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Neuroscience

दो-फोटॉन होलोग्राफिक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके तंत्रिका गतिविधि का मूल्यांकन और हेरफेर

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64205
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2, 4, 5, 6, 1,2,6
1Department of Anatomy and Molecular Cell Biology, Nagoya University Graduate School of Medicine, 2Division of Multicellular Circuit Dynamics, National Institute for Physiological Sciences, National Institutes of Natural Sciences, 3Department of System Science, Kobe University Graduate School of System Informatics, 4Department of Biology, Graduate School of Sciences, Kobe University, 5Department of Information Science, Kobe University Graduate School of System Informatics, 6Center of Optical Scattering Image Science, Kobe University

Summary

हमने एक दो-फोटॉन होलोग्राफिक माइक्रोस्कोप विकसित किया है जो असामान्य तंत्रिका गतिविधि से जुड़े न्यूरोसाइकिएट्रिक विकारों के रोगजनन को स्पष्ट करने के उद्देश्य से, उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन का उपयोग करके तंत्रिका गतिविधि की कल्पना, आकलन और हेरफेर कर सकता है।

Abstract

ऑप्टिकल बायोइमेजिंग और ऑप्टोजेनेटिक्स में हालिया प्रगति ने जीवित जानवरों में सेलुलर गतिविधियों सहित जैविक घटनाओं के विज़ुअलाइज़ेशन और हेरफेर को सक्षम किया है। तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में, मस्तिष्क के कार्यों से संबंधित विस्तृत तंत्रिका गतिविधि, जैसे सीखने और स्मृति, अब सामने आई है, और मस्तिष्क के कार्यों को व्यक्त करने के लिए इस गतिविधि को कृत्रिम रूप से हेरफेर करना संभव हो गया है। हालांकि, दो-फोटॉन सीए2 + इमेजिंग द्वारा तंत्रिका गतिविधि के पारंपरिक मूल्यांकन में कम अस्थायी रिज़ॉल्यूशन की समस्या है। इसके अलावा, ऑप्टिक फाइबर के माध्यम से पारंपरिक ऑप्टोजेनेटिक्स द्वारा तंत्रिका गतिविधि का हेरफेर केवल एक ही आनुवंशिक पृष्ठभूमि वाले न्यूरॉन्स की गतिविधि को नियंत्रित कर सकता है, जिससे व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की गतिविधि को नियंत्रित करना मुश्किल हो जाता है। इस मुद्दे को हल करने के लिए, हमने हाल ही में डिजिटल होलोग्राफिक तकनीक के साथ ऑप्टोजेनेटिक्स के संयोजन से जैविक अनुप्रयोगों के लिए एक उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन के साथ एक माइक्रोस्कोप विकसित किया है जो फेम्टोसेकंड इन्फ्रारेड लेजर बीम को संशोधित कर सकता है। यहां, हम तंत्रिका गतिविधि के विज़ुअलाइज़ेशन, मूल्यांकन और हेरफेर के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसमें नमूने की तैयारी और दो-फोटॉन होलोग्राफिक माइक्रोस्कोप (चित्रा 1) का संचालन शामिल है। ये प्रोटोकॉल तंत्रिका गतिविधि पर सटीक स्थानिक जानकारी प्रदान करते हैं, जो न्यूरोसाइकिएट्रिक विकारों के रोगजनन को स्पष्ट करने के लिए उपयोगी हो सकता है जो तंत्रिका गतिविधि में असामान्यताएं पैदा करते हैं।

Introduction

दो-फोटॉन सीए2 + इमेजिंग तंत्रिका गतिविधि के आकलन के लिए एक उपयोगी तकनीक है। इसका उपयोग न केवल सामान्य जानवरों 1,2 में व्यवहार और स्मृति के लिए आवश्यक तंत्रिका गतिविधि की पहचान करने के लिए किया जा सकता है, बल्कि एक असामान्य न्यूरोनल गतिविधि भी है जो न्यूरोसाइकिएट्रिक विकारों 3,4 के माउस मॉडल में होती है। तकनीक का उपयोग मस्तिष्क के कार्यों के तंत्रिका आधार को स्पष्ट करने के लिए किया गया है। हालांकि, हालांकि यह उच्च-रिज़ॉल्यूशन और उच्च-गुणवत्ता वाली छवियां प्रदान कर सकता है, इसका अस्थायी रिज़ॉल्यूशन इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विधि 1,3 की तुलना में कम है।

ऑप्टोजेनेटिक्स ने न्यूरोसाइंटिस्टों को मस्तिष्क समारोह को समझने के तरीके को नया करने में मदद कीहै। तकनीकी सीमाओं को देखते हुए, ऑप्टोजेनेटिक अनुसंधान के बहुमत ने कम स्थानिक संकल्प के साथ सक्रियण योजनाओं का उपयोग किया है, इस प्रकार तंत्रिका गतिविधि के जोड़तोड़ के प्रकारों को सीमित किया जा सकता है जो तदनुसार किया जा सकता है। हालांकि, बेहतर स्थानिक तराजू पर तंत्रिका गतिविधि में हेरफेर करना संभवतः तंत्रिका गणना और न्यूरोसाइकिएट्रिक विकारों के रोगजनन की अधिक पूर्ण समझ के लिए उपयोगी हो सकता है। स्थानिक रूप से सटीक होलोग्राफिक तकनीक जो इन्फ्रारेड लेजर बीम के पास फेम्टोसेकंड को आकार दे सकती है, इस चुनौती को दूर करने का वादा करती है और कई नए प्रयोगात्मक वर्गों को खोलती है जो पहले असंभव थे 6,7। यह तकनीक तंत्रिका विज्ञानियों को संवेदी, संज्ञानात्मक और व्यवहार तंत्रिका कोड के मौलिक पहलुओं और विकृति को उजागर करने में सक्षम बनाती है जो पहुंच से परे हैं।

होलोग्राफिक प्रोजेक्शन में व्यक्तिगत कोशिकाओं और कार्यात्मक नेटवर्क को चुनिंदा रूप से एक्सेस करने के लिए वांछित प्रकाश पैटर्न की पीढ़ी शामिल है। विवो प्रयोगों में जीवित मस्तिष्क में कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए इष्टतम प्रकाश संचरण की आवश्यकता होती है। इन्फ्रारेड प्रकाश जीवित ऊतक में गहराई से प्रवेश करता है और इसका उपयोग नॉनलाइनर दो-फोटॉन उत्तेजना (2पीई) 8,9,10 के लिए किया जा सकता है। इस प्रकार, दो-फोटॉन होलोग्राफिक माइक्रोस्कोपी, जो होलोग्राफिक प्रोजेक्शन और 2पीई को जोड़ती है, का उपयोग विवो में सेलुलर और कार्यात्मक नेटवर्क की जांच के लिए तंत्रिका गतिविधियों का मूल्यांकन और हेरफेर करने के लिए किया जा सकता है। दो-फोटॉन होलोग्राफिक माइक्रोस्कोपी के हालिया जैविक अनुप्रयोगों ने दृश्य कॉर्टेक्स 11,12, घ्राण बल्ब13 और हिप्पोकैम्पस14 में सीखने के लिए आवश्यक तंत्रिका गतिविधि और सर्किटरी को स्पष्ट किया है।

दुनिया भर में कई प्रयोगशालाओं ने अपने होलोग्राफिक उत्तेजना प्रणाली 15,16,17,18,19,20,21,22,23 का उपयोग करके रोमांचक परिणाम और सुधार की सूचना दी है। यहां वर्णित प्रणाली में, होलोग्राफिक उत्तेजना प्रणाली को पारंपरिक माइक्रोस्कोप के लिए एक ऐड-ऑन डिवाइस के रूप में बनाया जा सकता है। चरण-केवल स्थानिक प्रकाश मॉड्यूलेटर (एसएलएम) किसी भी आकार में एक विमान वेवफ्रंट को संशोधित करने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण है, और हस्तक्षेप प्रभाव का उपयोग फॉसी की तीव्रता और स्थान को नियंत्रित करने के लिए किया जाता है। चित्रा 2 होलोग्राफिक उत्तेजना और इमेजिंग प्रकाश पथ दिखाता है। पहला प्रकाश पथ बिंदु-स्कैनिंग इमेजिंग मोड के लिए है और इसमें एक स्कैन हेड और इमेज डिटेक्टर होते हैं। दूसरा प्रकाश पथ 1040 एनएम तरंग दैर्ध्य के साथ होलोग्राफिक उत्तेजना के लिए है और इसमें एक एसएलएम 1 होता है। तीसरा प्रकाश पथ 920 एनएम तरंग दैर्ध्य के साथ होलोग्राफिक रोशनी के लिए है और इसमें एक एसएलएम 2 और एक छवि सेंसर शामिल है। होलोग्राफिक इमेजिंग मोड नमूने में कई बिंदुओं को रोशन करके रुचि के कई क्षेत्रों से तीव्रता रिकॉर्ड कर सकता है। इस तरह, रिकॉर्डिंग की गति को प्रति सेकंड फ्रेम के कुछ सौ तक बढ़ाया जा सकता है। पॉइंट स्कैनिंग इमेजिंग या होलोग्राफिक रोशनी इमेजिंग को प्राप्त करने के लिए, 920 एनएम लेजर को 3: 7 के निश्चित अनुपात के साथ बीम स्प्लिटर द्वारा दो पथों में विभाजित किया गया था। सभी ऑप्टिकल तत्वों को 600 मिमी × 600 मिमी के आयामों के साथ एक ऑप्टिकल ब्रेडबोर्ड पर संरेखित किया गया था। मॉड्यूलेटेड प्रकाश सूक्ष्म शरीर के किनारे पर प्रकाश पोर्ट के माध्यम से प्रवेश करता है, जबकि बिंदु स्कैनिंग इमेजिंग प्रकाश सूक्ष्म शरीर के शीर्ष पर स्कैन हेड के माध्यम से प्रवेश करता है। इन लाइट्स को ऑब्जेक्टिव लेंस के ठीक ऊपर एकीकृत किया गया था और सैंपल प्लेन में फॉसी बनाई गई थी। इसके अलावा, कस्टम-निर्मित सॉफ़्टवेयर ने नियमित वर्कफ़्लो को सरल और सुसंगत होने में सक्षम बनाया।

इस लेख में, तंत्रिका गतिविधि को मापने और न्यूरॉन्स के बीच कार्यात्मक कनेक्टिविटी का आकलन करने के लिए होलोग्राफिक उत्तेजना या रोशनी के उपयोग के लिए एक पूर्ण प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। प्रदर्शन उद्देश्यों के लिए, हम यहां माउस मस्तिष्क के प्राथमिक सोमैटोसेंसरी कॉर्टेक्स (एस 1 एचएल) के हिंदलिम्ब क्षेत्र को लक्षित करने वाली एक मस्तिष्क सर्जरी और दो-फोटॉन होलोग्राफिक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके तंत्रिका गतिविधि का आकलन और हेरफेर करने की एक विधि का वर्णन करते हैं। प्रयोगात्मक प्रक्रिया को चार भागों में विभाजित किया गया है। सबसे पहले, हेड प्लेट को डेंटल सीमेंट का उपयोग करके माउस की खोपड़ी पर तय किया गया था। दूसरा, jGCaMP8f या GCaMP6m-P2A-ChRmine को व्यक्त करने वाले एक वायरल वेक्टर को स्टीरियोटैक्टिकल रूप से S1HL में इंजेक्ट किया गया था। तीसरा, होलोग्राफिक उत्तेजना या रोशनी प्रणाली को कैलिब्रेट किया गया था। चौथा, इन दो प्रोटीनों की पोस्टऑपरेटिव रिकवरी और अभिव्यक्ति के बाद, विवो सीए2 + इमेजिंग में दो-फोटॉन होलोग्राफिक माइक्रोस्कोपी के साथ न्यूरॉन्स के बीच तंत्रिका गतिविधि और कार्यात्मक कनेक्टिविटी का आकलन करने के लिए प्रदर्शन किया गया था।

Protocol

सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल नागोया यूनिवर्सिटी ग्रेजुएट स्कूल ऑफ मेडिसिन (अनुमोदन संख्या: एम 220295-003) की पशु देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित किए गए थे।

1. हेड प्लेट आरोपण (चित्रा 1 ए)।

  1. माउस को एनेस्थेटाइज करने के लिए एनेस्थेटिक (74 मिलीग्राम / किग्रा केटामाइन और 10 मिलीग्राम / किग्रा ज़ाइलेज़िन का मिश्रण) इंट्रापरिटोनियल रूप से प्रशासित करें। पेडल रिफ्लेक्सिस का आकलन करके अक्सर माउस की एनेस्थेटिक स्थिति की जांच करें।
  2. संज्ञाहरण के बाद, माउस को एक स्टीरियोटैक्सिक उपकरण में रखें। सिर प्लेट प्रत्यारोपित होने पर कॉर्निया को सूखने से रोकने के लिए एक आंख मरहम ( सामग्री की तालिका देखें) लागू करें।
  3. सर्जिकल क्षेत्र को शेव करें और पोविडोन-आयोडीन या क्लोरहेक्सिडाइन स्क्रब के तीन वैकल्पिक राउंड के साथ त्वचा को कीटाणुरहित करें, इसके बाद 70% अल्कोहल वाइप्स करें। खोपड़ी को ध्यान से उजागर करें और इसे कपास के फाहे से साफ करें।
    नोट: सभी सर्जिकल उपकरणों को निष्फल किया जाना चाहिए, और सभी प्रक्रियाओं को तदनुसार किया जाना चाहिए। कोई भी शेष मलबे (जैसे, बाल या सूखा रक्त) भड़काऊ प्रतिक्रियाओं का कारण बनता है। इसलिए, किसी भी मलबे को बाँझ पानी या 70% अल्कोहल के साथ नम कपास के स्वैब का उपयोग करके स्टीरियोस्कोप के तहत हटा दिया जाना चाहिए।
  4. क्रेनियोटॉमी के केंद्र को खोजने और मार्कर पेन से लेबल करने के लिए स्टीरियोटैक्टिक निर्देशांक-पूर्वकाल और पीछे = 0.5 मिमी, औसत दर्जे का और पार्श्व = 1.5 मिमी ब्रेग्मा का उपयोग करें।
  5. खोपड़ी के केंद्र में एक कस्टम-निर्मित हेड प्लेट रखें। इसके बाद, खोपड़ी को मजबूती से ठीक करने के लिए दंत सीमेंट ( सामग्री की तालिका देखें) लागू करें। हल्का दबाव तब तक लागू करें जब तक कि हेड प्लेट खोपड़ी के सामने और पीछे के साथ दृढ़ संपर्क न करे।
    नोट: इस चरण को पूरा करने में लगभग 20 मिनट लगते हैं और दो-फोटॉन इमेजिंग के दौरान मस्तिष्क में गति कलाकृतियों को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। हेड-प्लेट के आयाम 20 मिमी × 40 मिमी × 1 मिमी हैं, जिसमें एक होम प्लेट आकार 15 मिमी लंबा, दो आसन्न पक्ष 3 मिमी लंबा और शेष दो पक्ष 10 मिमी लंबे हैं।
  6. एक ऐक्रेलिक-आधारित दंत चिपकने वाला राल सीमेंट को निम्नानुसार मिलाएं: आधा चम्मच पाउडर, तरल की तीन बूंदें और उत्प्रेरक की एक बूंद ( सामग्री की तालिका देखें)। सूखने से रोकने के लिए, इस मिश्रित दंत चिपकने वाला राल सीमेंट को सिर प्लेट के साथ माउस की बरकरार खोपड़ी की सतह पर लागू करें।
  7. माउस को एक गर्म पिंजरे में रखें जब तक कि यह संज्ञाहरण से ठीक न हो जाए। माउस को तब तक लावारिस न छोड़ें जब तक कि वह उरोस्थि की पुनरावृत्ति को बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर ले।

2. सर्जरी और एडेनो से जुड़े वायरस (एएवी) इंजेक्शन (चित्रा 1 बी)।

  1. सिर प्लेट प्रत्यारोपण के 1 दिन बाद खोपड़ी से दंत चिपकने वाला राल सीमेंट को हटाए बिना क्रैनियोटॉमी या वायरल इंजेक्शन करें।
    नोट: इस प्रक्रिया के दौरान माउस को एनेस्थीसिया (74 मिलीग्राम / किग्रा केटामाइन और 10 मिलीग्राम / किग्रा ज़ाइलेज़िन का मिश्रण) इंट्रापरिटोनियल रूप से प्रशासित करें।
  2. सेरेब्रल एडिमा से बचने के लिए, सर्जरी से 1 घंटे पहले डेक्सामेथासोन सोडियम फॉस्फेट (1.32 मिलीग्राम / किग्रा) इंट्रापरिटोनियल रूप से प्रशासित करें।
  3. हीटिंग पैड के साथ शरीर के तापमान को बनाए रखते हुए वेपोराइज़र (एनेस्थीसिया डिलीवरी सिस्टम) का उपयोग करके 1% आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया के साथ हेड प्लेट के साथ माउस को एनेस्थेटाइज करें। कॉर्नियल ड्राईिंग को रोकने के लिए आंखों का मलहम लगाएं।
  4. एक स्टीरियोस्कोप के तहत, दंत ड्रिल का उपयोग करके लगभग 2 मिमी व्यास का एक गोलाकार क्रैनियोटॉमी करें। मस्तिष्क की क्षति को कम करने के लिए, दंत ड्रिल को लगातार मामूली आंदोलन और हल्के नीचे के दबाव के साथ सावधानी पूर्वक संचालित करें।
  5. सक्शन सिस्टम का उपयोग करके हड्डी के टुकड़ों को कई बार निकालें। हड्डी के टुकड़ों को हटाने के बाद, मस्तिष्क की सतह पर शेष किसी भी मलबे को हटाने और धोने के लिए एक कृत्रिम रीढ़ की हड्डी के तरल पदार्थ (एसीएसएफ) समाधान का उपयोग करें। भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को दबाने के लिए इस सफाई प्रक्रिया को कई बार दोहराएं।
    नोट: एसीएसएफ समाधान (140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 5 mM HEPES, 2.0 mM CaCl 2, और 1.0 mM MgCl2) अभिकर्मक को भंग करने और फ़िल्टर करने के बाद 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था (छिद्र आकार = 0.22 μm)।
  6. एक दबाव इंजेक्शन प्रणाली ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके, 10 मिनट के लिए 10-20 μm (माइक्रोपिपेट पुलर के साथ तैयार) के टिप व्यास के साथ ग्लास केशिका के माध्यम से 500 nL AAV समाधान इंजेक्ट करने के लिए उपयुक्त दबाव (4 एमएस की अवधि के साथ दालों में लगभग 10 PSI) सेट करें।
  7. निर्धारित करें कि क्या एएवी समाधान मस्तिष्क को यह जांचकर प्रशासित किया जा रहा है कि ग्लास केशिका में एएवी समाधान का स्तर धीरे-धीरे कम हो जाता है या नहीं।
  8. बैकफ्लो को रोकने के लिए अतिरिक्त 10 मिनट के लिए ग्लास केशिका को छोड़ दें। मस्तिष्क में एएवी समाधान के कुल 1.5 μL को प्रशासित करने के लिए तीन बार दोहराएं।
  9. परत 2/3 (एल 2/3) पिरामिड कोशिकाओं में तंत्रिका गतिविधि का मूल्यांकन और हेरफेर करने के लिए, एक एएवी समाधान इंजेक्ट करें (सीए 2 + इमेजिंग के लिए: एएवी 2/1-सिन-जेजीसीएएमपी 8 एफ-डब्ल्यूपीआरई 1.28 × 1014 वेक्टर जीनोम / एमएल, खारा में 1: 1 पतला; ऑप्टोजेनेटिक्स के साथ सीए 2 + इमेजिंग के लिए: एएवी 2/8-सीएएमकेआईआई-जीसीएएमपी 6 एम-पी 2 ए-सीएचआरएमइन-केवी2.1-डब्ल्यूपीआरई 1.73 × 1014 वेक्टर जीनोम / एमएल, खारा में 1: 1 पतला है) जंगली प्रकार के चूहों के प्राथमिक सोमैटोसेंसरी कॉर्टेक्स के पिछले पंजे क्षेत्र में (एस 1, ब्रेग्मा से 0.5 मिमी पीछे और 1.5 मिमी पार्श्व पर केंद्रित, सतह से 150 μm गहराई)।
    नोट: एएवी समाधान को क्रमशः jGCaMP8f और GCaMP6m-P2A-ChRmine अभिव्यक्ति के लिए इमेजिंग से पहले 2-3 सप्ताह और 1-2 सप्ताह में इंजेक्ट किया जाना चाहिए।
  10. माइक्रोपिपेट का उपयोग करके एस 1 की मस्तिष्क की सतह पर 2% (डब्ल्यू / वी) कम पिघलने वाले एग्रोज के आवेदन के बाद, दो कवर ग्लास के साथ क्रैनियोटॉमी के ऊपर एक ग्लास खिड़की रखें। यूवी इलाज योग्य चिपकने वाले के साथ दो कवर ग्लास (छोटे 2.0 मिमी व्यास और बड़े 4.5 मिमी व्यास; सामग्री की तालिका देखें) संलग्न करें।
  11. कवर ग्लास को अगारोस के खिलाफ दबाएं जबकि यह अभी भी तरल है; यह अगारोस में हवा के बुलबुले के गठन को रोकता है। दंत और चिपकने वाला राल सीमेंट (चित्रा 1 सी) के साथ कपाल खिड़की के किनारों को सील करें।
  12. स्टीरियोटैक्सिक उपकरण से माउस निकालें और इसे अपने पिंजरे में वापस कर दें। माउस को एक गर्म पिंजरे में रखें और अन्य जानवरों के साथ पिंजरे में वापस न आएं जब तक कि यह संज्ञाहरण से पूरी तरह से ठीक न हो जाए। जीवित रहने की सर्जरी के दौरान बाँझ स्थितियों को सावधानीपूर्वक बनाए रखें।
  13. सर्जरी के बाद पहले 72 घंटों के लिए, सामान्य व्यवहार को देखकर माउस की स्वास्थ्य स्थिति की जांच करें। यदि सामान्य व्यवहार में कोई असामान्यताएं हैं, तो चमड़े के नीचे विरोधी भड़काऊ और एनाल्जेसिक एजेंटों को इंजेक्ट करें।

3. होलोग्राफिक उत्तेजना या रोशनी प्रणाली के लिए तैयारी (चित्रा 3)।

  1. नमूना विमान पर लाल प्रतिदीप्ति स्लाइड (कास्ट ऐक्रेलिक सब्सट्रेट) की सतह रखकर होलोग्राफिक उत्तेजना प्रणाली को कैलिब्रेट करें। माइक्रोस्कोप को एक कमजोर उत्तेजना प्रकाश के साथ लाइव इमेजिंग मोड में रखें और calibration_GUI.एम फ़ाइल चलाएं। पैरामीटर फलक की जाँच करें और सहेजें बटन पर क्लिक करें।
  2. चरण 1 फलक में Z स्कैन बटन क्लिक करें। यह स्वचालित रूप से सभी 21 अक्षीय विमानों में तीन यादृच्छिक स्थान उत्पन्न करेगा, प्रत्येक विमान से 2 μm अलग।
  3. स्लाइड बार को स्थानांतरित करें और लाइव छवि की जांच करें। एक आदर्श विमान ढूंढें जहां धब्बे सबसे छोटे और सबसे चमकीले दिखाई देते हैं, और फिर सहेजें बटन पर क्लिक करें। यह स्वचालित रूप से डिजिटल होलोग्राम के लिए एक ऑफसेट गोलाकार वेवफ्रंट उत्पन्न करेगा।
    नोट: यदि आप सबसे चमकीले प्रतिदीप्ति धब्बे खोजने में विफल रहते हैं, तो स्कैन रेंज के न्यूनतम और अधिकतम मान परिवर्तित करें और पुन: प्रयास करें।
  4. चरण 2 फलक में गो बटन क्लिक करें, और उसके बाद बाएँ वर्ग पर छह स्थान क्लिक करें। लाइव छवि की जाँच करें। यदि छह अलग-अलग प्रतिदीप्ति धब्बे हैं, तो संपादन बक्से में उनके x और y अक्ष टाइप करें और सहेजें बटन पर क्लिक करें। यह स्वचालित रूप से होलोग्राफिक उत्तेजना और इमेजिंग सिस्टम के बीच अंशांकन के समन्वय के लिए एफिन ट्रांसफॉर्म गुणांक उत्पन्न करेगा।
    नोट: अक्ष जोड़ी संख्या और क्लिक किए गए स्पॉट नंबर क्रम में मिलान किया जाना चाहिए। यदि सुनिश्चित नहीं है, या यदि आपकी छवि में कोई धब्बे नहीं हैं, तो कृपया फिर से प्रयास करें और एक अद्वितीय स्पॉट पैटर्न उत्पन्न करें या दृश्य क्षेत्र (एफओवी) के केंद्र के आसपास एक छोटी सीमा चुनें।
  5. चरण 3 फलक में स्कैन बटन क्लिक करें। यह 21 × 21 चरणों में एफओवी में एकल स्पॉट स्कैनिंग करने के लिए 441 डिजिटल होलोग्राम उत्पन्न करेगा।
    1. सबसे पहले, सूची बॉक्स में पैटर्न बदलते समय छवियों की जांच करें। फिर, इमेजिंग डिवाइस की गतिशील सीमा के भीतर स्पॉट छवियों को प्राप्त करने के लिए लेजर शक्ति को समायोजित करें (उदाहरण के लिए, अत्यधिक संतृप्त छवियों से बचने के लिए)।
    2. इसके बाद, संपादन बॉक्स में अंतराल समय समायोजित करें; अंतराल समय रिकॉर्डिंग अंतराल समय के दो गुना से अधिक होना चाहिए। अंत में, इमेजिंग डिवाइस को रिकॉर्डिंग मोड में रखें और प्ले बटन पर क्लिक करें। यदि नाटक पूरा हो जाता है, तो कमांड विंडो में दिखाए गए "डिस्प्ले ओके" स्ट्रिंग होंगे। अधिकतम तीव्रता विधि का उपयोग करके रिकॉर्ड की गई अनुक्रमिक छवियों को रिकॉर्ड करना और ढेर करना बंद करें।
  6. चरण 4 फलक में WM जेनरेट करें पर क्लिक करें और ऊपर से स्टैक्ड छवि चुनें। फिर calibration_GUI विंडो बंद करें। यह स्वचालित रूप से प्रत्येक स्थान में असंतुलित तीव्रता की भरपाई के लिए एक वजन मानचित्र उत्पन्न करेगा।
    नोट: अधिक विस्तृत विवरण के लिए, कृपया 2 देखें; Matlab कोड यहाँ से डाउनलोड किया जा सकता है (https://github.com/ZenKG/SLM_control).

4. होलोग्राफिक रोशनी के साथ एक छवि सेंसर का उपयोग करके सीए2 + इमेजिंग (चित्रा 4)।

  1. एएवी-इंजेक्शन माउस को माइक्रोस्कोप के नीचे एक हेड प्लेट के साथ रखें (चित्रा 1 डी)।
    नोट: इस प्रक्रिया के दौरान, माउस जागृत अवस्था में संयमित होता है, लेकिन असुविधाजनक उत्तेजनाओं से बचने में सक्षम होता है।
  2. एक होलोग्राफिक माइक्रोस्कोप और एक मोड-लॉक टीआई: नीलम लेजर का उपयोग करके दो-फोटॉन इमेजिंग (पॉइंट स्कैनिंग मोड) करें, जो 25x उद्देश्य के साथ 920 एनएम तक ट्यून किया गया है ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. वाणिज्यिक इमेजिंग सॉफ़्टवेयर चालू करें ( सामग्री की तालिका देखें)। लाइव इमेजिंग मोड में, छवि डिटेक्टर के वोल्टेज को समायोजित करें (सामग्री की तालिका देखें) और इमेजिंग लेजर की शक्ति को जेजीसीएएमपी 8 एफ व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स की चमक को अनुकूलित करने के लिए। इस प्रोटीन को व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स की छवियों को कैप्चर करें।
    नोट: इमेजिंग लेजर (920 एनएम) की तीव्रता 20-30 मेगावाट है। एफओवी कॉर्टिकल सतह से 100-150 μm की गहराई पर 512 μm × 512 μm था।
  4. होलोग्राफिक रोशनी के साथ jGCaMP8f व्यक्त करने वाले विशिष्ट न्यूरॉन्स को रोशन करने के लिए, SLMcontrol.m स्क्रिप्ट फ़ाइल चलाएँ। संदर्भ छवि पर क्लिक करें और ऊपर प्राप्त छवि चुनें। फिर, निरंतर माउस क्लिक करके छवि में न्यूरॉन्स पर विशिष्ट पिक्सेल चुनने के लिए स्पॉट बटन पर क्लिक करें (चित्रा 4 ए)। यदि चयन पूरा हो गया है, तो इसे अंतिम रूप देने के लिए कीबोर्ड पर एंटर बटन दबाएं।
    नोट: डिजिटल होलोग्राम स्वचालित रूप से गणना की जाती है और एसएलएम पर प्रदर्शित होती है। इस पैटर्न को सूची बॉक्स पर क्लिक करके भी फिर से देखा जा सकता है। एसएलएम द्वारा उत्पन्न एकल स्पॉट का स्थानिक रिज़ॉल्यूशन अनुप्रस्थ दिशा के साथ लगभग 1.2 μm और ऑप्टिकल अक्ष के साथ ~ 8.3 μm था। हमने अधिक स्थानीयकृत होलोग्राफिक उत्तेजना प्राप्त करने के लिए एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर (1.1) उद्देश्य लेंस का उपयोग किया। तालिका 1 होलोग्राफिक उत्तेजना के स्थानिक संकल्प के संबंध में पिछली रिपोर्टों और इस प्रणाली को सारांशित करती है।
  5. एक छवि सेंसर (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके उच्च अस्थायी रिज़ॉल्यूशन के साथ तंत्रिका गतिविधि का पता लगाने के लिए, छवि अधिग्रहण (चित्रा 4 सी) करने से पहले एक्सपोज़र समय, इमेजिंग क्षेत्र और बिनिंग (चित्रा 4 बी) सेट करें।
    नोट: होलोग्राफिक रोशनी लेजर (920 एनएम) की तीव्रता जो लगातार एक न्यूरॉन को उत्तेजित करती है, 2 एमडब्ल्यू है, जो तंत्रिका गतिविधि का पता लगाने के लिए पर्याप्त है। उदाहरण के लिए, इमेजिंग के लिए 100 हर्ट्ज की फ्रेम दर प्राप्त करने के लिए, एक्सपोज़र समय 9 एमएस है, इमेजिंग क्षेत्र 400 μm × 400 μm है, और बिनिंग 4 है।
  6. प्रयोग के बाद, माउस को उसके घर के पिंजरे में वापस कर दें।

5. होलोग्राफिक माइक्रोस्कोप (चित्रा 2) का उपयोग करके ऑप्टोजेनेटिक्स के साथ दो-फोटॉन इमेजिंग (पॉइंट स्कैनिंग मोड)

  1. चरण 4.1 और 4.2 दोहराएँ।
  2. वाणिज्यिक इमेजिंग सॉफ़्टवेयर चालू करें ( सामग्री की तालिका देखें)। लाइव इमेजिंग मोड में, छवि डिटेक्टर के वोल्टेज को समायोजित करें (सामग्री की तालिका देखें) और इमेजिंग लेजर की शक्ति को जीसीएएमपी 6 एम-पी 2 ए-सीएचआरमाइन व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स की चमक को अनुकूलित करने के लिए। इन प्रोटीनों को व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स की छवियों को कैप्चर करें (चित्रा 1 ई)।
  3. चरण 4.4 दोहराएँ।
  4. एल 2/3 न्यूरॉन्स के भीतर कार्यात्मक कनेक्टिविटी की जांच करने के लिए, ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना के होलोग्राफिक पैटर्न उत्पन्न करने के लिए एक एसएलएम का उपयोग करें (ChRmine; 1,040 nm) और इसे दो-फोटॉन Ca2+ इमेजिंग (GCaMP6m; 920 nm, 512 × 512 पिक्सेल, 2 Hz या 30 Hz, 2x डिजिटल ज़ूम, पॉइंट स्कैनिंग मोड) के साथ मिलाएं; चित्रा 4 डी-एच)।
    1. इस प्रोटोकॉल के लिए, इमेजिंग लेजर की तीव्रता को 920 एनएम पर सेट करें, 10-20 एमडब्ल्यू पर, और एफओवी को कॉर्टिकल सतह से 100-150 μm की गहराई पर मापा गया 256 μm × 256 μm के रूप में सेट करें। पिक्सेल निवास समय 2 हर्ट्ज के लिए 1.5 μs या 30 Hz के लिए 100 ns पर सेट करें।
    2. यह देखने के लिए कि क्या एक होलोग्राफिक उत्तेजना न्यूरॉन्स में कैल्शियम प्रतिक्रिया का कारण बनती है, इमेजिंग फ्रेम दर के रूप में 2 हर्ट्ज और 30 हर्ट्ज दोनों का उपयोग करें। होलोग्राफिक उत्तेजना लेजर (1,040 एनएम) की तीव्रता निर्धारित करें जो 10 एमडब्ल्यू पर एक एकल न्यूरॉन को उत्तेजित करता है, जो तंत्रिका गतिविधि को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है (चित्रा 4 डी)।
      नोट: एसएलएम द्वारा उत्पन्न एकल स्थान का स्थानिक रिज़ॉल्यूशन अनुप्रस्थ दिशा के साथ लगभग 1.2 μm और ऑप्टिकल अक्ष के साथ ~ 8.3 μm है। पार्श्व दिशा में सुलभ मात्रा की सीमा अक्षीय दिशा में लगभग 500 μm × 500 μm और 100 μm है। हमने 2 हर्ट्ज या 30 हर्ट्ज इमेजिंग फ्रेम दर पर सीए2 + इमेजिंग के साथ पुष्टि की है कि न केवल एक न्यूरॉन, बल्कि कई न्यूरॉन्स को एक साथ होलोग्राफिक रूप से उत्तेजित किया जा सकता है (चित्रा 4 ई)।
  5. निम्नलिखित प्रोटोकॉल के साथ छवि अधिग्रहण करें: एक साथ 10 सेकंड की बेसलाइन अवधि के बाद 50 एमएस की अवधि के लिए 8 सेकंड अंतराल (0.125 हर्ट्ज) के साथ 1,040 एनएम पर 10 होलोग्राफिक उत्तेजनाओं के साथ 920 एनएम पर सीए2 + प्रतिक्रिया की छवि बनाएं। सभी प्रयोग ों के पूरा होने के बाद, चूहों को इच्छामृत्यु दी जाती है।
    नोट: सीए2 + क्षणिक, यदि मौजूद हैं, तो होलोग्राफिक उत्तेजना द्वारा उत्पन्न किए गए थे, उत्तेजना के बाद 1 सेकंड के भीतर उनका चरम दिखाई देता है (चित्रा 4 एफ-एच)।

6. छवि विश्लेषण और कार्यात्मक कनेक्टिविटी का मूल्यांकन (चित्रा 4)।

  1. ImageJ का उपयोग करके चरण 4.5 या 5.5 में सहेजी गई कच्ची छवियों को खोलें। फोकल प्लेन विस्थापन की भरपाई के लिए, इमेजजे प्लग-इन टर्बोरेग का उपयोग करें।
    नोट: यदि टर्बोरेग के साथ सुधार पर्याप्त नहीं है, तो फोकल प्लेन विस्थापन को ठीक करने के लिए कैमन (http://github.com / साइमनफाउंडेशन) का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
  2. तंत्रिका गतिविधि का आकलन करने के लिए, एक स्वचालित एल्गोरिथ्म (CaImAn) का उपयोग करके L2/3 में रुचि के क्षेत्रों (ROIs) का निर्धारण करें। बेसलाइन फ्लोरेसेंस तीव्रता (एफ0) और थ्रेशोल्ड मान को परिभाषित करने के बाद सीए2 + क्षणिकों का पता लगाएं और उनका विश्लेषण करें।
    नोट: एफ0 बेसलाइन इमेजिंग अवधि के दौरान प्राप्त प्रतिदीप्ति तीव्रता का 35वां प्रतिशत मूल्य है। Ca2+ क्षणिकों को त्रिभुज F/F 0 (त्रिभुज F = F-F 0) द्वारा निरूपित किया जाता है, जहाँF तात्कालिक प्रतिदीप्ति संकेत है। यदि त्रिभुज F मानF 0 से 2 S.D. से अधिक है, तो हम एक महत्वपूर्ण Ca2+ क्षणिक का मूल्यांकन करते हैं।
  3. एल 2 /3 न्यूरॉन्स में कार्यात्मक कनेक्टिविटी को परिभाषित करने के लिए, लक्ष्य न्यूरॉन्स को उत्तेजित करें और उत्तेजित और आसपास के न्यूरॉन्स में जीसीएएमपी 6 एम प्रतिक्रियाओं को तदनुसार मापें (चित्रा 4 एफ-एच)।

Representative Results

यहां वर्णित विधि का उपयोग करके प्राप्त प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग प्रस्तुत की जाती हैं। विवो में । होलोग्राफिक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सीए 2 + इमेजिंग को हेड प्लेट इम्प्लांटेशन और एएवी इंजेक्शन से डेटा अधिग्रहण तक पूरा करने के लिए2-4 सप्ताह की आवश्यकता होती है। इसलिए, स्थिर परिणाम प्राप्त करने के लिए, मस्तिष्क में गति कलाकृतियों को कम करना महत्वपूर्ण है। हेड प्लेट आरोपण (चरण 1.5) और कपाल खिड़की का प्लेसमेंट (चरण 2.9) इस प्रक्रिया में बहुत महत्वपूर्ण कदम हैं। इसके अलावा, एक AAV (AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1) का चयन करना भी महत्वपूर्ण है जो एक साथ एक ही न्यूरॉन (चरण 2.8) में कैल्शियम संकेतक और ऑप्सिन व्यक्त करता है।

चित्रा 4 ए कस्टम-निर्मित MATLAB स्क्रिप्ट का उपयोग करके अधिग्रहित न्यूरॉन छवि की होलोग्राफिक रोशनी के लिए एक स्थान दिखाता है। यदि होलोग्राफिक रोशनी ने जेजीसीएएमपी 8 एफ को व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स को सफलतापूर्वक रोशन किया, तो सीए2 + निशान एक छवि सेंसर (चित्रा 4 बी) के साथ प्राप्त किया जा सकता है, जैसा कि चित्रा 4 सी में दिखाया गया है।

न्यूरॉन्स के बीच कार्यात्मक कनेक्टिविटी का मूल्यांकन होलोग्राफिक उत्तेजना (चित्रा 4 डी) का उपयोग करके किया गया था, जैसा कि चित्रा 4 ई में दिखाया गया है। क्योंकि न्यूरॉन्स के बीच कार्यात्मक कनेक्टिविटी तंत्रिका सर्किटरी गुणों में से एक है जिसे दर्द मॉडल माउस24 के रोगजनन में बदल दिया जाता है, हम इसका मूल्यांकन करने के लिए एक सरल प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। चित्रा 4 एफ जीसीएएमपी 6 एम का उपयोग करके कल्पना की गई एस 1 एचएल में एल 2/3 न्यूरॉन्स की एक विशिष्ट छवि दिखाता है। जब एक न्यूरॉन (नारंगी वृत्त) होलोग्राफिक रूप से उत्तेजित होता था, तो दूसरा न्यूरॉन (लाल सर्कल) एक साथ सक्रिय होता था; इस प्रकार, न्यूरॉन्स के बीच कार्यात्मक जुड़ाव की संख्या एक थी (चित्रा 4 जी)।

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगात्मक प्रक्रिया की योजनाबद्ध रूपरेखा। (ए) खोपड़ी के लिए सिर प्लेट का निर्धारण। (बी) प्राथमिक सोमैटोसेंसरी कॉर्टेक्स (एस 1 एचएल) के पिछले पंजे के क्षेत्र में एएवी का स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन। (सी) कपाल खिड़की का आरोपण। तंत्रिका गतिविधि का आकलन और हेरफेर करने के लिए, विवो सीए2 + इमेजिंग में होलोग्राफिक उत्तेजना (ई) के साथ जागृत चूहों (डी) में किया जाता है। फ्लैश मार्क होलोग्राफिक उत्तेजना या रोशनी का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: होलोग्राफिक माइक्रोस्कोप के लिए उपयोग की जाने वाली प्रणाली। (ए) एक छवि सेंसर (दाएं) के साथ माइक्रोस्कोप (मध्य) के पास होलोग्राफिक उत्तेजना और रोशनी प्रकाश पथ (बाएं) की छवियां। (बी) ये संबंधित एसएलएम (बाएं और दाएं) के चारों ओर होलोग्राफिक उत्तेजना और रोशनी प्रकाश पथ की आवर्धित छवियां हैं और स्कैन हेड (मध्य और दाएं) के चारों ओर एक बिंदु स्कैनिंग प्रकाश पथ हैं। (सी) उत्तेजना और इमेजिंग ऑप्टिकल पथ का एक योजनाबद्ध। चरण-केवल एसएलएम का उपयोग डिजिटल होलोग्राम प्रदर्शित करने के लिए किया जाता है, और एक बीम विस्तारक (एल 1 और एल 2 का एक संयोजन) और एक 4 एफ रिले सिस्टम (होलोग्राफिक उत्तेजना के लिए एल 3 और एल 4 और होलोग्राफिक रोशनी के लिए एल 4 और एल 5 का संयोजन) को संबंधित एसएलएम से पहले और बाद में रखा जाता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि प्रत्येक डिजिटल होलोग्राम को जल विसर्जन उद्देश्य लेंस के निकास पुतली पर चित्रित किया गया है। थोड़ा कम भरे हुए छवि आकार के साथ। अवशिष्ट शून्य-क्रम घटकों को दबाने के लिए, मध्यवर्ती तल पर एक बीम ब्लॉक रखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: होलोग्राफिक उत्तेजना या रोशनी प्रणाली को कैलिब्रेट करने के तरीके का फ्लोचार्ट। यह फ़्लोचार्ट नमूना स्थान और इमेजिंग सिस्टम के लिए एक होलोग्राफिक उत्तेजना या रोशनी प्रणाली को कैलिब्रेट करने के चरणों का वर्णन करता है। विस्तृत निर्देशों के लिए कृपया चरण 3, होलोग्राफिक उत्तेजना या रोशनी प्रणाली की तैयारी पर जाएं और एक नमूना कार्यक्रम डाउनलोड करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: होलोग्राफिक माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इमेजिंग और कार्यात्मक कनेक्टिविटी के प्रतिनिधि परिणाम । (ए) jGCaMP8f या GCaMP6m-P2A-ChRmine को व्यक्त करने वाले विशिष्ट न्यूरॉन्स को रोशन करने के लिए, न्यूरॉन्स की छवि को कैप्चर किया जाता है, और फिर कस्टम-निर्मित MATLAB स्क्रिप्ट का उपयोग करके न्यूरॉन पर एक स्थान बनाया जाता है। (बी) छवि सेंसर की स्थापना (एक्सपोज़र समय, इमेजिंग क्षेत्र और बिनिंग)। (सी) होलोग्राफिक रोशनी और एक छवि सेंसर के साथ 100 हर्ट्ज इमेजिंग में जेजीसीएएमपी 8 एफ व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स की प्रतिनिधि छवि और निशान। (डी) यह ग्राफ प्रत्येक लेजर पावर पर होलोग्राफिक उत्तेजना (1,040 एनएम) के लिए तंत्रिका प्रतिक्रिया को दर्शाता है (GCaMP6m-P2A-ChRmine से डेटा 2 हर्ट्ज इमेजिंग फ्रेम दर [n = 16] पर न्यूरॉन्स व्यक्त करता है)। त्रुटि पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटि को इंगित करती हैं. (ई) प्रतिनिधि सीए 2+ 2 हर्ट्ज (बाएं) और 30 हर्ट्ज (दाएं) इमेजिंग फ्रेम दरों पर 10 अलग-अलग न्यूरॉन्स के होलोग्राफिक उत्तेजना (नीली ऊर्ध्वाधर रेखाओं) के दौरान निशान लगाता है। 2 हर्ट्ज और 30 हर्ट्ज सीए2 + निशान में, एक ही रंग एक ही न्यूरॉन को इंगित करता है। (एफ) न्यूरॉन्स के बीच कार्यात्मक कनेक्शन का मूल्यांकन करने वाला योजनाबद्ध आरेख। जब नारंगी न्यूरॉन उत्तेजित होता है, तो लाल न्यूरॉन्स एक ही समय में प्रतिक्रिया करते हैं, यह दर्शाता है कि इन न्यूरॉन्स के बीच कार्यात्मक कनेक्टिविटी है। स्केल बार = 10 μm. (H) 2 हर्ट्ज (ऊपरी) और 30 हर्ट्ज (निचले) इमेजिंग फ्रेम दरों पर होलोग्राफिक उत्तेजना (नीली ऊर्ध्वाधर रेखाएं) के दौरान विशिष्ट सीए2 + निशान। उत्तेजित न्यूरॉन को नारंगी रंग में घेरा जाता है, प्रतिक्रिया देने वाले न्यूरॉन्स को लाल रंग में घेरा जाता है, और गैर-प्रतिक्रिया देने वाले न्यूरॉन्स को भूरे रंग में घेरा जाता है। होलोग्राफिक उत्तेजना के लिए तंत्रिका प्रतिक्रिया का पता 2 हर्ट्ज और 30 हर्ट्ज इमेजिंग गति दोनों पर लगाया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

हमारा सेट-अप 6  प्रकाश, आर. एट अल. 25  मार्शल, जे एच एट अल। रॉबिन्सन, एन. टी. एम. एट अल. 14
पार्श्व संकल्प 1.2 μm 1.27 μm ― 2.22 μm
अक्षीय संकल्प 8.3 μm 56.86 μm 15.5 μm 10.26 μm
ऑब्जेक्टिव लेंस/न्यूमेरिकल एपर्चर 25x/1.1 20x/0.5 16x/0.8 16x/0.8

तालिका 1: होलोग्राफिक उत्तेजना के स्थानिक संकल्प के लिए पिछली रिपोर्टों और इस प्रणाली का सारांश। माप के दौरान उपयोग किए जाने वाले पार्श्व रिज़ॉल्यूशन, अक्षीय रिज़ॉल्यूशन और उद्देश्य लेंस का वर्णन किया गया है।

Discussion

मस्तिष्क समारोह को समझने के लिए, तंत्रिका गतिविधि की गतिशीलता को निकालकर मस्तिष्क समारोह के अंतर्निहित तंत्रिका सर्किटरी का सही आकलन करना आवश्यक है। इसके अलावा, यह पहचानना आवश्यक है कि न्यूरोसाइकिएट्रिक विकारों के रोगजनन को स्पष्ट करने के लिए इस तंत्रिका सर्किटरी को कैसे बदल दिया जाता है। दरअसल, यह ज्ञात है कि अल्जाइमर रोग4 और नाजुक एक्स सिंड्रोम26 के माउस मॉडल और बिगड़ा हुआ सफेद पदार्थ समारोह3 वाले चूहों में तंत्रिका गतिविधि बढ़ जाती है। इसके अलावा, भड़काऊ दर्द के एक माउस मॉडल में, न्यूरॉन्स के बीच तंत्रिका गतिविधि और कार्यात्मक कनेक्टिविटी के सिंक्रनाइज़ेशन में वृद्धि लक्षणों24 से जुड़ी हुई है। दो-फोटॉन होलोग्राफिक माइक्रोस्कोपी हमें एक साथ व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की गतिविधि और न्यूरॉन्स के बीच कार्यात्मक कनेक्शन का निरीक्षण करने की अनुमति देती है, जो तंत्रिका सर्किटरी को समझने के लिए आवश्यक है। हमने संख्यात्मक एपर्चर = 1.1 के साथ 1,040 एनएम के तरंग दैर्ध्य के साथ 25x उद्देश्य लेंस का उपयोग किया। सैद्धांतिक बिंदु प्रसार फ़ंक्शन एक गॉसियन वितरण है जिसकी पूर्ण चौड़ाई 0.5 μm पार्श्व और 1.7 μm अक्षीय रूप से आधी है। हालांकि, वास्तविक संख्यात्मक एपर्चर 1.1 से कम है, और प्रतिदीप्ति मोती पर मापा स्पॉट आकार 1.2 μm पार्श्व रूप से और 8.3 μm अक्षीय है। यह देखते हुए कि न्यूरॉन व्यास लगभग 15 μm है और अंशांकन त्रुटि 3 μm के भीतर है, लक्ष्यीकरण आम तौर पर अच्छा है। हालांकि, अक्षीय दिशा में कोशिकाएं लंबे स्पॉट आकार6 से प्रभावित हो सकती हैं। यहां, हमने वायरल इंजेक्शन, सर्जरी, होलोग्राफिक उत्तेजना या रोशनी प्रणालियों के अंशांकन, और हमारे माइक्रोस्कोपी सिस्टम का उपयोग करके जीवित चूहों में तंत्रिका गतिविधि का मूल्यांकन और हेरफेर करने के लिए इमेजिंग प्रोटोकॉल का वर्णन किया।

होलोग्राफिक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके विवो सीए 2 + इमेजिंग में हेड प्लेट इम्प्लांटेशन और वायरस इंजेक्शन से लेकर डेटा अधिग्रहण तक सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को पूरा करने में 2-4 सप्ताह लगते हैं। प्रक्रिया जटिल और श्रमसाध्य है, और प्रयोग की अंतिम सफलता कई कारकों पर निर्भर करती है, जिसमें कपाल खिड़की की स्थिति शामिल है, जो पोस्टऑपरेटिव सूजन से प्रभावित होती है, सीए2 + संकेतक और ऑप्सिन की उचित पसंद, और क्या अधिग्रहित छवियों में गति कलाकृतियों को ठीक किया जा सकता है। विशेष रूप से, एक सफल परिणाम के लिए दो कदम महत्वपूर्ण हैं। पहला सिर प्लेट निर्धारण और सर्जरी से संबंधित है; यह महत्वपूर्ण है कि हेड प्लेट को डेंटल सीमेंट के साथ माउस हेड पर मजबूती से लगाया जाए। इसके अलावा, सर्जरी के दौरान ठंडे एसीएसएफ का उपयोग करके हड्डी के टुकड़ों और थक्के वाले रक्त को बार-बार साफ करना महत्वपूर्ण है। चूंकि इस प्रक्रिया का पालन सूजन को कम करता है, इसलिए हमने माइक्रोग्लिया की गतिशीलता को सफलतापूर्वक देखा, मस्तिष्क की प्रतिरक्षा प्रणाली के लिए जिम्मेदार कोशिकाएं, उनकी प्रक्रियाओं और रीढ़ या न्यूरॉन्स के माइक्रोस्ट्रक्चरको सक्रिय किए बिना। दूसरा मुद्दा तंत्रिका गतिविधि का मूल्यांकन और हेरफेर है। हमने एक न्यूरॉन में सीए 2 + संकेतक और ऑप्सिन को एक साथ व्यक्त करने के लिए एएवी 2/8-सीएएमकेआईआई-जीसीएएमपी 6 एम-पी 2 ए-सीएचआरमाइन-केवी2.1 को चुना। ऐसा इसलिए है क्योंकि विभिन्न एएवी प्रकारों के साथ एक न्यूरॉन को कुशलतापूर्वक संक्रमित करना मुश्किल है। इस विकल्प का एक और कारण यह था कि ChRmine दो-फोटॉन लेजर12 का उपयोग करके 1,040 एनएम पर तंत्रिका गतिविधि को कुशलतापूर्वक सक्रिय कर सकता है। हाल ही में, यह बताया गया है कि क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त संरचनात्मक जानकारी के आधार पर अपनी संरचना को परिवर्तित करके, ChRmine अपने कार्य29 में सुधार करता है, जिसे तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में लक्ष्य समारोह विश्लेषण के लिए उपयोगी माना जाता है। इन मुद्दों के प्रकाश में, तंत्रिका गतिविधि को पढ़ने और होलोग्राफिक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके जानकारी लिखने के दौरान न्यूरॉन्स के मूल्यांकन और हेरफेर के लिए प्रभावी तरीकों को साझा करना आवश्यक है।

इमेजिंग और ऑप्टोजेनेटिक्स में हालिया प्रगति ने सीखने और स्मृति जैसे मस्तिष्क कार्यों में शामिल विस्तृत तंत्रिका गतिविधि का खुलासा किया है, और मस्तिष्क के कार्यों को व्यक्तकरने के लिए इस तंत्रिका गतिविधि को कृत्रिम रूप से हेरफेर करना संभव है। हालांकि, तंत्रिका गतिविधि के हेरफेर के लिए पारंपरिक तरीके मस्तिष्क में ऑप्टिकल फाइबर के सम्मिलन के कारण अत्यधिक आक्रामक हैं और क्योंकि ऑप्सिन-व्यक्त करने वाली कोशिकाओं का एक समूह एक साथ उत्तेजित होता है, जिससे अस्थायी और स्थानिक परिशुद्धता के साथ तंत्रिका गतिविधि में हेरफेर करना असंभव हो जाता है। हमारी विधि मस्तिष्क में केवल विशिष्ट न्यूरॉन्स को उत्तेजित करके तंत्रिका गतिविधि में हेरफेर कर सकती है, इस प्रकार विशिष्ट उत्तेजना पैटर्न और उच्च स्थानिक संकल्प के साथ तंत्रिका गतिविधि के हेरफेर को सक्षम करती है। इसके अलावा, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि न्यूरॉन्स के बीच कार्यात्मक कनेक्टिविटी का मूल्यांकन केवल मस्तिष्क स्लाइस प्रयोगों का उपयोग करके न्यूरॉन्स की एक छोटी संख्या में किया जा सकताहै31; हालांकि, यह तकनीक जीवित जानवरों में कई न्यूरॉन्स के एक साथ मूल्यांकन की अनुमति देती है।

वर्तमान होलोग्राफिक माइक्रोस्कोप की प्रमुख सीमाओं में से एक माउस हेड को ठीक करने की आवश्यकता है, जो माउस के व्यवहार को सीमित करता है। हाल ही में, एक छोटा दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपविकसित किया गया था, और डिवाइस के आगे लघुकरण के साथ, विवो सीए2 + इमेजिंग में होलोग्राफिक उत्तेजना के साथ मुक्त-चलती चूहों में संभव हो सकता है। इसके अलावा, इमेजिंग के अस्थायी रिज़ॉल्यूशन में सुधार करके और इसे अत्यधिक संवेदनशील वोल्टेज-संवेदनशील फ्लोरोसेंट प्रोटीन33 के साथ जोड़कर इस माइक्रोस्कोप की क्षमता का विस्तार किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस कार्य को नवान्वेषी क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता अनुदान (19H04753, 19H05219, और H.W. को 25110732), परिवर्तनकारी अनुसंधान क्षेत्रों के लिए सहायता अनुदान (A) (20H05899 से H.W., 20H05886 से O.M., और 21H05587 से D.K. वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता अनुदान (ए) (21एच04663 से ओ.एम.), प्रारंभिक कैरियर वैज्ञानिकों के लिए सहायता अनुदान (20K15193 से X.Q.), JST क्रेस्ट अनुदान संख्या JPMJCR1755, जापान और JST A-STEP अनुदान संख्या JPMJTR204C।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
25x Objective Nikon N25X-APO-MP Objective
A1MP Nikon A1MP Microscope
AnesII Bio machinery AnesII Anesthesia delivery system
C2 plus Nikon C2 plus Microscope
DECADRON Phosphate Injection Aspen 21N024 Avoid cerebral edema
Dental Drill Jota C1.HP.005 Dental drill
Electric Microinjector NARISHIGE IM-31 Pressure injection system
FEATHERS FEARGER FA-10 Shaving
G-CEM ONE ADHESIVE ENHANCING PRIMER GC 2110271 Resin cement primer for dental adhesion
G-CEM ONE neo GC 43093 Resin cement for dental adhesion
Glass Capillary with Filament NARISHIGE GDC-1 Glass capillary
Image Detector Hamamatsu H10770PA-40 GaAsP photocathode photomultiplier tube
Imaging Software Nikon NISelements Imaging software
Isoflurane Inhalation Solution Pfizer 229KAR Anesthetics
iXon EMCCD Camera Andor iXon Life 888 Image sensor
Ketamine daiitisannkyou s9-018506 Anesthetics
Leica-M60 Leica M60 Stereoscope
Linicon Linicon LV-125 Vacuum pump
Mode-locked Ti:sapphire Chameleon Ultra II laser  Coherent Chameleon Discovery NX Femtosecond laser
Mos-Cure U-VIX mini 365 Portable LED UV Light Source
PEN Bright SHOFU INC. PEN Bright Dental light curing unit
Puller SUTTER instaument P-97 Puller
Stereotaxic Instrument (for Mice) NARISHIGE SR-6M-H Stereotaxic instrument
Stereotaxic Micromanipulator NARISHIGE SM-15R Stereotaxic micromanipulator
Super-Bond CATALYST V SUN MEDICAL 8070 Dental adhesive resin cement
Super-Bond Dental Adhesive Monomer SUN MEDICAL 8071 Dental adhesive monomer
Super-Bond Teeth Color Polymer Powder SUN MEDICAL 145052000 Teeth color polymer powder
Tarivid Ophthalmic Ointment 0.3% Santen Pharmaceutical  TRN3952 Eye ointment
UlTIMATE XL NSK Y141446 Dental laboratory micromotor control unit
UV Curing Optical Adhesives THORLABS NOA61 UV Curing Optical Adhesives
Xylazine Bayer KP0F2BK Anesthetics

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References

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वापसी अंक 187
दो-फोटॉन होलोग्राफिक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके तंत्रिका गतिविधि का मूल्यांकन और हेरफेर
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Kato, D., Quan, X., Tanisumi, Y.,… More

Kato, D., Quan, X., Tanisumi, Y., Guo, Z., Morita, M., Takiguchi, T., Matoba, O., Wake, H. Evaluation and Manipulation of Neural Activity Using Two-Photon Holographic Microscopy. J. Vis. Exp. (187), e64205, doi:10.3791/64205 (2022).

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