Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Evaluering og manipulation af neural aktivitet ved hjælp af to-foton holografisk mikroskopi

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64205
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2, 4, 5, 6, 1,2,6
1Department of Anatomy and Molecular Cell Biology, Nagoya University Graduate School of Medicine, 2Division of Multicellular Circuit Dynamics, National Institute for Physiological Sciences, National Institutes of Natural Sciences, 3Department of System Science, Kobe University Graduate School of System Informatics, 4Department of Biology, Graduate School of Sciences, Kobe University, 5Department of Information Science, Kobe University Graduate School of System Informatics, 6Center of Optical Scattering Image Science, Kobe University

Summary

Vi udviklede et to-foton holografisk mikroskop, der kan visualisere, vurdere og manipulere neural aktivitet ved hjælp af høj rumlig tidsmæssig opløsning med det formål at belyse patogenesen af neuropsykiatriske lidelser, der er forbundet med unormal neural aktivitet.

Abstract

Nylige fremskridt inden for optisk bioimaging og optogenetik har muliggjort visualisering og manipulation af biologiske fænomener, herunder cellulære aktiviteter, hos levende dyr. Inden for neurovidenskab er detaljeret neural aktivitet relateret til hjernefunktioner, såsom læring og hukommelse, nu blevet afsløret, og det er blevet muligt kunstigt at manipulere denne aktivitet for at udtrykke hjernefunktioner. Imidlertid har den konventionelle evaluering af neural aktivitet ved to-foton Ca2+ billeddannelse problemet med lav tidsmæssig opløsning. Derudover kan manipulation af neural aktivitet ved konventionel optogenetik gennem synsfiberen kun samtidig regulere aktiviteten af neuroner med samme genetiske baggrund, hvilket gør det vanskeligt at kontrollere aktiviteten af individuelle neuroner. For at løse dette problem udviklede vi for nylig et mikroskop med en høj rumlig tidsopløsning til biologiske applikationer ved at kombinere optogenetik med digital holografisk teknologi, der kan ændre femtosekund infrarøde laserstråler. Her beskriver vi protokoller til visualisering, evaluering og manipulation af neural aktivitet, herunder forberedelse af prøver og drift af et to-foton holografisk mikroskop (figur 1). Disse protokoller giver nøjagtige spatiotemporale oplysninger om neural aktivitet, hvilket kan være nyttigt til belysning af patogenesen af neuropsykiatriske lidelser, der fører til abnormiteter i neural aktivitet.

Introduction

To-foton Ca2+ billeddannelse er en nyttig teknik til vurdering af neural aktivitet. Det kan bruges til at identificere ikke kun den neurale aktivitet, der kræves for adfærd og hukommelse hos normale dyr1,2, men også en unormal neuronal aktivitet, der forekommer i musemodeller af neuropsykiatriske lidelser 3,4. Teknikken er blevet brugt til at belyse hjernens neurale grundlag. Selvom det kan give billeder i høj opløsning og høj kvalitet, er dets tidsmæssige opløsning lavere end den elektrofysiologiske metode 1,3.

Optogenetik har bidraget til at innovere den måde, neuroforskere forstår hjernefunktion5. I betragtning af de tekniske begrænsninger har størstedelen af optogenetisk forskning brugt aktiveringsordninger med lav rumlig opløsning, hvilket begrænser de typer manipulationer af neural aktivitet, der kan udføres i overensstemmelse hermed. Imidlertid kan manipulation af neural aktivitet på finere rumlige tidsmæssige skalaer potentielt være nyttig til en mere fuldstændig forståelse af neural beregning og patogenesen af neuropsykiatriske lidelser. Rumligt præcis holografisk teknologi, der kan forme femtosekund nær infrarøde laserstråler, lover at overvinde denne udfordring og åbner flere nye eksperimentelle klasser, der tidligere var umulige 6,7. Denne teknologi gør det muligt for neuroforskere at afdække de grundlæggende aspekter og patologier af sensoriske, kognitive og adfærdsmæssige neurale koder, der har været uden for rækkevidde.

Holografisk projektion involverer generering af ønskede lysmønstre for selektivt at få adgang til individuelle celler og funktionelle netværk. In vivo-eksperimenter kræver optimal lystransmission til målceller i den levende hjerne. Infrarødt lys trænger dybere ind i levende væv og kan bruges til ikke-lineær to-foton excitation (2PE)8,9,10. Således kan to-foton holografisk mikroskopi, der kombinerer holografisk projektion og 2PE, bruges til at evaluere og manipulere neurale aktiviteter for at undersøge cellulære og funktionelle netværk in vivo. Nylige biologiske anvendelser af to-foton holografisk mikroskopi har belyst den neurale aktivitet og kredsløb, der kræves for læring i den visuelle cortex 11,12, olfaktorisk pære13 og hippocampus14.

Talrige laboratorier verden over har rapporteret spændende resultater og forbedringer ved hjælp af deres holografiske stimuleringssystemer 15,16,17,18,19,20,21,22,23. I det her beskrevne system kan det holografiske stimuleringssystem bygges som en add-on enhed til et konventionelt mikroskop. Den fasebaserede rumlige lysmodulator (SLM) er nøgleenheden til modulering af en plan bølgefront til enhver form, og interferenseffekten bruges til at kontrollere intensiteten og placeringen af foci. Figur 2 viser holografisk stimulering og billeddannelse af lysbaner. Den første lysvej er til punktscanningsbilledtilstand og består af et scanningshoved og billeddetektorer. Den anden lysvej er til holografisk stimulering med en bølgelængde på 1040 nm og består af en SLM1. Den tredje lysvej er til holografisk belysning med 920 nm bølgelængde og består af en SLM2 og en billedsensor. Den holografiske billedbehandlingstilstand kan registrere intensiteter fra flere interesseområder ved at belyse flere punkter i prøven. På denne måde kan optagehastigheden øges til få hundrede billeder i sekundet. For at opnå punktscanningsbilleddannelse eller holografisk belysningsbilleddannelse blev 920 nm-laseren opdelt i to stier af en strålesplitter med et fast forhold på 3:7. Alle de optiske elementer blev justeret på et optisk brødbræt med dimensioner på 600 mm × 600 mm. Det modulerede lys kom ind gennem lysporten på siden af det mikroskopiske legeme, mens punktscanningsbilledlyset kom ind gennem scanningshovedet øverst på det mikroskopiske legeme. Disse lys blev integreret lige over objektivlinsen og skabte foci i prøveplanet. Derudover gjorde den specialfremstillede software det muligt for den almindelige arbejdsgang at være enkel og konsekvent.

I denne artikel præsenteres en komplet protokol til brug af holografisk stimulering eller belysning til måling af neural aktivitet og vurdering af den funktionelle forbindelse mellem neuroner. Til demonstrationsformål beskriver vi her en hjerneoperation rettet mod bagbensområdet i den primære somatosensoriske cortex (S1HL) i musehjernen og en metode til at vurdere og manipulere neural aktivitet ved hjælp af to-foton holografisk mikroskopi. Den eksperimentelle procedure er opdelt i fire dele. Først blev hovedpladen fastgjort til musens kranium ved hjælp af tandcement. For det andet blev en viral vektor, der udtrykte jGCaMP8f eller GCaMP6m-P2A-ChRmine, stereotaktisk injiceret i S1HL. For det tredje blev det holografiske stimulerings- eller belysningssystem kalibreret. For det fjerde, efter postoperativ genopretning og ekspression af disse to proteiner, blev in vivo Ca2+ billeddannelse udført for at vurdere den neurale aktivitet og funktionelle forbindelse mellem neuroner med to-foton holografisk mikroskopi.

Protocol

Alle forsøgsprotokoller blev godkendt af Animal Care and Use Committees of Nagoya University Graduate School of Medicine (godkendelsesnummer: M220295-003).

1. Implantation af hovedplader (figur 1A)

  1. Administrer bedøvelsesmidlet (en blanding af 74 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xylazin) intraperitonealt for at bedøve musen. Kontroller musens bedøvelsesstatus ofte ved at vurdere pedalreflekserne.
  2. Efter anæstesi skal du placere musen i et stereotaxisk instrument. Påfør en øjensalve (se materialetabellen) for at forhindre, at hornhinden tørrer ud, når hovedpladen implanteres.
  3. Barber det kirurgiske område og desinficer huden med tre skiftende runder povidon-jod eller chlorhexidinscrubs efterfulgt af 70% alkoholservietter. Udsæt forsigtigt kraniet og rengør det med vatpinde.
    BEMÆRK: Alle kirurgiske instrumenter skal steriliseres, og alle procedurer skal udføres i overensstemmelse hermed. Eventuelle resterende snavs (f.eks. hår eller tørret blod) forårsager inflammatoriske reaktioner. Derfor skal snavs fjernes under et stereoskop ved hjælp af vatpinde fugtet med sterilt vand eller 70% alkohol.
  4. Brug de stereotaktiske koordinater - forreste og bageste = 0,5 mm, mediale og laterale = 1,5 mm fra bregma - for at finde midten af kraniotomien og mærke den med en markørpen.
  5. Placer en specialfremstillet hovedplade i midten af kraniet. Påfør derefter tandcement (se materialetabel) for at fastgøre den fast på kraniet. Påfør let tryk, indtil hovedpladen får fast kontakt med forsiden og bagsiden af kraniet.
    BEMÆRK: Dette trin tager cirka 20 minutter at gennemføre og er afgørende for at reducere bevægelsesartefakter i hjernen under to-fotonbilleddannelse. Hovedpladens dimensioner er 20 mm × 40 mm × 1 mm med en hjemmepladeformet åbning med en kant 15 mm lang, to tilstødende sider 3 mm lange og de resterende to sider 10 mm lange.
  6. Bland sammen en akrylbaseret tandklæbende harpikscement som følger: en halv ske pulver, tre dråber væske og en dråbe katalysator (se materialetabel). For at forhindre tørring skal du anvende denne blandede tandklæbende harpikscement på musens intakte kranieoverflade med hovedpladen.
  7. Placer musen i et varmt bur, indtil den er kommet sig efter anæstesi. Efterlad ikke musen uden opsyn, før den har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystliggende.

2. Kirurgi og adeno-associeret virus (AAV) injektion (figur 1B)

  1. Udfør kraniotomi eller viral injektion uden fjernelse af tandklæbende harpikscement fra kraniet 1 dag efter implantation af hovedpladen.
    BEMÆRK: Administrer anæstesi (en blanding af 74 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xylazin) intraperitonealt til musen under denne procedure.
  2. For at undgå cerebralt ødem skal du administrere dexamethasonnatriumphosphat (1,32 mg/kg) intraperitonealt 1 time før operationen.
  3. Bedøv musen med hovedpladen med 1% isofluranbedøvelse ved hjælp af en fordamper (anæstesileveringssystem), samtidig med at kropstemperaturen opretholdes med en varmepude. Påfør en øjensalve for at forhindre hornhindetørring.
  4. Under et stereoskop udføres en cirkulær kraniotomi med en diameter på ca. 2 mm ved hjælp af en tandboremaskine. For at reducere hjerneskade skal du betjene boremaskinen forsigtigt med konstant let bevægelse og let nedadgående tryk.
  5. Fjern knoglefragmenter flere gange ved hjælp af et sugesystem. Efter fjernelse af knoglefragmenterne skal du bruge en kunstig spinalvæske (ACSF) opløsning til at fjerne og vaske snavs, der er tilbage på hjerneoverfladen. Gentag denne rengøringsprocedure flere gange for at undertrykke inflammatoriske reaktioner.
    BEMÆRK: ACSF-opløsningen (140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 5 mM HEPES, 2,0 mM CaCl2 og 1,0 mM MgCl2) blev opbevaret ved 4 °C i 1 måned, efter at reagenset var opløst og filtreret (porestørrelse = 0,22 μm).
  6. Brug et trykindsprøjtningssystem (se materialetabellen) til at indstille det passende tryk (ca. 10 PSI i impulser med en varighed på 4 ms) til at injicere 500 nL AAV-opløsning gennem en glaskapillær med en spidsdiameter på 10-20 μm (forberedt med en mikropipettetrækker) i 10 minutter.
  7. Bestem, om AAV-opløsningen administreres til hjernen ved at kontrollere, om niveauet af AAV-opløsningen i glaskapillæret gradvist falder.
  8. Lad glaskapillæret sidde i yderligere 10 minutter for at forhindre tilbageløb. Gentag tre gange for at administrere i alt 1,5 μL AAV-opløsning i hjernen.
  9. For at evaluere og manipulere neural aktivitet i lag 2/3 (L2/3) pyramideceller injiceres en AAV-opløsning (til Ca 2+-billeddannelse: AAV2/1-Syn-jGCaMP8f-WPRE ved 1,28 × 10 14 vektorgenomer/ml, fortyndet 1:1 i saltvand; til Ca2+-billeddannelse med optogenetik: AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1-WPRE ved 1,73 × 1014 vektorgenomer/ml, fortyndet 1:1 i saltvand) i bagpoteområdet i den primære somatosensoriske cortex hos vildtypemus (S1, centreret 0,5 mm bagud og 1,5 mm lateralt fra bregmaen, 150 μm dybde fra overfladen).
    BEMÆRK: AAV-opløsningen skal injiceres 2-3 uger og 1-2 uger før billeddannelse for henholdsvis jGCaMP8f og GCaMP6m-P2A-ChRmine-ekspression.
  10. Efter en påføring af 2% (w/v) lavsmeltende agarose på hjerneoverfladen af S1 ved hjælp af en mikropipette, placeres et glasvindue over kraniotomien med to dækglas. Fastgør de to dækglas (lille 2,0 mm diameter og stor 4,5 mm diameter; se materialetabel) med UV-hærdeligt klæbemiddel.
  11. Tryk dækglasset mod agarose, mens det stadig er flydende; Dette forhindrer dannelsen af luftbobler i agarose. Forsegl kanterne på kranievinduet med tand- og klæbeharpikscement (figur 1C).
  12. Fjern musen fra det stereotaksiske instrument og returner det til buret. Placer musen i et varmt bur og vend ikke tilbage til buret med andre dyr, før det er helt genoprettet fra anæstesi. Oprethold omhyggeligt sterile forhold under overlevelsesoperationen.
  13. I de første 72 timer efter operationen skal du kontrollere musens sundhedsstatus ved at observere generel adfærd. Hvis der er abnormiteter i generel adfærd, injiceres subkutant antiinflammatoriske og smertestillende midler.

3. Forberedelse til holografisk stimulering eller belysningssystem (figur 3)

  1. Det holografiske stimuleringssystem kalibreres ved at placere overfladen af et rødt fluorescensglas (støbt akrylsubstrat) på prøveplanet. Placer mikroskopet i live billedbehandlingstilstand med et svagt excitationslys og kør calibration_GUI.m-fil. Kontroller parameterruden, og klik på knappen Gem .
  2. Klik på knappen Z Scan i trin 1-ruden. Det genererer automatisk tre tilfældige pletter i alle 21 aksiale planer, 2 μm fra hvert plan.
  3. Flyt skyderen, og kontroller livebilledet. Find et perfekt plan, hvor pletterne ser de mindste og lyseste ud, og klik derefter på knappen Gem . Dette genererer automatisk en forskudt sfærisk bølgefront til det digitale hologram.
    BEMÆRK: Hvis du ikke kan finde de lyseste fluorescenspletter, skal du ændre minimum- og maksimumværdierne for scanningsområdet og prøve igen.
  4. Klik på knappen Gå i ruden Trin 2, og klik derefter på seks punkter i venstre firkant. Tjek livebilledet. Hvis der er seks genkendelige fluorescenspunkter, skal du skrive deres x- og y-akse til redigeringsfelterne og klikke på knappen Gem . Dette genererer automatisk affine transformationskoefficienter for at koordinere kalibrering mellem det holografiske stimulerings- og billeddannelsessystem.
    BEMÆRK: Akseparnummeret og det klikkede spotnummer skal matches i rækkefølge. Hvis du ikke er sikker, eller hvis der ikke er nogen pletter i dit billede, skal du prøve igen og generere et unikt staffagemønster eller vælge et mindre område omkring midten af synsfeltet (FOV).
  5. Klik på knappen Scan i trin 3-ruden. Det vil generere 441 digitale hologrammer til at udføre scanning af enkelte vinkler på tværs af synsfeltet i 21 × 21 trin.
    1. Kontroller først billederne, mens du ændrer mønstre i listeboksen. Juster derefter lasereffekten for at opnå spotbilleder inden for billeddannelsesenhedens dynamiske område (f.eks. for at undgå alt for mættede billeder).
    2. Juster derefter intervaltiden i redigeringsfeltet; Intervaltiden skal være mere end to gange optageintervaltiden. Til sidst skal du sætte billedenheden i optagetilstand og klikke på knappen Afspil . Hvis afspilningen fuldføres, vises der "display OK" -strenge i kommandovinduet. Stop optagelsen, og stak optagede sekventielle billeder op ved hjælp af metoden med maksimal intensitet.
  6. Klik på Generer WM i trin 4-ruden, og vælg et stablet billede ovenfra. Luk derefter calibration_GUI vindue. Det genererer automatisk et vægtkort for at kompensere for den ubalancerede intensitet på hvert sted.
    BEMÆRK: For en mere detaljeret beskrivelse henvises til 2; Matlab-koden kan downloades herfra (https://github.com/ZenKG/SLM_control).

4. Ca2+ -billeddannelse ved hjælp af en billedsensor med holografisk belysning (figur 4)

  1. Placer den AAV-injicerede mus med en hovedplade under mikroskopet (figur 1D).
    BEMÆRK: Under denne procedure fastholdes musen i vågen tilstand, men er i stand til at undslippe ubehagelige stimuli.
  2. Udfør to-foton-billeddannelse (punktscanningstilstand) ved hjælp af et holografisk mikroskop og en tilstandslåst Ti:safir-laser indstillet til 920 nm med et 25x mål (se materialetabel).
  3. Tænd for den kommercielle billedbehandlingssoftware (se Materialetabel). I live billedbehandlingstilstand skal du justere billeddetektorens spænding (se materialetabel) og billedlaserens effekt for at optimere lysstyrken af neuronerne, der udtrykker jGCaMP8f. Tag billeder af neuronerne, der udtrykker dette protein.
    BEMÆRK: Intensiteten af billedlaseren (920 nm) er 20-30 mW. FOV var 512 μm × 512 μm i en dybde på 100-150 μm fra den kortikale overflade.
  4. For at belyse specifikke neuroner, der udtrykker jGCaMP8f med holografisk belysning, skal du køre scriptfilen SLMcontrol.m. Klik på referencebilledet , og vælg det billede, der er erhvervet ovenfor. Klik derefter på knappen Spot for at vælge specifikke pixels på neuronerne i billedet ved kontinuerligt museklik (figur 4A). Hvis valget er fuldført, skal du trykke på Enter-knappen på tastaturet for at afslutte det.
    BEMÆRK: Det digitale hologram beregnes automatisk og vises på SLM. Dette mønster kan også gennemgås igen ved at klikke på en liste. Den rumlige opløsning af et enkelt punkt genereret af SLM var ca. 1,2 μm langs tværretningen og ~ 8,3 μm langs den optiske akse. Vi brugte en objektiv linse med høj numerisk blænde (1.1) for at opnå mere lokaliseret holografisk stimulering. Tabel 1 opsummerer tidligere rapporter og dette system med hensyn til den rumlige opløsning af holografisk stimulering.
  5. For at registrere neural aktivitet med høj tidsmæssig opløsning ved hjælp af en billedsensor (se materialetabellen) skal du indstille eksponeringstid, billedområde og binning (figur 4B), før du udfører billedoptagelse (figur 4C).
    BEMÆRK: Intensiteten af den holografiske belysningslaser (920 nm), der kontinuerligt stimulerer en neuron, er 2 mW, hvilket er tilstrækkeligt til at detektere neural aktivitet. For at opnå en billedhastighed på 100 Hz til billeddannelse er eksponeringstiden 9 ms, billedområdet er 400 μm × 400 μm, og binningen er 4.
  6. Efter eksperimentet skal du returnere musen til sit hjemmebur.

5. To-fotonbilleddannelse (punktscanningstilstand) med optogenetik ved hjælp af et holografisk mikroskop (figur 2)

  1. Gentag trin 4.1 og 4.2.
  2. Tænd for den kommercielle billedbehandlingssoftware (se Materialetabel). I live billedbehandlingstilstand skal du justere billeddetektorens spænding (se materialetabellen) og billedlaserens effekt for at optimere lysstyrken af neuronerne, der udtrykker GCaMP6m-P2A-ChRmine. Tag billeder af neuronerne, der udtrykker disse proteiner (figur 1E).
  3. Gentag trin 4.4.
  4. For at undersøge den funktionelle forbindelse inden for L2/3-neuroner skal du bruge en SLM til at generere holografiske mønstre af optogenetisk stimulering (ChRmine; 1.040 nm) og kombinere den med to-foton Ca 2+ billeddannelse (GCaMP6m; 920 nm, 512 × 512 pixels, 2 Hz eller 30 Hz,2x digital zoom, punktscanningstilstand; Figur 4D-H).
    1. For denne protokol indstilles intensiteten af billedlaseren til 920 nm ved 10-20 mW og synsfeltet som 256 μm × 256 μm målt i en dybde på 100-150 μm fra den kortikale overflade. Indstil pixelopholdstiden til 1,5 μs for 2 Hz eller 100 ns for 30 Hz.
    2. For at se, om en enkelt holografisk stimulus forårsagede et calciumrespons i neuronerne, skal du bruge både 2 Hz og 30 Hz som billedbilleddannelseshastighed. Indstil intensiteten af den holografiske stimuleringslaser (1.040 nm), der stimulerer en enkelt neuron ved 10 mW, hvilket er tilstrækkeligt til at inducere neural aktivitet (figur 4D).
      BEMÆRK: Den rumlige opløsning af et enkelt punkt, der genereres af SLM, er ca. 1,2 μm langs tværretningen og ~8,3 μm langs den optiske akse. Rækkevidden af tilgængeligt volumen i lateral retning er omkring 500 μm × 500 μm og 100 μm i aksial retning. Vi har yderligere bekræftet med Ca2+ billeddannelse ved 2 Hz eller 30 Hz billedbilleddannelseshastighed, at ikke kun en neuron, men flere neuroner kan stimuleres holografisk samtidigt (figur 4E).
  5. Udfør billedoptagelse med følgende protokol: Afbild samtidig Ca2+ -responsen ved 920 nm med 10 holografiske stimuli ved 1.040 nm med 8 s intervaller (0,125 Hz) i en varighed på 50 ms efter en basisperiode på 10 s. Når alle eksperimenterne er afsluttet, aflives musene.
    BEMÆRK: Ca2+ transienter, hvis de var til stede, blev fremkaldt ved holografisk stimulering, hvor deres højdepunkt optrådte inden for 1 s efter stimulering (figur 4F-H).

6. Billedanalyse og vurdering af funktionel konnektivitet (figur 4)

  1. Åbn de raw-billeder, der er gemt i trin 4.5 eller 5.5, ved hjælp af ImageJ. For at kompensere for fokalplanforskydning skal du bruge ImageJ-ekstramodulet TurboReg.
    BEMÆRK: Hvis korrektionen med TurboReg ikke er tilstrækkelig, anbefales det at bruge CaImAn (http://github.com/simonsfoundation) til at korrigere fjerplanforskydningen.
  2. For at vurdere neural aktivitet skal du bestemme interesseområderne (ROI'er) i L2/3 ved hjælp af en automatiseret algoritme (CaImAn). Detekter og analysér Ca2+-transienter efter definition af baseline-fluorescensintensitet (F0) og tærskelværdien.
    BEMÆRK: F0 er den 35. percentilværdi af fluorescensintensitet opnået i baseline-billeddannelsesperioden. Ca2+ transienter betegnes med Δ F/F 0 (Δ F = F-F0), hvor F er det øjeblikkelige fluorescenssignal. Hvis Δ F-værdien er over 2 S.D. fra F0, vurderer vi en signifikant Ca2+ forbigående.
  3. For at definere funktionel forbindelse i L2/3-neuroner skal du stimulere målneuroner og måle GCaMP6m-responser i stimulerede og omgivende neuroner i overensstemmelse hermed (figur 4F-H).

Representative Results

Repræsentative optagelser opnået ved hjælp af metoden beskrevet her præsenteres. In vivo Ca2+ billeddannelse ved hjælp af holografisk mikroskopi kræver 2-4 uger at gennemføre fra hovedpladeimplantation og AAV-injektion til dataindsamling. For at opnå stabile resultater er det derfor vigtigt at reducere bevægelsesartefakter i hjernen. Hovedpladeimplantationen (trin 1.5) og placeringen af kranievinduet (trin 2.9) er meget vigtige trin i denne proces. Desuden er det også vigtigt at vælge en AAV (AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1), der samtidig udtrykker calciumindikator og opsin i en enkelt neuron (trin 2.8).

Figur 4A viser et sted til holografisk belysning af et erhvervet neuronbillede ved hjælp af et specialfremstillet MATLAB-script. Hvis holografisk belysning med succes belyste neuronerne, der udtrykker jGCaMP8f, kunne Ca2+ spor opnås med en billedsensor (figur 4B), som vist i figur 4C.

Funktionel forbindelse mellem neuroner blev evalueret ved hjælp af holografisk stimulering (figur 4D), som vist i figur 4E. Fordi funktionel forbindelse mellem neuroner er en af de neurale kredsløbsegenskaber, der ændres i patogenesen af en smertemodelmus24, beskriver vi en simpel procedure til evaluering af den. Figur 4F viser et typisk billede af L2/3 neuroner i S1HL visualiseret ved hjælp af GCaMP6m. Når en neuron (orange cirkel) blev holografisk stimuleret, var en anden neuron (rød cirkel) samtidig aktiv; således var antallet af funktionelle forbindelser mellem neuroner en (figur 4G).

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over forsøgsproceduren . (A) Fastgørelse af hovedpladen til kraniet. (B) Stereotaktisk injektion af AAV i bagpoteområdet i den primære somatosensoriske cortex (S1HL). (C) Implantation af kranievinduet. For at vurdere og manipulere neural aktivitet udføres in vivo Ca2+ billeddannelse i vågne mus (D) med holografisk stimulering (E). Flashmærker angiver holografisk stimulering eller belysning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: System, der anvendes til holografisk mikroskop. (A) Billeder af de holografiske stimulerings- og belysningslysbaner (venstre) nær mikroskopet (midten) med en billedsensor (højre). (B) Disse er forstørrede billeder af holografiske stimulerings- og belysningslysbaner omkring respektive SLM'er (venstre og højre) og en punktscanningslyssti omkring et scanningshoved (midt og højre). (C) Et skema over stimulerings- og billeddannelsesoptiske veje. SLM'er, der kun er fasebaserede, bruges til at vise digitale hologrammer, og en stråleekspander (en kombination af L1 og L2) og et 4f-relæsystem (en kombination af L3 og L4 til holografisk stimulering og L4 og L5 til holografisk belysning) placeres før og efter de respektive SLM'er for at sikre, at hvert digitalt hologram er afbildet ved udgangspupillen på en objektivlinse til nedsænkning i vand. med lidt underfyldt billedstørrelse. For at undertrykke resterende nulordenskomponenter placeres en stråleblok på mellemplanet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Rutediagram over, hvordan man kalibrerer det holografiske stimulerings- eller belysningssystem. Dette rutediagram beskriver trin til kalibrering af et holografisk stimulerings- eller belysningssystem til prøverummet og billeddannelsessystemet. Besøg trin 3, forberedelse til holografisk stimulering eller belysningssystem, for detaljerede instruktioner og download et eksempelprogram. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative resultater af billeddannelse og funktionel forbindelse ved hjælp af et holografisk mikroskop. (A) For at belyse specifikke neuroner, der udtrykker jGCaMP8f eller GCaMP6m-P2A-ChRmine, fanges billedet af neuroner, og derefter dannes en plet på neuronen ved hjælp af et specialfremstillet MATLAB-script. (B) Billedsensorens indstilling (eksponeringstid, billedområde og binning). (C) Repræsentativt billede og spor af neuroner, der udtrykker jGCaMP8f i 100 Hz billeddannelse med holografisk belysning og en billedsensor. (D) Denne graf viser det neurale respons på holografisk stimulering (1.040 nm) ved hver lasereffekt (data fra GCaMP6m-P2A-ChRmine, der udtrykker neuroner ved 2 Hz billedbilledbilledhastighed [n = 16]). Fejlbjælker angiver standardfejlen i middelværdien. (E) Repræsentative Ca2+ spor under holografisk stimulering (blå lodrette linjer) af 10 forskellige neuroner ved 2 Hz (venstre) og 30 Hz (højre) billedbilleddannelseshastigheder. I 2 Hz og 30 Hz Ca2+ spor indikerer den samme farve den samme neuron. (F) Skematisk diagram, der evaluerer funktionelle forbindelser mellem neuroner. Når den orange neuron stimuleres, reagerer de røde neuroner på samme tid, hvilket indikerer, at der er funktionel forbindelse mellem disse neuroner. (G) Et typisk billede af S1HL-neuroner, der udtrykker GCaMP6m i WT. Skalabjælke = 10 μm. (H) Typiske Ca2+ -spor under holografisk stimulering (blå lodrette linjer) ved 2 Hz (øvre) og 30 Hz (lavere) billedbilledhastigheder. Den stimulerede neuron er cirklet i orange, responderende neuroner er cirklet i rødt, og ikke-responderende neuroner er cirklet i gråt. Neural respons over for holografisk stimulering kan detekteres ved både 2 Hz og 30 Hz billedhastigheder. Klik her for at se en større version af denne figur.

Vores set-up 6  Prakash, R. et al. 25  Marshel, J. H. et al. 12 Robinson, N. T. M. et al. 14
Lateral opløsning 1,2 μm 1,27 μm ― 2,22 μm
Aksial opløsning 8,3 μm 56,86 μm 15,5 μm 10,26 μm
Objektiv linse/numerisk blænde 25x/1.1 20x/0,5 16x/0,8 16x/0,8

Tabel 1: Resumé af tidligere rapporter og dette system til rumlig opløsning af holografisk stimulering. Den laterale opløsning, aksial opløsning og objektivlinsen, der anvendes under målingen, er beskrevet.

Discussion

For at forstå hjernefunktionen er det nødvendigt nøjagtigt at vurdere det neurale kredsløb, der ligger til grund for hjernefunktionen ved at udtrække dynamikken i neural aktivitet. Desuden er det vigtigt at identificere, hvordan dette neurale kredsløb ændres for at belyse patogenesen af neuropsykiatriske lidelser. Det er faktisk kendt, at neural aktivitet er forhøjet i musemodeller af Alzheimers sygdom4 og skrøbeligt X-syndrom26 og mus med nedsat hvid substansfunktion3. Desuden er øget synkronisering af neural aktivitet og funktionel forbindelse mellem neuroner i en musemodel af inflammatorisk smerte forbundet med symptomer24. To-foton holografisk mikroskopi giver os mulighed for samtidig at observere aktiviteten af individuelle neuroner og de funktionelle forbindelser mellem neuroner, hvilket er nødvendigt for at forstå neurale kredsløb. Vi brugte et 25x objektivobjektiv med numerisk blænde = 1.1 med bølgelængder på 1.040 nm. Den teoretiske punktspredningsfunktion er en Gaussisk fordeling med fuld bredde ved halvt maksimum på 0,5 μm lateralt og 1,7 μm aksialt. Den faktiske numeriske blænde er dog mindre end 1,1, og den målte spotstørrelse på en fluorescensperle er 1,2 μm lateralt og 8,3 μm aksialt. I betragtning af at neurondiameteren er ca. 15 μm, og kalibreringsfejlen er inden for 3 μm, er målretningen generelt god. Imidlertid kan celler i aksial retning blive påvirket af den længere pletstørrelse6. Her beskrev vi viral injektion, kirurgi, kalibrering af holografiske stimulerings- eller belysningssystemer og billeddannelsesprotokoller til evaluering og manipulation af neural aktivitet hos levende mus ved hjælp af vores mikroskopisystem.

Det tager 2-4 uger at gennemføre alle eksperimentelle procedurer, fra hovedpladeimplantation og virusinjektion til dataindsamling til in vivo Ca2+ billeddannelse ved hjælp af holografisk mikroskopi. Processen er kompleks og besværlig, og eksperimentets ultimative succes afhænger af flere faktorer, herunder kranievinduets tilstand, som påvirkes af postoperativ inflammation, det korrekte valg af Ca2+ indikator og opsin, og om bevægelsesartefakter i de erhvervede billeder kan korrigeres. Især to trin er vigtige for et vellykket resultat. Den første vedrører fiksering og kirurgi af hovedplader. Det er afgørende, at hovedpladen fastgøres fast til musehovedet med tandcement. Desuden er det vigtigt gentagne gange at rense knoglefragmenter og koaguleret blod ved hjælp af kold ACSF under operationen. Da overholdelse af denne procedure reducerer inflammation, observerede vi med succes dynamikken i microglia, cellerne, der er ansvarlige for hjernens immunsystem, uden at aktivere deres processer og rygsøjler eller mikrostrukturerne af neuroner27,28. Det andet spørgsmål er evaluering og manipulation af neural aktivitet. Vi valgte AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1 til at udtrykke Ca2+ indikatoren og opsin i en neuron samtidigt. Dette skyldes, at det er vanskeligt effektivt at inficere en neuron med forskellige AAV-typer. En anden grund til dette valg var, at ChRmine effektivt kan aktivere neural aktivitet ved 1.040 nm ved hjælp af en to-foton laser12. For nylig er det blevet rapporteret, at ChRmine ved at mutere sin struktur baseret på strukturel information opnået ved kryo-elektronmikroskopi forbedrer dens funktion29, hvilket anses for nyttigt til målfunktionsanalyse inden for neurovidenskab. I lyset af disse problemer er det nødvendigt at dele effektive metoder til evaluering og manipulation af neuroner, når man læser neural aktivitet og skriver information ved hjælp af holografisk mikroskopi.

Nylige fremskridt inden for billeddannelse og optogenetik har afsløret den detaljerede neurale aktivitet, der er involveret i hjernefunktioner som læring og hukommelse, og det er muligt kunstigt at manipulere denne neurale aktivitet for at udtrykke hjernefunktioner30. Imidlertid er konventionelle metoder til manipulation af neural aktivitet meget invasive på grund af indsættelsen af optiske fibre i hjernen, og fordi en gruppe opsin-ekspressive celler samtidig stimuleres, hvilket gør det umuligt at manipulere neural aktivitet med tidsmæssig og rumlig præcision. Vores metode kan manipulere neural aktivitet ved kun at stimulere specifikke neuroner i hjernen og dermed muliggøre manipulation af neural aktivitet med specifikke stimuleringsmønstre og høj rumlig tidsmæssig opløsning. Desuden er det vigtigt at bemærke, at funktionel forbindelse mellem neuroner kun kan evalueres i et lille antal neuroner ved hjælp af hjerneskiveeksperimenter31; Denne teknik tillader imidlertid samtidig evaluering af flere neuroner hos levende dyr.

En af de største begrænsninger ved nuværende holografiske mikroskoper er behovet for at fastgøre musehovedet, hvilket begrænser musens adfærd. For nylig blev der udviklet et miniaturiseret to-fotonmikroskop32, og med den yderligere miniaturisering af enheden kan in vivo Ca2+ billeddannelse med holografisk stimulering være mulig i frit bevægelige mus. Desuden kan potentialet i dette mikroskop udvides ved at forbedre billeddannelsens tidsmæssige opløsning og kombinere det med meget følsomme spændingsfølsomme fluorescerende proteiner33.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Grants-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (19H04753, 19H05219 og 25110732 to H. W.), Grants-in-Aid for Transformative Research Areas (A) (20H05899 til H. W., 20H05886 til O. M. og 21H05587 til D. K.), Fostering Joint International Research (B) (20KK0170 til H. W.), Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (18H02598 til H. W.), Tilskud til videnskabelig forskning (A) (21H04663 til O. M.), Grant-in-Aid for Early Career Scientists (20K15193 til X. Q.), JST CREST Grant Number JPMJCR1755, Japan, og JST A-STEP Grant Number JPMJTR204C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
25x Objective Nikon N25X-APO-MP Objective
A1MP Nikon A1MP Microscope
AnesII Bio machinery AnesII Anesthesia delivery system
C2 plus Nikon C2 plus Microscope
DECADRON Phosphate Injection Aspen 21N024 Avoid cerebral edema
Dental Drill Jota C1.HP.005 Dental drill
Electric Microinjector NARISHIGE IM-31 Pressure injection system
FEATHERS FEARGER FA-10 Shaving
G-CEM ONE ADHESIVE ENHANCING PRIMER GC 2110271 Resin cement primer for dental adhesion
G-CEM ONE neo GC 43093 Resin cement for dental adhesion
Glass Capillary with Filament NARISHIGE GDC-1 Glass capillary
Image Detector Hamamatsu H10770PA-40 GaAsP photocathode photomultiplier tube
Imaging Software Nikon NISelements Imaging software
Isoflurane Inhalation Solution Pfizer 229KAR Anesthetics
iXon EMCCD Camera Andor iXon Life 888 Image sensor
Ketamine daiitisannkyou s9-018506 Anesthetics
Leica-M60 Leica M60 Stereoscope
Linicon Linicon LV-125 Vacuum pump
Mode-locked Ti:sapphire Chameleon Ultra II laser  Coherent Chameleon Discovery NX Femtosecond laser
Mos-Cure U-VIX mini 365 Portable LED UV Light Source
PEN Bright SHOFU INC. PEN Bright Dental light curing unit
Puller SUTTER instaument P-97 Puller
Stereotaxic Instrument (for Mice) NARISHIGE SR-6M-H Stereotaxic instrument
Stereotaxic Micromanipulator NARISHIGE SM-15R Stereotaxic micromanipulator
Super-Bond CATALYST V SUN MEDICAL 8070 Dental adhesive resin cement
Super-Bond Dental Adhesive Monomer SUN MEDICAL 8071 Dental adhesive monomer
Super-Bond Teeth Color Polymer Powder SUN MEDICAL 145052000 Teeth color polymer powder
Tarivid Ophthalmic Ointment 0.3% Santen Pharmaceutical  TRN3952 Eye ointment
UlTIMATE XL NSK Y141446 Dental laboratory micromotor control unit
UV Curing Optical Adhesives THORLABS NOA61 UV Curing Optical Adhesives
Xylazine Bayer KP0F2BK Anesthetics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Masamizu, Y., et al. Two distinct layer-specific dynamics of cortical ensembles during learning of a motor task. Nature Neuroscience. 17 (7), 987-994 (2014).
  2. Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
  3. Kato, D., et al. Motor learning requires myelination to reduce asynchrony and spontaneity in neural activity. Glia. 68 (1), 193-210 (2020).
  4. Busche, M. A., et al. Tau impairs neural circuits, dominating amyloid-β effects, in Alzheimer models in vivo. Nature Neuroscience. 22 (1), 57-64 (2019).
  5. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  6. Quan, X., Kato, D., Daria, V., Matoba, O., Wake, H. Holographic microscope and its biological application. Neuroscience Research. 179, 57-64 (2022).
  7. Adesnik, H., Abdeladim, L. Probing neural codes with two-photon holographic optogenetics. Nature Neuroscience. 24 (10), 1356-1366 (2021).
  8. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  9. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  10. Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).
  11. Carrillo-Reid, L., Han, S., Yang, W., Akrouh, A., Yuste, R. Controlling visually guided behavior by holographic recalling of cortical ensembles. Cell. 178 (2), 447-457 (2019).
  12. Marshel, J. H., et al. Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception. Science. 365 (6453), (2019).
  13. Gill, J. V., et al. Precise holographic manipulation of olfactory circuits reveals coding features determining perceptual detection. Neuron. 108 (2), 382-393 (2020).
  14. Robinson, N. T. M., et al. Targeted activation of hippocampal place cells drives memory-guided spatial behavior. Cell. 183 (6), 1586-1599 (2020).
  15. Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Häusser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).
  16. Mardinly, A. R., et al. Precise multimodal optical control of neural ensemble activity. Nature Neuroscience. 21 (6), 881-893 (2018).
  17. Yang, W., Carrillo-Reid, L., Bando, Y., Peterka, D. S., Yuste, R. Simultaneous two-photon imaging and two-photon optogenetics of cortical circuits in three dimensions. Elife. 7, 32671 (2018).
  18. Forli, A., et al. Two-photon bidirectional control and imaging of neuronal excitability with high spatial resolution in vivo. Cell Reports. 22 (11), 3087-3098 (2018).
  19. Pégard, N. C., et al. Three-dimensional scanless holographic optogenetics with temporal focusing (3D-SHOT). Nature Communications. 8 (1), 1228 (2017).
  20. Dal Maschio, M., Donovan, J. C., Helmbrecht, T. O., Baier, H. Linking neurons to network function and behavior by two-photon holographic optogenetics and volumetric imaging. Neuron. 94 (4), 774-789 (2017).
  21. Russell, L. E., et al. All-optical interrogation of neural circuits in behaving mice. Nature Protocols. 17 (7), 1579-1620 (2022).
  22. Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. Two-photon optogenetics. Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).
  23. Hernandez, O., et al. Three-dimensional spatiotemporal focusing of holographic patterns. Nature Communications. 7, 11928 (2016).
  24. Okada, T., et al. Pain induces stable, active microcircuits in the somatosensory cortex that provide a therapeutic target. Science Advances. 7 (12), 8261 (2021).
  25. Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).
  26. Gonçalves, J. T., Anstey, J. E., Golshani, P., Portera-Cailliau, C. Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice. Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).
  27. Akiyoshi, R., et al. Microglia enhance synapse activity to promote local network synchronization. eNeuro. 5 (5), (2018).
  28. Haruwaka, K., et al. Dual microglia effects on blood brain barrier permeability induced by systemic inflammation. Nature Communications. 10 (1), 5816 (2019).
  29. Kishi, K. E., et al. Structural basis for channel conduction in the pump-like channelrhodopsin ChRmine. Cell. 185 (4), 672-689 (2022).
  30. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  31. Ko, H., et al. The emergence of functional microcircuits in visual cortex. Nature. 496 (7443), 96-100 (2013).
  32. Zong, W., et al. Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice. Cell. 185 (7), 1240-1256 (2022).
  33. Villette, V., et al. ultrafast two-photon imaging of a high-gain voltage indicator in awake behaving mice. Cell. 179 (7), 1590-1608 (2019).

Tags

Tilbagetrækning nr. 187
Evaluering og manipulation af neural aktivitet ved hjælp af to-foton holografisk mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kato, D., Quan, X., Tanisumi, Y.,… More

Kato, D., Quan, X., Tanisumi, Y., Guo, Z., Morita, M., Takiguchi, T., Matoba, O., Wake, H. Evaluation and Manipulation of Neural Activity Using Two-Photon Holographic Microscopy. J. Vis. Exp. (187), e64205, doi:10.3791/64205 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter