Summary
Het huidige protocol beschrijft een gegeneraliseerd en eenvoudig te implementeren schema voor het verzamelen van gekantelde gegevens met één deeltje in cryo-EM-experimenten. Een dergelijke procedure is vooral nuttig voor het verkrijgen van een hoogwaardige EM-kaart voor monsters die lijden aan preferentiële oriëntatiebias als gevolg van de naleving van de lucht-waterinterface.
Abstract
Single-particle analysis (SPA) door cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) is nu een mainstream techniek voor hoge resolutie structurele biologie. Structuurbepaling door SPA is gebaseerd op het verkrijgen van meerdere verschillende weergaven van een macromoleculair object dat verglaasd is in een dunne laag ijs. Idealiter zou een verzameling van uniform verdeelde willekeurige projectieoriëntaties neerkomen op alle mogelijke weergaven van het object, wat aanleiding geeft tot reconstructies die worden gekenmerkt door isotrope directionele resolutie. In werkelijkheid hebben veel monsters echter last van bij voorkeur georiënteerde deeltjes die zich hechten aan het lucht-water-grensvlak. Dit leidt tot niet-uniforme hoekoriëntatieverdelingen in de dataset en inhomogene Fourier-ruimtebemonstering in de reconstructie, wat zich vertaalt in kaarten die worden gekenmerkt door anisotrope resolutie. Het kantelen van de monsterfase biedt een generaliseerbare oplossing voor het overwinnen van resolutie-anisotropie door het verbeteren van de uniformiteit van oriëntatieverdelingen, en dus de isotropie van Fourier-ruimtebemonstering. Het huidige protocol beschrijft een gekantelde geautomatiseerde gegevensverzamelingsstrategie met behulp van Leginon, een software voor geautomatiseerde beeldacquisitie. De procedure is eenvoudig te implementeren, vereist geen extra apparatuur of software en is compatibel met de meeste standaard transmissie-elektronenmicroscopen (TEM's) die worden gebruikt voor het afbeelden van biologische macromoleculen.
Introduction
De komst van directe elektronendetectoren in het afgelopen decennium 1,2,3 heeft geleid tot een exponentiële toename van het aantal hoge-resolutiestructuren van macromoleculen en macromoleculaire assemblages opgelost met behulp van cryo-EM 4,5,6 met één deeltje. Bijna alle gezuiverde macromoleculaire soorten zijn naar verwachting vatbaar voor structuurbepaling met behulp van cryo-EM, behalve de kleinste eiwitten ~ 10 kDa in grootte of lager dan7. De hoeveelheid uitgangsmateriaal die nodig is voor rastervoorbereiding en structuurbepaling is ten minste een orde van grootte kleiner dan andere structuurbepalingstechnieken, zoals kernspinresonantiespectroscopie en röntgenkristallografie 4,5,6.
Een belangrijke uitdaging voor structuurbepaling door cryo-EM is echter een geschikte rastervoorbereiding voor beeldvorming. Een uitgebreide studie die diverse monsters evalueerde met behulp van verschillende vitrificatiestrategieën en -roosters suggereerde dat de meeste benaderingen voor het verglazen van monsters op cryo-EM-roosters leiden tot preferentiële hechting van macromoleculen aan de lucht-waterinterface8. Een dergelijke hechting kan mogelijk vier suboptimale uitkomsten veroorzaken: (1) het macromoleculaire monster denatureert volledig, in welk geval geen succesvolle gegevensverzameling en -verwerking mogelijk is; (2) het monster denatureert gedeeltelijk, in welk geval het mogelijk kan zijn om structurele inzichten te verkrijgen uit gebieden van het macromolecuul die niet zijn beschadigd; (3) het monster behoudt de oorspronkelijke structuur, maar slechts één reeks deeltjesoriëntaties ten opzichte van de richting van de elektronenbundel wordt in de afbeeldingen weergegeven; (4) Het monster behoudt de oorspronkelijke structuur en sommige, maar niet alle mogelijke deeltjesoriëntaties ten opzichte van de richting van de elektronenbundel worden weergegeven in de afbeeldingen. Voor gevallen (3) en (4) zal gekantelde gegevensverzameling helpen bij het minimaliseren van directionele resolutie-anisotropie die de gereconstrueerde cryo-EM-kaart beïnvloedt en biedt een generaliseerbare oplossing voor een breed scala aan monsters9. Technisch gezien kan kantelen ook het geval (2) ten goede komen, omdat de denaturatie vermoedelijk plaatsvindt op het lucht-water-grensvlak en op dezelfde manier het aantal verschillende oriëntaties beperkt dat in de gegevens wordt weergegeven. De mate van oriëntatiebias in de dataset kan mogelijk worden gewijzigd door te experimenteren met oplossingsadditieven, maar een gebrek aan brede toepasbaarheid belemmert deze trial-and-error-benaderingen. Het kantelen van de monstertrap onder een enkele geoptimaliseerde kantelhoek is voldoende om de verdeling van oriëntaties te verbeteren door de geometrie van het beeldvormingsexperiment9 te wijzigen (figuur 1). Vanwege de geometrische configuratie van het bij voorkeur georiënteerde monster ten opzichte van de elektronenbundel, genereert het kantelen van het raster voor elk cluster van voorkeursoriëntaties een kegel van verlichtingshoeken ten opzichte van het clustercentroïde. Dit spreidt de weergaven dus en verbetert bijgevolg fourierruimtebemonstering en de isotropie van directionele resolutie.
Er kleven in de praktijk wel wat nadelen aan het kantelen van het podium. Het kantelen van de monsterfase introduceert een focusverloop over het gezichtsveld, wat van invloed kan zijn op de nauwkeurigheid van CTF-schattingen (Contrast Transfer Function). Gekantelde gegevensverzameling kan ook leiden tot een verhoogde door de bundel geïnduceerde deeltjesbeweging veroorzaakt door verhoogde ladingseffecten bij het in beeld brengen van gekantelde monsters. Rasterkanteling leidt ook tot een toename van de schijnbare ijsdikte, wat op zijn beurt leidt tot luidruchtigere micrografieën en uiteindelijk de resolutie van reconstructies kan beïnvloeden 5,9,10. Het is mogelijk om deze problemen op te lossen door geavanceerde computationele gegevensverwerkingsschema's toe te passen die kort worden beschreven in de protocol- en discussiesecties. Ten slotte kan kantelen leiden tot een grotere overlapping van deeltjes, waardoor de daaropvolgende beeldverwerkingspijplijn wordt belemmerd. Hoewel dit tot op zekere hoogte kan worden verzacht door de deeltjesconcentratie op het net te optimaliseren, is het toch een belangrijke overweging. Hier wordt een eenvoudig te implementeren protocol beschreven voor gekantelde gegevensverzameling met behulp van de Leginon-softwaresuite (een geautomatiseerde beeldacquisitiesoftware), beschikbaar open access en compatibel met een breed scala aan microscopen11,12,13,14. De methode vereist ten minste versie 3.0 of hoger, met versies 3.3 en hoger die speciale verbeteringen bevatten om gekantelde gegevensverzameling mogelijk te maken. Voor dit protocol is geen extra software of apparatuur nodig. Uitgebreide instructies over computationele infrastructuur en installatiehandleidingen zijn elders te vinden15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Monstervoorbereiding
- Gebruik rasters met goudfolie en goudrastersteun16 (zie materiaaltabel) omdat gekantelde gegevensverzameling door bundelgeïnduceerde beweging 17 kan accentueren.
OPMERKING: Voor dit onderzoek werden monsters op roosters verglaasd met behulp van de handmatige plof- en blottingtechniek18 in een bevochtigde (meer dan 80%) koelruimte (~4 °C). - Vermijd het gebruik van roosters met koperen ondersteuning en koolstoffolie of een continue laag amorfe koolstof, tenzij absoluut noodzakelijk, omdat deze roosters kunnen leiden tot een grotere door de bundel geïnduceerde beweging16 wanneer de monsterfase wordt gekanteld.
OPMERKING: Alternatieve ondersteuningslagen, zoals grafeen/grafeenoxide, lijken de door de bundel geïnduceerde beweging te verminderen in vergelijking met amorfe koolstof 19,20. - Vooraf rasters screenen en regio's identificeren die worden gekenmerkt door een acceptabele ijsdikte en deeltjesverdeling. Rasters die te dicht opeengepakte deeltjes bevatten, zullen leiden tot deeltjesoverlapping tijdens gekantelde gegevensverzameling, wat van invloed kan zijn op downstream gegevensverwerkingsstappen.
OPMERKING: Deze stappen zijn subjectief omdat het identificeren van goede gebieden van ijs wordt uitgevoerd door het visueel inspecteren van onscherpe beelden voor gebieden waar het deeltjescontrast duidelijk is. Dit is mogelijk niet haalbaar voor alle monsters, omdat sommige monsters zich niet efficiënt verspreiden in gebieden met dun ijs, wat leidt tot uitdagingen tijdens het verzamelen van gegevens (beschreven in de sectie Discussie). - Verglaas de roosters met uw eiwitmonster. Hier, voor demonstratiedoeleinden, gebruiken we DNA-bescherming tijdens uithongering (DPS) -eiwit (zie tabel met materialen) in een bereik van 0,1-0,5 mg / ml met goudfolie en gouden ondersteuningsroosters.
OPMERKING: Het eiwit werd gezuiverd zoals eerder beschreven, behalve dat er geen TEV-proteasesplitsing werd uitgevoerd21. Het eiwitconcentratiebereik voor een monster van belang zal individueel moeten worden geoptimaliseerd, omdat het moeilijk is om een ideaal bereik te meten dat universeel toepasbaar is en vrijwel zeker zal variëren tussen verschillende monsters.
2. Gekantelde gegevensverzameling instellen
- Lijn de microscoop uit om parallelle verlichting van het monster te garanderen en coma-afwijkingen te minimaliseren22.
OPMERKING: De microscoop moet goed zijn uitgelijnd voor standaard SPA-gegevensverzameling zonder fasekanteling. Er zijn geen speciale uitlijningen nodig voor gekantelde gegevensverzameling, maar een goede uitlijning zorgt ervoor dat targeting en imaging soepel verlopen. Een algemeen schema waarin gekantelde en niet-gekantelde gegevensverzameling worden vergeleken, wordt gegeven in figuur 2. - Neem een rasteratlas op zonder fasekanteling om vierkanten te identificeren die geschikt zijn voor gegevensverzameling of inspecteer vierkanten handmatig bij de vergroting die wordt gebruikt in Square Acquisition Node. Zoek naar vierkanten waar de folie intact is, er niet uitgedroogd uitziet en een ideale ijsdikte heeft.
OPMERKING: Square Acquisition Node is het knooppunt met lage vergroting dat wordt gebruikt voor beeldvorming op meerdere schalen in Leginon.- Voor typische niet-gekantelde geautomatiseerde gegevensverzameling neemt u een rasteratlas op, die een overzicht geeft van de algehele rasterkwaliteit en een eerste indicatie van geschikte gebieden voor gegevensverzameling.
- Selecteer vervolgens geschikte vakjes door de atlas en dien deze in de wachtrij in. Vervolgens, hetzij door handmatige selectie van gaten of via de geautomatiseerde EM-gatzoeker, wachtrij en dien de gatdoelen in.
- Gebruik ten slotte de geautomatiseerde EM-gatzoeker voor het indienen van blootstellingsdoelen met een hoge vergroting.
OPMERKING: Voor het verzamelen van gekantelde gegevens moeten vierkanten mogelijk handmatig in de wachtrij worden geplaatst voor consistente resultaten, vooral als de optimale kantelhoek niet vooraf is bepaald en waarschijnlijk tijdens het verzamelen van gegevens zal worden aangepast. De rasteratlas kon ook worden vastgelegd met behulp van een vooraf gedefinieerde fasekanteling als de kantelhoek die werd gebruikt voor het verzamelen van gegevens eerder was vastgesteld.
- Verplaats het voorbeeldstadium naar een interessant vierkant.
- Bepaal de eucentrische hoogte voor de podiumpositie met behulp van α-wobbler bij ± 15° podiumkanteling. Pas de Z-hoogte aan om het podium op eucentrische hoogte te brengen met behulp van het toetsenbordpaneel voor de microscoop. Zorg ervoor dat de beeldverschuiving minimaal is tijdens de α-wiebelroutine.
OPMERKING: Als de eucentrische hoogte niet goed wordt geïdentificeerd, wordt een grote beeldverschuiving waargenomen bij het kantelen van het podium bij de vierkante vergroting. Dit kan ook gebeuren als er lokale vervormingen op het raster zijn, bijvoorbeeld als het raster in de buurt van het afgebeelde gebied is gebroken of ernstig is gebogen. Hoewel het het beste is om dergelijke regio's voor gegevensverzameling te vermijden, is het noodzakelijk om de eucentrische hoogte nauwkeurig te schatten als deze een van de weinige veelbelovende regio's voor gegevensverzameling vertegenwoordigen. Figuur 3 laat zien hoe targeting zonder de eucentrische hoogte goed te identificeren grote beeldverschuivingen in de vierkante vergroting kan veroorzaken. - Zoek een nauwkeurigere Z-hoogte, gebruik het focuserknooppunt en druk op Simuleren.
- Schat doorgaans de Z-hoogte in het Focuser-knooppunt bij de vergroting die wordt gebruikt in Square Acquisition Node.
OPMERKING: De focusvolgorde van het Focuser-knooppunt kan ook een fijne Z-focusschatting bevatten bij de Hole Acquisition-knoop (een hulpmiddel in Leginon-software) vergroting tijdens het verzamelen van gegevens. - Pas de instellingen voor het Focuser-knooppunt aan en schakel de fijne Z-focusoptie in of uit tijdens de eerste wachtrij van vierkanten.
OPMERKING: Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de eucentrische hoogte nauwkeurig wordt geïdentificeerd wanneer geautomatiseerde gegevensverzameling begint, waardoor mogelijk opnieuw fijne Z-focus moet worden ingeschakeld (stap 2.10).
- Schat doorgaans de Z-hoogte in het Focuser-knooppunt bij de vergroting die wordt gebruikt in Square Acquisition Node.
- Kantel de monstertrap naar de gewenste kantelhoek voor gegevensverzameling op de ware eucentrische hoogte en centreer het podium indien nodig opnieuw. Voor dit onderzoek werden hellingshoeken van 0°, 30° en 60° gebruikt. Druk op Simuleren in het knooppunt Square Acquisition om te beginnen met het in de rij plaatsen van doelen voor blootstellingen van hole acquisition-knooppunten .
OPMERKING: Zoals aangegeven in stap 2.2.1, kan de rasteratlas worden opgenomen met behulp van een vooraf gedefinieerde fasekanteling, waardoor het niet nodig is om het podium bij deze stap opnieuw te kantelen. Dit werkt goed en versnelt het proces als de kantelhoek die wordt gebruikt voor het verzamelen van gegevens vooraf is gedefinieerd. Het huidige protocol is geschreven met nieuwe exemplaren in gedachten, waarbij de gebruiker mogelijk verschillende kantelhoeken wil testen voor gegevensverzameling. - Selecteer een Z-focusdoel en gebieden met gaten die geschikt zijn voor hoge vergrotingsbelichtingen.
- Druk op Doelen indienen om in de wachtrij te staan voor beeldvorming. Druk niet op Doelen in wachtrij verzenden totdat u klaar bent met het in de rij zetten van alle vakjes.
- Breng het stadium van het monster terug naar de niet-gekantelde staat. Ga naar het volgende vierkant en herhaal stap 2.3-2.8 totdat een voldoende aantal gatblootstellingen in de wachtrij is geplaatst.
- Ga naar het knooppunt Hole Targeting en druk op Submit Queued Targets zodra alle vakjes in de wachtrij staan.
OPMERKING: Als fijne Z-focus eerder is uitgeschakeld om tijd te besparen (stap 2.5), moet deze opnieuw worden ingeschakeld voordat de wachtrij wordt verzonden. - Inspecteer handmatig doelen die zijn geselecteerd door het knooppunt Belichting acquisitie met hoge vergroting om te testen of de geautomatiseerde EM-gatzoeker nauwkeurig geschikte gebieden voor beeldacquisitie kan identificeren wanneer de monsterfase wordt gekanteld.
- Selecteer tijdens deze procedure 'Gebruikersverificatie van geselecteerde doelen toestaan' in de knooppuntinstellingen voor blootstellingsacquisitie . Zodra de gebruiker tevreden is met de nauwkeurigheid van de targeting, schakelt u deze optie uit voor geautomatiseerde gegevensverzameling.
OPMERKING: Doelen in het knooppunt Belichtingsacquisitie met hoge vergroting worden meestal afgebeeld met behulp van een beam-tilt beeldverschuivingsstrategie, die even goed werkt voor zowel gekantelde als niet-gekantelde gegevensverzameling23,24,25,26. Voor een nauwkeurige CTF-schatting in downstream gegevensverwerkingsstappen moet de lens-coma aberratiekalibratie worden uitgevoerd voor de bundel-kantel beeldverschuivingsstrategie voor gegevensverzameling.
- Selecteer tijdens deze procedure 'Gebruikersverificatie van geselecteerde doelen toestaan' in de knooppuntinstellingen voor blootstellingsacquisitie . Zodra de gebruiker tevreden is met de nauwkeurigheid van de targeting, schakelt u deze optie uit voor geautomatiseerde gegevensverzameling.
3. Gegevensverwerking
- Start on-the-fly gegevensverwerking 10,27,28,29 met bewegingscorrectie van opgenomen films, CTF-schatting, deeltjesselectie en generatie van initiële reconstructies tijdens gegevensverzameling.
OPMERKING: Voor deze studie is cryoSPARC Live10 (zie materiaaltabel) gebruikt voor voorbewerking. On-the-fly gegevensverwerking biedt een eerste cryo-EM-reconstructie en een benadering voor de hoekverdeling, die de gebruiker kan informeren over de mate van resolutie-anisotropie. Deze kunnen op hun beurt worden gebruikt om de gebruiker te begeleiden of de kantelhoek die wordt gebruikt voor het verzamelen van gegevens voldoende hoog is. - Visualiseer de gereconstrueerde kaart en plot de Euler-hoekverdeling om de mate van voorkeursdeeltjesoriëntaties te meten.
OPMERKING: De Euler-hoekverdelingen kunnen direct worden omgezet in Fourier-ruimtebemonsteringsverdelingen om de potentiële mate van resolutie-anisotropie te bepalen. Een grafische gebruikersinterface (GUI) is ontwikkeld om de gebruiker te helpen bij het evalueren van de kwaliteit van een Euler-hoekverdeling en het bepalen van een optimale kantelhoek30,31. De tool kan worden verkregen uit de Github-repository, https://github.com/LyumkisLab/SamplingGui. - Pas indien nodig de kantelhoek van het podium aan waarbij gegevens worden verzameld om de effecten van voorkeursoriëntatie te ondervangen. De hoek kan worden vergroot als de voorkeursoriëntatie een probleem blijft, zoals blijkt uit de kaart en de Euler-verdeling in 3.2. Als alternatief kan de gebruiker de gegevensverzameling in groepen splitsen en opnemen met behulp van verschillende kantelhoeken, zoals 20 °, 30 ° en 40 °.
OPMERKING: Hoewel de meeste TEM's de mogelijkheid moeten hebben om het podium tot 70 ° te kantelen, variëren de gebruikelijke kantelingen van het monsterstadium (die we hebben gebruikt) van 20 ° -40 °.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DPS bij 0,3 mg/ml werd gebruikt om beeldvorming bij 0°, 30° en 60° kanteling te demonstreren. Gegevens van verschillende kantelhoeken werden verzameld op hetzelfde raster in verschillende rastergebieden. CTF-resolutie past bij hogere hoekkantelingen zijn meestal slechter, zoals het geval was bij het vergelijken van de drie datasets in deze studie. Figuur 4 toont vergelijkende representatieve beelden en 2D-classificatiegemiddelden. Hoewel de eiwitconcentratie onveranderd is over de verschillende kantelhoeken, zorgt een hogere kantelhoek ervoor dat het afgebeelde gebied drukker lijkt in termen van deeltjesconcentratie. Dit kan problematisch zijn voor gegevensverwerking omdat deeltjesoverlapping 3D-reconstructies en hoekverfijningen kan bemoeilijken. Iteratieve 2D-classificatie produceerde routinematig een schone stapel deeltjes met de 0 ° en 30 ° gekantelde datasets, terwijl de 60 ° -dataset zorgvuldige reiniging van de deeltjesstapels vereiste om ervoor te zorgen dat klassegemiddelden minimale overlap vertonen voor aangrenzende deeltjes. Het klassegemiddelde uit figuur 4C in het rode vak is een voorbeeld van deeltjesoverlapping. Hoewel het opnieuw centreren tijdens de classificatie ertoe kan leiden dat het signaal van naburige deeltjes gemiddeld wordt, kan aanzienlijke deeltjesoverlapping de nauwkeurigheid van deeltjesuitlijningsparameters in gevaar brengen, wat reconstructies oplevert die worden gekenmerkt door een lagere resolutie. De beste oplossing om deeltjesoverlapping te voorkomen, is het vooraf screenen van rasters met een optimale ijsdikte en deeltjesverdeling. Een uitgebreid kwantitatief overzicht van de statistieken om verbeteringen van gekantelde gegevensverzameling te evalueren, wordt elders beschreven32.
Figuur 1: Overzicht van de voordelen en uitdagingen van gekantelde dataverzameling. Het bovenste paneel toont een close-up van een rastergat. Rasterstaven zijn in goud, glasachtig ijsblauw en macromoleculaire deeltjes rood. Pijlen geven de richting van de elektronenbundel aan. Het onderste paneel vertegenwoordigt een verzameling gaten met hetzelfde kleurenschema als in het bovenste paneel. De zwarte ster vertegenwoordigt het fijne focusdoel voorafgaand aan de belichting van het beeldvergroting bij hoge vergroting. De kantelhoek wordt aangegeven als 'α'. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Workflowdiagram waarin de strategie voor het verzamelen van niet-gekantelde en gekantelde gegevens wordt vergeleken. Stapsgewijze vergelijking van niet-gekantelde en gekantelde gegevensverzameling toont de extra stap van het handmatig schatten van de eucentrische hoogte en het opnieuw centreren voor elk gekanteld vierkant (2 en 3 voor gekantelde gegevensverzameling). De rest van de workflow is vergelijkbaar tussen de twee strategieën. Deze omvatten het selecteren van een geschikt vierkant voor beeldvorming (1 voor gekantelde en niet-gekantelde gegevensverzameling), het initiëren van een wachtrijschema door een vierkant te kiezen voor beeldvorming (aangeduid als simuleren; 2 en 4 voor respectievelijk niet-gekantelde en gekantelde gegevensverzameling), het bieden van een eucentrisch hoogtefocusdoel en wachtrijgatvergrotingsacquisitiedoelen (3 en 5 voor niet-gekantelde en gekantelde gegevensverzameling, respectievelijk). en ten slotte het indienen van de wachtrij met geselecteerde blootstellingsdoelen met hoge vergroting (4 en 6 voor respectievelijk niet-gekantelde en gekantelde gegevensverzameling). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve afbeeldingen van het raster bij vierkante vergroting met verschillende kantelhoeken. Beelden die dichtbij en ver van de eucentrische Z-hoogte zijn verzameld, worden respectievelijk op het boven- en onderpaneel weergegeven. De optische as van de bundel wordt aangegeven door het midden van de rode concentrische ringen. De groene pijl geeft het vierkant van belang aan. Er is een gebroken rasterfunctie naast het vierkant van belang ter referentie. Het diafragma van het objectief is verwijderd voor een gemakkelijke weergave. Schaalbalk = 20 μM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve gatblootstellingen en 2D-klassegemiddelden verzameld onder verschillende kantelhoeken. De panelen (A), (B) en (C) hebben betrekking op beeldvorming die wordt uitgevoerd met het monsterstadium niet gekanteld op 0° of gekanteld tot 30° en 60°. 2D-klassegemiddelden die worden beïnvloed door overbevolking worden weergegeven in het rode vak in (C). Schaalbalk = 100 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De voorkeursoriëntatie van deeltjes veroorzaakt door de hechting van het monster aan de lucht-waterinterface is een van de laatste grote knelpunten voor routinematige structuurbepaling met hoge resolutie met behulp van cryo-EM SPA 4,5,6. Het hier gepresenteerde schema voor gegevensverzameling biedt een eenvoudig te implementeren strategie voor het verbeteren van de oriëntatieverdeling van deeltjes binnen een dataset. We merken op dat het protocol geen extra apparatuur of software vereist en geen invloed heeft op de snelheid van het verzamelen van gegevens. De volgende overwegingen zijn belangrijk bij het verzamelen van gegevens voor gekantelde exemplaren.
Ten eerste moet het afgebeelde vierkant zich op eucentrische hoogte bevinden voor optimale targeting. De eucentrische hoogte wordt aangepast door tilt-pair-beelden op te nemen in kleine hellingshoeken (meestal 0,5 ° -2 °) en de focus te identificeren op basis van een vooraf gedefinieerde relatie tussen beeldverschuiving en onscherpte. Als het beoogde vierkant een grote aanpassing in eucentrische hoogte vereist, zal dit resulteren in een significante beeldverschuiving van het vierkante beeld, zodat wanneer het podium opnieuw wordt gekanteld, het gezichtsveld kan worden geblokkeerd door het objectiefopening.
Ten tweede wordt het normaal cirkelvormige gat steeds langer langwerpig met hogere kantelingen bij gemiddelde vergroting (Hole Acquisition Node vergroting). Bij gebrek aan nauwkeurige beeldverschuivingskalibraties is het mogelijk dat een deel van de folie wordt afgebeeld samen met deeltjes die zijn ingebed in glasachtig ijs voor een bepaalde belichtingsvergroting. Daarom moeten de image-shift kalibraties idealiter nauwkeurig zijn. Een alternatief is om de vergroting zodanig te vergroten dat het afgebeelde gebied ten opzichte van de gatgrootte afneemt. Bij een hogere vergroting zouden fouten in door bundelkanteling geïnduceerde beeldverschuiving een kleiner effect hebben op het vermogen van een gebruiker om naar een gebied met glasachtig ijs te navigeren. Dit gaat echter ten koste van het verminderen van het aantal deeltjes in de resulterende micrografieën, evenredig met een toename van de vergroting.
Ten derde heeft autofocus een grotere kans om te falen voor gekantelde gegevensverzameling als gevolg van verhoogde door de bundel geïnduceerde beweging en een grotere monsterdikte. Het bereiken van nauwkeurige scherpstelling kan dus af en toe enkele uitdagingen opleveren voor gekantelde gegevensverzameling, vooral als het focusdoel de goudfolie in het midden van vier gaten is, wat standaardpraktijk is voor niet-gekantelde gegevensverzameling. In het geval van frequente fouten bij het schatten van de focus, is een alternatief om de rand van een gat in te stellen als het focusdoel. Dit moet een voldoende signaal opleveren voor een nauwkeurige fasecorrelatie tussen door bundelkanteling geïnduceerde beeldparen en daaropvolgende focusaanpassing. In onze ervaring resulteert scherpstellen op de rand van een gat zelden in autofocusfalen.
En ten slotte, wanneer afbeeldingen met een hoge vergroting ver van het rastercentrum worden geselecteerd, kan het verschil in focus tussen gerichte afbeeldingen aan weerszijden van de kantelas aanzienlijk zijn. De grootte van dit verschil is afhankelijk van de kantelhoek en de afstand tot het scherpstelpunt. Bijvoorbeeld, bij een kantelhoek van 30°, hebben twee doelen die 6 μm uit elkaar liggen op het oppervlak van het raster en precies loodrecht op de kantelas zijn geselecteerd, een verschil van 3 μm in onscherpte tussen hen (de relatie is: delta defocus = sin (kantelhoek) * (afstand van kantelas)). Doelen die langs de kantelas worden geselecteerd, hebben dezelfde onscherpte, terwijl andere ergens tussenin vallen. Als de kantelas tijdens de kalibratie in Leginon wordt gedefinieerd, compenseert de software automatisch de verandering in onscherpte. Gebruikers moeten zich er echter van bewust zijn dat de mogelijkheid van grotere focusgradiënten tijdens beeldvorming met hoge vergroting toch bestaat. Grote focusgradiënten zouden de uiteindelijke reconstructie minimaal moeten beïnvloeden33, maar het kan nodig zijn om grotere doosformaten te gebruiken tijdens de gegevensverwerking om aliasing-effecten te voorkomen. Onder deze omstandigheden kan het gebruik van een smaller onscherptebereik tijdens gegevensverzameling gerechtvaardigd zijn, en randomisatie van onscherpte komt vanzelf door het stadium te kantelen. Aanpassingen van de onscherpte per deeltje tijdens de gegevensverwerking kunnen de resoluties van definitieve reconstructies verbeteren. Omdat nauwkeurige modellering van CTF-pasvormen echter een uitdaging kan zijn voor hoge trap-kantelhoeken, moet ervoor worden gezorgd dat de kwaliteit van de gegevens wordt bewaakt en dat de CTF-pasvormen tijdens de belichtingscuratie passen. Over het algemeen resulteert een suboptimale ijsdikte in een slechtere nauwkeurigheid bij het modelleren van CTF-schattingen. Daarom moet worden gezorgd voor afbeeldingen in gebieden waar het ijs dun is, ervan uitgaande dat de deeltjesverdeling in deze gebieden voldoende goed is.
Een verbeterde en meer uniforme oriëntatieverdeling leidt tot een overeenkomstige verbetering van de richtingsresolutie van de gereconstrueerde cryo-EM-kaarten. Bovendien verbetert een meer uniforme oriëntatieverdeling de bemonsteringscompensatiefactor, die rechtstreeks verband houdt met de globale resolutie30,31. Het collectief verbeteren van de oriëntatieverdeling zou dus de nauwkeurigheid van atomaire modellering en verfijning moeten verbeteren 9,30,31. Dit zou in principe een sterk argument zijn voor routinematige implementatie van gekantelde gegevensverzameling. Er zijn echter verschillende kanttekeningen waar de gebruiker zich bewust van moet zijn. Ten eerste kunnen de verhoogde focusgradiënt en ijsdikte van invloed zijn op de algehele globale resolutie, vermoedelijk als gevolg van een combinatie van verhoogde achtergrondruis en verhoogde door de bundel geïnduceerde beweging, gecombineerd met andere indirecte problemen die zich als gevolg daarvan voordoen17. Dit effect zal naar verwachting meer uitgesproken zijn in gevallen waarin het ijs inherent dikker is. Aangezien de meeste steekproeven echter een zekere mate van voorkeursoriëntatie hebben, wat op zijn beurt kan leiden tot niet-uniformiteit van de steekproef, kan gekantelde gegevensverzameling over het algemeen gunstig zijn zolang de schadelijke effecten worden geminimaliseerd of beperkt. Ten tweede kan het nodig zijn om het podium zo hoog als 60 ° te kantelen voor sommige monsters die worden gekenmerkt door een ernstige voorkeursoriëntatie. Anekdotisch ongepubliceerd bewijs uit ons werk en de rapporten van collega's suggereert dat zelfs ~ 40 ° kantelingen onvoldoende zijn om resolutie-anisotropie voor sommige exemplaren te overwinnen. Er wordt gewerkt aan het identificeren van een optimale kantelhoek voor een reeks verdelingen, gebaseerd op de ideeën die zijn uiteengezet in Baldwin et al.31. Ten slotte moet worden opgemerkt dat, in principe, een reconstructie van een monster dat wordt gekenmerkt door een perfect pathologische enkele voorkeursoriëntatie nog steeds een 30 ° ontbrekende kegel zou hebben, zelfs wanneer de gegevens worden verzameld in een kantelhoek van 60 °. In gesimuleerde experimenten is het onwaarschijnlijk dat een 30° ontbrekende kegel de experimentele interpretaties sterk beïnvloedt. Een kanteling van 60° is waarschijnlijk voldoende voor zelfs de meest pathologisch bij voorkeur georiënteerde exemplaren. In gevallen waarin het stadium mogelijk met maar liefst 60 ° moet worden gekanteld, moet de concentratie van deeltjes in het gezichtsveld echter zorgvuldig worden geoptimaliseerd, omdat deeltjesoverlapping de gegevensverwerking zal bemoeilijken. Het is niet mogelijk om te kantelen tot meer dan 60° (of 70° op bepaalde microscoopfasen) op standaard TEM's, vanwege beperkingen van het ontwerp van de monsterfase. In dergelijke gevallen kan aanvullende optimalisatie met additieven en biochemie van monsters nodig zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken Bill Anderson, Charles Bowman en Jean-Christophe Ducom (TSRI) voor hun hulp bij microscopie, Leginon-installaties en infrastructuur voor gegevensoverdracht. We bedanken ook Gordon Louie (Salk Institute) en Yong Zi Tan (National University of Singapore) voor het kritisch lezen van het manuscript. We danken Chris Russo (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge) voor het verstrekken van het plasmide voor expressie van DPS. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Amerikaanse National Institutes of Health (U54AI150472, U54 AI170855 en R01AI136680 aan DL), de National Science Foundation (NSF MCB-2048095 aan DL), de Hearst Foundations (aan DL) en Arthur en Julie Woodrow Chair (aan J. P. N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryosparc Live v3.1.0+210216 | Structura Biotechnology | ||
| DPS protein | Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098. | ||
| K2 Summit Direct Electron Detector | Gatan | ||
| Leginon software suite | C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60. | ||
| Manual plunging device | Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids | ||
| Talos Arctica | FEI/Thermo Fisher | ||
| UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids | Quantifoil | N1-A14nAu30-01 |
References
- Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, 00461 (2013).
- Li, X. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Chua, E. Y. D., et al. cheaper: recent advances in cryo-electron microscopy. Annual Review of Biochemistry. , (2022).
- Lyumkis, D. Challenges and opportunities in cryo-EM single-particle analysis. Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).
- Wu, M., Lander, G. C. Present and emerging methodologies in Cryo-EM single-particle analysis. Biophysical Journal. 119 (7), 1281-1289 (2020).
- Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. Elife. 7, 34257 (2018).
- Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting. Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Potter, C. S., et al. Leginon: a system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
- Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
- NYSBC.org Homepage. , Available from: https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Homepage (2022).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy. Science. 346, 1377-1380 (2014).
- Russo, C. J., Henderson, R.
- Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (180), e62765 (2022).
- Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
- Naydenova, K., Peet Mathew, J., Russo Christopher J, J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (24), 11718-11724 (2019).
- Naydenova, K., et al. CryoEM at 100 keV: a demonstration and prospects. IUCrJ. 6 (6), 1086-1098 (2019).
- Herzik, M. A. cryoEM: Methods and Protocols. Gonen, T., Nannenga, B. L. , Springer US. 125-144 (2021).
- Cash, J. N., Kearns, S., Li, Y., Cianfrocco, M. A. High-resolution cryo-EM using beam-image shift at 200 keV. IUCrJ. 7 (6), 1179-1187 (2020).
- Peck, J. V., Fay, J. F., Strauss, J. D. High-speed high-resolution data collection on a 200 keV cryo-TEM. IUCrJ. 9 (2), 243-252 (2022).
- Bouvette, J., et al. Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography. Nature Communications. 12 (1), 1957 (1957).
- Cheng, A., et al. High resolution single particle cryo-electron microscopy using beam-image shift. Journal of Structural Biology. 204 (2), 270-275 (2018).
- Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
- Structura Biotechnology Inc. , Available from: https://cryosparc.com/live (2022).
- DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).
- Baldwin, P. R., Lyumkis, D. Non-uniformity of projection distributions attenuates resolution in Cryo-EM. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 150, 160-183 (2020).
- Baldwin, P. R., Lyumkis, D. Tools for visualizing and analyzing Fourier space sampling in Cryo-EM. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 160, 53-65 (2021).
- Aiyer, S., Zhang, C., Baldwin, P. R., Lyumkis, D. cryoEM: Methods and Protocols. Gonen, T., Nannenga, B. L. , Springer US. 161-187 (2021).
- Glaeser, R. M., et al.
