Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para detecção de bactérias produtoras de sulfeto de hidrogênio com um protocolo modificado usado para precipitação de sulfeto de bismuto (BS). As principais vantagens deste método são que é fácil de avaliar e não requer equipamentos especializados.
Abstract
O sulfeto de hidrogênio (H2S) é um gás tóxico produzido por bactérias na proteólise de aminoácidos e proteínas contendo enxofre que desempenha um papel importante na saúde humana. O teste de produção de H2S é um dos importantes testes de identificação bioquímica bacteriana. Os métodos tradicionais não são apenas tediosos e demorados, mas também propensos à inibição do crescimento bacteriano devido ao efeito tóxico dos sais de metais pesados em meio contendo enxofre, o que muitas vezes leva a resultados negativos. Aqui, estabelecemos um método simples e sensível para detectar H2S em bactérias. Este método é uma versão modificada da precipitação de sulfeto de bismuto (BS) que usa placas de microtitulação transparentes de 96 poços. A cultura bacteriana foi combinada com solução de bismuto contendo L-cisteína e cultivada por 20 min, ao final do qual um precipitado negro foi observado. O limite de detecção visual para H 2 S foi de0,2mM. Com base na mudança de cor visual, a detecção simples, de alto rendimento e rápida de bactérias produtoras de H2S pode ser alcançada. Em resumo, este método pode ser usado para identificar a produção de H2S em bactérias.
Introduction
As bactérias produtoras de sulfeto de hidrogênio podem utilizar aminoácidos e proteínas contendo enxofre para produzir sulfeto de hidrogênio (H2S). A produção de H2S ocorre geralmente em bactérias da família Enterobacteriaceae gram-negativas e também em membros de Citrobacter spp., Proteus spp., Edwardsiella spp., e Shewanella spp.1. Essas bactérias têm a capacidade de reduzir o sulfato em sulfeto de hidrogênio (H2S) para obter energia. O sulfeto de hidrogênio tem sido implicado no desenvolvimento de resistência bacteriana a drogas. O H 2 S protege as bactérias da toxicidade das espécies reativas de oxigênio (EROs), antagonizando o efeito antibacteriano dos antibióticos 2,3. H2S também tem um efeito fisiológico importante na manutenção da homeostase. Em níveis suprafisiológicos, H2S tem sido mostrado para ser profundamente tóxico para o corpo. No corpo humano, H2S tem outro papel como uma molécula de sinalização de gás que está envolvida em uma variedade de processos fisiológicos e patológicos. A H2S pode regular a função sistólica do coração e desempenha importante papel fisiológico no relaxamento dos vasos sanguíneos, inibindo o remodelamento vascular e protegendo o miocárdio 4,5. A H2S também desempenha um papel importante na regulação do sistema nervoso e do trato digestivo 6,7. Verificou-se que, quando expostas a antibióticos bactericidas, as bactérias produzem espécies reativas letais de oxigênio (EROs), levando à morte celular 8,9,10,11.
Como um teste bioquímico comum em cursos de laboratório microbiológico, o teste de sulfeto de hidrogênio é um experimento importante na identificação de bactérias, especialmente bactérias da família Enterobacteriaceae. Atualmente, o teste de sulfeto de hidrogênio é geralmente realizado em um grande número de aminoácidos contendo enxofre e meio acetato de chumbo inoculado com as bactérias a serem testadas. Após um período de incubação (2-3 dias), os resultados são julgados observando-se se o meio de cultura ou a tira de papel acetato de chumbo está enegrecido devido à produção de acetato de chumbo11. No entanto, esses métodos tradicionais não são apenas tediosos e demorados, mas também propensos à inibição do crescimento bacteriano devido ao efeito tóxico de sais de metais pesados em meio contendo enxofre, o que muitas vezes leva a resultados negativos. Um método baseado em bismuto foi estabelecido para a detecção de H2S12,13. H2S pode reagir com bismuto, formando precipitação de sulfeto de bismuto preto. A fim de realizar uma reforma para este teste bioquímico, um método simples e rápido, sem efeitos colaterais sobre o crescimento bacteriano precisa ser estabelecido. Aqui, montamos um método simples para a detecção de bactérias produtoras de sulfeto de hidrogênio cultivadas em ambiente in vitro usando sulfeto de bismuto como substrato em um formato de placa de microtitulação de 96 poços.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cepas bacterianas
NOTA: Para este experimento, nove cepas padrão foram utilizadas, incluindo Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1, Proteus vuigaris e Klebsiella pneumoniae (Tabela 1). Salmonella paratyphi A, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa e Proteus vuigaris podem produzir H2S, como descrito na literatura anterior1.
- Preparo da cultura bacteriana
- Transferir uma colônia bacteriana de Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1 e Klebsiella pneumoniae de uma placa de ágar Luria-Bertani (LB) para 100 mL de meio LB e cultura a 37 °C por 12-16 h até que a concentração bacteriana seja de cerca de 1 x 109 células/mL (conforme indicado por OD600 = 1).
- Transferir uma colônia bacteriana de Fusobacterium nucleatum e Proteus vuigaris de placas de ágar caldo de soja tripticase (TSB) para 100 mL de meio TSB e cultura a 37 °C por via anaeróbia por 24 h até que a concentração bacteriana seja de cerca de 1 x 109 células/mL (conforme indicado por OD600 = 1).
2. Ensaio de detecção de H2S
- Teste de produção de sulfeto de hidrogênio
- Misturar 100 μL de cultura bacteriana com 100 μL de solução de bismuto recém-preparada (pH 8,0; cloreto de bismuto (III) 10 mM, 0,4 M de trietanolamina-HCl, piridoxal 20 mM 5-fosfato monohidratado, 20 mM EDTA e 40 mM L-cisteína) nas placas de microtitulação de 96 poços e cultura por 20 min a 37 °C. Para cada cepa bacteriana, realizar a análise em triplicata.
- Após 20 min, verifique se há mudança de cor. Se a cor da solução mudar de amarelo claro para preto, isso indica que a bactéria é capaz de produzir H2S. Repita esta medida 3x.
- Sensibilidade do método
- Determinar a sensibilidade do método utilizando diferentes concentrações de hidrossulfeto de sódio (NaHS): 2 mM, 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM e 0 mM, misturados com solução BS 14.
- Determinar a presença de HS−/S2− observando a formação de um precipitado BS preto. Pontuar a cor dos poços usando uma escala visual de nenhuma produção de cores (-) para a produção de cores pretas mais escuras (++++++).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detecção de bactérias produtoras de sulfeto de hidrogênio
O desempenho do teste H2S foi investigado por meio de culturas puras de cepas bacterianas selecionadas, conforme listado na Tabela 1. Os resultados indicaram que Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa e Proteus vuigaris podem produzir H2S com precipitado BS preto, enquanto Salmonella paratyphi A, Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila e Klebsiella pneumoniae não apresentaram precipitado preto. A produção mais rápida de H2S foi observada para Fusobacterium nucleatum, atingindo a máxima produção de cor (Figura 1).
Sensibilidade do método
A sensibilidade foi determinada pela mistura de diferentes concentrações de hidrossulfeto de sódio (NaHS) com solução de BS. A inspeção visual revelou que a profundidade de cor da solução se aprofundou com o aumento da concentração de íons HS−/S 2− (Figura 2). O limite de detecção de H 2 S para o método é de0,2mM.
Figura 1: Detecção de bactérias produtoras de sulfeto de hidrogênio. A produção de H2S em Fusobacterium nucleatum foi detectada pela formação do precipitado BS preto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Sensibilidade do método do sulfeto de bismuto (BS). A sensibilidade do método BS para detecção de H2S foi registrada como nenhuma produção de cor (-) para a produção de cor preta mais escura (+++++). Da esquerda para a direita, as concentrações de NaHS são 2 mM, 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM e 0 mM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Espécie | H2S produção a | |
| Salmonella paratyphi Um | _ | |
| Salmonella paratyphi B | +++ | |
| Fusobacterium nucleatum | | ++++ | |
| Enterococcus faecalis | | + | |
| Staphylococcus aureus | _ | |
| Pseudomonas aeruginosa | ++ | |
| Aeromonas hidrofílica | _ | |
| Proteus vuigaris | | + | |
| Klebsiella pneumoniae | _ | |
Tabela 1: Avaliação visual da produção de H2S. A produção de sulfeto de hidrogênio (H2S) por diferentes cepas bacterianas foi medida usando o método visual em uma placa de microtitulação de 96 poços. a: Registrado como sulfeto de bismuto preto (BS) precipitação de nenhuma produção de cor (-) para produção de cor preta (+).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O teste de produção de sulfeto de hidrogênio é um dos testes fenotípicos convencionais para a identificação e diferenciação de cepas bacterianas. Muitas espécies bacterianas podem produzir sulfeto de hidrogênio em seu ambiente natural, como a água aquática. Essas espécies bacterianas incluem Salmonella sp., Citrobacter sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., algumas cepas de Klebsiella sp., Escherichia coli e algumas espécies anaeróbias de Clostridia15,16. No entanto, a sensibilidade do método tradicional de teste H2S é baixa, e o método é demorado17,18. O meio teste tradicional H2S contém PbAc, que tem efeitos tóxicos sobre o crescimento de bactérias, e a cultura é inoculada por punção em ágar semissólido. O teor de oxigênio na parte inferior do meio é baixo, então as bactérias aeróbicas crescem mal. Portanto, muitas vezes leva a resultados falso-negativos.
Neste método, foi utilizado bismuto (III) em vez de chumbo ou íons ferrosos. Quando um isolado bacteriano produtor de H2S é exposto ao cloreto de bismuto (III), ocorre uma reação de substituição. Nesta reação, o íon cloreto e o íon sulfeto se posicionam, produzindo ácido clorídrico hidrogênio e sulfeto de bismuto (III); este produto de sulfeto de bismuto (III) precipita-se para fora da solução como um sólido negro. A profundidade de cor do precipitado preto pode ser usada até certo ponto para determinar a quantidade de H2S produzida pela cepa bacteriana. Com base na precipitação da SB e na alta reprodutibilidade, confiabilidade e simplicidade, o método apresentado no estudo foi estabelecido como um teste de sulfeto de hidrogênio para a detecção de bactérias produtoras de H2S. A etapa crítica deste método é que a solução de bismuto deve ser preparada fresca. Em comparação com o método tradicional, não há toxicidade de sal de metais pesados no crescimento de bactérias, e também pode economizar tempo para a detecção de sulfeto de hidrogênio produzindo bactérias aeróbias.
Neste trabalho, baseado na reação de cloreto de bismuto (III) e H 2 S,que produziu precipitação BS visualblack, um método simples, sensível, barato e de alto rendimento para a detecção de bactérias produtoras de H2S é mostrado. Este método é útil para a detecção rápida de amostras contaminadas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo Desenvolvimento do Programa Acadêmico Prioritário das Instituições de Ensino Superior de Jiangsu (PAPD) e pelo Projeto de Pesquisa de Reforma do Ensino da Universidade Farmacêutica da China (2019XJYB18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bismuth (III)chloride | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | 7787-60-2 | |
| EDTA | Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd | 60-00-4 | |
| Enterococcus faecalis | ATCC | 19433 | |
| Fusobacterium nucleatum | ATCC | 25586 | |
| Klebsiella pneumoniae | ATCC | 43816 | |
| L-cysteine | Amresco | 52-90-4 | |
| Proteus vuigaris | CMCC | 49027 | |
| Salmonella paratyphi A | CMCC | 50001 | |
| Salmonella paratyphi B | CMCC | 50094 | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 | |
| Triethanolamine-HCl | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. | 637-39-8 |
References
- Thompson, L. S. The group of hydrogen sulphide producing bacteria. Journal of Medical Research. 42 (184), 383-389 (1921).
- Ono, K., et al. Cysteine hydropersulfide inactivates β-lactam antibiotics with formation of ring-opened carbothioic s-acids in bacteria. ACS Chemical Biology. 16 (4), 731-739 (2021).
- Mironov, A., et al. Mechanism of H2S-mediated protection against oxidative stress in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (23), 6022-6027 (2017).
- Shen, Y., Shen, Z., Luo, S., Guo, W., Zhu, Y. The cardioprotective effects of hydrogen sulfide in heart diseases: From molecular mechanisms to therapeutic potential. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 925167 (2015).
- Salloum, F. N. Hydrogen sulfide and cardioprotection-mechanistic insights and clinical translatability. Pharmacology & Therapeutics. 152, 11-17 (2015).
- Wallace, J. L., Wang, R. Hydrogen sulfide-based therapeutics: Exploiting a unique but ubiquitous gasotransmitter. Nature Reviews. Drug Discovery. 14 (5), 329-345 (2015).
- Wu, D., et al. Role of hydrogen sulfide in ischemia-reperfusion injury. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 186908 (2015).
- Truong, D. H., Eghbal, M. A., Hindmarsh, W., Roth, S. H., O'Brien, P. J. Molecular mechanisms of hydrogen sulfide toxicity. Drug Metabolism Reviews. 38 (4), 733-744 (2006).
- Shatalin, K., et al. Inhibitors of bacterial H2S biogenesis targeting antibiotic resistance and tolerance. Science. 372 (6547), 1169-1175 (2021).
- Frávega, J., et al. Salmonella Typhimurium exhibits fluoroquinolone resistance mediated by the accumulation of the antioxidant molecule H2S in a CysK-dependent manner. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (12), 3409-3415 (2016).
- Luhachack, L., Nudler, E. Bacterial gasotransmitters: An innate defense against antibiotics. Current Opinion in Microbiology. 21, 13-17 (2014).
- Yoshida, A., et al. Hydrogen sulfide production from cysteine and homocysteine by periodontal and oral bacteria. Journal of Periodontology. 80 (11), 1845-1851 (2009).
- Basic, A., Blomqvist, S., Carlén, A., Dahlén, G. Estimation of bacterial hydrogen sulfide production in vitro. Journal of Oral Microbiology. 7, 28166 (2015).
- Rosolina, S. M., Carpenter, T. S., Xue, Z. L. Bismuth-based, disposable sensor for the detection of hydrogen sulfide gas. Analytical Chemistry. 88 (3), 1553-1558 (2016).
- Barton, L. L., Fauque, G. D. Biochemistry, physiology and biotechnology of sulfate-reducing bacteria. Advances in Applied Microbiology. 68, 41-98 (2009).
- Shatalin, K., Shatalina, E., Mironov, A., Nudler, E. H2S: A universal defense against antibiotics in bacteria. Science. 334 (6058), 986-990 (2011).
- Schnabel, B., Caplin, J. L., Cooper, I. R. Modification of the H2S test to screen for the detection of sulphur- and sulphate-reducing bacteria of faecal origin in water. Water Supply. 21 (1), 59-79 (2021).
- Netzer, R., Ribičić, D., Aas, M., Cavé, L., Dhawan, T. Absolute quantification of priority bacteria in aquaculture using digital PCR. Journal of Microbiological Methods. 183, 106171 (2021).
