Summary
ここでは、硫化ビスマス(BS)沈殿に使用されるプロトコルを修正して硫化水素生成細菌を検出するためのプロトコルを提示します。この方法の主な利点は、評価が容易であり、特殊な機器を必要としないことです。
Abstract
硫化水素(H2S)は、人間の健康に重要な役割を果たす硫黄含有アミノ酸およびタンパク質のタンパク質分解において細菌によって生成される有毒ガスである。H2S産生試験は、重要な細菌生化学的同定試験の1つである。従来の方法は、面倒で時間がかかるだけでなく、硫黄含有培地中の重金属塩の毒性作用のために細菌の増殖を阻害する傾向があり、それはしばしば否定的な結果をもたらす。ここでは、細菌中のH2Sを検出するための簡便で高感度な方法を確立した。この方法は、96ウェル透明マイクロタイタープレートを使用する硫化ビスマス(BS)沈殿の修正版です。細菌培養物をL-システインを含むビスマス溶液と合わせ、20分間培養したところ、最後に黒色沈殿が観察された。H2Sの視覚的検出限界は0.2mMであった。視覚的な色の変化に基づいて、H2S産生細菌の単純で、ハイスループットで、迅速な検出を達成することができる。要約すると、この方法は、細菌におけるH2S産生を同定するために使用することができる。
Introduction
硫化水素生成細菌は、硫化水素(H2S)を生成するために硫黄含有アミノ酸およびタンパク質を利用することができる。H2Sの産生は、通常、グラム陰性腸内細菌科細菌において、ならびにシトロバクター属、プロテウス属、エドワルジエラ属、およびシュワネラ属1のメンバーにおいても起こる。これらの細菌は、エネルギーを得るために硫酸塩を硫化水素(H2S)に還元する能力を有する。硫化水素は、細菌の薬剤耐性の発生に関与しています。H2Sは活性酸素種(ROS)の毒性から細菌を保護し、抗生物質の抗菌効果に拮抗します2,3。H2Sはまた、恒常性の維持において重要な生理学的効果を有する。超生理学的レベルでは、H2Sは身体に対して非常に有毒であることが示されている。人体において、H2Sは、様々な生理学的および病理学的過程に関与するガスシグナル伝達分子として別の役割を果たす。H2Sは、心臓の収縮機能を調節することができ、血管を弛緩させ、血管リモデリングを阻害し、心筋を保護する上で重要な生理学的役割を果たす4,5。H2Sはまた、神経系および消化管の調節において重要な役割を果たす6,7。殺菌性抗生物質にさらされると、細菌は致命的な活性酸素種(ROS)を産生し、細胞死を引き起こすことがわかっています8,9,10,11。
微生物学実験室コースでの一般的な生化学的試験として、硫化水素試験は細菌、特に腸内細菌科の細菌の同定における重要な実験です。現在、硫化水素試験は通常、試験対象の細菌を接種した多数の含硫アミノ酸および酢酸鉛培地に対して実施される。インキュベーション期間(2〜3日)後、結果は、酢酸鉛の生成のために培地または酢酸鉛紙片が黒くなっているかどうかを観察することによって判断されます11。しかしながら、これらの伝統的な方法は、面倒で時間がかかるだけでなく、硫黄含有培地中の重金属塩の毒性作用のために細菌増殖を阻害する傾向があり、それはしばしば否定的な結果をもたらす。H2S12、13の検出のためにビスマスベースの方法が確立されている。H2Sはビスマスと反応して黒色硫化ビスマス沈殿を形成することができる。この生化学的検査の改革を行うためには、細菌の増殖に副作用のない簡便かつ迅速な方法を確立する必要があります。ここでは、96ウェルマイクロタイタープレートフォーマットの基質として硫化ビスマスを使用して、in vitro環境で増殖した硫化水素生成細菌を検出するための簡単な方法を設定しました。
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Protocol
1.細菌株
注:この実験では、サルモネラ・パラチフスA、サルモネラ・パラチフスB、フソバクテリウム・ヌクレアタム、エンテロコッカス・フェカリス、黄色 ブドウ球菌、緑膿菌PAO1、アエロモナス・ハイドロフィラYJ-1、プロテウス・ヴイガリス、および肺炎桿菌を含む9つの標準株を使用しました(表1)。サルモネラ・パラチフスA、フソバクテリウム・ヌクレアタム、緑膿菌、およびプロテウス・ブイガリスは、先行文献1で概説されているように、H2Sを産生することができる。
- 細菌培養の調製
- サルモネラ・パラチフスA、サルモネラ・パラチフスB、エンテロコッカス・フェカリス、黄色ブドウ球菌、緑膿菌PAO1、アエロモナス・ハイドロフィラYJ-1、および肺炎桿菌の細菌コロニーをルリア・ベルターニ(LB)寒天プレートから100 mLのLB培地に移し、細菌濃度が約1 x 109細胞/ mLになるまで37°Cで12〜16時間培養します(OD600 = 1で示されます)。
- トリプチカーゼ大豆ブロス(TSB)寒天プレートから フソバクテリウム・ ヌクレアタム と プロテウス・ブイガリスの 細菌コロニー1つを100 mLのTSB培地に移し、細菌濃度が約1 x 109 細胞/mLになるまで37°Cで嫌気的に24時間培養します(OD600 = 1で示されます)。
2. H2S検出アッセイ
- 硫化水素製造試験
- 96ウェルマイクロタイタープレートに100 μLの細菌培養液を新たに調製したビスマス溶液100 μL(pH 8.0;10 mM塩化ビスマス(III)、0.4 Mトリエタノールアミン-HCl、20 mMピリドキサール5-リン酸一水和物、20 mM EDTA、および40 mM L-システイン)と混合し、37°Cで20分間培養します。 各細菌株について、3回に分けて分析を行う。
- 20分後、色の変化を確認します。溶液の色が淡黄色から黒色に変化した場合、これは細菌がH2Sを生成することができることを示しています。 この測定を3回繰り返します。
- 方法の感度
- 異なる濃度の水硫化ナトリウム(NaHS)を使用して方法の感度を決定します:2 mM、1 mM、0.8 mM、0.6 mM、0.4 mM、0.2 mM、0.1 mM、および0 mM、BS溶液 14と混合。
- 黒色BS沈殿物の形成を観察することにより、HS−/S2− の存在を決定する。生成なし(-)から最も暗い黒色生成(++++++)までの視覚的なスケールを使用して、ウェルの色をスコアリングします。
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Representative Results
硫化水素生成細菌の検出
H2S試験の性能を、表1に列挙するように、選択された細菌株の純粋培養物を用いて調査した。その結果,サルモネラ菌B,フソバクテリウム・ヌクレアタム,エンテロコッカス・フェカリス,緑膿菌,プロテウス・ブイガリスは黒色BS沈殿物でH2Sを産生するが,サルモネラ・パラチフスA,黄色ブドウ球菌,アエロモナス・ハイドロフィラ,肺炎桿菌は黒色沈殿を示さなかった。最も急速なH2S産生はフソバクテリウム核で見られ、最大発色に達した(図1)。
方法の感度
感度は、異なる濃度の水硫化ナトリウム(NaHS)をBS溶液と混合することによって決定されました。目視検査では、HS−/S2−のイオン濃度の増加とともに溶液の色深度が深くなることが明らかになりました(図2)。この方法のH 2 Sの検出限界は0.2mMです。
図1:硫化水素生成細菌の検出。 フソバクテリウム・ヌクレアタムにおけるH2Sの産生は、黒色BS沈殿物形成により検出された。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:硫化ビスマス(BS)法の感度。H2Sの検出のためのBS法の感度は、最も暗い黒色の発色(+++++)に対する発色なし(−)として記録された。NaHS濃度は左から2 mM、1 mM、0.8 mM、0.6 mM、0.4 mM、0.2 mM、0.1 mM、および0 mMです。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 種 | H2S生産a | |
| サルモネラ・パラチフス ある | _ | |
| サルモネラ・パラチフス B | +++ | |
| フソバクテリウム・ヌクレアタム | ++++ | |
| エンテロコッカス・フェカリス | + | |
| 黄色 ブドウ 球菌 | _ | |
| 緑膿菌 | ++ | |
| アエロモナス親水性 | _ | |
| プロテウス・ブイガリス | + | |
| 肺炎桿菌 | _ | |
表1:H2S産生の視覚的評価。 異なる細菌株による硫化水素(H2S)の産生を、96ウェルマイクロタイタープレート中で目視法を用いて測定した。a:無発色(-)から黒色発色(+)までの黒色硫化ビスマス(BS)沈殿として記録された。
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Discussion
硫化水素産生試験は、細菌株の同定および分化のための従来の表現型試験の1つである。多くの細菌種は、水生水などの自然環境で硫化水素を生成する可能性があります。これらの細菌種には、サルモネラ属、シトロバクター属、プロテウス属、シュードモナス属、クレブシエラ属のいくつかの株、大腸菌、および嫌気性クロストリジウムのいくつかの種が含まれます15,16。しかしながら、従来のH2S試験方法の感度は低く、この方法は時間がかかる17,18。従来のH2S試験培地は、細菌の増殖に毒性作用を有するPbAcを含み、培養物を半固体寒天培地に穿刺接種する。培地下部の酸素含有量が低いため、好気性細菌の増殖が鈍い。したがって、それはしばしば偽陰性の結果につながります。
この方法では、鉛または第一鉄イオンの代わりにビスマス(III)を使用しました。H2Sを生成する細菌分離物が塩化ビスマス(III)にさらされると、置換反応が起こる。この反応において、塩化物イオンと硫化物イオン交換位置から、塩化水素酸と硫化ビスマス(III)を生成;この硫化ビスマス(III)生成物は、黒色固体として溶液から沈殿する。黒色沈殿物の色深度は、細菌株によって産生されるH2Sの量を決定するためにある程度使用することができる。BS沈殿および高い再現性、信頼性、および単純さに基づいて、研究に示された方法は、H2S産生細菌の検出のための硫化水素試験として確立された。この方法の重要なステップは、ビスマス溶液を新鮮に調製することです。従来の方法と比較して、細菌の増殖に重金属塩毒性がなく、硫化水素を生成する好気性細菌の検出にかかる時間も節約できます。
この論文では、塩化ビスマス(III)とH2Sの反応に基づいて、視覚的な黒BS沈殿を生成した、H2S産生細菌を検出するための単純で、高感度で、安価で、ハイスループットな方法を示します。この方法は、汚染されたサンプルの迅速な検出に役立ちます。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この研究は、江蘇省高等教育機関の優先学術プログラム開発(PAPD)および中国薬科大学の教育改革研究プロジェクト(2019XJYB18)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bismuth (III)chloride | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | 7787-60-2 | |
| EDTA | Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd | 60-00-4 | |
| Enterococcus faecalis | ATCC | 19433 | |
| Fusobacterium nucleatum | ATCC | 25586 | |
| Klebsiella pneumoniae | ATCC | 43816 | |
| L-cysteine | Amresco | 52-90-4 | |
| Proteus vuigaris | CMCC | 49027 | |
| Salmonella paratyphi A | CMCC | 50001 | |
| Salmonella paratyphi B | CMCC | 50094 | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 | |
| Triethanolamine-HCl | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. | 637-39-8 |
References
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