruzioni finali. Tuttavia, poiché la modellazione accurata degli adattamenti CTF può essere difficile per angoli di inclinazione del palcoscenico elevati, è necessario prestare attenzione a monitorare la qualità dei dati e il CTF si adatta durante la cura dell'esposizione. Generalmente, uno spessore del ghiaccio non ottimale si traduce in una minore accuratezza nella modellazione degli adattamenti di stima CTF. Pertanto, è necessario prestare attenzione all'immagine nelle aree in cui il ghiaccio è sottile, supponendo che la distribuzione delle particelle sia sufficientemente buona in queste aree.
Una migliore e più uniforme distribuzione dell'orientamento porta ad un corrispondente miglioramento della risoluzione direzionale delle mappe crio-EM ricostruite. Inoltre, una distribuzione di orientamento più uniforme migliora il fattore di compensazione del campionamento, che si riferisce direttamente alla risoluzione globale30,31. Pertanto, migliorare collettivamente la distribuzione dell'orientamento dovrebbe migliorare l'accuratezza della modellazione atomica e del perfezionamento 9,30,31. In linea di principio, ciò costituirebbe un valido motivo per l'attuazione di routine della raccolta di dati inclinata. Tuttavia, ci sono diversi avvertimenti di cui l'utente deve essere a conoscenza. In primo luogo, l'aumento del gradiente di messa a fuoco e dello spessore del ghiaccio può influire sulla risoluzione globale complessiva, presumibilmente a causa di una combinazione di aumento del rumore di fondo e aumento del movimento indotto dal fascio, combinato con altri problemi indiretti che sorgono come risultato17. Questo effetto dovrebbe essere più pronunciato nei casi in cui il ghiaccio è intrinsecamente più spesso. Tuttavia, poiché la maggior parte dei campioni soffre di una certa quantità di orientamento preferito, che a sua volta può portare a una non uniformità del campionamento, la raccolta di dati inclinata può essere generalmente vantaggiosa purché gli effetti dannosi siano ridotti al minimo o mitigati. In secondo luogo, potrebbe essere necessario inclinare il palco fino a 60° per alcuni campioni caratterizzati da un severo orientamento preferenziale. Prove aneddotiche non pubblicate dal nostro lavoro e dai rapporti dei colleghi suggeriscono che anche ~ 40 ° inclinazioni sono insufficienti per superare l'anisotropia di risoluzione per alcuni campioni. Sono in corso sforzi per identificare un angolo di inclinazione ottimale per un insieme di distribuzioni, sulla base delle idee esposte in Baldwin et al.31. Infine, si dovrebbe notare che, in linea di principio, una ricostruzione da un campione caratterizzato da un orientamento singolo preferito perfettamente patologico avrebbe comunque un cono mancante di 30° anche quando i dati sono raccolti con un angolo di inclinazione di 60°. Negli esperimenti simulati, è improbabile che un cono mancante di 30° influenzi notevolmente le interpretazioni sperimentali. Un'inclinazione di 60° è probabilmente sufficiente anche per gli esemplari più patologicamente orientati preferenzialmente. Tuttavia, nei casi in cui lo stadio debba essere inclinato fino a 60°, la concentrazione di particelle nel campo visivo deve essere attentamente ottimizzata, poiché la sovrapposizione delle particelle complicherà l'elaborazione dei dati. Non è possibile inclinarsi a più di 60° (o 70° su stadi di microscopio selezionati) su TEM standard, a causa delle limitazioni del design dello stadio del campione. In tali casi, potrebbe essere necessaria un'ulteriore ottimizzazione con additivi e biochimica del campione.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Bill Anderson, Charles Bowman e Jean-Christophe Ducom (TSRI) per l'aiuto con la microscopia, le installazioni Leginon e l'infrastruttura di trasferimento dati. Ringraziamo anche Gordon Louie (Salk Institute) e Yong Zi Tan (National University of Singapore) per la lettura critica del manoscritto. Ringraziamo Chris Russo (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge) per averci fornito il plasmide per l'espressione della DPS. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health degli Stati Uniti (U54AI150472, U54 AI170855 e R01AI136680 a DL), la National Science Foundation (NSF MCB-2048095 a DL), le Hearst Foundations (a DL) e Arthur e Julie Woodrow Chair (a J. P. N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryosparc Live v3.1.0+210216 | Structura Biotechnology | ||
| DPS protein | Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098. | ||
| K2 Summit Direct Electron Detector | Gatan | ||
| Leginon software suite | C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60. | ||
| Manual plunging device | Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids | ||
| Talos Arctica | FEI/Thermo Fisher | ||
| UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids | Quantifoil | N1-A14nAu30-01 |
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