Summary
We ontwikkelden een holografische microscoop met twee fotonen die neurale activiteit kan visualiseren, beoordelen en manipuleren met behulp van een hoge spatiotemporale resolutie, met als doel de pathogenese van neuropsychiatrische stoornissen die geassocieerd zijn met abnormale neurale activiteit op te helderen.
Abstract
Recente ontwikkelingen in optische bioimaging en optogenetica hebben de visualisatie en manipulatie van biologische verschijnselen, inclusief cellulaire activiteiten, bij levende dieren mogelijk gemaakt. Op het gebied van neurowetenschappen is nu gedetailleerde neurale activiteit met betrekking tot hersenfuncties, zoals leren en geheugen, onthuld en het is mogelijk geworden om deze activiteit kunstmatig te manipuleren om hersenfuncties uit te drukken. De conventionele evaluatie van neurale activiteit door twee-foton Ca2 + beeldvorming heeft echter het probleem van een lage temporele resolutie. Bovendien kan manipulatie van neurale activiteit door conventionele optogenetica via de optische vezel alleen tegelijkertijd de activiteit van neuronen met dezelfde genetische achtergrond reguleren, waardoor het moeilijk wordt om de activiteit van individuele neuronen te beheersen. Om dit probleem op te lossen, hebben we onlangs een microscoop ontwikkeld met een hoge spatiotemporale resolutie voor biologische toepassingen door optogenetica te combineren met digitale holografische technologie die femtoseconde infraroodlaserstralen kan wijzigen. Hier beschrijven we protocollen voor de visualisatie, evaluatie en manipulatie van neurale activiteit, inclusief de voorbereiding van monsters en de werking van een holografische microscoop met twee fotonen (figuur 1). Deze protocollen bieden nauwkeurige spatiotemporale informatie over neurale activiteit, die nuttig kan zijn voor het ophelderen van de pathogenese van neuropsychiatrische stoornissen die leiden tot afwijkingen in neurale activiteit.
Introduction
Twee-foton Ca2+ beeldvorming is een nuttige techniek voor de beoordeling van neurale activiteit. Het kan worden gebruikt om niet alleen de neurale activiteit te identificeren die nodig is voor gedrag en geheugen bij normale dieren1,2, maar ook een abnormale neuronale activiteit die optreedt in muismodellen van neuropsychiatrische stoornissen 3,4. De techniek is gebruikt om de neurale basis van hersenfuncties op te helderen. Hoewel het beelden met een hoge resolutie en hoge kwaliteit kan leveren, is de temporele resolutie lager dan die van de elektrofysiologische methode 1,3.
Optogenetica heeft bijgedragen aan het innoveren van de manier waarop neurowetenschappers de hersenfunctie begrijpen5. Gezien de technische beperkingen heeft de meerderheid van het optogenetische onderzoek activeringsschema's met een lage ruimtelijke resolutie gebruikt, waardoor de soorten manipulaties van neurale activiteit die dienovereenkomstig kunnen worden uitgevoerd, worden beperkt. Het manipuleren van neurale activiteit op fijnere spatiotemporale schalen kan echter mogelijk nuttig zijn voor een vollediger begrip van neurale berekening en de pathogenese van neuropsychiatrische stoornissen. Ruimtelijk nauwkeurige holografische technologie die femtoseconde nabij-infrarode laserstralen kan vormen, belooft deze uitdaging te overwinnen en opent verschillende nieuwe experimentele klassen die voorheen onmogelijk waren 6,7. Deze technologie stelt neurowetenschappers in staat om de fundamentele aspecten en pathologieën van sensorische, cognitieve en gedragsneurale codes te ontdekken die buiten bereik zijn geweest.
Holografische projectie omvat het genereren van gewenste lichtpatronen om selectief toegang te krijgen tot individuele cellen en functionele netwerken. In vivo experimenten vereisen een optimale lichttransmissie om cellen in de levende hersenen te targeten. Infrarood licht dringt dieper door in levend weefsel en kan worden gebruikt voor niet-lineaire twee-foton excitatie (2PE)8,9,10. Zo kan holografische microscopie met twee fotonen, die holografische projectie en 2PE combineert, worden gebruikt om neurale activiteiten te evalueren en te manipuleren om cellulaire en functionele netwerken in vivo te onderzoeken. Recente biologische toepassingen van holografische microscopie met twee fotonen hebben de neurale activiteit en circuits opgehelderd die nodig zijn voor het leren in de visuele cortex 11,12, olfactorische bol13 en hippocampus14.
Talrijke laboratoria over de hele wereld hebben opwindende resultaten en verbeteringen gemeld met behulp van hun holografische stimulatiesystemen 15,16,17,18,19,20,21,22,23. In het hier beschreven systeem kan het holografische stimulatiesysteem worden gebouwd als een add-on-apparaat voor een conventionele microscoop. De fase-only ruimtelijke lichtmodulator (SLM) is het belangrijkste apparaat voor het moduleren van een vlak golffront naar elke vorm, en het interferentie-effect wordt gebruikt om de intensiteit en locatie van de foci te regelen. Figuur 2 toont holografische stimulatie en beeldvorming van lichtpaden. Het eerste lichtpad is voor point-scanning imaging mode en bestaat uit een scankop en beelddetectoren. Het tweede lichtpad is voor holografische stimulatie met een golflengte van 1040 nm en bestaat uit een SLM1. Het derde lichtpad is voor holografische verlichting met een golflengte van 920 nm en bestaat uit een SLM2 en een beeldsensor. De holografische beeldvormingsmodus kan intensiteiten van meerdere interessante gebieden registreren door meerdere punten in het monster te verlichten. Op deze manier kan de opnamesnelheid worden verhoogd tot enkele honderden frames per seconde. Om puntscanbeelden of holografische verlichtingsbeeldvorming te bereiken, werd de 920 nm-laser in twee paden gesplitst door een bundelsplitser met een vaste verhouding van 3:7. Alle optische elementen werden uitgelijnd op een optisch breadboard met afmetingen van 600 mm × 600 mm. Het gemoduleerde licht kwam binnen via de lichtpoort aan de zijkant van het microscopische lichaam, terwijl het puntscannende beeldlicht binnenkwam via de scankop aan de bovenkant van het microscopische lichaam. Deze lichten werden net boven de objectieflens geïntegreerd en creëerden brandpunten in het monstervlak. Bovendien zorgde de op maat gemaakte software ervoor dat de reguliere workflow eenvoudig en consistent was.
In dit artikel wordt een compleet protocol gepresenteerd voor het gebruik van holografische stimulatie of verlichting om neurale activiteit te meten en de functionele connectiviteit tussen neuronen te beoordelen. Voor demonstratiedoeleinden beschrijven we hier een hersenoperatie gericht op het achterste gebied van de primaire somatosensorische cortex (S1HL) van het muizenbrein en een methode om neurale activiteit te beoordelen en te manipuleren met behulp van holografische microscopie met twee fotonen. De experimentele procedure is verdeeld in vier delen. Eerst werd de hoofdplaat met behulp van tandcement aan de schedel van de muis bevestigd. Ten tweede werd een virale vector die jGCaMP8f of GCaMP6m-P2A-ChRmine tot expressie bracht stereotactisch geïnjecteerd in de S1HL. Ten derde werd het holografische stimulatie- of verlichtingssysteem gekalibreerd. Ten vierde, na postoperatief herstel en expressie van deze twee eiwitten, werd in vivo Ca2+ beeldvorming uitgevoerd om de neurale activiteit en functionele connectiviteit tussen neuronen te beoordelen met holografische microscopie met twee fotonen.
Protocol
Alle experimentele protocollen zijn goedgekeurd door de Animal Care and Use Committees van de Nagoya University Graduate School of Medicine (goedkeuringsnummer: M220295-003).
1. Implantatie van de hoofdplaat (figuur 1A)
- Dien het verdovingsmiddel (een mengsel van 74 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine) intraperitoneaal toe om de muis te verdoven. Controleer de verdovingsstatus van de muis regelmatig door de pedaalreflexen te beoordelen.
- Plaats na de anesthesie de muis in een stereotaxisch instrument. Breng een oogzalf aan (zie tabel met materialen) om te voorkomen dat het hoornvlies uitdroogt wanneer de hoofdplaat wordt geïmplanteerd.
- Scheer het operatiegebied en desinfecteer de huid met drie afwisselende rondes povidon-jodium of chloorhexidine-scrubs gevolgd door 70% alcoholdoekjes. Leg de schedel voorzichtig bloot en maak deze schoon met wattenstaafjes.
OPMERKING: Alle chirurgische instrumenten moeten worden gesteriliseerd en alle procedures moeten dienovereenkomstig worden uitgevoerd. Achtergebleven vuil (bijvoorbeeld haar of gedroogd bloed) veroorzaakt ontstekingsreacties. Daarom moet al het vuil onder een stereoscoop worden verwijderd met wattenstaafjes bevochtigd met steriel water of 70% alcohol. - Gebruik de stereotactische coördinaten - voorste en achterste = 0,5 mm, mediaal en lateraal = 1,5 mm van bregma - om het midden van de craniotomie te vinden en te labelen met een markeerstift.
- Plaats een op maat gemaakte hoofdplaat in het midden van de schedel. Breng vervolgens tandcement aan (zie materiaaltabel) om het stevig aan de schedel te bevestigen. Oefen lichte druk uit totdat de hoofdplaat stevig contact maakt met de voor- en achterkant van de schedel.
OPMERKING: Deze stap duurt ongeveer 20 minuten om te voltooien en is van cruciaal belang voor het verminderen van bewegingsartefacten in de hersenen tijdens beeldvorming met twee fotonen. De afmetingen van de kopplaat zijn 20 mm × 40 mm × 1 mm met een opening in de vorm van de thuisplaat met één rand van 15 mm lang, twee aangrenzende zijden van 3 mm lang en de overige twee zijden 10 mm lang. - Meng een tandlijmcement op acrylbasis als volgt: een halve lepel poeder, drie druppels vloeistof en een druppel katalysator (zie materiaaltabel). Om uitdroging te voorkomen, brengt u dit gemengde tandlijmharscement aan op het intacte schedeloppervlak van de muis met de kopplaat.
- Plaats de muis in een warme kooi totdat deze is hersteld van de anesthesie. Laat de muis niet onbeheerd achter totdat deze weer voldoende bij bewustzijn is gekomen om de sternale lighouding te behouden.
2. Chirurgie en adeno-geassocieerd virus (AAV) injectie (Figuur 1B)
- Voer craniotomie of virale injectie uit zonder verwijdering van het tandlijmharscement uit de schedel 1 dag na implantatie van de hoofdplaat.
OPMERKING: Dien anesthesie (een mengsel van 74 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine) intraperitoneaal toe aan de muis tijdens deze procedure. - Om hersenoedeem te voorkomen, dient u dexamethasonnatriumfosfaat (1,32 mg / kg) intraperitoneaal toe te dienen 1 uur vóór de operatie.
- Verdoof de muis met de hoofdplaat met 1% isofluraananesthesie met behulp van een verdamper (anesthesieafgiftesysteem) terwijl de lichaamstemperatuur wordt gehandhaafd met een verwarmingskussen. Breng een oogzalf aan om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
- Voer onder een stereoscoop een cirkelvormige craniotomie uit met een diameter van ongeveer 2 mm met behulp van een tandartsboor. Om hersenschade te verminderen, bedient u de tandartsboor zorgvuldig met constante lichte beweging en lichte neerwaartse druk.
- Verwijder botfragmenten meerdere keren met behulp van een zuigsysteem. Gebruik na het verwijderen van de botfragmenten een kunstmatige spinale vloeistof (ACSF) -oplossing om vuil dat op het hersenoppervlak achterblijft te verwijderen en te wassen. Herhaal deze reinigingsprocedure meerdere keren om ontstekingsreacties te onderdrukken.
OPMERKING: De ACSF-oplossing (140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 5 mM HEPES, 2,0 mM CaCl 2 en 1,0 mM MgCl2) werd bewaard bij 4 °C gedurende 1 maand nadat het reagens was opgelost en gefilterd (poriegrootte = 0,22 μm). - Stel met behulp van een drukinjectiesysteem (zie tabel met materialen) de juiste druk in (ongeveer 10 PSI in pulsen met een duur van 4 ms) om 500 nL AAV-oplossing te injecteren door een glazen capillair met een tipdiameter van 10-20 μm (bereid met een micropipettrekker) gedurende 10 minuten.
- Bepaal of de AAV-oplossing aan de hersenen wordt toegediend door te controleren of het niveau van de AAV-oplossing in het glazen capillair geleidelijk afneemt.
- Laat het glazen capillair nog eens 10 minuten op zijn plaats zitten om terugstroming te voorkomen. Herhaal dit driemaal om in totaal 1,5 μl AAV-oplossing in de hersenen toe te dienen.
- Om neurale activiteit in laag 2/3 (L2/3) piramidale cellen te evalueren en te manipuleren, injecteert u een AAV-oplossing (voor Ca 2+ beeldvorming: AAV2/1-Syn-jGCaMP8f-WPRE bij1,28 × 10 14 vectorgenomen / ml, verdund 1: 1 in zoutoplossing; voor Ca2 + beeldvorming met optogenetica: AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1-WPRE bij 1,73 × 1014 vectorgenomen / ml, verdund 1: 1 in zoutoplossing) in het achterpootgebied van de primaire somatosensorische cortex van wildtype muizen (S1, gecentreerd op 0,5 mm achteraan en 1,5 mm lateraal van de bregma, 150 μm diepte van het oppervlak).
OPMERKING: De AAV-oplossing moet worden geïnjecteerd na 2-3 weken en 1-2 weken vóór beeldvorming voor respectievelijk jGCaMP8f en GCaMP6m-P2A-ChRmine-expressie. - Na een toepassing van 2% (w/v) laagsmeltende agarose op het hersenoppervlak van S1 met behulp van een micropipette, plaatst u een glazen venster over de craniotomie met twee afdekglazen. Bevestig de twee afdekglazen (kleine diameter van 2,0 mm en grote diameter van 4,5 mm; zie materiaaltabel) met UV-uithardende lijm.
- Druk het dekglas tegen de agarose terwijl het nog vloeibaar is; Dit voorkomt de vorming van luchtbellen in de agarose. Sluit de randen van het schedelraam af met tand- en kleefharscement (figuur 1C).
- Verwijder de muis van het stereotaxische instrument en breng deze terug naar de kooi. Plaats de muis in een warme kooi en keer niet terug naar de kooi met andere dieren totdat deze volledig is hersteld van de anesthesie. Zorg zorgvuldig voor steriele omstandigheden tijdens overlevingsoperaties.
- Controleer de eerste 72 uur na de operatie de gezondheidsstatus van de muis door algemeen gedrag te observeren. Als er afwijkingen zijn in het algemene gedrag, injecteer dan subcutaan ontstekingsremmende en pijnstillende middelen.
3. Voorbereiding voor het holografische stimulatie- of verlichtingssysteem (figuur 3)
- Kalibreer het holografische stimulatiesysteem door het oppervlak van een rode fluorescentieglaasje (gegoten acrylsubstraat) op het monstervlak te plaatsen. Plaats de microscoop in de live beeldmodus met een zwak excitatielicht en voer calibration_GUI.m-bestand uit. Controleer het deelvenster Parameters en klik op de knop Opslaan .
- Klik op de knop Z Scan in het deelvenster stap 1. Het genereert automatisch drie willekeurige plekken in alle 21 axiale vlakken, 2 μm uit elk vlak.
- Verplaats de schuifbalk en controleer de live afbeelding. Zoek een perfect vlak waar de vlekken het kleinst en het helderst lijken en klik vervolgens op de knop Opslaan . Dit genereert automatisch een offset bolvormig golffront voor het digitale hologram.
OPMERKING: Als u de helderste fluorescentievlekken niet kunt vinden, wijzigt u de minimum- en maximumwaarden van het scanbereik en probeert u het opnieuw. - Klik op de knop Ga in het deelvenster Stap 2 en klik vervolgens op zes plekken in het linkervierkant. Bekijk het live beeld. Als er zes te onderscheiden fluorescentievlekken zijn, typt u hun x- en y-as in de bewerkingsvakken en klikt u op de knop Opslaan . Dit genereert automatisch affiene transformatiecoëfficiënten om de kalibratie tussen het holografische stimulatie- en beeldvormingssysteem te coördineren.
OPMERKING: Het aspaarnummer en het aangeklikte spotnummer moeten in volgorde overeenkomen. Als u het niet zeker weet of als er geen vlekken in uw afbeelding zijn, probeert u het opnieuw en genereert u een uniek vlekkenpatroon of kiest u een kleiner bereik rond het midden van het gezichtsveld (FOV). - Klik op de knop Scannen in het deelvenster stap 3. Het genereert 441 digitale hologrammen om in 21 × 21 stappen single spot scanning over de FOV uit te voeren.
- Controleer eerst de afbeeldingen terwijl u patronen in de keuzelijst wijzigt. Pas vervolgens het laservermogen aan om steunbeelden te verkrijgen binnen het dynamische bereik van het beeldverwerkingsapparaat (bijvoorbeeld om oververzadigde beelden te voorkomen).
- Pas vervolgens de intervaltijd aan in het bewerkingsvak; De intervaltijd moet meer dan twee keer de opname-intervaltijd zijn. Zet ten slotte het beeldapparaat in de opnamemodus en klik op de knop Afspelen . Als het afspelen is voltooid, worden er "display OK" -tekenreeksen weergegeven in het opdrachtvenster. Stop met opnemen en stapel opgenomen sequentiële beelden op met behulp van de maximale intensiteitsmethode.
- Klik op WM genereren in het deelvenster stap 4 en kies een gestapelde afbeelding van bovenaf. Sluit vervolgens het calibration_GUI venster. Het genereert automatisch een gewichtskaart om de onevenwichtige intensiteit op elke plek te compenseren.
OPMERKING: Voor een meer gedetailleerde beschrijving, zie 2; de Matlab-code kan hier worden gedownload (https://github.com/ZenKG/SLM_control).
4. Ca2+ beeldvorming met behulp van een beeldsensor met holografische verlichting (figuur 4)
- Plaats de AAV-geïnjecteerde muis met een kopplaat onder de microscoop (figuur 1D).
OPMERKING: Tijdens deze procedure wordt de muis in de wakkere toestand vastgehouden, maar kan hij ontsnappen aan ongemakkelijke stimuli. - Voer beeldvorming van twee fotonen (puntscanmodus) uit met behulp van een holografische microscoop en een in de modus vergrendelde Ti:saffierlaser afgestemd op 920 nm met een objectief van 25x (zie Materiaaltabel).
- Schakel de commerciële beeldbewerkingssoftware in (zie Materiaaltabel). Pas in de live beeldvormingsmodus de spanning van de beelddetector (zie materiaaltabel) en de kracht van de beeldlaser aan om de helderheid van de neuronen die jGCaMP8f tot expressie brengen te optimaliseren. Leg beelden vast van de neuronen die dit eiwit tot expressie brengen.
OPMERKING: De intensiteit van de beeldlaser (920 nm) is 20-30 mW. De FOV was 512 μm × 512 μm op een diepte van 100-150 μm van het corticale oppervlak. - Als u specifieke neuronen wilt belichten die jGCaMP8f tot expressie brengen met holografische verlichting, voert u het scriptbestand SLMcontrol.m uit. Klik op de referentieafbeelding en kies de bovenstaande afbeelding. Klik vervolgens op de knop Spot om specifieke pixels op de neuronen in de afbeelding te kiezen door continu met de muis te klikken (Figuur 4A). Als de selectie is voltooid, drukt u op de knop Enter op het toetsenbord om deze te voltooien.
OPMERKING: Het digitale hologram wordt automatisch berekend en weergegeven op de SLM. Dit patroon kan ook opnieuw worden bekeken door op een keuzelijst te klikken. De ruimtelijke resolutie van een enkele spot gegenereerd door de SLM was ongeveer 1,2 μm langs de dwarsrichting en ~8,3 μm langs de optische as. We gebruikten een objectief objectief met een hoog numeriek diafragma (1.1) om meer gelokaliseerde holografische stimulatie te bereiken. Tabel 1 geeft een overzicht van eerdere rapporten en dit systeem met betrekking tot de ruimtelijke resolutie van holografische stimulatie. - Als u neurale activiteit met een hoge temporele resolutie wilt detecteren met behulp van een beeldsensor (zie Materiaaltabel), stelt u de belichtingstijd, het beeldgebied en het binning in (figuur 4B) voordat u beeldacquisitie uitvoert (figuur 4C).
OPMERKING: De intensiteit van de holografische verlichtingslaser (920 nm) die continu één neuron stimuleert, is 2 mW, wat voldoende is om neurale activiteit te detecteren. Om bijvoorbeeld een framesnelheid van 100 Hz voor beeldvorming te bereiken, is de belichtingstijd 9 ms, het beeldgebied 400 μm × 400 μm en de binning 4. - Na het experiment brengt u de muis terug naar zijn thuiskooi.
5. Beeldvorming van twee fotonen (puntscanmodus) met optogenetica met behulp van een holografische microscoop (figuur 2)
- Herhaal stap 4.1 en 4.2.
- Schakel de commerciële beeldbewerkingssoftware in (zie Materiaaltabel). Pas in de live beeldvormingsmodus de spanning van de beelddetector (zie materiaaltabel) en de kracht van de beeldlaser aan om de helderheid van de neuronen die GCaMP6m-P2A-ChRmine tot expressie brengen te optimaliseren. Maak beelden van de neuronen die deze eiwitten tot expressie brengen (figuur 1E).
- Herhaal stap 4.4.
- Om de functionele connectiviteit binnen L2/3-neuronen te onderzoeken, gebruikt u een SLM om holografische patronen van optogenetische stimulatie te genereren (ChRmine; 1.040 nm) en combineert u deze met twee-foton Ca 2 + -beeldvorming (GCaMP6m; 920 nm, 512 × 512 pixels,2 Hz of 30 Hz, 2x digitale zoom, puntscanmodus; Figuur 4D-H).
- Stel voor dit protocol de intensiteit van de beeldlaser in op 920 nm, op 10-20 mW, en de FOV op 256 μm × 256 μm gemeten op een diepte van 100-150 μm van het corticale oppervlak. Stel de verblijftijd van de pixel in op 1,5 μs voor 2 Hz of 100 ns voor 30 Hz.
- Om te zien of een enkele holografische stimulus een calciumrespons in de neuronen veroorzaakte, gebruikt u zowel 2 Hz als 30 Hz als beeldframesnelheid. Stel de intensiteit van de holografische stimulatielaser (1.040 nm) die een enkel neuron stimuleert in op 10 mW, wat voldoende is om neurale activiteit te induceren (figuur 4D).
OPMERKING: De ruimtelijke resolutie van een enkele spot gegenereerd door de SLM is ongeveer 1,2 μm langs de dwarsrichting en ~8,3 μm langs de optische as. Het bereik van het toegankelijke volume in de laterale richting is ongeveer 500 μm × 500 μm en 100 μm in de axiale richting. We hebben verder bevestigd met Ca2+ beeldvorming bij 2 Hz of 30 Hz beeldframesnelheid dat niet alleen één neuron, maar meerdere neuronen tegelijkertijd holografisch kunnen worden gestimuleerd (figuur 4E).
- Voer beeldacquisitie uit met het volgende protocol: simultaan de Ca2+ respons op 920 nm met 10 holografische stimuli op 1.040 nm met 8 s intervallen (0,125 Hz) gedurende een duur van 50 ms na een baseline periode van 10 s. Nadat alle experimenten zijn voltooid, worden de muizen geëuthanaseerd.
OPMERKING: Ca2+ transiënten, indien aanwezig, werden opgeroepen door holografische stimulatie, waarbij hun piek binnen 1 s na stimulatie verscheen (figuur 4F-H).
6. Beeldanalyse en beoordeling van functionele connectiviteit (figuur 4)
- Open de RAW-afbeeldingen die zijn opgeslagen in stap 4.5 of 5.5 met ImageJ. Om de verplaatsing van het brandpuntsvlak te compenseren, gebruikt u de ImageJ-plug-in TurboReg.
OPMERKING: Als de correctie met TurboReg niet voldoende is, wordt aanbevolen om CaImAn (http://github.com/simonsfoundation) te gebruiken om de verplaatsing van het brandpuntsvlak te corrigeren. - Om neurale activiteit te beoordelen, bepaalt u de interessegebieden (ROIs) in L2/3 met behulp van een geautomatiseerd algoritme (CaImAn). Detecteer en analyseer Ca2+ transiënten na het definiëren van de baseline fluorescentie-intensiteit (F0) en de drempelwaarde.
OPMERKING: F0 is de 35e percentielwaarde van de fluorescentie-intensiteit die is verkregen tijdens de basislijnbeeldvormingsperiode. Ca2+ transiënten worden aangeduid met Δ F/F 0 (Δ F = F-F0), waarbij F het momentane fluorescentiesignaal is. Als de Δ F-waarde hoger is dan 2 S.D. van F0, evalueren we een significante Ca2+ transiënt. - Om functionele connectiviteit in L2/3-neuronen te definiëren, doelneuronen te stimuleren en GCaMP6m-responsen in gestimuleerde en omliggende neuronen dienovereenkomstig te meten (figuur 4F-H).
Representative Results
Representatieve opnamen verkregen met behulp van de hier beschreven methode worden gepresenteerd. In vivo Ca2+ beeldvorming met behulp van holografische microscopie vereist 2-4 weken om te voltooien, van hoofdplaatimplantatie en AAV-injectie tot gegevensverzameling. Daarom is het belangrijk om bewegingsartefacten in de hersenen te verminderen om stabiele resultaten te verkrijgen. De kopplaatimplantatie (stap 1.5) en de plaatsing van het schedelraam (stap 2.9) zijn zeer belangrijke stappen in dit proces. Verder is het ook belangrijk om een AAV (AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1) te selecteren die tegelijkertijd calciumindicator en opsine uitdrukt in een enkel neuron (stap 2.8).
Figuur 4A toont een plek voor de holografische verlichting van een verworven neuronbeeld met behulp van een op maat gemaakt MATLAB-script. Als holografische verlichting met succes de neuronen verlicht die jGCaMP8f tot expressie brengen, kunnen Ca2+ sporen worden verkregen met een beeldsensor (figuur 4B), zoals weergegeven in figuur 4C.
Functionele connectiviteit tussen neuronen werd geëvalueerd met behulp van holografische stimulatie (figuur 4D), zoals weergegeven in figuur 4E. Omdat functionele connectiviteit tussen neuronen een van de neurale circuiteigenschappen is die is veranderd in de pathogenese van een pijnmodelmuis24, beschrijven we een eenvoudige procedure om deze te evalueren. Figuur 4F toont een typisch beeld van L2/3 neuronen in S1HL gevisualiseerd met behulp van GCaMP6m. Wanneer één neuron (oranje cirkel) holografisch werd gestimuleerd, was een ander neuron (rode cirkel) tegelijkertijd actief; het aantal functionele verbindingen tussen neuronen was dus één (figuur 4G).
Figuur 1: Schematisch overzicht van de experimentele procedure . (A) Bevestiging van de hoofdplaat aan de schedel. (B) Stereotactische injectie van AAV in het achterpootgebied van de primaire somatosensorische cortex (S1HL). (C) Implantatie van het schedelvenster. Om neurale activiteit te beoordelen en te manipuleren, wordt in vivo Ca2+ beeldvorming uitgevoerd bij wakkere muizen (D) met holografische stimulatie (E). Flitsmarkeringen duiden op holografische stimulatie of verlichting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Systeem gebruikt voor de holografische microscoop. (A) Beelden van de holografische stimulatie- en verlichtingslichtpaden (links) in de buurt van de microscoop (midden) met een beeldsensor (rechts). (B) Dit zijn uitvergrote beelden van holografische stimulatie- en verlichtingslichtpaden rond respectievelijke SLMs (links en rechts) en een puntscanlichtpad rond een scankop (midden en rechts). (C) Een schema van de optische paden voor stimulatie en beeldvorming. Fase-only SLM's worden gebruikt om digitale hologrammen weer te geven, en een beam expander (een combinatie van L1 en L2) en een 4f-relaissysteem (een combinatie van L3 en L4 voor holografische stimulatie en L4 en L5 voor holografische verlichting) worden vóór en na de respectieve SLM's geplaatst om ervoor te zorgen dat elk digitaal hologram wordt afgebeeld bij de uitgangspupil van een objectief objectief voor wateronderdompeling, met een iets te weinig gevuld afbeeldingsformaat. Om resterende nul-orde componenten te onderdrukken, wordt een balkblok op het tussenvlak geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Stroomdiagram van hoe het holografische stimulatie- of verlichtingssysteem moet worden gekalibreerd. Dit stroomdiagram beschrijft stappen om een holografisch stimulatie- of verlichtingssysteem te kalibreren op de monsterruimte en het beeldvormingssysteem. Ga naar stap 3, voorbereiding voor het holografische stimulatie- of verlichtingssysteem, voor gedetailleerde instructies en download een voorbeeldprogramma. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve resultaten van beeldvorming en functionele connectiviteit met behulp van een holografische microscoop . (A) Om specifieke neuronen te verlichten die jGCaMP8f of GCaMP6m-P2A-ChRmine tot expressie brengen, wordt het beeld van neuronen vastgelegd en vervolgens wordt een vlek op het neuron gevormd met behulp van een op maat gemaakt MATLAB-script. (B) De instelling van de beeldsensor (belichtingstijd, beeldgebied en binning). (C) Representatief beeld en sporen van neuronen die jGCaMP8f tot expressie brengen in 100 Hz-beeldvorming met holografische verlichting en een beeldsensor. (D) Deze grafiek toont de neurale respons op holografische stimulatie (1.040 nm) bij elk laservermogen (gegevens van GCaMP6m-P2A-ChRmine die neuronen tot expressie brengen met een beeldvormingsframesnelheid van 2 Hz [n = 16]). Foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde aan. (E) Representatieve Ca2+ sporen tijdens holografische stimulatie (blauwe verticale lijnen) van 10 verschillende neuronen bij 2 Hz (links) en 30 Hz (rechts) beeldframesnelheden. In 2 Hz en 30 Hz Ca2+ sporen duidt dezelfde kleur op hetzelfde neuron. (F) Schematisch diagram dat functionele verbindingen tussen neuronen evalueert. Wanneer het oranje neuron wordt gestimuleerd, reageren de rode neuronen tegelijkertijd, wat aangeeft dat er functionele connectiviteit is tussen deze neuronen. (G) Een typisch beeld van S1HL-neuronen die GCaMP6m tot expressie brengen in WT. Schaalbalk = 10 μm. (H) Typische Ca2+ sporen tijdens holografische stimulatie (blauwe verticale lijnen) bij 2 Hz (bovenste) en 30 Hz (onderste) beeldframesnelheden. Het gestimuleerde neuron is oranje omcirkeld, reagerende neuronen zijn rood omcirkeld en niet-reagerende neuronen zijn grijs omcirkeld. Neurale responsiviteit op holografische stimulatie kan worden gedetecteerd bij beeldsnelheden van zowel 2 Hz als 30 Hz. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Onze set-up 6 | Prakash, R. et al. 25 | Marshel, J. H. et al. 12 | Robinson, N. T. M. et al. 14 | |
| Laterale resolutie | 1,2 μm | 1,27 μm | ― | 2,22 μm |
| Axiale resolutie | 8,3 μm | 56,86 μm | 15,5 μm | 10,26 μm |
| Objectief lens/numeriek diafragma | 25x/1,1 | 20x/0,5 | 16x/0,8 | 16x/0,8 |
Tabel 1: Samenvatting van eerdere rapporten en dit systeem voor de ruimtelijke resolutie van holografische stimulatie. De laterale resolutie, axiale resolutie en de objectieflens die tijdens de meting wordt gebruikt, worden beschreven.
Discussion
Om de hersenfunctie te begrijpen, is het noodzakelijk om de neurale circuits die ten grondslag liggen aan de hersenfunctie nauwkeurig te beoordelen door de dynamiek van neurale activiteit te extraheren. Bovendien is het essentieel om te identificeren hoe deze neurale circuits worden gewijzigd om de pathogenese van neuropsychiatrische stoornissen op te helderen. Het is inderdaad bekend dat de neurale activiteit verhoogd is in muismodellen van de ziekte van Alzheimer4 en het fragiele X-syndroom26 en muizen met een verminderde wittestoffunctie3. Bovendien wordt in een muismodel van ontstekingspijn een verhoogde synchronisatie van neurale activiteit en functionele connectiviteit tussen neuronen geassocieerd met symptomen24. Holografische microscopie met twee fotonen stelt ons in staat om tegelijkertijd de activiteit van individuele neuronen en de functionele verbindingen tussen neuronen te observeren, wat nodig is voor het begrijpen van neurale circuits. We gebruikten een 25x objectieflens met numeriek diafragma = 1.1 met golflengten van 1.040 nm. De theoretische puntspreidingsfunctie is een Gaussische verdeling met een volledige breedte van maximaal 0,5 μm lateraal en 1,7 μm axiaal. Het werkelijke numerieke diafragma is echter minder dan 1,1 en de gemeten spotgrootte op een fluorescentiekraal is 1,2 μm lateraal en 8,3 μm axiaal. Aangezien de neurondiameter ongeveer 15 μm is en de kalibratiefout binnen 3 μm ligt, is de targeting over het algemeen goed. Cellen in de axiale richting kunnen echter worden beïnvloed door de langere spotgrootte6. Hier beschreven we de virale injectie, chirurgie, kalibratie van holografische stimulatie- of verlichtingssystemen en beeldvormingsprotocollen voor het evalueren en manipuleren van neurale activiteit bij levende muizen met behulp van ons microscopiesysteem.
Het duurt 2-4 weken om alle experimentele procedures te voltooien, van hoofdplaatimplantatie en virusinjectie tot gegevensverzameling voor in vivo Ca2+ beeldvorming met behulp van holografische microscopie. Het proces is complex en bewerkelijk, en het uiteindelijke succes van het experiment hangt af van meerdere factoren, waaronder de toestand van het schedelvenster, dat wordt beïnvloed door postoperatieve ontsteking, de juiste keuze van Ca2 + -indicator en opsine, en of bewegingsartefacten in de verkregen afbeeldingen kunnen worden gecorrigeerd. In het bijzonder zijn twee stappen belangrijk voor een succesvol resultaat. De eerste betreft hoofdplaatfixatie en chirurgie; Het is van cruciaal belang dat de kopplaat stevig aan de muizenkop wordt bevestigd met tandcement. Verder is het belangrijk om botfragmenten en gestolld bloed herhaaldelijk te reinigen met behulp van koude ACSF tijdens de operatie. Omdat het volgen van deze procedure ontstekingen vermindert, hebben we met succes de dynamiek van microglia waargenomen, de cellen die verantwoordelijk zijn voor het immuunsysteem van de hersenen, zonder hun processen en stekels of de microstructuren van neuronen te activeren27,28. Het tweede probleem is de evaluatie en manipulatie van neurale activiteit. We kozen voor AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1 om de Ca2+ indicator en opsine tegelijkertijd in één neuron uit te drukken. Dit komt omdat het moeilijk is om één neuron efficiënt te infecteren met verschillende AAV-typen. Een andere reden voor deze keuze was dat ChRmine neurale activiteit bij 1.040 nm efficiënt kan activeren met behulp van een twee-foton laser12. Onlangs is gemeld dat ChRmine, door zijn structuur te muteren op basis van structurele informatie verkregen door cryo-elektronenmicroscopie, zijn functieverbetert 29, wat nuttig wordt geacht voor doelfunctieanalyse op het gebied van neurowetenschappen. In het licht van deze problemen is het noodzakelijk om effectieve methoden te delen voor het evalueren en manipuleren van neuronen bij het lezen van neurale activiteit en het schrijven van informatie met behulp van holografische microscopie.
Recente ontwikkelingen in beeldvorming en optogenetica hebben de gedetailleerde neurale activiteit onthuld die betrokken is bij hersenfuncties zoals leren en geheugen, en het is mogelijk om deze neurale activiteit kunstmatig te manipuleren om hersenfuncties uit te drukken30. Conventionele methoden voor de manipulatie van neurale activiteit zijn echter zeer invasief vanwege het inbrengen van optische vezels in de hersenen en omdat een groep opsine-tot expressie brengende cellen tegelijkertijd wordt gestimuleerd, waardoor het onmogelijk is om neurale activiteit met temporele en ruimtelijke precisie te manipuleren. Onze methode kan neurale activiteit manipuleren door alleen specifieke neuronen in de hersenen te stimuleren, waardoor manipulatie van neurale activiteit met specifieke stimulatiepatronen en een hoge spatiotemporale resolutie mogelijk wordt. Verder is het belangrijk op te merken dat functionele connectiviteit tussen neuronen alleen kan worden geëvalueerd in een klein aantal neuronen met behulp van brain slice-experimenten31; Deze techniek maakt echter gelijktijdige evaluatie van meerdere neuronen in levende dieren mogelijk.
Een van de belangrijkste beperkingen van de huidige holografische microscopen is de noodzaak om de muiskop te fixeren, wat het gedrag van de muis beperkt. Onlangs werd een geminiaturiseerde twee-fotonenmicroscoop ontwikkeld32, en met de verdere miniaturisatie van het apparaat kan in vivo Ca2+ beeldvorming met holografische stimulatie mogelijk zijn bij vrij bewegende muizen. Bovendien kan het potentieel van deze microscoop worden uitgebreid door de temporele resolutie van beeldvorming te verbeteren en deze te combineren met zeer gevoelige spanningsgevoelige fluorescerende eiwitten33.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Grants-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (19H04753, 19H05219, and 25110732 to H. W.), Grants-in-Aid for Transformative Research Areas (A) (20H05899 to H. W., 20H05886 to O. M., and 21H05587 to D. K.), Fostering Joint International Research (B) (20KK0170 to H. W.), Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (18H02598 to H. W.), Grant-in-Aid for Scientific Research (A) (21H04663 to O. M.), Grant-in-Aid for Early-Career Scientists (20K15193 to X. Q.), JST CREST Grant Number JPMJCR1755, Japan, en JST A-STEP Grant Number JPMJTR204C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25x Objective | Nikon | N25X-APO-MP | Objective |
| A1MP | Nikon | A1MP | Microscope |
| AnesII | Bio machinery | AnesII | Anesthesia delivery system |
| C2 plus | Nikon | C2 plus | Microscope |
| DECADRON Phosphate Injection | Aspen | 21N024 | Avoid cerebral edema |
| Dental Drill | Jota | C1.HP.005 | Dental drill |
| Electric Microinjector | NARISHIGE | IM-31 | Pressure injection system |
| FEATHERS | FEARGER | FA-10 | Shaving |
| G-CEM ONE ADHESIVE ENHANCING PRIMER | GC | 2110271 | Resin cement primer for dental adhesion |
| G-CEM ONE neo | GC | 43093 | Resin cement for dental adhesion |
| Glass Capillary with Filament | NARISHIGE | GDC-1 | Glass capillary |
| Image Detector | Hamamatsu | H10770PA-40 | GaAsP photocathode photomultiplier tube |
| Imaging Software | Nikon | NISelements | Imaging software |
| Isoflurane Inhalation Solution | Pfizer | 229KAR | Anesthetics |
| iXon EMCCD Camera | Andor | iXon Life 888 | Image sensor |
| Ketamine | daiitisannkyou | s9-018506 | Anesthetics |
| Leica-M60 | Leica | M60 | Stereoscope |
| Linicon | Linicon | LV-125 | Vacuum pump |
| Mode-locked Ti:sapphire Chameleon Ultra II laser | Coherent | Chameleon Discovery NX | Femtosecond laser |
| Mos-Cure | U-VIX | mini 365 | Portable LED UV Light Source |
| PEN Bright | SHOFU INC. | PEN Bright | Dental light curing unit |
| Puller | SUTTER instaument | P-97 | Puller |
| Stereotaxic Instrument (for Mice) | NARISHIGE | SR-6M-H | Stereotaxic instrument |
| Stereotaxic Micromanipulator | NARISHIGE | SM-15R | Stereotaxic micromanipulator |
| Super-Bond CATALYST V | SUN MEDICAL | 8070 | Dental adhesive resin cement |
| Super-Bond Dental Adhesive Monomer | SUN MEDICAL | 8071 | Dental adhesive monomer |
| Super-Bond Teeth Color Polymer Powder | SUN MEDICAL | 145052000 | Teeth color polymer powder |
| Tarivid Ophthalmic Ointment 0.3% | Santen Pharmaceutical | TRN3952 | Eye ointment |
| UlTIMATE XL | NSK | Y141446 | Dental laboratory micromotor control unit |
| UV Curing Optical Adhesives | THORLABS | NOA61 | UV Curing Optical Adhesives |
| Xylazine | Bayer | KP0F2BK | Anesthetics |
References
- Masamizu, Y., et al. Two distinct layer-specific dynamics of cortical ensembles during learning of a motor task. Nature Neuroscience. 17 (7), 987-994 (2014).
- Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
- Kato, D., et al. Motor learning requires myelination to reduce asynchrony and spontaneity in neural activity. Glia. 68 (1), 193-210 (2020).
- Busche, M. A., et al. Tau impairs neural circuits, dominating amyloid-β effects, in Alzheimer models in vivo. Nature Neuroscience. 22 (1), 57-64 (2019).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Quan, X., Kato, D., Daria, V., Matoba, O., Wake, H. Holographic microscope and its biological application. Neuroscience Research. 179, 57-64 (2022).
- Adesnik, H., Abdeladim, L. Probing neural codes with two-photon holographic optogenetics. Nature Neuroscience. 24 (10), 1356-1366 (2021).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).
- Carrillo-Reid, L., Han, S., Yang, W., Akrouh, A., Yuste, R. Controlling visually guided behavior by holographic recalling of cortical ensembles. Cell. 178 (2), 447-457 (2019).
- Marshel, J. H., et al. Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception. Science. 365 (6453), (2019).
- Gill, J. V., et al. Precise holographic manipulation of olfactory circuits reveals coding features determining perceptual detection. Neuron. 108 (2), 382-393 (2020).
- Robinson, N. T. M., et al. Targeted activation of hippocampal place cells drives memory-guided spatial behavior. Cell. 183 (6), 1586-1599 (2020).
- Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Häusser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).
- Mardinly, A. R., et al. Precise multimodal optical control of neural ensemble activity. Nature Neuroscience. 21 (6), 881-893 (2018).
- Yang, W., Carrillo-Reid, L., Bando, Y., Peterka, D. S., Yuste, R. Simultaneous two-photon imaging and two-photon optogenetics of cortical circuits in three dimensions. Elife. 7, 32671 (2018).
- Forli, A., et al. Two-photon bidirectional control and imaging of neuronal excitability with high spatial resolution in vivo. Cell Reports. 22 (11), 3087-3098 (2018).
- Pégard, N. C., et al. Three-dimensional scanless holographic optogenetics with temporal focusing (3D-SHOT). Nature Communications. 8 (1), 1228 (2017).
- Dal Maschio, M., Donovan, J. C., Helmbrecht, T. O., Baier, H. Linking neurons to network function and behavior by two-photon holographic optogenetics and volumetric imaging. Neuron. 94 (4), 774-789 (2017).
- Russell, L. E., et al. All-optical interrogation of neural circuits in behaving mice. Nature Protocols. 17 (7), 1579-1620 (2022).
- Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V.
- Hernandez, O., et al. Three-dimensional spatiotemporal focusing of holographic patterns. Nature Communications. 7, 11928 (2016).
- Okada, T., et al. Pain induces stable, active microcircuits in the somatosensory cortex that provide a therapeutic target. Science Advances. 7 (12), 8261 (2021).
- Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).
- Gonçalves, J. T., Anstey, J. E., Golshani, P., Portera-Cailliau, C. Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice. Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).
- Akiyoshi, R., et al. Microglia enhance synapse activity to promote local network synchronization. eNeuro. 5 (5), (2018).
- Haruwaka, K., et al. Dual microglia effects on blood brain barrier permeability induced by systemic inflammation. Nature Communications. 10 (1), 5816 (2019).
- Kishi, K. E., et al. Structural basis for channel conduction in the pump-like channelrhodopsin ChRmine. Cell. 185 (4), 672-689 (2022).
- Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
- Ko, H., et al. The emergence of functional microcircuits in visual cortex. Nature. 496 (7443), 96-100 (2013).
- Zong, W., et al. Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice. Cell. 185 (7), 1240-1256 (2022).
- Villette, V., et al. ultrafast two-photon imaging of a high-gain voltage indicator in awake behaving mice. Cell. 179 (7), 1590-1608 (2019).
