Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Dissekere celle-autonom funksjon av skjøre X mental retardasjon protein i en auditiv krets ved i ovo elektroporering

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/64187
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1
1Division of Histology & Embryology, Key Laboratory for Regenerative Medicine of the Ministry of Education, College of Medicine, Jinan University, 2Department of Clinical Pathology, First Affiliated Hospital of Jinan University, 3Program in Neuroscience, Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University
* These authors contributed equally

Summary

Ved hjelp av ovo-elektroporering utviklet vi en metode for selektivt å transfektere det hørbare indre øret og cochleakjernen i kyllingembryoer for å oppnå en cellegruppespesifikk knockdown av skjørt X-mentalt retardasjonsprotein i diskrete perioder med kretsmontering.

Abstract

Fragile X mental retardation protein (FMRP) er et mRNA-bindende protein som regulerer lokal proteinoversettelse. FMRP-tap eller dysfunksjon fører til avvikende nevronale og synaptiske aktiviteter i fragilt X-syndrom (FXS), som er preget av intellektuell funksjonshemming, sensoriske abnormiteter og sosiale kommunikasjonsproblemer. Studier av FMRP-funksjon og FXS-patogenese er primært utført med Fmr1 (genet som koder for FMRP) knockout hos transgene dyr. Her rapporterer vi en in vivo-metode for å bestemme den celle-autonome funksjonen til FMRP i perioden med kretsmontering og synaptisk dannelse ved bruk av kyllingembryoer. Denne metoden benytter scene-, steds- og retningsspesifikk elektroporering av et legemiddelinduserbart vektorsystem som inneholder Fmr1 lite hårnåls-RNA (shRNA) og en EGFP-reporter. Med denne metoden oppnådde vi selektiv FMRP-knockdown i den auditive ganglion (AG) og i et av hjernestammemålene, kjernen magnocellularis (NM), og dermed gi en komponentspesifikk manipulasjon i AG-NM-kretsen. I tillegg tillater mosaikkmønsteret til transfeksjonen kontroller innen dyr og nærliggende nevron / fiber sammenligninger for økt pålitelighet og følsomhet i dataanalyse. Det induserbare vektorsystemet gir tidsmessig kontroll av genredigeringsstart for å minimere akkumulerende utviklingseffekter. Kombinasjonen av disse strategiene gir et innovativt verktøy for å dissekere den celle-autonome funksjonen til FMRP i synaptisk og kretsutvikling.

Introduction

Fragilt X-syndrom (FXS) er en nevroutviklingsforstyrrelse preget av intellektuell funksjonshemming, sensoriske abnormiteter og autistisk atferd. I de fleste tilfeller er FXS forårsaket av et globalt tap av skjøre X-mental retardasjonsprotein (FMRP; kodet av Fmr1-genet) som starter i tidlige embryonale stadier1. FMRP er et RNA-bindende protein som normalt uttrykkes i de fleste nevroner og gliaceller i hjernen, samt i sanseorganer 2,3,4. I pattedyrhjerner er FMRP sannsynligvis forbundet med hundrevis av mRNA som koder for proteiner som er viktige for ulike nevrale aktiviteter5. Studier av konvensjonelle Fmr1 knockout-dyr viste at FMRP-uttrykk er spesielt viktig for montering og plastisitet av synaptisk nevrotransmisjon6. Flere betingede og mosaiske knockoutmodeller har videre vist at FMRP-handlinger og signaler varierer på tvers av hjernegrupper, celletyper og synaptiske steder under flere utviklingshendelser, inkludert aksonal projeksjon, dendritisk mønster og synaptisk plastisitet 7,8,9,10,11,12,13,14 . Akutt funksjon av FMRP i regulering av synaptisk overføring ble studert ved intracellulær levering av hemmende FMRP-antistoffer eller FMRP selv i hjerneskiver eller dyrkede nevroner15,16,17,18. Disse metodene gir imidlertid ikke muligheten til å spore FMRP-feiluttrykksinduserte konsekvenser under utvikling. Dermed er det stort behov for å utvikle in vivo-metoder for å undersøke de celle-autonome funksjonene til FMRP, og forventes å bidra til å avgjøre om de rapporterte anomaliene hos FXS-pasienter er direkte konsekvenser av FMRP-tap i de tilknyttede nevronene og kretsene, eller sekundære konsekvenser avledet av nettverksomfattende endringer under utvikling19.

Den auditive hjernestammen til kyllingembryoer tilbyr en unik fordelaktig modell for dyptgående funksjonelle analyser av FMRP-regulering i krets- og synapseutvikling. Den enkle tilgangen til embryonale kyllinghjerner og den veletablerte i ovo elektroporeringsteknikk for genetisk manipulasjon har bidratt sterkt til vår forståelse av hjernens utvikling i tidlige embryonale stadier. I en nylig publisert studie ble denne teknikken kombinert med avanserte molekylære verktøy som tillater temporal kontroll av FMRP feiluttrykk20,21. Her er metodikken avansert for å indusere selektive manipulasjoner av presynaptiske og postsynaptiske nevroner separat. Denne metoden ble utviklet i den auditive hjernestammekretsen. Akustisk signal oppdages av hårceller i det hørbare indre øret og overføres deretter til den hørbare ganglion (AG; også kalt spiralganglion hos pattedyr). Bipolare nevroner i AG innerverer hårceller med sine perifere prosesser og sender i sin tur en sentral projeksjon (hørselsnerven) til hjernestammen hvor de avsluttes i to primære cochleakjerner, kjernen magnocellularis (NM) og nucleus angularis (NA). Nevroner i NM er strukturelt og funksjonelt sammenlignbare med de sfæriske buskcellene i pattedyrets anteroventrale cochleakjerne. Innenfor NM, auditive nervefibre (ANFs) synapse på somata av NM nevroner via den store endbulb av Held terminaler22. Under utviklingen oppstår NM-nevroner fra rhombomeres 5 og 6 (r5/6) i bakhjernen23, mens AG-nevroner er avledet fra neuroblaster bosatt i otocyst24. Her beskriver vi prosedyren for selektivt å slå ned FMRP-uttrykk i de presynaptiske AG-nevronene og i de postsynaptiske NM-nevronene separat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Egg og kyllingembryoer ble håndtert med forsiktighet og respekt i samsvar med dyreprotokollene godkjent av Jinan University Animal Care and Use Committee.

1. Egg- og plasmidpreparat

  1. Egg forberedelse
    1. Få ferske befruktede kyllingegg (Gallus gallus) fra South China Agricultural University og oppbevar ved 16 ° C før inkubasjon. For optimal levedyktighet, sett alle egg til inkubasjon innen en uke etter ankomst.
    2. Legg egg horisontalt og rug ved 38 °C i 46-48 timer til Hamburger og Hamilton (HH) etappe 1225 for nevralrørtransfeksjon, eller i 54-56 timer til HH13 for otocysttransfeksjon. Fordi eggets dyrepol er lettere enn den vegetabilske polen, plasserer horisontal plassering embryoet på toppen av egget for enkel manipulering. Vær forsiktig med å holde egget horisontalt i dette og alle følgende trinn.
    3. Plasseringen av embryoet vises som et mørkt område på eggeskallet når du kaster lys fra bunnen av egget ved hjelp av lommelykt. På de ønskede HH-stadiene, bruk denne lommelyktmetoden for å markere plasseringen av embryoet på eggeskallet med blyant.
    4. Tørk eggene med gasbind som inneholder 75% etanol. Bor et hull i den spisse enden av eggene ved hjelp av saksespissen og fjern 2 ml albumin med en 18 G nålsprøyte. Forsikre deg om at hullet bare er stort nok til å tillate nålinnsetting. Tørk bort lekkende albumin med gasbind og tett hullet med klar tape.
    5. For å minimere sprekker og for å forhindre fallende skallrester under vindu, dekk toppen av egg med klart tape, sentrert på det blyantmerkede mørke området.
  2. Plasmid DNA-ekstraksjon
    1. Klon kylling Fmr1 shRNA ved hjelp av et transposonbasert Tet-on-system som beskrevet tidligere20. Dette systemet inneholder tre plasmider: pCAGGS-T2TP, pT2K-CAGGS-rtTA-M2 og pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA, som gir et legemiddelinduserbart vektorsystem hvor uttrykket av Fmr1 shRNA og EGFP er stille etter transfeksjon og kan slås på ved doxycyklin (Dox) induksjon.
      MERK: Disse plasmidene er for øyeblikket ikke tilgjengelige i et depot. Forfatterne er enige om å gi plasmidene på rimelig forespørsel.
    2. Trekk ut plasmid-DNAer ved hjelp av et endotoksinfritt forberedelsessett i henhold til produsentens instruksjon og utfelling ved å tilsette 1/15 volum av 7,5 M natriumacetat og 1 volum på 100% isopropanol.
    3. Utfelling av plasmider ved -20 °C over natten og sentrifuge ved 13 000 x g i 10 minutter. Oppløs pelleten med Tris-EDTA-bufferen som følger med i settet til en endelig konsentrasjon på 4-5 μg / μL. Plasmider kan lagres ved -20 ° C i 12 måneder uten redusert transfeksjonseffektivitet.
    4. På dagen for elektroporering blandes 2 μL av hvert plasmid grundig i et sterilt sentrifugerør ved hjelp av en pipettespiss. Det resulterende 6 μL-volumet av plasmidblandingen er nok til å elektroporere tre dusin egg. For å visualisere plasmidet under elektroporering, tilsett 1 μL 0,1% rask grønn (fremstilt i steril ddH2O) for hver 6 μL DNA-blanding26, som gjør plasmidblandingen blå.

2. I ovo elektroporering

  1. Eggvindu og embryoidentifikasjon
    1. På dagen for elektroporering, fjern eggene fra inkubatoren, et dusin egg om gangen. Å holde egg ut av inkubatoren i mer enn 1 time introduserer utviklingsvariasjoner og reduserer levedyktigheten.
    2. Tørk alle kirurgiske verktøy med gasbind som inneholder 75% etanol.
    3. Legg hvert egg i en skreddersydd skumholder. Tørk av det tapedekkede området med 75 % etanol og klipp et vindu (1–2 cm2) rundt omkretsen av blyantmerket med en liten saks (figur 1A). Når du klipper, hold saksen flat for å unngå å skade embryoet under.
    4. Plasser vindusegget under et stereomikroskop med et 10x okular og 2x zoom og identifiser embryoet. Juster vinkelen og lysstyrken på lyskilden for bedre visualisering.
      MERK: Det krever øvelse og erfaring å visualisere embryoet og identifisere nevrale røret på dette stadiet.
      1. For nybegynnere, bruk følgende valgfrie blekkinjeksjon for å lette embryoidentifikasjon. Forbered 10% indisk blekkløsning i 0,01 M fosfatbufret saltvann (PBS) og autoklav på forhånd. Fyll en 1 ml sprøyte med blekkoppløsningen og sett deretter på en 27G kanyle. Bøy nålen i en vinkel på 45° med tang.
      2. Under mikroskopet, stikk forsiktig fra kanten av området opaca og stikk nålen under embryoet. Injiser ~ 50 μL blekk, som vil diffundere under området pellucida for embryo visualisering. Blekket vil danne en mørk bakgrunn for en klar visualisering av embryoet.
        MERK: Fjern luften fra sprøyten før innsetting og injeksjon. Når du er dyktig til å visualisere, unngå blekkinjeksjonstrinnet, da det reduserer overlevelsesraten.
  2. Neural tube injeksjon og elektroporering
    MERK: Denne prosedyren utføres ved HH12 for transfeksjon av NM-nevroner i hjernestammen.
    1. Trekk glasskapillærene (~ 1 mm i diameter og 100 mm lange) inn i pipetter ved hjelp av en pipettetrekker. Under et dissekeringsmikroskop åpner du forsiktig spissen av kapillærnålen til 10-20 μm i diameter med tang. Oppbevar pipettene (vanligvis 5-10 på en gang) i en oppbevaringsboks til bruk.
    2. Fyll en kapillærpipette med 0,5-1 μL av plasmidblandingen ved å påføre undertrykk gjennom et gummirør på enden av pipetten. Dette kan oppnås med en sprøyte eller luftpumpe.
    3. Plasser egget under mikroskopet slik at embryoet er vertikalt orientert med halen nær deg (eller horisontalt for injeksjon av kapillære pipetter ved hjelp av en treakset manipulator). Hold kapillærpipetten med en hånd eller med den treaksede manipulatoren og kjør pipettens spiss til r5/6 i hale-til-hode-retning.
      MERK: Det mest fremre bakhjerneområdet er r1 og hver påfølgende bule langs nevrale røret er en individuell rhombomere. R5/6 er på samme anteroposteriornivå som otocysten, som er en lett gjenkjennelig kopplignende struktur (figur 1B-C).
    4. Stikk spissen forsiktig gjennom vitellinmembranen og inn i dorsale nevrale røret og trekk deretter pipetten litt slik at spissen er i lumen i nevrale røret. Injiser plasmidblandingen ved å påføre lufttrykk til det tonede plasmidet diffunderer helt inn i r5/6 og strekker seg inn i r3 og r4.
      MERK: Det er ikke nødvendig å lage et spor på vitellinmembranen til injeksjon.
    5. Se etter en vellykket injeksjon, som oppnås når den blå plasmidoppløsningen raskt diffunderer ned i nevrale røret uten å lekke (figur 1B-C). Når lekkasje oppstår, blekner det blå raskt.
    6. Umiddelbart etter injeksjonen, plasser en platina bipolar elektrode på hver side av nevrale røret (figur 1D). Levér to pulser av 12 V og 50 ms varighet med en elektroporator. Vær oppmerksom på luftbobler i enden av den bipolare elektroden, med mer på den negative siden.
    7. Kontroller for vellykket elektroporering, som oppnås når den tonede plasmidblandingen kommer inn i nevralrørsvevet nær den positive siden av elektroden. Etter elektroporering, fjern forsiktig den bipolare elektroden.
    8. Dekk vinduet på eggeskallet med et stykke gjennomsiktig film som er forhåndsskåret i 2 i firkanter og sprayet med 75% etanol. Plasser egget tilbake i inkubatoren.
    9. Rengjør den bipolare elektroden ved å levere 10-20 pulser av 12 V og 50 ms varighet i saltvann før du går videre til neste egg.
  3. Otocyst injeksjon og elektroporering
    MERK: Denne prosedyren utføres på HH13 for transfecting hårceller og AG nevroner i det indre øret.
    1. På HH13 (som er ~ embryonal dag 2,5), har embryoet snudd slik at høyre side av hodet vender opp. Under mikroskopet, plasser egget slik at embryoet er vertikalt, med halen nær deg. Hold kapillærpipetten og stikk forsiktig høyre otocyst i dorsolateral retning (figur 2A).
      MERK: På dette stadiet vises otocysten som en liten sirkulær struktur på toppen av kroppen på samme anteroposteriornivå som r5/6.
    2. Injiser plasmidblandingen med lufttrykk til otocysten er fylt med blå løsning27. Sjekk for en vellykket injeksjon, som oppnås når den blå plasmidblandingen er begrenset i otocysten og ikke lekker.
    3. Umiddelbart etter injeksjonen, plasser den bipolare elektroden på otocysten som vist i figur 2B. Plasser de positive og negative sidene henholdsvis fremre og bakre til otocysten. Lever to pulser av 12 V og 50 ms varighet med elektroporatoren.
    4. Kontroller for vellykket elektroporering, som oppnås når den blå plasmidblandingen kommer inn i otocystens vev nær den positive siden av elektroden. Etter elektroporering, fjern forsiktig den bipolare elektroden. Dekk vinduet på eggeskallet med en gjennomsiktig film og returner egget til inkubatoren.

3. Administrering av Dox for å initiere og opprettholde plasmidtranskripsjon

  1. Tilberedning av Dox-oppløsningen
    1. Mål 100 mg Dox pulver under en kjemisk hette og oppløs det i 100 ml steril PBS for å lage en 1 mg / ml arbeidsløsning. Filtrer oppløsningen med et 0,22 μm filter og oppbevar 1 ml aliquots ved -20 °C. Beskytt mot lys20,28.
  2. Administrering av Dox
    1. For full styrke genredigering, ved 24 timer før ønsket alder, tine en Dox aliquot på is. Slipp 50 μL Dox direkte på eggets chorioallantoiske membran ved hjelp av en sprøyte som trenger inn i den gjennomsiktige filmen. Forsegl kanylehullet med gjennomsiktig film eller tape etter injeksjonen.
    2. For å opprettholde knockdown-effekten, administrer Dox annenhver dag til vevshøsting på ønsket utviklingsstadium.

4. Vevsdisseksjon og seksjonering

  1. Hjernestammen
    1. For embryoer på embryonalt stadium 3 (E3) og E6, åpne eggeskallet og klipp den tilhørende membranen med saks. Skje embryoet ut og senk det i 4% paraformaldehyd (PFA) i 0,1 M fosfatbuffer.
    2. For E9-embryoer, åpne eggeskallet, halshugg embryoet med saks, og overfør hodet til en silisiumbunnet plate fylt med PBS. Fest hodet ned gjennom banene og kutt toppen av skallen fra hverandre. Plasser tangen forsiktig under hjernen fra begge sider og løft hele hjernen fra skallen med skuldrene på tangen. Fordyp hjernen i 4% PFA.
    3. For E15- og E19-embryoer, åpne eggeskallet, halshugg embryoet med saks og legg hodet på en silisiumbunnet plate fylt med PBS. Klipp opp huden på toppen av hodet for å eksponere skallen.
    4. Snitt gjennom skallen vertikalt med en barberhøvel for å skille forhjernen og kaudalhjernen. Fordyp kaudalblokken i PBS, fjern toppen av skallen, og ta deretter hjernen av skallen.
    5. Fest hjernen ned gjennom optisk lobe og skille cerebellum og hjernestamme. Pass på at du ikke skader den hørbare hjernestammen, som ligger rett under lillehjernen. Fjern så mye dura som mulig fra hjernestammen og senk den deretter ned i 4% PFA.
    6. Hold embryoer og hjernevev i 4% PFA ved 4 ° C over natten bortsett fra E19 hjernestammer, som bør holdes under samme tilstand i 24 timer.
    7. Etter fiksering, dehydrer vevet i PBS som inneholder 30% sukrose til det legger seg, noe som vanligvis tar 1-3 dager, avhengig av alder.
    8. Seksjon hjernestammen (E15 og E19) ved 30 μm ved koronalplanet ved hjelp av en glidende mikrotom. Samle seksjoner i PBS og oppbevar ved 4 ° C før immunostaining.
    9. For E3- og E6-embryoer og E9-hjernestammer, seksjon ved 50 μm på tvers. Samle seksjoner i PBS og oppbevar ved 4 ° C. Monter seksjonene på gelatinbelagte mikroskopglass før immunostaining. Innsamling av tykkere seksjoner for disse aldrene letter vevshåndtering.
  2. Auditiv kanal
    1. Etter å ha fjernet hjernestammene fra E9, E15 og E19 embryoer, er hørselskanalen, som er innebygd i tinningbenet, lett identifiserbar liggende under skallen, og tinningbenet er lett skilles fra den omkringliggende skallen. For E9-embryoer, fest hele tinningbenet i 4% PFA. For eldre embryoer, fjern den benete strukturen i tinningbenet for å isolere hørselskanalen og fikse hørselskanalen i 4% PFA.
    2. Hold alle tinningbein og hørselskanaler i 4% PFA ved 4 ° C over natten før vevsinnlegging.
    3. Utfør vevsinnbygging som beskrevet. Forbered innebyggingsløsningen som følger: Bløtlegg 10% gelatin (fra storfehud) i kaldt vann til gelatingranulatene svulmer og legger seg (ca. 30 min). Varm blandingen til ~ 50 ° C for å oppløse gelatinen og tilsett 20% sukrose i gelatinoppløsningen og rør for å oppløse. Oppbevar gelatin-sukroseoppløsningen ved 4 °C i opptil en måned.
    4. For bruk, varm gelatin-sukrose-løsningen ved 37 ° C. Bløtlegg de temporale bein/hørselskanalene i den varme gelatin-sukrose-løsningen på en 96-brønns plate ved 37 °C til de legger seg, vanligvis 30-60 min.
    5. Linje bunnen av brønnene på en 12-brønns plate med en stripe gjennomsiktig film. Tilsett et lag med varm gelatin-sukroseløsning og vent til den stivner. Overfør en temporal bein / hørbar kanal til hver brønn.
    6. Implanter vevet med et andre lag med varm gelatin-sukroseoppløsning. Juster vevets posisjon slik at den er i midten av gelen og hørselskanalen er orientert horisontalt. Flytt platen forsiktig inn i et 4 °C kjøleskap og vent til gelen er fast.
    7. Trekk den gjennomsiktige filmstrimmelen for å flytte gelvevsblokken ut av brønnen. Trim ekstra gel i en firkantet blokk og kutt et hjørne av blokken for å identifisere retningen. Pakk gelatinblokken med et stykke folie, frys på tørris, og oppbevar deretter ved -80 ° C til seksjonering.
    8. Seksjon blokken ved 20 μm langs lengdegraden til hørselskanalen med en kryostat. Monter seksjonene direkte på gelatinbelagte mikroskopglass. Oppbevar lysbildene ved -80 °C før immunstaining.
    9. Før immunstaining, senk lysbildene i forvarmet PBS (45 ° C) i 5 minutter for å oppløse gelatinen, og vask deretter lysbildene 3x med romtemperatur PBS for å fjerne gjenværende gelatin.

5. Immunostaining og mikroskop imaging

MERK: To typer immunostaining utføres avhengig av om seksjoner er montert på lysbilder eller frittflytende i PBS.

  1. Immunostaining på lysbilder
    1. Vask lysbildene 3x i 10 minutter hver med PBS. Sirkle rundt regionen som inneholder seksjonene med en oljepenn for å forhindre væskelekkasje under farging. Dekk seksjonene med en blokkerende løsning som inneholder 5% normalt geiteserum i PBS og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur.
    2. Fortynn de primære antistoffene (for den endelige konsentrasjonen som brukes, se materialtabell) i PBS som inneholder 0,3% TritonX-100 og 5% normalt geitserum. Fjern blokkeringsløsningen og dekk deretter seksjonene med den primære antistoffløsningen. Inkuber lysbildene ved 4 °C over natten i en boks med et lag destillert vann i bunnen.
    3. Skyll lysbildene 3x i 10 minutter med PBS. Påfør fluorescerende sekundære antistoffer fortynnet ved 1:500 i PBS som inneholder 0,3% TritonX-100 på lysbilder. Inkuber lysbildene ved romtemperatur i 4 timer, skjermet mot lys.
    4. Vask lysbildene 3x med PBS. Slipp forsiktig to dråper monteringsmedium på lysbildene og dekk seksjonene med deksler. Pass på at det ikke genereres luftbobler mellom dekselet og lysbildet.
  2. Immunostaining for helmonterte embryoer og frittflytende seksjoner
    1. Vask embryoene/seksjonene med PBS 3x i 10 minutter hver i en brønnplate. Fortynn de primære antistoffene i PBS som inneholder 0,3% TritonX-100 og 5% normalt geitserum i sentrifugalrør. Overfør hvert embryo/seksjon til et rør med glasskrok og inkuber på en shaker ved 60 o/min over natten ved 4 °C.
    2. Vask embryoer/seksjoner 3x med PBS i 10 minutter hver i en brønnplate. Overfør hvert embryo/seksjon til et mørkt sentrifugalrør fylt med fluorescerende sekundær antistoffløsning og inkuber ved romtemperatur i 4 timer på shakeren.
    3. Vask embryoene/seksjonene 3x med PBS i en brønnplate. Bruk en børste til å montere seksjonene på gelatinbelagte mikroskopglass i en 15 cm tallerken som inneholder PBS. Etter at lysbildene er tørket litt (~ 5 min), bruk to dråper monteringsmedium og legg et deksel. Pass på at det ikke genereres luftbobler mellom dekselet og lysbildet. Hold hele monteringsvevet i PBS for avbildning.
  3. Imaging
    1. Bilde hele monteringsvevet i PBS i en tallerken med silisiumbunn som inneholder karbonpulver, som gir en svart bakgrunn. Ta og behandle bilder ved hjelp av en kommersiell Olympus-programvarepakke for bildebehandling, som beskrevet tidligere29.
    2. Bilde seksjonene på lysbildene med et konfokalt mikroskop som beskrevet tidligere20. Bilde seksjonene på et enkelt fokalplan med 10x, 20x og 63x mål. Ta alle bilder fra samme dyr ved hjelp av de samme parametrene. Pass på å justere innstillingene for lasernivå og bildeopptak for å unngå signalmetning.
    3. Utfør bildebehandling ved hjelp av Fiji-programvaren. For illustrasjon, juster bildets lysstyrke, kontrast og gamma ved hjelp av en profesjonell bilderedigeringsprogramvare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved å utføre i ovo-elektroporering på forskjellige steder og på forskjellige utviklingsstadier, oppnådde vi selektiv FMRP-knockdown enten i den hørbare periferien eller i den auditive hjernestammen.

FMRP knockdown i NM
Liten hårnål RNA (shRNA) mot kyllingen Fmr1 ble designet og klonet inn i Tet-On vektorsystemet som beskrevet tidligere20. Oppsettet for in ovo elektroporering er vist i figur 1A. Plasmid-DNA farget med rask grønn ble injisert i nevrale røret på r5 / r6-nivå ved HH12 (figur 1B-C). En platinabipolar elektrode ble plassert på hver side av nevrale røret på r5/6-nivå (figur 1D). To pulser ved 12 V ble levert for å drive plasmidet inn i vevet nær den positive siden av elektroden. Dox ble påført på chorioallantoic membranen for å utløse uttrykket av Fmr1 shRNA og EGFP. Etter 24 timers Dox-behandling ble EGFP påvist under et fluorescerende stereomikroskop. Figur 1E-F viser et eksempel på E3 da Dox ble brukt på E2. Tverrgående seksjoner bekreftet plasseringen av EGFP-uttrykkende (EGFP +) celler på den ene siden av bakhjernen (figur 1G-H). I tillegg ble en gruppe transfiserte celler funnet fremre til otocysten; disse var kraniale nevrale kamceller som migrerte ventrolateralt fra nevrale rør (figur 1F). Elektroporerte embryoer kan også inkuberes lenger for å studere kretsdannelse på senere stadier. Ved E15 ble EGFP observert i hjernestammen, men bare på transfisert side (figur 1I-J). Tverrsnitt på nivået av den dorsale hjernestammen viste en håndfull EGFP+-nevroner som var spredt i NM på siden av elektroporering (figur 1L). EGFP+-fibre ble sett projisere til målet for NM-nevroner: dorsalkjernen laminaris (NL) på den ipsilaterale siden (figur 1L) og ventral NL på kontralateral side (figur 1K). Knockdown-effekten av Fmr1 shRNA ble validert ved markerte reduksjoner i FMRP-immunreaktivitet i transfiserte NM-nevroner sammenlignet med nærliggende ikke-transfekterte nevroner (figur 1M-N). I den auditive ganglion (AG) var nevroner ikke-transfisert (EGFP-), selv om noen gliaceller rundt AG-nevroner var EGFP + (figur 1O-P), antagelig avledet fra EGFP + kraniale nevrale kamceller (se figur 1F). Dermed gir denne elektroporeringsstrategien en selektiv transfeksjon av de postsynaptiske nevronene i AG-NM-kretsen.

FMRP-knockdown i hørselskanalen
Plasmidblandingen ble injisert i otocysten ved HH13 (figur 2A), etterfulgt av elektroporering ved å plassere den positive siden av elektroden foran til otocysten og den negative siden bakre til otocysten (figur 2B). Helhodeseksjoner ved E6 viste sterk EGFP-fluorescens i høyre otocyst, men ikke i hjernestammen (figur 2C). Isolerte hørselskanaler ved E9 viste omfattende EGFP-fluorescens gjennom hele kanalens lengde (figur 2D-E). På tverrsnitt ble EGFP+-celler bekreftet i basilar papilla (BP) langs veggen i cochleakanalen og i AG (figur 2F-G). Knockdown-effekten av Fmr1 shRNA ble validert ved markerte reduksjoner i FMRP-immunreaktivitet i transfiserte hårceller (*, figur 2H-J) sammenlignet med nærliggende ikke-transfiserte hårceller (•, figur 2H-J). For støtteceller var FMRP-immunreaktiviteten svak i både transfekterte og ikke-transfiserte celler (figur 2H-J). I likhet med hårceller ble FMRP-immunoreaktiviteten i stor grad redusert i transfiserte AG-nevroner sammenlignet med nærliggende ikke-transfekterte nevroner (figur 2K-M).

Vi sporet deretter den sentrale projeksjonen av transfiserte AG-nevroner til hjernestammen via hørselsnerven. Mosaikkmønsteret av Fmr1 shRNA-transfeksjon i AG ble videre bekreftet ved E6 ved bruk av Islet-1 immunoreaktivitet (figur 3A), en markør for utviklingen av kyllingens indre øre31. Når en del av AG ble ekstrahert med hjernestammen under disseksjon, ble isolerte EGFP + AG-nevroner og deres fibre i hjernestammen visualisert in situ i de samme preparatene (figur 3B-C). På tverrsnitt på NM-nivå hadde EGFP+ ANF-er nådd NM ved E9 (figur 3D) og ble kontinuerlig observert ved E15 og E19 (figur 3E-F). Bilder med høy forstørrelse avslørte vekstkeglelignende avslutninger av ANF-er ved E9 (figur 3H), som dannet den store palmelignende endbulben ved E15 før de vokste til den karakteriserte endbulben til Held-morfologi med komplekse grener ved E19 (figur 3I-J). Utover NM ble det også sett omfattende grener av ANF-er i NA, en annen primær cochleakjerne (figur 3E). Dette var forventet, da de samme ANF-ene bifurcate å innervate både NM og NA hos kyllinger32. Vi så også EGFP + -fibre komme inn i de tilstøtende vestibulære cellegruppene, inkludert den synkende vestibulære kjernen (VeD) som vist i figur 3E. Selv om vi optimaliserte plasseringen av elektroporatingelektroden for å fortrinnsvis målrette mot den fremre delen av otocysten der AG dannes, ble noen vestibulære ganglionneuroner også transfisert. Immunostaining for parvalbumin, en markør for ANF hos kyllinger, kan brukes til å skille auditive vs. vestibulære fibre i hjernestammen (figur 3F-G).

Oppsummert gir denne elektroporeringsstrategien en selektiv transfeksjon av de presynaptiske nevronene i AG-NM-kretsen og kan brukes til å spore utviklingen av endbulb av Held på individuelle terminalnivåer etter genetiske manipulasjoner.

Figure 1
Figur 1. FMRP knockdown i kylling NM. (A) Bilde av elektroporeringsoppsett. (B) Skjematisk tegning som viser mikroinjeksjonsstedet ved rhombomere r5/6-nivået til et HH12 kyllingembryo. Forkortelser: NT = nevrale rør; SO = somite. (C) For økt synlighet ble indisk blekk (svart) injisert under embryoet med en sprøyte. Plasmidblanding tonet med rask grønn ble deretter injisert i lumen i nevrale røret. (D) Posisjonering av den bipolare elektroden for elektroporering. + og - angi henholdsvis de positive og negative sidene. Merk at den blå plasmidblandingen diffundert inn i nevrale røret på den positive siden etter elektroporering. (EF) Bright field (BF) bilde (E) fusjonerte med EGFP-kanal (F) av et elektroporert kyllingembryo på embryonal dag 3 (E3), som viser transfeksjon i nevrale røret på samme anteroposterior nivå av otocysten. Dox ble påført på E2, 6 timer etter elektroporeringen. Migrerende kraniale nevrale crest (CNC) celler er indikert med den gule pilen og forstørret i innfelt i F. Skalalinje = 500 μm i E, gjelder for E og F; 100 μm i innfelt. (G-H) Transfiserte celler med Fmr1 shRNA og EGFP på tverrsnittet av et transfisert E3-embryo. EGFP+-celler var begrenset på den ene siden av nevrale røret. Seksjonen var dobbeltfarget med FMRP immunoreaktivitet (grå). Skalabar = 40 μm i G, gjelder G og H. (I-J) BF-bilde (I) fusjonert med EGFP-kanal (J) av en E15 hjernestamme etter Dox-behandling ved E8. Skalabar = 1 mm i I, gjelder kun I og J. (K-L) Tverrsnitt av en E15 hjernestamme med EGFP + NM-nevroner på transfected (trans) side. På kontralateral (contra) side (K) ble EGFP+ aksoner sett i den ventrale delen av nucleus laminaris (NL). (M-N) Høyforstørrelsesbilder av NM ved E19 med dobbeltmerking av FMRP (rød) og SNAP25 (blå) immunostaining. SNAP25 er en presynaptisk markør som merker endbulben til Held. Legg merke til den markerte reduksjonen av FMRP-immunreaktivitet i de transfekterte (grønne; *) nevronene sammenlignet med nærliggende ikke-transfekterte nevroner (•). (O-P) Bilder med høy forstørrelse av hørselsganglion (AG) ved E19 med FMRP-immunreaktivitet. AG-nevroner (AGN) ble ikke transfisert (EGFP-). Noen gliaceller avledet fra CNC-celler indikert i F ble transfisert. Skala bar = 10 μm i M, gjelder for M-P. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2. FMRP knockdown i kylling hørselskanalen. (A) Bright field (BF) bilde som viser mikroinjeksjon av plasmider i otocyst ved HH13. Indisk blekk (svart) ble injisert under embryoet for økt synlighet. (B) Posisjonering av den bipolare elektroden for elektroporering. Den positive siden (merket med et plusssymbol, +) ble plassert fremre til otocysten, og den negative siden (merket med et minussymbol, -) ble plassert bakre til otocysten. (C) Tverrgående del av et kyllinghode ved E6 ble immunfarget for FMRP (rød) og nevrofilament (NF; blå). Dox ble påført på E3 etter elektroporeringen. EGFP-fluorescens ble påvist i otocysten, men ikke i hjernestammen. Skalalinje = 100 μm. (D-E) BF-bilde (D) fusjonert med EGFP-kanal (E) av en hørselskanal ved E9. Skalabar = 500 μm. (F-G) Tverrgående del av en E9 hørselskanal med FMRP (rød) og NF (blå) immunostaining. EGFP+-celler ble sett i cochleakanalveggen, basilar papilla (BP) og auditiv ganglion (AG). Skalabar = 50 μm i F, gjelder F og G. (H-J) Høyforstørrelsesbilder av en E9 BP som viser stort sett redusert FMRP-immunreaktivitet i transfiserte hårceller (HCs; *) sammenlignet med ikke-transfiserte HCs (•). NF-positive fibre (blå) var periferiens innervering fra AG-nevroner. (KM) Bilder med høy forstørrelse av AG-nevroner ved E9 med FMRP-immunostaining (rød). FMRP-immunreaktivitet var sterk i ikke-transfiserte nevroner (•) og kunne ikke påvises i transfiserte nevroner (EGFP+; *). Skalalinje = 50 μm i H, og gjelder for H-M. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3. Axonal sporing av transfiserte AG-nevroner i hjernestammen. Embryoer ble elektroporert ved HH13 for otocysttransfeksjon av Fmr1 shRNA. Dox-applikasjonen startet på E2. (A) Tverrgående seksjoner av et E6 kyllinghode med Islet-1 immunostaining og DAPI counterstain. EGFP+-celler var tydelige i den auditive ganglionen (AG). Stjerner* indikerer flere transfiserte AG-nevroner i innfellingen. Skalabar = 100 μm i A og 10 μm i innfelt. (BC) Bright field (BF)-bilde (B) slått sammen med EGFP-kanal (C) av en E9-hjernestamme. I dette tilfellet ble en del av AG (hvite piler) igjen koblet til den auditive hjernestammen. Gul pil indikerer transfiserte AG-nevroner (AGN) i innfellingen. EGFP+-fibrene var tydelige på den transfiserte siden av hjernestammen. Skalastang = 1 mm i B, gjelder B og C; 100 μm i innfelt. (D) Tverrsnitt av E9-hjernestammen på nivået angitt i C med stiplet linje. EGFP+ hørselsnervefibre (ANF; grønn) strakte seg langs hjernestammens dorsale margin og nærmet seg kjernen magnocellularis (NM). Skalabar = 100 μm. (E-G) EGFP+-fibre ved E15 (E) og E19 (F-G). Noen fibre ble også sett i nucleus angularis (NA) og den synkende vestibulære kjernen (VeD). E19-seksjoner ble farget for parvalbumin (PV) immunreaktivitet som markør for ANF. Den stiplede boksen i F er forstørret i innfeltene, og viser en EGFP + ANF, som var PV immunoreaktiv. Skala bar = 100 μm i E; 50 μm i F, gjelder for F og G; 2 μm i innfeltene. (H-J) Bilder med høy forstørrelse av ANF-terminaler i NM ved E9, E15 og E19, som viser dannelsen og den progressive modningen av endbulben til Held. Skalabar = 5 μm i H, gjelder H-J. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For å bestemme den celle-autonome funksjonen til FMRP, er det nødvendig å manipulere uttrykket i individuelle cellegrupper eller celletyper. Siden en av hovedfunksjonene til FMRP er å regulere synaptisk formasjon og plastisitet, er selektiv manipulering av hver synaptisk komponent i en bestemt krets en forutsetning for en full forståelse av FMRP-mekanismen i synaptisk kommunikasjon. Ved hjelp av ovo-elektroporering av kyllingembryoer demonstrerte vi en metode for å målrette FMRP-uttrykk i AG-NM-kretsen, enten i presynaptiske AG-nevroner eller postsynaptiske NM-nevroner. For å oppnå dette er det kritiske trinn å velge passende utviklingsstadier for elektroporering og nøyaktig posisjonering av elektroporeringselektroden på embryoet. NM-nevroner oppstår fra nevrale forfedre i nevrale røret på r5/6-nivå ved HH1223. På samme stadium migrerer kraniale nevrale kamceller fra dorsalspissen av nevrale røret til cochleovestibulær ganglion for å omslutte fremtidige AG-nevroner33. Dermed er både NM-nevronene og gliacellene i AG nevrale rør avledet. I motsetning til dette stammer hårceller og AG-nevroner fra ektodermen24. Ektodermen ved siden av r5/6-nivået tykner ved HH10 og invaginerer deretter for å danne den otiske koppen ved HH13. Den otiske koppen lukkes og separeres deretter fra ektodermen for å danne otocysten, med den fremre delen som det hørbare sensoriske organet og den bakre delen bidrar til vestibulær system. I både de hørbare og vestibulære delene deaminerer neuroblastcellene som bor i den ventrale delen av otisk kopp og migrerer for å danne cochleovestibulær ganglion. Basert på disse skjebnekartleggingsstudiene transfiserte vi forfedrene til NM-nevroner ved å elektropodere nevralrøret ved HH12, en strategi som tidligere er etablert26,28,34. Selv om denne strategien fører til ytterligere transfeksjon av gliaceller i hjernestammen og AG, ble ingen av AG-nevronene transfisert. Neuronal-spesifikk transfeksjon kan oppnås ved å bruke en Atoh1 promotordrevet strategi, som det vi gjorde tidligere21. For selektiv transfeksjon av AG-nevroner elektroporerte vi otocysten ved HH13. Plasmider injisert i otisk kopp kom hovedsakelig inn i den fremre delen av otocysten for hårcelle- og AG-nevrontransfeksjon samtidig ved plassering av elektroder som vist i figur 2B. For å fortrinnsvis målrette AG-nevroner over hårceller, er det mulig å injisere plasmidoppløsningen rett inn i regionen ved siden av den fremre otocysten, hvor de delaminerte neuroblaster lokaliserer35. Imidlertid har denne metoden en lavere effektivitet av AG-nevrontransfeksjon sammenlignet med otocystinjeksjon, da plasmidene diffunderer raskt etter injeksjon. Denne metoden kan også føre til ytterligere transfeksjon av de omkringliggende mesenkymale hodecellene. En metode for å fortrinnsvis målrette hårceller over AG-nevroner er å forsinke otocystinjeksjonen og elektroporering til HH18 (som er ~ embryonal dag 3), da flertallet av neuroblaster (AG-nevronforløpere) har migrert ut fra otocysten på dette stadiet24.

Med modifikasjoner kan denne metoden utvides for å studere det vestibulære systemet. For vestibulær gangliontransfeksjon må retningen til elektrodene vist i figur 2B reverseres for å transfektere den bakre delen av otocysten på grunn av den distinkte plasseringen av auditive og vestibulære ganglionforløpere.

I ovo er elektroporering av kyllingembryoer en veletablert teknikk for å undersøke tidlige utviklingsstadier (innen den første uken av inkubasjon). For langsiktige studier er overlevelsesraten en stor bekymring. Ved oppstart av Dox-behandling ved E8 er overlevelsesraten funnet her ~60 % ved E9, men synker til 30 % ved E15 og enda lavere ved E19. Hatchlings fra elektroporerte egg er mulige, men sjeldne og kan bare overleve i flere dager i de fleste tilfeller. For å øke overlevelsesraten, bør følgende vurderes: 1) bruk en elektroporator som gir firkantbølger i stedet for skarpe bølger; 2) Påfør en eller to dråper steril PBS på toppen av embryoet hvis albuminlaget ikke er tykt nok til å fremme elektrisk ledningsevne (dette vil bidra til å redusere elektrisk traumer); 3) åpning av vitellinmembranen for å eksponere embryoet på injeksjonsstedet er ikke nødvendig for en vellykket transfeksjon og kan skade embryoet; 4) for å redusere risikoen for kontaminering, bruk en sprøyte til å stikke parafilmen og administrere Dox i stedet for å åpne vinduet igjen. Etter injeksjon, tørk den gjennomsiktige filmen med 75% etanol og dekk nålåpningen med tape; 5) For Otocyst-transfeksjon, injiser plasmider i Otocyst dorsolateralt med en 45 ° vinklet pipette for å unngå mulig punktering av aorta dorsalis under. Hvis aorta dorsalis er skadet, vil blødning skylle ut plasmidene og til og med forårsake død; 6) Hvis mulig, unngå å bruke indisk blekk for å visualisere embryoet. Mindre håndtering og færre prosedyrer vil resultere i en høyere overlevelse.

I tillegg til evnen til selektivt å transfektere AG- eller NM-nevroner, gir elektroporering i ovo et unikt system som tillater nærliggende sammenligninger for dataanalyser. Etter elektroporering transfiseres bare en delmengde av celler i enten NM eller AG, slik at de omkringliggende ikke-transfiserte cellene i samme cellegruppe kan tjene som en ideell kontroll20. Hvis potensiell interaksjon mellom nærliggende nevroner er en bekymring, kan nevronmodeller fra den ikke-transfiserte siden av øret og hjernen tjene som en ekstra kontroll. For histologiske og avbildningsstudier muliggjør dette resultatet dataanalyser med høy effektivitet på enkeltcelle- eller enkeltfibernivå. Molekylære analyser er også gjennomførbare hvis de kombineres med fluorescerende basert cellesortering og storskala protein- og RNA-analyser som massespektrometri og neste generasjons sekvensering. Imidlertid kan bruk av in ovo-elektroporering som et middel til genredigering være utfordrende for funksjonelle og atferdsstudier fordi prosentandelen transfekterte celler i en cellegruppe kanskje ikke er stor nok til å resultere i funksjonelle konsekvenser.

Det er viktig å utføre to verifikasjonsanalyser når man tar i bruk in ovo-elektroporeringsmetoden. Først bør effekten av genredigering på proteinet av interesse bekreftes. I ovo elektroporering transfects bare en delmengde av nevroner i NM eller AG (dvs. et mosaikkmønster). Å utføre western blot på homogeniserte vev som inneholder en blanding av transfiserte og ikke-transfekterte nevroner, er ikke følsom nok til å nøyaktig reflektere knockdown-effekten. Dermed må valideringen utføres på individnivå ved hjelp av metoder som immuncytokjemi. For dette formålet genererte vi tidligere et antistoff som gjenkjenner kylling FMRP. Spesifisiteten til dette antistoffet ble verifisert ved immuncytokjemi og western blot i en tidligere studie30. Knockdown-effekten av Fmr1 shRNA ble validert kvantitativt ved å observere signifikante reduksjoner i intensiteten av FMRP-immunoreaktivitet i transfiserte NM-nevroner sammenlignet med nærliggende ikke-transfiserte nevroner. For det andre bør kontrollgrupper som bruker krypterte RNA, eller andre kontrollkonstruksjoner, brukes til å bekrefte spesifisiteten til observerte cellulære effekter av FMRP-feiluttrykk20,21. For å oppnå dette målet designet vi et kryptert shRNA, klonet det til det samme Tet-On-vektorsystemet og elektroporerte det til NM-forløpere, som beskrevet tidligere20. FMRP-ekspresjon i NM-nevronene transfisert med kryptert shRNA ble ikke påvirket, noe som fremgår av uendret intensitet av FMRP-immunoreaktivitet sammenlignet med nærliggende ikke-transfekterte nevroner. Vi har også identifisert en rekke effekter av Fmr1 shRNA-transfeksjon på aksonal vekst, dendritisk beskjæring, terminaldannelse og nevrotransmisjon (gjennomgått i Curnow og Wang, 2022)36. Vi konkluderte med at disse effektene ble indusert spesielt av celle autonomt tap av FMRP fordi scrambled shRNA ikke klarte å indusere lignende endringer.

Avslutningsvis muliggjør in ovo-elektroporeringsteknikken selektiv Fmr1-genredigering med temporal kontroll og komponentspesifisitet i de auditive øre-hjernestammekretsene og kan modifiseres for å manipulere det vestibulære systemet. Utviklingen av denne avanserte teknologien i kyllingembryoet, en veletablert modell innen utviklingsbiologi, har og vil fortsette å bidra til vår forståelse av hjernens utvikling under normale og unormale forhold som FXS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av: et National Natural Science Foundation of China-stipend (nr. 32000697); vitenskaps- og teknologiprogrammet i Guangzhou (202102080139); Guangdong naturvitenskapelige stiftelse (2019A1515110625, 2021A1515010619); de grunnleggende forskningsfondene for de sentrale universitetene (11620324); et forskningsstipend fra Key Laboratory of Regenerative Medicine, Utdanningsdepartementet, Jinan University (nr. ZSYXM202107); de grunnleggende forskningsfondene for de sentrale universitetene i Kina (21621054); og Medical Scientific Research Foundation i Guangdong-provinsen i Kina (20191118142729581). Vi takker det medisinske eksperimentelle senteret ved Jinan University. Vi takker Dr. Terra Bradley for nøye redigering av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Egg incubation
16 °C refrigerator MAGAT Used for fertilized egg storage.
Egg incubator SHANGHAI BOXUN GZX-9240MBE
Fertilized eggs Farm of South China Agricultural University Eggs must be used in one week for optimal viability.
Plasmid preparation
Centrifuge Sigma 10016
Fast green Solarbio G1661 Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.
Plasmid Maxi-prep kit QIAGEN 12162 Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889 Make 7.5M working solution in nuclase-free water.
Electroporation and Doxycycline Administration
Electroporator BTX ECM399
1 mL / 5 mL Syringe GUANGZHOU KANGFULAI
Dissecting microscope CNOPTEC SZM-42
Doxcycline Sigma-Aldrich D9891 Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C.
Glass capillary BEIBOBOMEI RD0910 0.9-1.1 mm*100 mm
Laboratory parafilm PARAFILM PM996 transparent film
Pipette puller CHENGDU INSTRUMENT FACTORY WD-2 Pulling condition: 500 °C for 15 s
Platinum elctrodes Home made 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
Rubber tube Sigma-Aldrich A5177
Tissue Dissection and Fixation
Forceps RWD F11020-11 Tip size: 0.05*0.01 mm
Other surgery tools RWD
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127 Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week.
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW 01673921 For black background plates, food-grade carbon powder is applied.
Sectioning
Cryostat LEICA CM1850
Gelatin Sigma-Aldrich G9391 From bovine skin.
Sliding microtome LEICA SM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse Abcam ab150113 1:500 dilution, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit Abcam ab150078 1:500 dilution, RRID: AB_2722519
DAPI Abcam ab285390 1: 1000 dilution
Fluoromount-G mounting medium Southern Biotech Sb-0100-01
FMRP antibody Y. Wang, Florida State University #8263 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242
Islet-1 antibody DSHB 39.3F7 1:100 dilution, RRID: AB_1157901
Netwell plate Corning 3478
Neurofilament antibody Sigma-Aldrich N4142 1:1000 dilution, RRID: AB_477272
Parvalbumin antibody Sigma-Aldrich P3088 1:10000 dilution, RRID: AB_477329
SNAP25 antibody Abcam ab66066 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052
Imaging
Adobe photoshop ADOBE image editing software
Confocal microscope LEICA SP8
Fluorescent stereomicroscope OLYMPUS MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0 OlYMPUS commercial image processing software package

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hagerman, R. J., et al. Fragile X syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065 (2017).
  2. Hinds, H. L., et al. Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome. Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).
  3. Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens. Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).
  4. Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).
  5. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
  6. Bakker, C. E., Oostra, B. A. Understanding fragile X syndrome: insights from animal models. Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).
  7. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
  8. Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).
  9. Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).
  10. Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).
  11. Higashimori, H., et al. Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).
  12. Hodges, J. L., et al. Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome. Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).
  13. Gonzalez, D., et al. Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).
  14. Bland, K. M., et al. FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner. Neurobiology of Disease. 150, 105253 (2021).
  15. Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation. Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).
  16. Pfeiffer, B. E., et al. Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2. Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).
  17. Deng, P. Y., et al. FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels. Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).
  18. Yang, Y. M., et al. Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain. Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).
  19. Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. Developmental studies in fragile X syndrome. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13 (2020).
  20. Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).
  21. Wang, X., et al. Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit. Development. 147 (21), (2020).
  22. Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
  23. Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).
  24. Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development. Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).
  25. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  26. Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e56628 (2017).
  27. Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53864 (2016).
  28. Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).
  29. Wang, X. Y., et al. High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo. Scientific Reports. 5, 18321 (2015).
  30. Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation. Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).
  31. Li, H., et al. Islet-1 expression in the developing chicken inner ear. Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).
  32. Carr, C. E., Boudreau, R. E. Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl. Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).
  33. Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells. Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).
  34. Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).
  35. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).
  36. Curnow, E., Wang, Y. New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology. Cells. 11 (10), 1628 (2022).

Tags

Nevrovitenskap utgave 185 fragilt X-syndrom sensorisk krets indre øre cochleakjerne synapsedannelse hjerneutvikling endbulb av Held kyllingembryo
Dissekere celle-autonom funksjon av skjøre X mental retardasjon protein i en auditiv krets ved <em>i ovo</em> elektroporering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fan, Q., Zhang, X., Wang, Y., Wang,… More

Fan, Q., Zhang, X., Wang, Y., Wang, X. Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation. J. Vis. Exp. (185), e64187, doi:10.3791/64187 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter