Summary
여기에서 우리는 황화비스무트(BS) 침전에 사용되는 수정된 프로토콜로 황화수소 생성 박테리아를 검출하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법의 주요 장점은 평가하기 쉽고 특수 장비가 필요하지 않다는 것입니다.
Abstract
황화수소(H2S)는 인체 건강에 중요한 역할을 하는 황 함유 아미노산과 단백질의 단백질 분해에서 박테리아에 의해 생성되는 독성 가스입니다. H2S 생산 시험은 중요한 박테리아 생화학 적 동정 시험 중 하나입니다. 전통적인 방법은 지루하고 시간이 많이 소요될 뿐만 아니라 황 함유 매질에서 중금속 염의 독성 효과로 인해 박테리아 성장이 억제되기 쉬워 종종 부정적인 결과를 초래합니다. 여기에서 우리는 박테리아에서 H2S를 검출하는 간단하고 민감한 방법을 확립했습니다. 이 방법은 96웰 투명 마이크로타이터 플레이트를 사용하는 황화비스무트(BS) 침전의 수정된 버전입니다. 세균 배양을 L-시스테인을 함유한 비스무트 용액과 합하여 20분 동안 배양한 후 흑색 침전물이 관찰되었습니다. H2S에 대한 시각적 검출 한계는 0.2mM이었다. 시각적 색상 변화를 기반으로 H2S 생성 박테리아의 간단하고 처리량이 높으며 신속한 검출이 가능합니다. 요약하면, 이 방법은 박테리아에서H2S생산을 확인하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
황화수소 생성 박테리아는 황 함유 아미노산과 단백질을 활용하여 황화수소(H2S)를 생성할 수 있습니다. H2S의 생산은 일반적으로 그람 음성 장내 세균과 박테리아 및 시트로박터 종, 프로테우스 종, 에드워시엘라 종 및 셰와넬라 종 1의 구성원에서 발생합니다. 이 박테리아는 에너지를 얻기 위해 황산염을 황화수소(H2S)로 환원시키는 능력이 있습니다. 황화수소는 박테리아 약물 내성의 발달과 관련이 있습니다. H 2 S는 활성 산소 종 (ROS)의 독성으로부터 박테리아를 보호하여 항생제 2,3의 항균 효과를 길항합니다. H2S는 또한 항상성 유지에 중요한 생리학적 효과를 갖는다. 초생리학적 수준에서 H2S는 신체에 심각한 독성을 나타내는 것으로 나타났습니다. 인체에서 H2S는 다양한 생리 학적 및 병리학 적 과정에 관여하는 가스 신호 분자로서의 또 다른 역할을합니다. H2S는 심장의 수축기 기능을 조절할 수 있으며 혈관을 이완시키고 혈관 리모델링을 억제하며 심근을 보호하는 데 중요한 생리학적 역할을 합니다 4,5. H2S는 또한 신경계와 소화관을 조절하는데 중요한 역할을 한다 6,7. 살균성 항생제에 노출되면 박테리아는 치명적인 활성 산소 종 (ROS)을 생성하여 세포 사멸을 유도한다는 것이 밝혀졌습니다 8,9,10,11.
미생물 실험실 과정에서 일반적인 생화학 적 검사로서 황화수소 검사는 박테리아, 특히 장내 세균과 (Enterobacteriaceae)의 박테리아를 식별하는 중요한 실험입니다. 현재, 황화수소 시험은 일반적으로 시험 할 박테리아를 접종 한 많은 수의 황 함유 아미노산 및 납 아세테이트 배지에 대해 수행됩니다. 배양 기간(2-3일) 후, 결과는 아세트산납 생산으로 인해 배양 배지 또는 아세트산납 종이 스트립이 검게 변하는지 여부를 관찰하여 판단한다11. 그러나 이러한 전통적인 방법은 지루하고 시간이 많이 소요될 뿐만 아니라 황 함유 배지에서 중금속 염의 독성 효과로 인해 박테리아 성장을 억제하는 경향이 있어 종종 부정적인 결과를 초래합니다. H2S12,13의 검출을 위한 비스무트기반 방법이 확립되었다. H2S는 비스무트와 반응하여 흑색 비스무트 황화물 침전을 형성 할 수 있습니다. 이 생화학적 검사에 대한 개혁을 수행하기 위해서는 박테리아 성장에 부작용이 없는 간단하고 빠른 방법을 확립해야 합니다. 여기에서는 황화비스무트를 기질로 사용하여 시험관 내 환경에서 자란 황화수소 생성 박테리아를 96웰 마이크로타이터 플레이트 형식으로 검출하기 위한 간단한 방법을 설정했습니다.
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Protocol
1. 박테리아 균주
참고: 이 실험을 위해 살모넬라 파라티피 A, 살모넬라 파라티피 B, 푸소박테리움 뉴클레아툼, 엔테로코커스 패칼리스, 황색포도상구균, 녹농균 PAO1, 에어로모나스 하이드로필라 YJ-1, 프로테우스 부이가리스 및 폐렴간균을 포함한 9개의 표준 균주가 사용되었습니다(표 1). 살모넬라 파라티피 A, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa, 및 Proteus vuigaris는 이전 문헌1에 요약된 바와 같이H2S를 생성할 수 있습니다.
- 세균 배양의 준비
- 살모넬라 파라티피 A, 살모넬라 파라티피 B, 엔테로코커스 패칼리스, 황색포도상구균, 녹농균 PAO1, 에어로모나스 하이드로필라 YJ-1 및 폐렴간균의 박테리아 콜로니 1개를 Luria-Bertani(LB) 한천 플레이트에서 LB 배지 100mL로 옮기고 박테리아 농도가 약 1 x 109 cells/mL가 될 때까지 37°C에서 12-16시간 동안 배양합니다(OD600 = 1로 표시됨).
- 트립티카제 대두 배양액(TSB) 한천 플레이트에서 Fusobacterium nucleatum 및 Proteus vuigaris 의 박테리아 콜로니 1개를 TSB 배지 100mL로 옮기고 박테리아 농도가 약 1 x 109 cells/mL가 될 때까지 37°C에서 24시간 동안 혐기성 배양합니다(OD600 = 1로 표시됨).
2.H2S검출 분석
- 황화수소 생산 시험
- 박테리아 배양액 100μL와 새로 제조된 비스무트 용액 100μL(pH 8.0; 10mM 염화비스무트(III), 0.4M 트리에탄올아민-HCl, 20mM 피리독살 5-인산 일수화물, 20mM EDTA 및 40mM L-시스테인)를 96웰 마이크로타이터 플레이트에 혼합하고 37°C에서 20분 동안 배양합니다. 각 박테리아 균주에 대해 분석을 세 번 수행하십시오.
- 20분 후 색상 변화를 확인합니다. 용액의 색이 연한 노란색에서 검은 색으로 변하면 박테리아가 H2S를 생성 할 수 있음을 나타냅니다.이 측정을 3 번 반복하십시오.
- 방법의 민감도
- 상이한 농도의 수황화나트륨(NaHS)을 사용하여 방법의 민감도를 결정한다: 2 mM, 1 mM, 0.8 mM, 0.6 mM, 0.4 mM, 0.2 mM, 0.1 mM 및 0 mM, BS 용액 14와 혼합.
- 검은색 BS 침전물의 형성을 관찰하여 HS-/S2- 의 존재를 결정합니다. 색상 생성 없음(-)에서 가장 어두운 검은색 색상 생성(++++++)까지 시각적 척도를 사용하여 웰의 색상을 채점합니다.
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Representative Results
황화수소 생성 박테리아 검출
H2S시험의 성능은 표 1에 열거된 바와 같이, 선택된 박테리아 균주의 순수 배양물을 사용하여 조사하였다. 결과는 살모넬라 파라티피 B, 푸소박테리움 뉴클레아툼, 엔테로코커스 패칼리스, 녹농균 및 프로테우스 부이가리스가 검은색 BS 침전물로 H2S를 생성할 수 있는 반면, 살모넬라 파라티피 A, 황색포도상구균, 에어로모나스 하이드로필라 및 폐렴간균은 흑색 침전물을 나타내지 못했다. 가장 빠른 H2S생산은 Fusobacterium nucleatum에서 나타났으며, 최대 색상 생성에 도달했습니다(그림 1).
방법의 민감도
민감도는 상이한 농도의 수황화나트륨(NaHS)을 BS 용액과 혼합하여 측정하였다. 육안 검사는 HS-/S 2- 의 이온 농도가 증가함에 따라 용액의 색 농도가 깊어지는 것으로 나타났습니다(그림 2). 상기 방법에 대한H2S의 검출 한계는 0.2mM이다.
그림 1: 황화수소 생성 박테리아의 검출. 푸소박테리움 뉴클레아툼에서H2S의 생산은 검정 BS 침전물 형성에 의해 검출되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 황화비스무트(BS) 방법의 감도. H2S의 검출을 위한 BS 방법의 민감도는 가장 어두운 검정색 생성(+++++)에 대한 무색 생성(-)으로 기록되었다. 왼쪽에서 오른쪽으로, NaHS 농도는 2 mM, 1 mM, 0.8 mM, 0.6 mM, 0.4 mM, 0.2 mM, 0.1 mM 및 0 mM이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 종 | H2S생산 a | |
| 살모넬라 파라티피 A | _ | |
| 살모넬라 파라티피 B | +++ | |
| 푸소박테리움 뉴클레아툼 | ++++ | |
| 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) | + | |
| 황색포도상구균 | _ | |
| 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) | ++ | |
| 아에로모나스 하이드로필라 | _ | |
| 프로테우스 부이가리스 | + | |
| 폐렴간균 | _ | |
표 1:H2S생산의 시각적 평가. 상이한 박테리아 균주에 의한 황화수소(H2S)의 생산은 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 육안법을 이용하여 측정하였다. a: 무색 생산(-)에서 흑색 생산(+)까지 흑색 황화비스무트(BS) 침전으로 기록됨.
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Discussion
황화수소 생산 시험은 박테리아 균주의 식별 및 분화를위한 기존의 표현형 시험 중 하나입니다. 많은 박테리아 종은 수생수와 같은 자연 환경에서 황화수소를 생성할 수 있습니다. 이러한 박테리아 종에는 살모넬라 종, 시트로박터 종, 프로테우스 종, 슈도모나스 종, 클렙시엘라 종, 대장균의 일부 균주 및 혐기성 클로스트리디아15,16의 일부 종이 포함됩니다. 그러나 전통적인 H2S 테스트 방법의 감도는 낮고 시간이 많이 걸립니다17,18. 전통적인 H2S 시험 배지는 박테리아의 성장에 독성 영향을 미치는 PbAc를 함유하고 있으며, 배양액은 반고체 한천에 펑크 접종됩니다. 배지 하부의 산소 함량이 낮기 때문에 호기성 박테리아가 잘 자라지 않습니다. 따라서 종종 위음성 결과가 발생합니다.
이 방법에서는 납 또는 철 이온 대신 비스무트(III)를 사용했습니다. H2S를 생산하는 박테리아 분리물이 비스무트(III) 클로라이드에 노출되면, 치환 반응이 일어난다. 이 반응에서, 염소 이온과 황화물 이온이 교환되어 위치하여, 염소산과 황화비스무트(III)를 생성하고; 이 비스무트 (III) 황화물 생성물은 용액에서 흑색 고체로 침전됩니다. 흑색 침전물의 색 깊이는 박테리아 균주에 의해 생성된H2S의 양을 결정하기 위해 어느 정도 사용될 수 있다. BS 침전과 높은 재현성, 신뢰성 및 단순성을 바탕으로 연구에 나타난 방법은 H2S생성 박테리아의 검출을 위한 황화수소 테스트로 확립되었습니다. 이 방법의 중요한 단계는 비스무트 용액을 신선하게 준비해야한다는 것입니다. 전통적인 방법에 비해 박테리아의 성장에 중금속 염 독성이 없으며 황화수소 생성 호기성 박테리아의 검출 시간도 절약 할 수 있습니다.
이 논문에서는 비스무트(III) 클로라이드와H2S의 반응을 기반으로 비주얼블랙 BS 침전을 생성했으며,H2S생성 박테리아를 검출하기 위한 간단하고 민감하며 저렴하고 처리량이 높은 방법을 보여줍니다. 이 방법은 오염 된 샘플을 신속하게 검출하는 데 유용합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 장쑤 고등 교육 기관의 우선 학업 프로그램 개발(PAPD)과 중국 약학 대학의 교육 개혁 연구 프로젝트(2019XJYB18)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bismuth (III)chloride | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | 7787-60-2 | |
| EDTA | Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd | 60-00-4 | |
| Enterococcus faecalis | ATCC | 19433 | |
| Fusobacterium nucleatum | ATCC | 25586 | |
| Klebsiella pneumoniae | ATCC | 43816 | |
| L-cysteine | Amresco | 52-90-4 | |
| Proteus vuigaris | CMCC | 49027 | |
| Salmonella paratyphi A | CMCC | 50001 | |
| Salmonella paratyphi B | CMCC | 50094 | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 | |
| Triethanolamine-HCl | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. | 637-39-8 |
References
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