Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Рассечение клеточно-автономной функции хрупкого белка умственной отсталости X в слуховой цепи с помощью электропорации In Ovo

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/64187
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1
1Division of Histology & Embryology, Key Laboratory for Regenerative Medicine of the Ministry of Education, College of Medicine, Jinan University, 2Department of Clinical Pathology, First Affiliated Hospital of Jinan University, 3Program in Neuroscience, Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University
* These authors contributed equally

Summary

Используя электропорацию ово , мы разработали метод селективной трансфекции слухового внутреннего уха и кохлеарного ядра у куриных эмбрионов для достижения специфического для клеточной группы нокдауна хрупкого белка умственной отсталости X в течение дискретных периодов сборки цепи.

Abstract

Хрупкий белок умственной отсталости X (FMRP) является мРНК-связывающим белком, который регулирует локальную трансляцию белка. Потеря или дисфункция FMRP приводит к аберрантной нейрональной и синаптической активности при синдроме хрупкого X (FXS), который характеризуется умственной отсталостью, сенсорными аномалиями и проблемами социальной коммуникации. Исследования функции FMRP и патогенеза FXS в основном проводились с нокаутом Fmr1 (ген, кодирующий FMRP) у трансгенных животных. Здесь мы сообщаем о методе in vivo для определения клеточно-автономной функции FMRP в период сборки цепи и синаптического образования с использованием куриных эмбрионов. Этот метод использует стадийную, участковую и направленную электропорацию векторной системы, индуцируемой лекарственным средством, содержащей небольшую шпильковую РНК Fmr1 (шРНК) и репортер EGFP. С помощью этого метода мы достигли селективного нокдауна FMRP в слуховом ганглии (AG) и в одной из его мишеней ствола мозга, ядре magnocellularis (NM), тем самым обеспечивая компонентно-специфическую манипуляцию в цепи AG-NM. Кроме того, мозаичный рисунок трансфекции позволяет проводить внутри животных контроль и сравнение соседних нейронов / волокон для повышения надежности и чувствительности при анализе данных. Индуцируемая векторная система обеспечивает временной контроль начала редактирования генов, чтобы свести к минимуму накапливающиеся эффекты развития. Сочетание этих стратегий обеспечивает инновационный инструмент для препарирования клеточно-автономной функции FMRP в синаптическом и схемном развитии.

Introduction

Синдром хрупкой Х (FXS) — это расстройство нервного развития, характеризующееся умственной отсталостью, сенсорными аномалиями и аутистическим поведением. В большинстве случаев FXS вызван глобальной потерей хрупкого белка умственной отсталости X (FMRP; кодируется геном Fmr1), начиная с ранних эмбриональных стадий1. FMRP представляет собой РНК-связывающий белок, который обычно экспрессируется в большинстве нейронов и глиальных клеток головного мозга, а также ворганах чувств 2,3,4. В мозге млекопитающих FMRP, вероятно, связан с сотнями мРНК, которые кодируют белки, важные для различных нейронных активностей5. Исследования обычных нокаутирующих животных Fmr1 показали, что экспрессия FMRP особенно важна для сборки и пластичности синаптической нейротрансмиссии6. Несколько условных и мозаичных нокаутных моделей дополнительно продемонстрировали, что действия и сигналы FMRP варьируются в разных областях мозга, типах клеток и синаптических участках во время нескольких событий развития, включая аксональную проекцию, дендритный паттерн и синаптическую пластичность 7,8,9,10,11,12,13,14 . Острая функция FMRP в регуляции синаптической передачи изучалась внутриклеточной доставкой ингибирующих антител FMRP или самой FMRP в срезах мозга или культивируемых нейронах 15,16,17,18. Эти методы, однако, не дают возможности отслеживать последствия, вызванные неправильной экспрессией FMRP, во время развития. Таким образом, разработка методов in vivo для исследования клеточно-автономных функций FMRP очень необходима и, как ожидается, поможет определить, являются ли зарегистрированные аномалии у пациентов с FXS прямыми последствиями потери FMRP в ассоциированных нейронах и цепях или вторичными последствиями, полученными из общесетевых изменений во время развития19.

Слуховой ствол мозга куриных эмбрионов предлагает уникально выгодную модель для углубленного функционального анализа регуляции FMRP в цепном и синапсовом развитии. Легкий доступ к эмбриональному куриному мозгу и хорошо зарекомендовавшая себя техника электропорации в ово для генетических манипуляций в значительной степени способствовали нашему пониманию развития мозга на ранних эмбриональных стадиях. В недавно опубликованном исследовании этот метод был объединен с передовыми молекулярными инструментами, которые позволяют временно контролировать неправильную экспрессию FMRP20,21. Здесь усовершенствована методология индуцирования селективных манипуляций с пресинаптическими и постсинаптическими нейронами по отдельности. Этот метод был разработан в слуховой цепи ствола мозга. Акустический сигнал обнаруживается волосковыми клетками в слуховом внутреннем ухе, а затем передается в слуховой ганглий (AG; также называемый спиральным ганглием у млекопитающих). Биполярные нейроны в АГ иннервируют волосковые клетки своими периферическими отростками и, в свою очередь, посылают центральную проекцию (слуховой нерв) в ствол мозга, где они заканчиваются двумя первичными кохлеарными ядрами, ядром magnocellularis (NM) и ядром angularis (NA). Нейроны в НМ структурно и функционально сопоставимы со сферическими кустистыми клетками антеровентрального кохлеарного ядра млекопитающих. В NM, слуховые нервные волокна (ANF) синапс на соматах nm нейронов через большую конечную бульбу Held terminals22. Во время развития нейроны NM возникают из ромбомеров 5 и 6 (r5/6) в заднем мозге23, в то время как нейроны AG получены из нейробластов, находящихся в отоцисте24. Здесь мы описываем процедуру селективного сбивания экспрессии FMRP в пресинаптических нейронах AG и в постсинаптических нейронах NM по отдельности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Яйца и куриные эмбрионы обрабатывались с осторожностью и уважением в соответствии с протоколами для животных, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных Университета Цзинань.

1. Препарат яиц и плазмид

  1. Приготовление яиц
    1. Получите свежие оплодотворенные куриные яйца (Gallus gallus) из Южно-Китайского сельскохозяйственного университета и храните при температуре 16 °C перед инкубацией. Для оптимальной жизнеспособности поместите все яйца на инкубацию в течение недели после прибытия.
    2. Поместите яйца горизонтально и инкубируйте при 38 °C в течение 46-48 ч до стадии Гамбургера и Гамильтона (HH) 1225 для трансфекции нервной трубки или в течение 54-56 ч до HH13 для трансфекции отоцисты. Поскольку животная шеста яйца легче, чем растительный полюс, горизонтальное размещение помещает эмбрион в верхнюю часть яйца для легкой манипуляции. Соблюдайте осторожность, чтобы держать яйцо горизонтальным в этом и всех последующих шагах.
    3. Расположение эмбриона проявляется в виде темной области на яичной скорлупе при отбрасывании света со дна яйца с помощью фонарика. На нужных этапах HH используйте этот метод фонарика, чтобы отметить местоположение эмбриона на яичной скорлупе карандашом.
    4. Протрите яйца марлей, содержащей 75% этанола. Просверлите отверстие в заостренном конце яиц кончиком ножниц и удалите 2 мл альбумина шприцем из иглы 18 г. Убедитесь, что отверстие достаточно большое, чтобы можно было вставить иглу. Протрите любой протекающий альбумин марлей и заклейте отверстие прозрачной лентой.
    5. Чтобы свести к минимуму трещины и предотвратить падение обломков скорлупы во время окон, накройте верхнюю часть яиц прозрачной лентой, центрируясь на темной области, отмеченной карандашом.
  2. Экстракция плазмидной ДНК
    1. Клонирование куриной ШРНК Fmr1 с использованием транспозонной системы Tet-on, как описано ранее20. Эта система содержит три плазмиды: pCAGGS-T2TP, pT2K-CAGGS-rtTA-M2 и pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 шРНК, обеспечивая индуцируемую лекарственным средством векторную систему, с помощью которой экспрессия шРНК Fmr1 и EGFP заглушается после трансфекции и может быть включена индукции доксициклина (Dox).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти плазмиды в настоящее время недоступны в репозитории. Авторы соглашаются предоставить плазмиды по разумной просьбе.
    2. Экстрагируйте плазмидные ДНК с помощью безэндотоксинов в соответствии с инструкцией производителя и выпадайте в осадок, добавляя 1/15 объема 7,5 М ацетата натрия и 1 объем 100% изопропанола.
    3. Осадки плазмиды при -20 °C в течение ночи и центрифуга при 13 000 х г в течение 10 мин. Растворить гранулу с помощью буфера Tris-EDTA, предусмотренного в комплекте, до конечной концентрации 4-5 мкг/мкл. Плазмиды можно хранить при -20 °C в течение 12 месяцев без снижения эффективности трансфекции.
    4. В день электропорации тщательно перемешайте 2 мкл каждой плазмиды в стерильной центрифужной трубке с помощью наконечника пипетки. Полученного объема плазмидной смеси в 6 мкл достаточно для электропорации трех десятков яиц. Чтобы помочь визуализировать плазмиду во время электропорации, добавьте 1 мкл 0,1% быстрого зеленого (приготовленного в стерильном ddH2O) на каждые 6 мкл смеси ДНК26, что превращает плазмидную смесь в синий цвет.

2. В ово электропорация

  1. Вскрытие яйцеклеток и идентификация эмбрионов
    1. В день электропорации извлеките яйца из инкубатора, по дюжине яиц за раз. Удержание яиц вне инкубатора более 1 ч приводит к изменениям в развитии и снижает жизнеспособность.
    2. Протрите все хирургические инструменты марлей, содержащей 75% этанола.
    3. Поместите каждое яйцо в изготовленный на заказ держатель для пены. Протрите покрытую лентой область 75% этанолом и вырежьте окно (1-2 см2) по окружности карандашной метки с помощью небольшой пары ножниц (рисунок 1А). При резке держите ножницы плоскими, чтобы не повредить эмбрион под ними.
    4. Поместите оконное яйцо под стереомикроскоп с 10-кратным окуляром и 2-кратным зумом и идентифицируйте эмбрион. Отрегулируйте угол и яркость источника света для лучшей визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется практика и опыт, чтобы визуализировать эмбрион и идентифицировать нервную трубку на этом этапе.
      1. Для начинающих используйте следующую дополнительную инъекцию чернил, чтобы облегчить идентификацию эмбриона. Заранее приготовьте 10% раствор индийских чернил в 0,01 М фосфат-буферного физиологического раствора (PBS) и автоклаве. Заполните шприц объемом 1 мл раствором чернил, а затем поместите иглу 27G. Согните иглу под углом 45° щипцами.
      2. Под микроскопом аккуратно ткните от края области опаки и вставьте иглу под эмбрион. Вводят ~50 мкл чернил, которые будут диффундировать ниже области пеллюцида для визуализации эмбриона. Чернила образуют темный фон для четкой визуализации эмбриона.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Выталкивайте воздух из шприца перед введением и впрыском. При умении визуализации избегайте этапа инъекции чернил, так как это снижает выживаемость.
  2. Инъекция нервной трубки и электропорация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура выполняется в HH12 для трансфекции нейронов NM в стволе мозга.
    1. Втяните стеклянные капилляры (~1 мм в диаметре и 100 мм в длину) в пипетки с помощью съемника пипетки. Под рассекающим микроскопом осторожно откройте кончик капиллярной иглы до 10-20 мкм в диаметре щипцами. Храните пипетки (обычно по 5-10 за один раз) в ящике для хранения до использования.
    2. Наполните капиллярную пипетку 0,5-1 мкл плазмидной смеси, применяя отрицательное давление через резиновую трубку на конце пипетки. Это может быть достигнуто с помощью шприца или воздушного насоса.
    3. Поместите яйцеклетку под микроскоп так, чтобы эмбрион был вертикально ориентирован с хвостом рядом с вами (или горизонтально для введения капиллярных пипеток с помощью трехосевого манипулятора). Держите капиллярную пипетку одной рукой или трехосевым манипулятором и наведите кончик пипетки на r5/6 в направлении хвост к голове.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Самая передняя область заднего мозга составляет r1, а каждая последующая выпуклость вдоль нервной трубки представляет собой отдельный ромбомер. R5/6 находится на том же переднезаднем уровне, что и отоциста, которая представляет собой легко узнаваемую чашеобразную структуру (рисунок 1B-C).
    4. Осторожно просуните наконечник через вителлиновую мембрану в спинную нервную трубку, а затем немного выньте пипетку, чтобы наконечник находился в просвете нервной трубки. Впрыскивайте плазмидную смесь, применяя давление воздуха до тех пор, пока тонированная плазмида полностью не диффундирует в r5/6 и не распространится на r3 и r4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости делать прорезь на мембране вителлина для инъекций.
    5. Проверьте успешную инъекцию, которая достигается, когда раствор синей плазмиды быстро диффундирует вниз по нервной трубке без утечки (рисунок 1B-C). Когда происходит утечка, синий быстро исчезает.
    6. Сразу после инъекции поместите платиновый биполярный электрод по обе стороны нервной трубки (рисунок 1D). Подайте два импульса длительностью 12 В и 50 мс с помощью электропоратора. Наблюдайте пузырьки воздуха на концах биполярного электрода, с большим количеством на отрицательной стороне.
    7. Проверьте успешную электропорацию, которая достигается, когда тонированная плазмидная смесь попадает в ткань нервной трубки вблизи положительной стороны электрода. После электропорации осторожно извлеките биполярный электрод.
    8. Накройте окно на яичной скорлупе куском прозрачной пленки, который предварительно разрезают на 2 квадрата и опрыскивают 75% этанолом. Поместите яйцо обратно в инкубатор.
    9. Очистите биполярный электрод, подав 10-20 импульсов длительностью 12 В и 50 мс в физиологическом растворе, прежде чем перейти к следующему яйцу.
  3. Инъекция отоцистов и электропорация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура выполняется в HH13 для трансфекции волосковых клеток и нейронов AG во внутреннем ухе.
    1. В HH13 (который является ~ эмбриональным днем 2,5) эмбрион повернулся так, что правая сторона головы обращена вверх. Под микроскоп поместите яйцеклетку так, чтобы эмбрион был вертикальным, с хвостом рядом с вами. Зажмите капиллярную пипетку и аккуратно ткните правую отоцисту в дорсолатеральном направлении (рисунок 2А).
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этой стадии отоциста проявляется в виде небольшой круглой структуры на верхней части тела на том же переднезаднем уровне, что и r5/6.
    2. Вводят плазмидную смесь давлением воздуха до тех пор, пока отоциста не наполнится синим раствором27. Проверьте успешную инъекцию, которая достигается, когда синяя плазмидная смесь ограничена отоцистой и не протекает.
    3. Сразу после инъекции поместите биполярный электрод на отоцисту, как показано на рисунке 2B. Расположите положительную и отрицательную стороны спереди и сзади к отоцисте соответственно. Подайте два импульса длительностью 12 В и 50 мс с помощью электропоратора.
    4. Проверьте успешность электропорации, которая достигается, когда смешение синей плазмиды попадает в ткань отоцисты вблизи положительной стороны электрода. После электропорации осторожно извлеките биполярный электрод. Накройте окно на яичной скорлупе прозрачной пленкой и верните яйцо в инкубатор.

3. Введение Dox для инициирования и поддержания транскрипции плазмид

  1. Приготовление раствора Dox
    1. Отмерьте 100 мг порошка Dox под химическим капотом и растворите его в 100 мл стерильного PBS, чтобы получить 1 мг / мл рабочего раствора. Отфильтруйте раствор фильтром 0,22 мкм и сохраните 1 мл аликвоты при -20 °C. Защита от света 20,28.
  2. Администрация Dox
    1. Для полноценного редактирования генов за 24 часа до желаемого возраста разморозьте аликвоту Dox на льду. Капля 50 мкл Dox непосредственно на хориоаллантоидную мембрану яйца с помощью шприца, проникающего в прозрачную пленку. Запечатайте отверстие иглы прозрачной пленкой или лентой после инъекции.
    2. Чтобы сохранить эффект нокдауна, вводите Докс через день до сбора ткани на желаемой стадии развития.

4. Рассечение и сечение тканей

  1. Ствол мозга
    1. Для эмбрионов на эмбриональной стадии 3 (Е3) и Е6 откройте яичную скорлупу и перережьте связанную с ней мембрану ножницами. Выложите эмбрион и погрузите его в 4% параформальдегид (PFA) в 0,1 М фосфатного буфера.
    2. Для эмбрионов E9 откройте яичную скорлупу, обезглавите эмбрион ножницами и перенесите голову на пластину с кремниевым дном, заполненную PBS. Прожмите голову вниз по орбитам и разрежьте верхнюю часть черепа на части. Осторожно поместите щипцы под мозг с обеих сторон и поднимите весь мозг от черепа плечами щипцов. Погрузите мозг в 4% PFA.
    3. Для эмбрионов E15 и E19 откройте яичную скорлупу, обезглавите эмбрион ножницами и поместите голову на пластину с кремниевым дном, заполненную PBS. Отрежьте кожу на верхней части головы, чтобы обнажить череп.
    4. Прорезайте череп вертикально бритвой, чтобы разделить передний мозг и каудальный мозг. Погрузите каудальный блок в PBS, удалите верхнюю часть черепа, а затем снимите мозг с черепа.
    5. Зафиксируйте мозг через оптическую долю и разделите мозжечок и ствол мозга. Следите за тем, чтобы не повредить слуховой ствол мозга, который расположен прямо под мозжечком. Удалите как можно больше твердой мозговой оболочки из ствола мозга, а затем погрузите его в 4% PFA.
    6. Держите эмбрионы и ткани мозга в 4% PFA при 4 °C в течение ночи, за исключением стволов мозга E19, которые должны храниться в том же состоянии в течение 24 ч.
    7. После фиксации обезвоживают ткань в PBS, содержащую 30% сахарозы, пока она не осядет, что обычно занимает 1-3 дня, в зависимости от возраста.
    8. Разрезание ствола мозга (E15 и E19) на 30 мкм в корональной плоскости с помощью скользящего микротома. Соберите срезы в PBS и храните при 4 °C перед иммуноокрашиванием.
    9. Для эмбрионов E3 и E6 и стволов мозга E9 сечение составляет 50 мкм поперечно. Собирайте секции в PBS и храните при температуре 4 °C. Установите секции на предметные стекла микроскопа с желатиновым покрытием перед иммуноокрашиванием. Сбор более толстых участков для этих возрастов облегчает обработку тканей.
  2. Слуховой канал
    1. После удаления стволов мозга из эмбрионов E9, E15 и E19 слуховой проток, который встроен в височную кость, легко идентифицируется, лежа под черепом, а височная кость легко отделяется от окружающего черепа. Для эмбрионов E9 зафиксируйте всю височную кость в 4% PFA. Для пожилых эмбрионов удалите костную структуру височной кости, чтобы изолировать слуховой проток и зафиксировать слуховой проток в 4% PFA.
    2. Держите все височные кости и слуховые протоки в 4% PFA при 4 °C в течение ночи до встраивания ткани.
    3. Выполните встраивание тканей, как описано. Приготовьте раствор для встраивания следующим образом: Замочите 10% желатин (из кожи крупного рогатого скота) в холодной воде до тех пор, пока желатиновые гранулы не набухнут и не осядут (около 30 мин). Нагрейте смесь до ~50 °C, чтобы растворить желатин, добавьте 20% сахарозы в желатиновый раствор и перемешайте, чтобы растворить. Хранить желатино-сахарозный раствор при 4 °C до месяца.
    4. Для применения разогрейте желатино-сахарозный раствор при 37 °C. Замочите височные кости/слуховые протоки в теплом растворе желатино-сахарозы на 96-луночной пластине при 37 °C до тех пор, пока они не осядут, обычно 30-60 мин.
    5. Выровняйте дно колодцев 12-луночной плитой полоской прозрачной пленки. Добавить слой теплого желатино-сахарозного раствора и подождать, пока он затвердеет. Перенесите височную кость/слуховой проток в каждую лунку.
    6. Имплантировать в ткань второй слой теплого желатино-сахарозного раствора. Отрегулируйте положение ткани так, чтобы она находилась в центре геля, а слуховой проток был ориентирован горизонтально. Осторожно переместите пластину в холодильник с температурой 4 °C и подождите, пока гель не станет твердым.
    7. Потяните прозрачную пленочную полоску, чтобы переместить блок гелевой ткани из колодца. Обрежьте дополнительный гель в квадратный блок и срежьте угол блока, чтобы определить ориентацию. Оберните желатиновый блок кусочком фольги, заморозьте на сухом льду, а затем храните при -80 °C до секционирования.
    8. Секционирование блока на 20 мкм по долготе слухового протока криостатом. Установите секции непосредственно на предметные стекла микроскопа с желатиновым покрытием. Храните слайды при температуре -80 °C перед иммуноокрашиванием.
    9. Перед иммуноокрашиванием погрузите слайды в предварительно подогретый PBS (45 °C) на 5 мин, чтобы растворить желатин, а затем промыть слайды 3x с комнатной температурой PBS для удаления остаточного желатина.

5. Иммуноокрашивание и микроскопическая визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Два типа иммуноокрашивания выполняются в зависимости от того, установлены ли секции на слайдах или свободно плавают в PBS.

  1. Иммуноокрашивание на слайдах
    1. Мойте слайды 3x в течение 10 минут каждый с PBS. Обведите область, содержащую секции, масляной ручкой, чтобы предотвратить утечку жидкости во время окрашивания. Накрыть участки блокирующим раствором, содержащим 5% нормальную козью сыворотку в ПБС и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
    2. Разбавляют первичные антитела (конечную концентрацию используют в Таблице материалов) в ПБС, содержащих 0,3% TritonX-100 и 5% нормальной козьей сыворотки. Удалите блокирующий раствор и затем накройте участки раствором первичного антитела. Инкубируйте горки при 4 °C в течение ночи в коробке, содержащей слой дистиллированной воды на дне.
    3. Промойте слайды 3x в течение 10 минут с помощью PBS. Применяют флуоресцентные вторичные антитела, разведенные при 1:500 в PBS, содержащие 0,3% TritonX-100, на слайдах. Инкубировать горки при комнатной температуре в течение 4 ч, экранированные от света.
    4. Мойте слайды 3x с помощью PBS. Осторожно опустите две капли монтажного носителя на слайды и накройте секции чехлами. Следите за тем, чтобы не образовывать пузырьки воздуха между крышкой и слайдом.
  2. Иммуноокрашивание цельных эмбрионов и свободно плавающих секций
    1. Промывайте эмбрионы/срезы PBS 3x в течение 10 мин каждый в луночной пластине. Разбавляют первичные антитела в PBS, содержащие 0,3% TritonX-100 и 5% нормальной козьей сыворотки в центробежных пробирках. Перенесите каждый эмбрион/секцию в трубку со стеклянным крючком и инкубируйте на шейкере со скоростью 60 оборотов в минуту в течение ночи при 4 °C.
    2. Промывайте эмбрионы/секции 3x PBS в течение 10 мин каждый в луночной пластине. Перенесите каждый эмбрион/участок в темную центробежную трубку, заполненную флуоресцентным раствором вторичных антител, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 4 ч на шейкере.
    3. Промыть эмбрионы/секции 3x PBS в луночной пластине. Используйте щетку для крепления секций на предметные стекла микроскопа с желатиновым покрытием в 15-сантиметровой чашке, содержащей PBS. После того, как горки слегка высохнут (~5 мин), нанесите две капли монтажного материала и поместите крышку. Следите за тем, чтобы не образовывать пузырьки воздуха между крышкой и слайдом. Храните все ткани крепления в PBS для визуализации.
  3. Отображение
    1. Изобразите целые ткани крепления в PBS в чашке с кремниевым дном, содержащим углеродный порошок, который обеспечивает черный фон. Захватывайте и обрабатывайте изображения с помощью коммерческого программного пакета Olympus для обработки изображений, как описано ранее29.
    2. Изобразите участки на слайдах с помощью конфокального микроскопа, как описано ранее20. Изображайте участки в одной фокальной плоскости с 10-кратными, 20-кратными и 63-кратными целями. Захватите все изображения одного и того же животного, используя одни и те же параметры. Позаботьтесь о том, чтобы отрегулировать уровень лазера и настройки сбора изображений, чтобы избежать насыщения сигнала.
    3. Выполняйте обработку изображений с помощью программного обеспечения Fiji. Для иллюстрации отрегулируйте яркость, контрастность и гамму изображения с помощью профессионального программного обеспечения для редактирования изображений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Выполняя электропорацию ово на разных участках и на разных стадиях развития, мы добились селективного нокдауна FMRP либо на слуховой периферии, либо в слуховом стволе мозга.

Нокдаун FMRP в NM
Малая шпилька РНК (шРНК) против курицы Fmr1 была разработана и клонирована в векторную систему Тет-Он, как описано ранее20. Установка для электропорации in ovo показана на рисунке 1A. Плазмидную ДНК, окрашенную быстрым зеленым цветом, вводили в нервную трубку на уровне r5/r6 при HH12 (рисунок 1B-C). Платиновый биполярный электрод помещали с каждой стороны нервной трубки на уровне r5/6 (рисунок 1D). Два импульса при 12 В были доставлены для вбивания плазмиды в ткань вблизи положительной стороны электрода. Докс применяли на хориоаллантойной мембране, чтобы вызвать экспрессию ШРНК Fmr1 и EGFP. После 24 ч лечения Доксом EGFP был очевиден под флуоресцентным стереомикроскопом. На рисунке 1E-F показан пример на E3, когда Dox был применен на E2. Поперечные срезы подтвердили расположение EGFP экспрессирующих (EGFP+) клеток на одной стороне заднего мозга (рисунок 1G-H). Кроме того, группа трансфектированных клеток была обнаружена перед отоцистой; это были клетки черепного нервного гребня, мигрирующие вентролатерально из нервной трубки (рисунок 1F). Электропорированные эмбрионы также могут быть инкубированы дольше для изучения формирования цепи на более поздних стадиях. При E15 EGFP наблюдался в стволе мозга, но только на трансфектированной стороне (рисунок 1I-J). Поперечные сечения на уровне дорсального ствола мозга продемонстрировали горстку нейронов EGFP+, которые были разбросаны в НМ на стороне электропорации (рисунок 1L). Было замечено, что волокна EGFP+ проецируются к мишени нейронов NM: дорсальное ядро laminaris (NL) на ипсилатеральной стороне (Рисунок 1L) и вентральное NL на контралатеральной стороне (Рисунок 1K). Эффект нокдауна шРНК Fmr1 был подтвержден заметным снижением иммунореактивности FMRP в трансфектированных NM-нейронах по сравнению с соседними нетрансфектированными нейронами (рисунок 1M-N). В слуховом ганглии (AG) нейроны не были трансфектированы (EGFP-), хотя некоторые глиальные клетки, окружающие нейроны AG, были EGFP+ (рисунок 1O-P), предположительно полученными из клеток черепного нервного гребня EGFP+ (см. Рисунок 1F). Таким образом, эта стратегия электропорации обеспечивает селективную трансфекцию постсинаптических нейронов в цепи AG-NM.

Нокдаун FMRP в слуховом канале
Плазмидную смесь вводили в отоцисту в HH13 (рисунок 2A) с последующей электропорацией путем размещения положительной стороны электрода перед отоцистой и отрицательной стороны позади отоцисты (рисунок 2B). Целые головные участки на E6 продемонстрировали сильную флуоресценцию EGFP в правой отоцисте, но не в стволе мозга (рисунок 2C). Изолированные слуховые протоки в E9 демонстрировали обширную флуоресценцию EGFP по всей длине протока (рисунок 2D-E). На поперечных срезах клетки EGFP+ были подтверждены в базилярном сосочке (BP) вдоль стенки кохлеарного протока и в AG (рисунок 2F-G). Эффект нокдауна ШРНК Fmr1 был подтвержден выраженным снижением иммунореактивности FMRP в трансфектированных волосковых клетках (*, Рисунок 2H-J) по сравнению с соседними нетрансфектированными волосковыми клетками (•, Рисунок 2H-J). Для поддерживающих клеток иммунореактивность FMRP была слабой как в трансфектированных, так и в нетрансфектированных клетках (рисунок 2H-J). Подобно волосковым клеткам, иммунореактивность FMRP была в значительной степени снижена в трансфектированных нейронах AG по сравнению с соседними нетрансфектированными нейронами (рисунок 2K-M).

Затем мы отслеживали центральную проекцию трансфектированных нейронов AG на ствол мозга через слуховой нерв. Мозаичная картина трансфекции шРНК Fmr1 в АГ была дополнительно подтверждена на E6 с использованием иммунореактивности Islet-1 (Рисунок 3A), маркера для развивающегося внутреннего ухакурицы 31. Когда часть АГ извлекали со стволом мозга во время рассечения, изолированные нейроны EGFP+ AG и их волокна внутри ствола мозга визуализировали in situ в тех же препаратах (рисунок 3B-C). На поперечных сечениях на уровне НМ EGFP+ ANF достигли NM на E9 (рисунок 3D) и непрерывно наблюдались на E15 и E19 (рисунок 3E-F). Изображения с высоким увеличением показали рост конусообразных окончаний ANF в E9 (рисунок 3H), которые образовали большую пальмоподобную конечную бульбу в E15, прежде чем они выросли в характерную конечную балку морфологии Хельда со сложными ветвями на E19 (рисунок 3I-J). Помимо НМ, обширные ветви ANF были также замечены в NA, другом первичном кохлеарном ядре (рисунок 3E). Это было ожидаемо, так как одни и те же ANF раздваиваются, чтобы иннервировать как NM, так и NA у цыплят32. Мы также видели волокна EGFP+, попадающие в соседние вестибулярные группы клеток, включая нисходящее вестибулярное ядро (VeD), как показано на рисунке 3E. Хотя мы оптимизировали расположение электропорирующего электрода, чтобы предпочтительно нацеливаться на переднюю часть отоцисты, где образуется AG, некоторые вестибулярные ганглиозные нейроны также были трансфектированы. Иммуноокрашивание парвальбумина, маркера ANF у кур, может быть использовано для дифференциации слуховых и вестибулярных волокон в стволе мозга (рисунок 3F-G).

Таким образом, эта стратегия электропорации обеспечивает селективную трансфекцию пресинаптических нейронов в цепи AG-NM и может быть использована для отслеживания развития конечной бульбы Хелда на отдельных терминальных уровнях после генетических манипуляций.

Figure 1
Рисунок 1. ФМРП нокдаун в курице НМ. (A) Изображение электропорационной установки. (B) Схематический рисунок, показывающий участок микроинъекции на уровне ромбомера r5/6 куриного эмбриона HH12. Сокращения: NT = нервная трубка; SO = сомит. (C) Для улучшения видимости индийские чернила (черные) вводили под эмбрион шприцем. Плазмидная смесь, окрашенная быстрым зеленым цветом, затем вводилась в просвет нервной трубки. (D) Позиционирование биполярного электрода для электропорации. + и - указывают на положительную и отрицательную стороны соответственно. Отметим, синяя плазмидная смесь диффундирует в нервную трубку с положительной стороны после электропорации. (Е-Ф) Изображение яркого поля (BF) (E) слилось с каналом EGFP (F) электропорированного куриного эмбриона на эмбриональном дне 3 (E3), показывая трансфекцию в нервной трубке на том же переднезаднем уровне отосисты. Докс применяли при Е2, 6 ч после электропорации. Мигрирующие клетки черепного нервного гребня (ЧПУ) обозначены желтой стрелкой и увеличены во вставке в F. Шкала = 500 мкм в E, применяется к E и F; 100 мкм во вставке. (Г-Н) Трансфектированные клетки шРНК Fmr1 и EGFP на поперечном сечении трансфектированного эмбриона E3. Клетки EGFP+ были ограничены одной стороной нервной трубки. Участок был дважды окрашен иммунореактивностью FMRP (серый). Шкала bar = 40 мкм в G, применяется к G и H. (I-J) BF изображение (I) объединено с каналом EGFP (J) ствола мозга E15 после лечения Dox на E8. Шкала стержня = 1 мм в I, применяется к I и J. (K-L) Поперечное сечение ствола мозга E15 с нейронами EGFP + NM только на трансфектированной (транс) стороне. На контралатеральной (контра) стороне (K) аксоны EGFP+ были замечены в вентральной части ядра laminaris (NL). (М-Н) Изображения NM с высоким увеличением на E19 с двойной маркировкой FMRP (красный) и SNAP25 (синий) иммуноокрашивания. SNAP25 является пресинаптическим маркером, который маркирует конечную бульбу Хелда. Обратите внимание на заметное снижение иммунореактивности FMRP в трансфектированных (зеленых; *) нейронах по сравнению с соседними нетрансфектированными нейронами (•). (О-) Изображения слухового ганглия (AG) на E19 с высокой степенью увеличения с иммунореактивностью FMRP. Нейроны AG (AGN) не были трансфектированы (EGFP-). Некоторые глиальные клетки, полученные из клеток ЧПУ, указанных в F, были трансфектированы. Шкала bar = 10 мкм в M, применяется к M-P. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2. ФМРП нокдаун в курином слуховом протоке. (A) Изображение яркого поля (BF), показывающее микроинъекцию плазмид в отоцисту при HH13. Индийские чернила (черные) вводили под эмбрион для улучшения видимости. (B) Позиционирование биполярного электрода для электропорации. Положительная сторона (обозначенная символом плюс, +) была расположена перед отоцистой, а отрицательная сторона (обозначенная символом минус, -) была помещена сзади к отоцисте. (C) Поперечное сечение куриной головы на E6 было иммуноокрашено для FMRP (красный) и нейрофиламент (NF; синий). Докс применяли при Е3 после электропорации. Флуоресценция EGFP была обнаружена в отоцисте, но не в стволе мозга. Шкала = 100 мкм. (D-E) BF изображение (D) объединено с каналом EGFP (E) слухового канала при E9. Шкала = 500 мкм. (F-G) Поперечное сечение слухового протока E9 с иммуноокрашиванием FMRP (красный) и NF (синий). Клетки EGFP+ были замечены в стенке кохлеарного протока, базилярном сосочке (BP) и слуховом ганглии (AG). Шкала bar = 50 мкм в F, применяется к F и G. (H-J) Изображения с высоким увеличением E9 BP, показывающие значительно сниженную иммунореактивность FMRP в трансфектированных волосковых клетках (HCs; *) по сравнению с нетрансфектированными HCs (•). NF-положительные волокна (синие) были периферической иннервацией от нейронов AG. (К-М) Изображения с высоким увеличением нейронов AG в E9 с иммуноокрашивающим FMRP (красный). Иммунореактивность FMRP была сильной в нетрансфектированных нейронах (•) и не обнаруживалась в трансфектированных нейронах (EGFP+; *). Шкала bar = 50 мкм в H и применяется к H-M. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3. Аксональное отслеживание трансфектированных нейронов AG в стволе мозга. Эмбрионы были электропорированы в HH13 для трансфекции отоцисты ШРНК Fmr1 . Приложение Dox началось на E2. (A) Поперечные срезы куриной головки E6 с иммуноокрашивающим островком-1 и контрокрашиванием DAPI. Клетки EGFP+ были очевидны в слуховом ганглии (AG). Звезды* указывают на несколько трансфектированных нейронов AG во вставке. Шкала стержня = 100 мкм в А и 10 мкм во вставке. (Б-С) Изображение яркого поля (BF) (B) объединено с каналом EGFP (C) ствола мозга E9. В этом случае часть АГ (белые стрелки) оставляли связанной со слуховым стволом мозга. Желтая стрелка указывает на трансфектированные нейроны AG (AGN) во вставке. Волокна EGFP+ были очевидны на трансфектированной стороне ствола мозга. Шкала стержня = 1 мм в B, применяется к B и C; 100 мкм во вставке. (D) Поперечное сечение ствола мозга E9 на уровне, указанном в C пунктирной линией. Слуховые нервные волокна EGFP+ (ANF; зеленый) простирались вдоль дорсального края ствола мозга и приближались к магноцеллюлярному ядру (NM). Шкала стержней = 100 мкм. (E-G) волокон EGFP+ при E15 (E) и E19 (F-G). Некоторые волокна также были замечены в угловатом ядре (NA) и нисходящем вестибулярном ядре (VeD). Секции E19 окрашивали на иммунореактивность парвалбумина (PV) в качестве маркера для ANF. Пунктирная рамка в F увеличена во вставках, показывая EGFP + ANF, который был иммунореактивным PV. Шкала стержня = 100 мкм в E; 50 мкм в F, относится к F и G; 2 мкм во вставках. (Н-Дж) Изображения с высоким увеличением клемм ANF в NM на E9, E15 и E19, показывающие формирование и прогрессирующее созревание конечной bulb Хельда. Шкала bar = 5 мкм в H, применяется к H-J. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Для определения клеточно-автономной функции FMRP необходимо манипулировать его экспрессией в отдельных клеточных группах или типах клеток. Поскольку одной из основных функций FMRP является регулирование синаптического образования и пластичности, избирательное манипулирование каждым синаптическим компонентом определенной схемы является необходимым условием для полного понимания механизма FMRP в синаптической связи. Используя в овоэлектропорации куриных эмбрионов, мы продемонстрировали метод нацеливания экспрессии FMRP в цепи AG-NM, либо в пресинаптических нейронах AG, либо в постсинаптических нейронах NM. Чтобы достичь этого, выбор соответствующих стадий развития для электропорации и точное позиционирование электрода электропорации на эмбрионе являются критическими шагами. Нейроны НМ возникают из нейронных предшественников в нервной трубке на уровне r5/6 при HH1223. На той же стадии клетки черепного нервного гребня мигрируют от дорсальной оконечности нервной трубки к кохлеовестибулярному ганглию, чтобы окутать будущие нейроны AG33. Таким образом, как нейроны NM, так и клетки глии в AG являются производными от нервной трубки. Напротив, волосковые клетки и нейроны AG происходят из эктодермы24. Эктодерма, прилегающая к уровню r5/6, утолщается при HH10, а затем инвагинируется, образуя отическую чашу при HH13. Затем отическая чаша закрывается и отделяется от эктодермы, образуя отоцисту, причем передняя часть становится слуховым органом чувств, а задняя часть способствует вестибулярной системе. Как в слуховой, так и в вестибулярной частях клетки нейробластов, находящиеся в вентральной части отической чашечки, расслаиваются и мигрируют, образуя кохлеовестибулярный ганглий. Основываясь на этих исследованиях картирования судьбы, мы трансфицировали прародителей нейронов NM путем электропорации нервной трубки в HH12, стратегия, которая была установлена ранее 26,28,34. Хотя эта стратегия приводит к дополнительной трансфекции глиальных клеток в стволе мозга и АГ, ни один из нейронов АГ не был трансфектирован. Нейронально-специфическая трансфекция может быть достигнута путем использования промоторной стратегии Atoh1, как мы делали ранее21. Для селективной трансфекции нейронов AG мы электропорировали отоцисту в HH13. Плазмиды, вводимые в отическую чашу, преимущественно входили в переднюю часть отоцисты для трансфекции волосковых клеток и нейронов AG одновременно при позиционировании электродов, как показано на рисунке 2B. Чтобы предпочтительно нацеливать нейроны AG на волосковые клетки, возможно ввести плазмидный раствор прямо в область, прилегающую к передней отоцисте, где расслоенные нейробласты расположены35. Однако этот метод имеет более низкую эффективность трансфекции нейронов АГ по сравнению с инъекцией отоцисты, так как плазмиды быстро диффундируют после инъекции. Этот метод может также привести к дополнительной трансфекции окружающих головку мезенхимальных клеток. Одним из методов предпочтительного нацеливания волосковых клеток на нейроны AG является задержка инъекции отоцисты и электропорации до HH18 (что является ~ эмбриональным днем 3), поскольку большинство нейробластов (предшественников нейронов AG) мигрировали из отоцисты на этой стадии24.

С модификациями этот метод может быть расширен для изучения вестибулярной системы. Для вестибулярной ганглиозной трансфекции направление электродов, показанных на рисунке 2B , должно быть обращено вспять, чтобы трансфектировать заднюю часть отосисты из-за различного расположения слуховых и вестибулярных предшественников ганглия.

В ово электропорация куриных эмбрионов является хорошо зарекомендовавшей себя методикой исследования ранних стадий развития (в течение первой недели инкубации). Для долгосрочных исследований выживаемость является серьезной проблемой. При начале лечения Dox при E8 выживаемость, обнаруженная здесь, составляет ~ 60% при E9, но падает до 30% при E15 и еще ниже при E19. Детеныши из электропорированных яиц возможны, но редки и в большинстве случаев могут выжить только в течение нескольких дней. Для повышения выживаемости следует учитывать следующее: 1) использовать электропоратор, обеспечивающий квадратные волны вместо резких; 2) нанести одну или две капли стерильного PBS на верхнюю часть эмбриона, если слой альбумина недостаточно толстый, чтобы способствовать электропроводности (это поможет уменьшить электрическую травму); 3) вскрытие вителлиновой мембраны для обнажения эмбриона в месте инъекции не требуется для успешной трансфекции и может нанести вред эмбриону; 4) чтобы снизить риск загрязнения, используйте шприц, чтобы ткнуть парапленку и вводить Dox вместо повторного открытия окна. После инъекции протрите прозрачную пленку 75% этанолом и накройте отверстие иглы скотчем; 5) для трансфекции отоцисты вводят плазмиды в отоцисту дорсолатерально с помощью пипетки под углом 45°, чтобы избежать возможного прокола дорсальной аорты внизу. Если дорсальная аорта повреждена, кровотечение вымывает плазмиды и даже приводит к смерти; 6) по возможности избегайте использования индийских чернил для визуализации эмбриона. Меньшая управляемость и меньшее количество процедур приведут к более высокой выживаемости.

В дополнение к способности избирательно трансфектировать нейроны AG или NM, в ovo электропорация обеспечивает уникальную систему, которая позволяет проводить соседние сравнения для анализа данных. После электропорации трансфектируется только подмножество клеток в NM или AG, что позволяет окружающим нетрансфектированным клеткам в той же группе клеток служить идеальным контролем20. Если потенциальное взаимодействие между соседними нейронами является проблемой, аналоги нейронов с нетрансфектной стороны уха и мозга могут служить дополнительным контролем. Для гистологических и визуальных исследований этот результат позволяет анализировать данные с высокой эффективностью на уровне одной клетки или одного волокна. Молекулярный анализ также возможен в сочетании с флуоресцентной сортировкой клеток и крупномасштабным анализом белков и РНК, таким как масс-спектрометрия и секвенирование следующего поколения. Однако использование электропорации в ово в качестве средства редактирования генов может быть сложным для функциональных и поведенческих исследований, поскольку процент трансфектированных клеток в группе клеток может быть недостаточно большим, чтобы привести к функциональным последствиям.

При внедрении подхода электропорации in ovo необходимо выполнить два проверочных анализа. Во-первых, должно быть подтверждено влияние редактирования генов на интересующий белок. В ово электропорация трансфектирует только подмножество нейронов в NM или AG (т.е. мозаичный рисунок). Выполнение вестерн-блоттинга на гомогенизированных тканях, которые содержат смесь трансфектированных и нетрансфектированных нейронов, недостаточно чувствительно, чтобы точно отразить эффект нокдауна. Таким образом, валидация должна проводиться на индивидуальном клеточном уровне с использованием таких методов, как иммуноцитохимия. Для этой цели мы ранее генерировали антитело, которое распознает куриный FMRP. Специфичность этого антитела была подтверждена иммуноцитохимией и вестерн-блоттингом в предыдущем исследовании30. Эффект нокдауна шРНК Fmr1 был количественно подтвержден путем наблюдения значительного снижения интенсивности иммунореактивности FMRP в трансфектированных нейронах NM по сравнению с соседними нетрансфектированными нейронами. Во-вторых, контрольные группы, использующие скремблированные РНК или другие контрольные конструкции, должны быть использованы для подтверждения специфичности наблюдаемых клеточных эффектов неправильной экспрессии FMRP20,21. Для достижения этой цели мы разработали скремблированную шРНК, клонировали ее в ту же векторную систему Тет-Он и электропорировали в предшественники НМ, как описано ранее20. Экспрессия FMRP в нейронах NM, трансфектированных скремблированной шРНК, не была затронута, о чем свидетельствует неизменная интенсивность иммунореактивности FMRP по сравнению с соседними нетрансфектированными нейронами. Мы также определили ряд эффектов трансфекции ШРНК Fmr1 на рост аксонов, дендритную обрезку, терминальное образование и нейротрансмиссию (рассмотрено в Curnow and Wang, 2022)36. Мы пришли к выводу, что эти эффекты были вызваны именно автономной потерей FMRP клетками, потому что скремблированная шРНК не смогла вызвать аналогичные изменения.

В заключение, метод электропорации in ovo позволяет селективно редактировать ген Fmr1 с временным контролем и компонентной специфичностью в слуховых цепях ухо-ствол мозга и может быть модифицирован для манипулирования вестибулярной системой. Разработка этой передовой технологии в курином эмбрионе, хорошо зарекомендовавшей себя модели в биологии развития, способствовала и будет продолжать способствовать нашему пониманию развития мозга в нормальных и ненормальных условиях, таких как FXS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано: грантом Национального фонда естественных наук Китая (No 32000697); Научно-техническая программа Гуанчжоу (202102080139); Гуандунский фонд естественных наук (2019A1515110625, 2021A1515010619); Фонды фундаментальных исследований центральных университетов (11620324); Исследовательский грант Ключевой лаборатории регенеративной медицины, Министерство образования, Университет Цзинань (No. ZSYXM202107); Фонды фундаментальных исследований для центральных университетов Китая (21621054); и Фонд медицинских научных исследований китайской провинции Гуандун (20191118142729581). Благодарим медицинский экспериментальный центр Университета Цзинань. Мы благодарим доктора Терру Брэдли за тщательное редактирование рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Egg incubation
16 °C refrigerator MAGAT Used for fertilized egg storage.
Egg incubator SHANGHAI BOXUN GZX-9240MBE
Fertilized eggs Farm of South China Agricultural University Eggs must be used in one week for optimal viability.
Plasmid preparation
Centrifuge Sigma 10016
Fast green Solarbio G1661 Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.
Plasmid Maxi-prep kit QIAGEN 12162 Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889 Make 7.5M working solution in nuclase-free water.
Electroporation and Doxycycline Administration
Electroporator BTX ECM399
1 mL / 5 mL Syringe GUANGZHOU KANGFULAI
Dissecting microscope CNOPTEC SZM-42
Doxcycline Sigma-Aldrich D9891 Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C.
Glass capillary BEIBOBOMEI RD0910 0.9-1.1 mm*100 mm
Laboratory parafilm PARAFILM PM996 transparent film
Pipette puller CHENGDU INSTRUMENT FACTORY WD-2 Pulling condition: 500 °C for 15 s
Platinum elctrodes Home made 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
Rubber tube Sigma-Aldrich A5177
Tissue Dissection and Fixation
Forceps RWD F11020-11 Tip size: 0.05*0.01 mm
Other surgery tools RWD
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127 Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week.
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW 01673921 For black background plates, food-grade carbon powder is applied.
Sectioning
Cryostat LEICA CM1850
Gelatin Sigma-Aldrich G9391 From bovine skin.
Sliding microtome LEICA SM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse Abcam ab150113 1:500 dilution, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit Abcam ab150078 1:500 dilution, RRID: AB_2722519
DAPI Abcam ab285390 1: 1000 dilution
Fluoromount-G mounting medium Southern Biotech Sb-0100-01
FMRP antibody Y. Wang, Florida State University #8263 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242
Islet-1 antibody DSHB 39.3F7 1:100 dilution, RRID: AB_1157901
Netwell plate Corning 3478
Neurofilament antibody Sigma-Aldrich N4142 1:1000 dilution, RRID: AB_477272
Parvalbumin antibody Sigma-Aldrich P3088 1:10000 dilution, RRID: AB_477329
SNAP25 antibody Abcam ab66066 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052
Imaging
Adobe photoshop ADOBE image editing software
Confocal microscope LEICA SP8
Fluorescent stereomicroscope OLYMPUS MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0 OlYMPUS commercial image processing software package

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hagerman, R. J., et al. Fragile X syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065 (2017).
  2. Hinds, H. L., et al. Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome. Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).
  3. Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens. Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).
  4. Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).
  5. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
  6. Bakker, C. E., Oostra, B. A. Understanding fragile X syndrome: insights from animal models. Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).
  7. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
  8. Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).
  9. Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).
  10. Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).
  11. Higashimori, H., et al. Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).
  12. Hodges, J. L., et al. Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome. Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).
  13. Gonzalez, D., et al. Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).
  14. Bland, K. M., et al. FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner. Neurobiology of Disease. 150, 105253 (2021).
  15. Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation. Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).
  16. Pfeiffer, B. E., et al. Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2. Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).
  17. Deng, P. Y., et al. FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels. Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).
  18. Yang, Y. M., et al. Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain. Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).
  19. Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. Developmental studies in fragile X syndrome. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13 (2020).
  20. Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).
  21. Wang, X., et al. Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit. Development. 147 (21), (2020).
  22. Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
  23. Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).
  24. Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development. Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).
  25. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  26. Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e56628 (2017).
  27. Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53864 (2016).
  28. Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).
  29. Wang, X. Y., et al. High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo. Scientific Reports. 5, 18321 (2015).
  30. Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation. Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).
  31. Li, H., et al. Islet-1 expression in the developing chicken inner ear. Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).
  32. Carr, C. E., Boudreau, R. E. Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl. Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).
  33. Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells. Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).
  34. Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).
  35. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).
  36. Curnow, E., Wang, Y. New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology. Cells. 11 (10), 1628 (2022).

Tags

Неврология Выпуск 185 синдром хрупкой Х сенсорная схема внутреннее ухо кохлеарное ядро образование синапсов развитие мозга конечная бульба Хелда куриный эмбрион
Рассечение клеточно-автономной функции хрупкого белка умственной отсталости X в слуховой цепи с помощью электропорации <em>In Ovo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fan, Q., Zhang, X., Wang, Y., Wang,… More

Fan, Q., Zhang, X., Wang, Y., Wang, X. Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation. J. Vis. Exp. (185), e64187, doi:10.3791/64187 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter