Summary
ovoエレクトロポレーションを用いて、ニワトリ胚の聴覚内耳と蝸牛核を選択的にトランスフェクションし、回路アセンブリの離散期に脆弱X精神遅滞タンパク質の細胞群特異的ノックダウンを達成する方法を考案しました。
Abstract
脆弱X精神遅滞タンパク質(FMRP)は、局所タンパク質翻訳を調節するmRNA結合タンパク質です。FMRPの喪失または機能障害は、知的障害、感覚異常、および社会的コミュニケーションの問題を特徴とする脆弱X症候群(FXS)において、異常なニューロンおよびシナプス活動につながります。FMRP機能とFXSの病因の研究は、主にトランスジェニック動物における Fmr1 (FMRPをコードする遺伝子)ノックアウトで行われています。ここでは、ニワトリ胚を用いた回路形成期およびシナプス形成期におけるFMRPの細胞自律機能を決定するための in vivo 法について報告する。この方法は、 Fmr1 低分子ヘアピンRNA(shRNA)とEGFPレポーターを含む薬物誘導性ベクターシステムのステージ、部位、および方向特異的エレクトロポレーションを使用します。この方法では、聴神経節(AG)とその脳幹標的の1つであるマグノセルラリス核(NM)で選択的なFMRPノックダウンを達成し、AG-NM回路内で成分特異的な操作を提供しました。さらに、トランスフェクションのモザイクパターンにより、動物内コントロールや隣接するニューロン/ファイバーの比較が可能になり、データ解析の信頼性と感度が向上します。誘導ベクターシステムは、遺伝子編集開始の時間的制御を提供し、蓄積された発生効果を最小限に抑えます。これらの戦略の組み合わせは、シナプスおよび回路発生におけるFMRPの細胞自律機能を解剖するための革新的なツールを提供します。
Introduction
脆弱X症候群(FXS)は、知的障害、感覚異常、自閉症行動を特徴とする神経発達障害です。ほとんどの場合、FXSは、初期胚期1から始まる脆弱なX精神遅滞タンパク質(FMRP;Fmr1遺伝子によってコードされる)の全体的な喪失によって引き起こされます。FMRPはRNA結合タンパク質であり、通常、脳内のほとんどのニューロンおよびグリア細胞、ならびに感覚器官において発現される2,3,4。哺乳類の脳では、FMRPは、さまざまな神経活動に重要なタンパク質をコードする数百のmRNAに関連している可能性があります5。従来のFmr1ノックアウト動物の研究は、FMRP発現がシナプス神経伝達の集合および可塑性にとって特に重要であることを示した6。いくつかの条件付きおよびモザイクノックアウトモデルは、軸索投影、樹状突起パターニング、およびシナプス可塑性を含むいくつかの発生イベント中に、FMRPアクションおよびシグナルが脳領域、細胞型、およびシナプス部位間で異なることをさらに示しています7,8,9,10,11,12,13,14 .シナプス伝達の調節におけるFMRPの急性機能は、脳スライスまたは培養ニューロンにおける阻害性FMRP抗体またはFMRP自体の細胞内送達によって研究された15、16、17、18。ただし、これらの方法では、開発中にFMRPの誤発現が引き起こす結果を追跡する機能はありません。したがって、FMRPの細胞自律機能を調査するためのin vivoメソッドの開発は非常に必要であり、FXS患者で報告された異常が関連するニューロンおよび回路におけるFMRP喪失の直接的な結果であるか、または開発中のネットワーク全体の変化に由来する二次的な結果であるかを決定するのに役立つと期待されています19。
ニワトリ胚の聴覚脳幹は、回路およびシナプスの発生におけるFMRP調節の詳細な機能解析のための独自の有利なモデルを提供します。ニワトリの胚の脳に簡単にアクセスできることと、遺伝子操作のための確立された卵エレクトロポレーション技術は、初期の胚期における脳の発達の理解に大きく貢献しています。最近発表された研究では、この技術は、FMRPの誤発現の時間的制御を可能にする高度な分子ツールと組み合わされました20,21。ここでは、シナプス前ニューロンとシナプス後ニューロンの選択的操作を別々に誘導する方法論が進められています。この方法は、聴覚脳幹回路で開発されました。音響信号は、聴覚内耳の有毛細胞によって検出され、聴覚神経節(AG、哺乳類ではらせん神経節とも呼ばれます)に伝達されます。AGの双極性ニューロンは、末梢突起で有毛細胞を神経支配し、次に中枢投影(聴神経)を脳幹に送り、そこで2つの一次蝸牛核、マグノセルラリス核(NM)と角核(NA)で終わります。NMのニューロンは、構造的および機能的に、哺乳類の前腹側蝸牛核の球状のふさふさした細胞に匹敵します。NM内では、聴神経線維(ANF)は、Held端子22の大きな終末球を介してNMニューロンの体細胞上にシナプスする。発生中、NMニューロンは後脳23の菱形5および6(r5/6)から生じ、AGニューロンは耳嚢胞24に存在する神経芽細胞に由来する。ここでは、シナプス前AGニューロンとシナプス後NMニューロンにおけるFMRP発現を選択的にノックダウンする手順を別々に記載する。
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Protocol
卵と鶏の胚は、済南大学動物管理使用委員会によって承認された動物プロトコルに従って、注意と敬意を持って取り扱われました。
1.卵とプラスミドの調製
- 卵の準備
- 華南農業大学から新鮮な受精鶏卵(Gallus gallus)を入手し、孵卵前に16°Cで保存します。最適な生存率のために、到着後1週間以内にすべての卵を孵卵のために設定してください。
- 卵を水平に置き、神経管トランスフェクションの場合はハンバーガーとハミルトン(HH)のステージ1225 まで、耳嚢胞トランスフェクションの場合はHH13まで54〜56時間、38°Cで46〜48時間インキュベートします。卵の動物の棒は植物の棒よりも軽いので、水平に配置すると、操作が簡単になるように胚が卵の上に配置されます。この手順とそれに続くすべての手順で卵を水平に保つように注意してください。
- 胚の位置は、懐中電灯を使用して卵の底から光を当てると、卵殻の暗い領域として表示されます。目的のHH段階で、この懐中電灯法を使用して、卵殻上の胚の位置を鉛筆でマークします。
- 75%エタノールを含むガーゼで卵を拭きます。はさみの先端を使用して卵の先のとがった端に穴を開け、18 Gの針注射器で2 mLのアルブミンを取り除きます。穴が針を挿入できるのに十分な大きさであることを確認してください。漏れているアルブミンをガーゼで拭き取り、透明なテープで穴を塞ぎます。
- 亀裂を最小限に抑え、窓際の殻の破片の落下を防ぐために、鉛筆でマークされた暗い領域を中心に、卵の上部を透明なテープで覆います。
- プラスミドDNA抽出
- クローンニワトリ Fmr1 shRNAは、前述の20に記載のトランスポゾンベースのテトオンシステムを用いた。このシステムは、pCAGGS-T2TP、pT2K-CAGGS-rtTA-M2、およびpT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNAの3つのプラスミドを含み、トランスフェクション後に Fmr1 shRNAおよびEGFPの発現がサイレンシングされ、ドキシサイクリン(Dox)誘導によってオンにできる薬物誘導性ベクターシステムを提供します。
注:これらのプラスミドは現在、リポジトリで利用できません。著者らは、合理的な要求に応じてプラスミドを提供することに同意します。 - 製造元の指示に従ってエンドトキシンフリー調製キットを使用してプラスミドDNAを抽出し、1/15容量の7.5 M酢酸ナトリウムと1容量の100%イソプロパノールを加えて沈殿させます。
- プラスミドを-20°Cで一晩沈殿させ、13,000 x g で10分間遠心分離します。キットに付属のTris-EDTAバッファーでペレットを最終濃度4〜5 μg/μLに溶解します。 プラスミドは、トランスフェクション効率を低下させることなく、-20°Cで12ヶ月間保存できます。
- エレクトロポレーション当日、ピペットチップを用いて滅菌遠沈管内で各プラスミド2 μLを十分に混合します。得られた6μL容量のプラスミド混合物は、3ダースの卵をエレクトロポレーションするのに十分である。エレクトロポレーション中にプラスミドを可視化しやすくするために、DNA混合物26 μLごとに1 μLの0.1%ファストグリーン(滅菌ddH2Oで調製)を加えると、プラスミド混合物が青色になります。
- クローンニワトリ Fmr1 shRNAは、前述の20に記載のトランスポゾンベースのテトオンシステムを用いた。このシステムは、pCAGGS-T2TP、pT2K-CAGGS-rtTA-M2、およびpT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNAの3つのプラスミドを含み、トランスフェクション後に Fmr1 shRNAおよびEGFPの発現がサイレンシングされ、ドキシサイクリン(Dox)誘導によってオンにできる薬物誘導性ベクターシステムを提供します。
2. ovo エレクトロポレーション
- 卵窓と胚の識別
- エレクトロポレーションの日に、一度に1ダースの卵をインキュベーターから取り出します。卵をインキュベーターから1時間以上遠ざけると、発達上の変動が生じ、生存率が低下します。
- 75%エタノールを含むガーゼですべての手術器具を拭きます。
- 各卵をカスタムメイドのフォームホルダーに入れます。テープで覆われた領域を75%エタノールで拭き、小さなはさみを使用して鉛筆マークの周囲に窓(1〜2 cm2)を切ります(図1A)。切るときは、下の胚を傷つけないようにハサミを平らに持ってください。
- 窓付きの卵を10倍接眼レンズと2倍ズームを備えた実体顕微鏡の下に置き、胚を特定します。光源の角度と明るさを調整して、見やすくします。
注:この段階で胚を視覚化し、神経管を特定するには、練習と経験が必要です。- 初心者の場合は、胚の識別を容易にするために、次のオプションのインクインジェクションを使用します。0.01 Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS)とオートクレーブで10%インドのインク溶液を事前に調製します。1 mLシリンジにインク溶液を満たし、27Gの針をはめ込みます。鉗子で針を45°の角度に曲げます。
- 顕微鏡下で、領域オパカの端から慎重に突いて、胚の下に針を挿入します。~50 μLのインクを注入すると、胚の可視化のために透明領域の下に拡散します。インクは、胚を明確に視覚化するために暗い背景を形成します。
注意: 挿入および注入する前に、シリンジから空気を排出してください。視覚化に長けている場合は、生存率を低下させるため、インク注入ステップを避けてください。
- 神経管注入とエレクトロポレーション
注:この手順は、脳幹のNMニューロンをトランスフェクションするためにHH12で実行されます。- ピペットプーラーを使用して、ガラスキャピラリー(直径~1 mm、長さ100 mm)をピペットに引き込みます。解剖顕微鏡下で、毛細血管針の先端を鉗子で直径10〜20μmまで慎重に開きます。ピペット(通常は一度に5〜10個)は、使用するまで収納ボックスに保管してください。
- キャピラリーピペットの端にあるゴムチューブを通して負圧を適用することにより、0.5〜1 μLのプラスミド混合物をキャピラリーピペットに充填します。これは、シリンジまたはエアポンプによって達成することができる。
- 胚が尾を近づけて垂直に向けられるように(または3軸マニピュレーターを使用してキャピラリーピペットを注入する場合は水平になるように)卵を顕微鏡の下に置きます。キャピラリーピペットを片手または3軸マニピュレーターで持ち、ピペットの先端をr5/6に尾から頭の方向に駆動します。
注:最も前後脳領域はr1であり、神経管に沿った後続の各膨らみは個々の菱形です。R5/6は耳嚢胞と同じ前後レベルにあり、耳嚢胞は容易に認識できるカップ状の構造です(図1B-C)。 - 先端を卵子膜を通して背側神経管にそっと突っ込み、次にピペットを少し引き出して、先端が神経管の内腔に入るようにします。着色されたプラスミドがr5/6に完全に拡散し、r3およびr4に伸びるまで空気圧を加えてプラスミド混合物を注入します。
注:注射のために卵子膜にスロットを作る必要はありません。 - 青色プラスミド溶液が漏れずに神経管を急速に拡散したときに達成される注射が成功したことを確認します(図1B-C)。漏れが発生すると、青はすぐに消えます。
- 注入直後に、神経管の両側に白金バイポーラ電極を配置します(図1D)。エレクトロポレーターで12Vと50msの持続時間の2つのパルスを供給します。バイポーラ電極の端に気泡があり、マイナス側に気泡があるのを観察します。
- 着色されたプラスミド混合物が電極の正極側近くの神経管組織に入ったときに達成されるエレクトロポレーションの成功を確認します。エレクトロポレーション後、バイポーラ電極を慎重に取り外します。
- 卵殻の窓を、正方形に2つに事前にカットし、75%エタノールをスプレーした透明なフィルムで覆います。卵をインキュベーターに戻します。
- 次の卵に進む前に、生理食塩水中で12 Vおよび50 ms持続時間の10〜20パルスを供給して、バイポーラ電極を洗浄します。
- 耳嚢胞注射とエレクトロポレーション
注:この手順は、内耳の有毛細胞とAGニューロンをトランスフェクションするためにHH13で実行されます。- HH13(~胚の2.5日目)では、胚は頭の右側が上を向くように向きを変えています。顕微鏡下で、尾をあなたの近くにして、胚が垂直になるように卵を置きます。キャピラリーピペットを持ち、右耳鼻咽喉科を背外側方向にそっと突っ込みます(図2A)。
注:この段階では、耳嚢胞はr5 / 6と同じ前後レベルで体の上部に小さな円形の構造として現れます。 - 耳嚢胞が青色溶液27で満たされるまで、プラスミド混合物を空気圧で注入する。青色プラスミド混合物が耳嚢胞内に閉じ込められ、漏れないときに達成される注射が成功したことを確認します。
- 注入直後に、 図2Bに示すように、バイポーラ電極を耳嚢胞上に置きます。プラス側とマイナス側をそれぞれ耳嚢胞の前方と後方に配置します。エレクトロポレーターで12Vと50msの持続時間の2つのパルスを供給します。
- 青色プラスミド混合物が電極の正極側近くの耳嚢胞の組織に入ったときに達成されるエレクトロポレーションの成功を確認します。エレクトロポレーション後、バイポーラ電極を慎重に取り外します。卵殻の窓を透明なフィルムで覆い、卵をインキュベーターに戻します。
- HH13(~胚の2.5日目)では、胚は頭の右側が上を向くように向きを変えています。顕微鏡下で、尾をあなたの近くにして、胚が垂直になるように卵を置きます。キャピラリーピペットを持ち、右耳鼻咽喉科を背外側方向にそっと突っ込みます(図2A)。
3.プラスミド転写を開始および維持するためのDoxの投与
- Dox溶液の調製
- 化学フードの下で100 mgのDox粉末を測定し、100 mLの滅菌PBSに溶解して1 mg / mLの作業溶液を作ります。溶液を0.22 μmフィルターでろ過し、1 mLアリコートを-20°Cで保存します。 光から保護する20,28。
- ドックスの管理
- 全強度の遺伝子編集のために、希望年齢の24時間前に、氷上でDoxアリコートを解凍します。透明フィルムを貫通する注射器を使用して、卵の絨毛尿膜に直接50μLのDoxを滴下します。注入後、針穴を透明なフィルムまたはテープで密封します。
- ノックダウン効果を維持するには、目的の発達段階で組織が採取されるまで、一日おきにDoxを投与します。.
4.組織解剖と切片作成
- 脳幹
- 胚期3(E3)およびE6の胚の場合は、卵殻を開き、関連する膜をハサミで切ります。胚をスプーンで取り出し、0.1 Mリン酸緩衝液中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)に浸します。
- E9胚の場合は、卵殻を開き、ハサミで胚を断頭し、PBSで満たされたシリコン底プレートに頭を移します。頭を軌道に固定し、頭蓋骨の上部を切り裂きます。鉗子を両側から脳の下に慎重に置き、鉗子の肩で脳全体を頭蓋骨から持ち上げます。脳を4%PFAに浸します。
- E15およびE19胚の場合は、卵殻を開き、ハサミで胚を断頭し、PBSで満たされたシリコン底プレートに頭を置きます。頭蓋骨を露出させるために頭の上の皮膚を切り開きます。
- かみそりで頭蓋骨を垂直に切開し、前脳と尾脳を分離します。尾ブロックをPBSに浸し、頭蓋骨の上部を取り外してから、頭蓋骨から脳を取り除きます。
- 視葉を通して脳を固定し、小脳と脳幹を分離します。小脳の真下にある聴覚脳幹を傷つけないように注意してください。脳幹からできるだけ多くの硬膜を取り除き、4%PFAに浸します。
- 胚と脳組織は、同じ条件下で24時間保持する必要があるE19脳幹を除いて、4°Cで4%PFAで一晩保持します。
- 固定後、30%スクロースを含むPBSで組織を落ち着くまで脱水しますが、年齢にもよりますが、通常は1〜3日かかります。
- 脳幹(E15およびE19)を摺動ミクロトームを用いて冠状面で30μmで切片化する。切片をPBSに採取し、免疫染色前に4°Cで保存してください。
- E3およびE6胚およびE9脳幹の場合、横方向に50μmで切片化します。切片をPBSに集め、4°Cで保存します。 免疫染色の前に、ゼラチンコーティングされた顕微鏡スライドに切片を取り付けます。これらの年齢のためにより厚い切片を集めることは、組織の取り扱いを容易にします。
- 耳管
- E9、E15、およびE19胚から脳幹を取り除いた後、側頭骨に埋め込まれている聴覚管は頭蓋骨の下に横たわっていることを容易に識別でき、側頭骨は周囲の頭蓋骨から容易に分離できます。E9胚の場合は、側頭骨全体を4%PFAで固定します。古い胚の場合は、側頭骨の骨構造を取り除き、耳管を隔離し、聴覚管を4%PFAに固定します。
- 組織を包埋する前に、すべての側頭骨と聴覚管を4%PFAで4°Cで一晩保持します。
- 説明されているように組織包埋を実行します。次のように包埋溶液を調製します:ゼラチン顆粒が膨潤して落ち着くまで(約30分)冷水に10%ゼラチン(牛の皮膚から)を浸します。混合物を~50°Cに加熱してゼラチンを溶解し、ゼラチン溶液に20%スクロースを加えて攪拌して溶解させる。ゼラチン-ショ糖溶液を4°Cで最大1か月間保存します。
- 使用のために、ゼラチン - スクロース溶液を37°Cで温める。 側頭骨/耳管を96ウェルプレート上の温かいゼラチン-スクロース溶液に37°Cで、落ち着くまで(通常は30〜60分)浸します。
- 12ウェルプレートのウェルの底部を透明フィルムのストリップで裏打ちします。温かいゼラチン-スクロース溶液の層を追加し、固まるまで待ちます。側頭骨/耳管を各ウェルに移します。
- 温かいゼラチン - スクロース溶液の第2層で組織を移植する。組織がゲルの中心にあり、耳管が水平になるように組織の位置を調整します。プレートを慎重に4°Cの冷蔵庫に移動し、ゲルが固まるまで待ちます。
- 透明フィルムストリップを引き出して、ゲル組織ブロックをウェルから移動します。余分なゲルを正方形のブロックにトリミングし、ブロックの角を切り取って向きを特定します。ゼラチンブロックをホイルで包み、ドライアイスで凍結し、切片化まで-80°Cで保管します。
- クライオスタットで聴覚管の経度に沿って20μmでブロックを切断します。切片をゼラチンコーティングされた顕微鏡スライドに直接取り付けます。免疫染色の前にスライドを-80°Cで保存してください。
- 免疫染色の前に、スライドを予熱したPBS(45°C)に5分間浸してゼラチンを溶解し、次にスライドを室温PBSで3回洗浄して残留ゼラチンを除去します。
5. 免疫染色と顕微鏡イメージング
注:切片をスライドにマウントするか、PBSでフリーフローティングするかに応じて、2種類の免疫染色が行われます。
- スライド上の免疫染色
- スライドをPBSでそれぞれ10分間3回洗浄します。切片を含む部分をオイルペンで丸で囲み、染色時の液漏れを防ぎます。PBS中の5%正常ヤギ血清を含むブロッキング溶液で切片を覆い、室温で30分間インキュベートします。
- 一次抗体(使用する最終濃度については、材料の表を参照)を0.3%TritonX-100および5%正常ヤギ血清を含むPBSで希釈します。.ブロッキング溶液を除去し、切片を一次抗体溶液で覆います。底部に蒸留水の層が入った箱の中でスライドを4°Cで一晩インキュベートします。
- スライドをPBSで10分間3回すすぎます。0.3% TritonX-100を含むPBSで1:500に希釈した蛍光二次抗体をスライドに塗布します。スライドを室温で4時間インキュベートし、光から遮蔽する。
- スライドをPBSで3回洗浄します。スライドに2滴の封入剤をそっと落とし、カバーガラスでセクションを覆います。カバーガラスとスライドの間に気泡が発生しないように注意してください。
- ホールマウント胚およびフリーフローティング切片の免疫染色
- 胚/切片をPBS 3xでウェルプレートでそれぞれ10分間洗浄します。0.3%TritonX-100および5%正常ヤギ血清を含むPBSで一次抗体を遠心チューブで希釈します。各胚/切片をガラスフック付きのチューブに移し、シェーカーで60rpm、4°Cで一晩インキュベートします。
- 胚/切片をPBSで3回、ウェルプレートでそれぞれ10分間洗浄します。各胚/切片を蛍光二次抗体溶液で満たされた暗所の遠心チューブに移し、シェーカー上で室温で4時間インキュベートします。
- ウェルプレートでPBSで胚/切片を3回洗浄します。ブラシを使用して、PBSを含む15cmの皿にゼラチンコーティングされた顕微鏡スライドに切片を取り付けます。スライドがわずかに(~5分)乾いたら、封入剤を2滴塗布し、カバーガラスを置きます。カバーガラスとスライドの間に気泡が発生しないように注意してください。イメージングのためにマウント組織全体をPBSに保管してください。
- イメージング
- カーボンパウダーを含むシリコン底部が黒い背景を提供する皿のPBSでマウント組織全体を画像化します。前述のように、市販の画像処理オリンパスソフトウェアパッケージを使用して画像をキャプチャおよび処理する29。
- スライド上の切片を共焦点顕微鏡で画像化する(前述のように20)。10倍、20倍、63倍の対物レンズを持つ単一の焦点面でセクションを画像化します。同じパラメーターを使用して、同じ動物からすべての画像をキャプチャします。信号が飽和しないように、レーザーレベルと画像取得の設定を調整するように注意してください。
- フィジーのソフトウェアを使用して画像処理を実行します。説明のために、プロの画像編集ソフトウェアを使用して画像の明るさ、コントラスト、およびガンマを調整します。
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Representative Results
異なる部位および異なる発生段階で ovo エレクトロポレーションを行うことにより、聴覚末梢または聴覚脳幹のいずれかで選択的FMRPノックダウンを達成しました。
NM での FMRP ノックダウン
ニワトリFmr1に対する低分子ヘアピンRNA(shRNA)を設計し、前述のようにTet-Onベクター系にクローニングした20。 inovoエレクトロポレーションのセットアップを図1Aに示します。高速緑色に着色されたプラスミドDNAを、HH12のr5/r6レベルで神経管に注入しました(図1B-C)。白金バイポーラ電極を神経管の両側にr5/6レベルで配置しました(図1D)。12 Vで2つのパルスを送達して、プラスミドを電極の正極側近くの組織に駆動しました。Doxを絨毛尿膜に適用して、Fmr1 shRNAおよびEGFPの発現をトリガーしました。Dox処理の24時間後、EGFPは蛍光実体顕微鏡下で明らかであった。図1E-Fは、E2でDoxが適用された場合のE3の例を示しています。横断切片は、後脳の片側にEGFP発現(EGFP+)細胞の位置を確認した(図1G-H)。さらに、トランスフェクトされた細胞のグループが耳嚢胞の前方に見つかりました。これらは、神経管から腹外側に移動する脳神経堤細胞であった(図1F)。エレクトロポレーションされた胚は、後の段階で回路形成を研究するために、より長くインキュベートすることもできます。E15では、EGFPは脳幹で観察されましたが、トランスフェクトされた側でのみ観察されました(図1I-J)。背側脳幹レベルの断面は、エレクトロポレーション側のNMに散在する少数のEGFP+ニューロンを示しました(図1L)。EGFP+線維は、NMニューロンの標的である同側の背側核層状核(NL)(図1L)と反対側の腹側NL(図1K)に突出しているのが見られました。Fmr1 shRNAのノックダウン効果は、トランスフェクトされたNMニューロンのFMRP免疫反応性が、隣接する非トランスフェクトニューロンと比較して著しく低下することによって検証されました(図1M-N)。聴神経節(AG)では、ニューロンは非トランスフェクト(EGFP-)でしたが、AGニューロンを取り巻くグリア細胞の一部はEGFP+(図1O-P)であり、おそらくEGFP+脳神経堤細胞に由来します(図1Fを参照)。したがって、このエレクトロポレーション戦略は、AG-NM回路におけるシナプス後ニューロンの選択的トランスフェクションを提供する。
耳管におけるFMRPノックダウン
プラスミド混合物をHH13の耳嚢胞に注入し(図2A)、続いて電極の正極側を耳嚢胞の前方に、負側を耳嚢胞の後方に配置することによってエレクトロポレーションを行った(図2B)。E6の頭部全切片は、右耳嚢腫では強いEGFP蛍光を示したが、脳幹では示さなかった(図2C)。E9で孤立した聴覚管は、管の長さ全体にわたって広範なEGFP蛍光を示しました(図2D-E)。横断面では、蝸牛管壁に沿った脳底乳頭(BP)とAGにEGFP+細胞が確認されました(図2F-G)。Fmr1 shRNAのノックダウン効果は、トランスフェクトされた有毛細胞(*、図2H-J)において、隣接する非トランスフェクト有毛細胞(•、図2H-J)と比較して、FMRP免疫反応性が著しく低下することによって検証されました。支持細胞の場合、FMRP免疫反応性はトランスフェクト細胞と非トランスフェクト細胞の両方で弱かった(図2H-J)。有毛細胞と同様に、FMRPの免疫反応性は、トランスフェクトされたAGニューロンでは、隣接する非トランスフェクトニューロンと比較して大幅に低下しました(図2K-M)。
次に、トランスフェクトされたAGニューロンの中心投影を聴神経を介して脳幹に追跡しました。AGにおけるFmr1 shRNAトランスフェクションのモザイクパターンは、発育中のニワトリ内耳31のマーカーであるIslet-1免疫反応性(図3A)を用いてE6でさらに確認された。解剖中にAGの一部を脳幹とともに抽出すると、脳幹内の単離されたEGFP+ AGニューロンとその線維が同じ調製物でその場で視覚化されました(図3B-C)。NMレベルの横断セクションでは、EGFP+ ANFはE9でNMに到達し(図3D)、E15およびE19で継続的に観察されました(図3E-F)。高倍率画像は、E9でANFの成長円錐のような終末を明らかにし(図3H)、E15で大きな手のひらのような端球を形成した後、E19で複雑な枝を持つHeld形態の特徴的な終末球根に成長しました(図3I-J)。NMを超えて、ANFの広範な枝が別の一次蝸牛核であるNAにも見られました(図3E)。これは、同じANFがニワトリ32のNMとNAの両方を神経支配するために分岐するため、予想されていました。また、図3Eに示すように、EGFP+ファイバーが下行前庭核(VeD)を含む隣接する前庭細胞群に入るのも見られました。AGが形成される耳嚢胞の前部を優先的に標的とするようにエレクトロポレーション電極の位置を最適化しましたが、一部の前庭神経節ニューロンもトランスフェクトされました。ニワトリのANFのマーカーであるパルブアルブミンの免疫染色は、脳幹の聴覚線維と前庭線維を区別するために使用できます(図3F-G)。
要約すると、このエレクトロポレーション戦略は、AG-NM回路におけるシナプス前ニューロンの選択的トランスフェクションを提供し、遺伝子操作後の個々の末端レベルでのHeldのエンドバルブの発生を追跡するために使用することができる。
図 1.チキンNMのFMRPノックダウン。(A)エレクトロポレーション設定イメージ。(B)HH12ニワトリ胚の菱形r5/6レベルでの微小注入部位を示す模式図。略語:NT =神経管;SO =体節。(C)視認性を高めるために、インドのインク(黒)を注射器で胚の下に注入した。次いで、高速緑色で着色されたプラスミド混合物を神経管の内腔に注入した。(d)エレクトロポレーション用バイポーラ電極の位置決め。+と-はそれぞれプラス側とマイナス側を示します。なお、青色プラスミド混合物は、エレクトロポレーション後に陽性側の神経管内に拡散した。(E-F) 明視野(BF)画像(E)は、胚3日目(E3)にエレクトロポレーションされたニワトリ胚のEGFPチャネル(F)と融合し、耳嚢胞の同じ前後レベルで神経管へのトランスフェクションを示しています。Doxは、エレクトロポレーションの6時間後のE2で適用されました。遊走する脳神経堤(CNC)細胞は黄色の矢印で示され、Fの挿入図で拡大されます。挿入図で100μm。 (G-H) トランスフェクトされたE3胚の断面にFmr1 shRNAおよびEGFPをトランスフェクトした細胞。EGFP+細胞は神経管の片側に閉じ込められた。切片をFMRP免疫反応性で二重染色した(灰色)。スケールバー= Gで40μm、GおよびHに適用されます。 (I-J)BF画像(I)は、E8でのDox治療後のE15脳幹のEGFPチャネル(J)とマージされます。 スケールバー= Iで1 mm、トランスフェクトされた(トランス)側にのみEGFP + NMニューロンを持つE15脳幹のIおよびJ.(K-L)断面積に適用されます。対側(K)では、層状核(NL)の腹側部にEGFP+軸索が見られた。(M-N) FMRP(赤)およびSNAP25(青)免疫染色の二重標識によるE19でのNMの高倍率画像。SNAP25は、ヘルドの終末球を標識するシナプス前マーカーです。トランスフェクトされた(緑;*)ニューロンにおけるFMRP免疫反応性が、隣接する非トランスフェクトニューロン(•)と比較して著しく低下していることに注目してください。(O-P) FMRP免疫反応性を有するE19における聴神経節(AG)の高倍率画像。AGニューロン(AGN)はトランスフェクトされませんでした(EGFP-)。Fに示されたCNC細胞に由来するいくつかのグリア細胞をトランスフェクトした。スケールバー= Mで10μm、M-Pに適用されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.鶏の耳管におけるFMRPノックダウン。(A)HH13における耳鼻咽喉科へのプラスミドのマイクロインジェクションを示す明視野(BF)画像。視認性を高めるために、インドのインク(黒)を胚の下に注入しました。(b)エレクトロポレーション用バイポーラ電極の位置決め。プラス側(プラス記号+)は耳嚢胞の前方に位置し、マイナス側(マイナス記号、-)は耳嚢胞の後方に配置されました。(C)E6の鶏頭の横断面をFMRP(赤)およびニューロフィラメント(NF;青)について免疫染色した。エレクトロポレーション後のE3でDoxを適用しました。EGFP蛍光は耳嚢胞では検出されたが、脳幹では検出されなかった。スケールバー = 100 μm. (D-E) BF画像(D)は、E9で聴覚管のEGFPチャネル(E)と合流した。 スケールバー = 500 μm. (F-G) FMRP(赤)およびNF(青)免疫染色によるE9耳管の横断面。EGFP+細胞は、蝸牛管壁、脳底乳頭(BP)、および聴神経節(AG)に見られました。スケールバー= Fでは50μm、FおよびGに適用(H-J)E9 BPの高倍率画像は、トランスフェクトされていないHC(•)と比較して、トランスフェクトされた有毛細胞(HC)におけるFMRP免疫反応性が大幅に低下したことを示しています。NF陽性線維(青色)はAGニューロンからの末梢神経支配であった。(K-M) FMRP免疫染色によるE9でのAGニューロンの高倍率画像(赤)。FMRP免疫反応性は、トランスフェクトされていないニューロン(•)で強く、トランスフェクトされたニューロンでは検出できませんでした(EGFP+;*)。スケールバー= Hで50μm、H-Mに適用されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.脳幹におけるトランスフェクトされたAGニューロンの軸索追跡。胚をFmr1 shRNAの耳嚢胞トランスフェクションのためにHH13でエレクトロポレーションした。DoxアプリケーションはE2で開始されました。(A)E6ニワトリヘッドの横断切片をIslet-1免疫染色およびDAPI対比染色で検出。EGFP+細胞は聴神経節(AG)で明らかでした。星印*は、挿入図にトランスフェクトされたAGニューロンをいくつか示します。スケールバー = Aで100 μm、挿入図で10 μm。(B-C) 明視野(BF)画像(B)は、E9脳幹のEGFPチャネル(C)と融合した。この場合、AG(白矢印)の一部は聴脳幹に接続されたままであった。黄色の矢印は、挿入図にトランスフェクトされたAGニューロン(AGN)を示します。EGFP+線維は、脳幹のトランスフェクト側で明らかでした。スケールバー= Bで1 mm、BとCに適用されます。挿入図で100μm。(D)破線でCで示されたレベルでのE9脳幹の断面。EGFP+聴神経線維(ANF;緑色)は脳幹の背側縁に沿って伸び、マグノセルラリス核(NM)に接近した。スケールバー = 100 μm. (E-G) E15 (E) および E19 (F-G) の EGFP+ ファイバー。角核(NA)と下行前庭核(VeD)にもいくつかの繊維が見られました。E19切片をANFのマーカーとしてパルブアルブミン(PV)免疫反応性について染色した。Fの破線のボックスは挿入図で拡大されており、PV免疫反応性であったEGFP+ ANFを示しています。スケールバー= Eで100μm;Fで50μm、FとGに適用されます。インセットで2μm。(H-J) E9、E15、およびE19におけるNMのANF端子の高倍率画像は、Heldの終末球の形成と進行性成熟を示しています。スケールバー= Hで5μm、H-Jに適用されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
FMRPの細胞自律機能を決定するためには、個々の細胞群または細胞型におけるFMRPの発現を操作する必要があります。FMRPの主要な機能の1つはシナプス形成と可塑性を制御することであるため、特定の回路の各シナプスコンポーネントを選択的に操作することは、シナプス通信におけるFMRPメカニズムを完全に理解するための前提条件です。ニワトリ胚のovoエレクトロポレーションを用いて、シナプス前AGニューロンまたはシナプス後NMニューロンのいずれかのAG-NM回路におけるFMRP発現を標的とする方法を実証しました。これを達成するためには、エレクトロポレーションに適した発生段階を選択し、エレクトロポレーション電極を胚に正確に配置することが重要なステップです。NMニューロンは、HH1223でr5 / 6レベルで神経管内の神経前駆細胞から生じる。同じ段階で、脳神経堤細胞は、神経管の背側先端から蝸牛前庭神経節に移動し、将来のAGニューロン33を包み込む。したがって、AG内のNMニューロンおよびグリア細胞の両方が神経管由来である。対照的に、有毛細胞およびAGニューロンは外胚葉24に由来する。r5 / 6レベルに隣接する外胚葉は、HH10で肥厚し、次に陥入してHH13で耳のカップを形成します。その後、耳のカップが閉じて外胚葉から分離して耳嚢胞を形成し、前部が聴覚感覚器官になり、後部が前庭系に寄与します。聴覚部と前庭部の両方で、耳カップの腹側部分に存在する神経芽細胞が層間剥離して遊走し、蝸牛前庭神経節を形成します。これらの運命マッピング研究に基づいて、以前に確立された戦略であるHH12で神経管をエレクトロポレーションすることにより、NMニューロンの前駆細胞をトランスフェクトしました26,28,34。この戦略は、脳幹およびAGにおけるグリア細胞の追加のトランスフェクションをもたらすが、AGニューロンのいずれもトランスフェクションされなかった。ニューロン特異的トランスフェクションは、以前に行ったように、Atoh1プロモーター駆動戦略を採用することで達成できます21。AGニューロンの選択的トランスフェクションのために、HH13の耳嚢胞をエレクトロポレーションしました。オティックカップに注入されたプラスミドは、図2Bに示すように電極を配置すると、有毛細胞とAGニューロントランスフェクションのために耳嚢胞の前部に同時に入りました。有毛細胞よりもAGニューロンを優先的に標的とするために、剥離した神経芽細胞が位置する前耳嚢に隣接する領域にプラスミド溶液をまっすぐに注入することが可能です35。しかし、この方法は、注入後すぐにプラスミドが拡散するため、耳嚢胞注射と比較してAGニューロントランスフェクションの効率が低くなります。この方法はまた、周囲の頭部間葉系細胞の追加のトランスフェクションをもたらし得る。AGニューロンよりも有毛細胞を優先的に標的とする1つの方法は、神経芽細胞(AGニューロン前駆体)の大部分がこの段階で耳嚢胞から移動したため、耳嚢胞注射とエレクトロポレーションをHH18(~胚3日目)に遅らせることです24。
修正を加えると、この方法は前庭系を研究するために拡張することができる。前庭神経節トランスフェクションの場合、聴覚神経節と前庭神経節の前駆物質の位置が異なるため、耳嚢胞の後部をトランスフェクションするには、 図2B に示す電極の方向を逆にする必要があります。
ニワトリ 胚の卵管エレクトロポレーションは、発生の初期段階(孵卵の最初の1週間以内)を調査するための確立された技術です。長期的な研究では、生存率が大きな懸念事項です。E8でDox治療を開始すると、ここで見つかった生存率はE9で~60%ですが、E15で30%に低下し、E19でさらに低くなります。エレクトロポレーションされた卵からの孵化は可能ですが、まれであり、ほとんどの場合数日間しか生存できません。生存率を高めるためには、次のことを考慮する必要があります:1)鋭い波の代わりに方形波を提供するエレクトロポレーターを使用してください。2)アルブミン層が導電性を促進するのに十分な厚さでない場合は、胚の上部に1〜2滴の滅菌PBSを適用します(これは電気的外傷を軽減するのに役立ちます)。3)注射部位で胚を露出させるための卵子膜の開口部は、トランスフェクションの成功に必要ではなく、胚に害を及ぼす可能性があります。4)汚染のリスクを減らすために、注射器を使用してパラフィルムを突いて、窓を再び開く代わりにDoxを投与します。注射後、透明フィルムを75%エタノールで拭き、針の開口部をテープで覆います。5)耳嚢胞トランスフェクションの場合は、プラスミドを45°の角度のピペットで背外側の耳嚢胞に注入し、下の大動脈背筋の穿刺を回避します。大動脈背筋が損傷している場合、出血はプラスミドを洗い流し、さらには死に至ることさえあります。6)可能であれば、胚を視覚化するためにインドのインクを使用することは避けてください。取り扱いが少なく、手順が少ないほど、生存率が高くなります。
AGまたはNMニューロンを選択的にトランスフェクトする能力に加えて、 inovo エレクトロポレーションは、データ分析のための隣接比較を可能にする独自のシステムを提供します。エレクトロポレーション後、NMまたはAGのいずれかにおける細胞のサブセットのみがトランスフェクトされ、同じ細胞群内の周囲の非トランスフェクト細胞が理想的な対照20として機能することを可能にする。隣接するニューロン間の潜在的な相互作用が懸念される場合、耳および脳の非トランスフェクト側からのニューロン対応物は、追加の制御として役立ち得る。組織学的およびイメージング研究では、この結果により、単一細胞または単一繊維レベルで高効率のデータ解析が可能になります。分子解析は、蛍光ベースのセルソーティングや、質量分析や次世代シーケンシングなどの大規模なタンパク質およびRNA分析と組み合わせることでも実現可能です。しかし、遺伝子編集の手段として ovo エレクトロポレーションを使用することは、細胞群内のトランスフェクトされた細胞の割合が機能的結果をもたらすのに十分な大きさではない可能性があるため、機能的および行動的研究にとって困難な場合があります。
in ovoエレクトロポレーションアプローチを採用する際には、2つの検証分析を行うことが不可欠です。まず、目的のタンパク質に対する遺伝子編集の効果を確認する必要があります。ovoエレクトロポレーションでは、NMまたはAG内のニューロンのサブセット(すなわち、モザイクパターン)のみをトランスフェクトする。トランスフェクトされたニューロンとトランスフェクションされていないニューロンの混合物を含む均質化された組織に対してウェスタンブロットを実行することは、ノックダウン効果を正確に反映するのに十分な感度ではありません。したがって、検証は、免疫細胞化学などの方法を使用して個々の細胞レベルで実施する必要があります。この目的のために、我々は以前にニワトリFMRPを認識する抗体を作製した。この抗体の特異性は、以前の研究30において免疫細胞化学およびウェスタンブロットによって検証された。Fmr1 shRNAのノックダウン効果は、トランスフェクトされたNMニューロンにおけるFMRP免疫反応性の強度が隣接する非トランスフェクトニューロンと比較して有意に低下することを観察することにより定量的に検証されました。第二に、スクランブルRNAまたは他の対照構築物を使用する対照群を使用して、FMRP誤発現の観察された細胞効果の特異性を確認する必要があります20,21。この目標を達成するために、我々はスクランブルshRNAを設計し、それを同じTet-Onベクターシステムにクローニングし、それをNM前駆体にエレクトロポレーションした(前述の20)。スクランブルshRNAをトランスフェクトしたNMニューロンにおけるFMRP発現は、隣接する非トランスフェクトニューロンと比較してFMRP免疫反応性の強度が変化しないことからも明らかなように、影響を受けなかった。また、軸索の成長、樹状突起の剪定、末端形成、および神経伝達に対するFmr1 shRNAトランスフェクションの多くの効果も特定しました(Curnow and Wang、2022)36でレビュー)。これらの効果は、スクランブルされたshRNAが同様の変化を誘導できなかったため、FMRPの細胞自律的喪失によって特異的に誘導されたと結論付けました。
結論として、 in ovo エレクトロポレーション技術は、聴覚耳脳幹回路における時間的制御と成分特異性を備えた選択的な Fmr1 遺伝子編集を可能にし、前庭系を操作するように改変することができる。発生生物学のモデルとして確立されているニワトリ胚におけるこの高度な技術の開発は、FXSのような正常・異常条件下での脳発達の理解に貢献してきました。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学基金会の助成金(No.32000697)によってサポートされました。広州の科学技術プログラム(202102080139);広東自然科学財団(2019A1515110625、2021A1515010619);中央大学の基礎研究費(11620324)済南大学教育部再生医療重点研究所研究助成(No.ZSYXM202107);中国中央大学の基礎研究基金(21621054);中国広東省医学科学研究財団(20191118142729581)。済南大学の医学実験センターに感謝します。原稿を注意深く編集してくれたテラ・ブラッドリー博士に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Egg incubation | |||
| 16 °C refrigerator | MAGAT | Used for fertilized egg storage. | |
| Egg incubator | SHANGHAI BOXUN | GZX-9240MBE | |
| Fertilized eggs | Farm of South China Agricultural University | Eggs must be used in one week for optimal viability. | |
| Plasmid preparation | |||
| Centrifuge | Sigma | 10016 | |
| Fast green | Solarbio | G1661 | Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave. |
| Plasmid Maxi-prep kit | QIAGEN | 12162 | Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Make 7.5M working solution in nuclase-free water. |
| Electroporation and Doxycycline Administration | |||
| Electroporator | BTX | ECM399 | |
| 1 mL / 5 mL Syringe | GUANGZHOU KANGFULAI | ||
| Dissecting microscope | CNOPTEC | SZM-42 | |
| Doxcycline | Sigma-Aldrich | D9891 | Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C. |
| Glass capillary | BEIBOBOMEI | RD0910 | 0.9-1.1 mm*100 mm |
| Laboratory parafilm | PARAFILM | PM996 | transparent film |
| Pipette puller | CHENGDU INSTRUMENT FACTORY | WD-2 | Pulling condition: 500 °C for 15 s |
| Platinum elctrodes | Home made | 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval. | |
| Rubber tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Tissue Dissection and Fixation | |||
| Forceps | RWD | F11020-11 | Tip size: 0.05*0.01 mm |
| Other surgery tools | RWD | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week. |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW | 01673921 | For black background plates, food-grade carbon powder is applied. |
| Sectioning | |||
| Cryostat | LEICA | CM1850 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | From bovine skin. |
| Sliding microtome | LEICA | SM2010 | |
| Immunostaining | |||
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse | Abcam | ab150113 | 1:500 dilution, RRID: AB_2576208 |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit | Abcam | ab150078 | 1:500 dilution, RRID: AB_2722519 |
| DAPI | Abcam | ab285390 | 1: 1000 dilution |
| Fluoromount-G mounting medium | Southern Biotech | Sb-0100-01 | |
| FMRP antibody | Y. Wang, Florida State University | #8263 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242 |
| Islet-1 antibody | DSHB | 39.3F7 | 1:100 dilution, RRID: AB_1157901 |
| Netwell plate | Corning | 3478 | |
| Neurofilament antibody | Sigma-Aldrich | N4142 | 1:1000 dilution, RRID: AB_477272 |
| Parvalbumin antibody | Sigma-Aldrich | P3088 | 1:10000 dilution, RRID: AB_477329 |
| SNAP25 antibody | Abcam | ab66066 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052 |
| Imaging | |||
| Adobe photoshop | ADOBE | image editing software | |
| Confocal microscope | LEICA | SP8 | |
| Fluorescent stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Olympus Image-Pro Plus 7.0 | OlYMPUS | commercial image processing software package |
References
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